CN101550439A - 定量荧光pcr快速检测常见染色体三体的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法，包括：样本的收集与处理，DNA提取，引物设计和合成，第一体系和第二体系的PCR扩增反应，PCR产物的检测，第三体系的PCR扩增反应，PCR产物的检测。本发明还提供了一种准确、可靠的定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的试剂盒。本发明结合了定量荧光PCR灵敏、精确的特点与短串联重复序列分布广、均匀、多态性、杂合度高的特点，可应用在外周血及羊水、脐带血、绒毛等产前样本的常见染色体病数目的检测上。

Description

定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于医学临床检测领域，涉及一种快速检测常见染色体三体的方法，以及相应的试剂盒。

背景技术

流产和新生儿死亡最常见的原因是染色体异常，其中，第21、18、13号及性别染色体数目异常占出生后染色体异常总数的95％。唐氏综合征为最常见，新生儿的发病率为1/800～1/600，我国每年大约有26600个先天愚型痴呆儿出生，平均每20分钟就出生一例。由于目前尚无有效的治疗方法，患者智力低下、常伴有多种严重的先天缺陷，给家庭和社会造成沉重的负担。因此，及早检测并防止患儿的出生，对降低其发病率无疑具有非常重要的意义。

传统上采用羊水染色体检测方法，该方法存在以下缺陷：①对于妊娠胎儿的检查时间受到明显的限制(仅能检测妊娠16-22周的羊水染色体)；②对抽取样本的数量要求较多；③耗时长(15-20天的培养时间)；④工作量大(需要人工显微镜下对染色体区带进行分辨)；⑤不能保证母血污染羊水样本结果的准确性。而作为羊水染色体检查补充方法的脐带血及绒毛染色体检查的方法也同样存在以上缺点。

近年来，对染色体异常进行检测的分子遗传学方法很多，包括：荧光原位杂交技术(FISH)、引物原位标记技术(PRINS)、同源基因定量PCR(HGQ-PCR)和实时定量PCR(Real-time PCR)等。其中FISH和PRI NS在设备和技术上有较高要求，限制了这些方法的普及和应用；同源基因定量PCR(HGQ-PCR)技术，仅能对唐氏综合征进行检测；实时定量PCR方法，通过对21号染色体和其他染色体Ct值比率或差值的比较分析，来检测21号染色体的数目，但此方法对3个数量级以上的差别才能有较好的区分，而三体只是二体的1.5倍，区分度不大，另外Ct值的波动范围较大，轻微的变化都有可能对结果有影响，容易造成误诊，其检测的准确性还有待于进一步的研究和完善。

发明内容

本发明的目的在于提供一种准确、可靠的定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法。

本发明所述的一种定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法，包括以下步骤：

A.样本的收集与处理：样本为外周血或孕妇产前样本，包括：孕16周以后采集的羊水，孕18周以后采集的脐带血，或者孕13周前采集的绒毛，采用常规方法处理；

B.DNA提取：按常规苯酚-氯仿法提取前述样本的DNA，用紫外分光光度仪测OD₂₈₀及OD₂₆₀值以确定浓度和纯度，所需DNA纯度要求OD₂₆₀/OD₂₈₀的值为1.6～1.8；

C.引物设计和合成：

选择分布在第21、18、13号染色体和性别染色体上的11个短串联重复序列位点即STR位点，包括：21号染色体的三个STR位点：D21S11、D21S1411和D21S1412；18号染色体的四个STR位点：MBP、D18S535、D18S51和D18S386；13号染色体的三个STR位点：D13S631、D13S634和D13S317；X染色体的一个STR位点：XHPRT；另选择性别染色体上特异性的AMXY位点；上述位点可在人类基因组数据库即GDB网站中查询获得；

针对上述12个位点分别设计特异性引物，并在每对引物的反向链5’端加一段GTT CTT序列；用不同的荧光素对已合成的引物进行标记；

D.第一体系和第二体系的PCR扩增反应：

进行两个反应体系的PCR扩增反应，第一体系包括以下位点的引物：MBP、AMXY、D13S631和D13S634；第二体系包括以下位点的引物：D18S535、XHPRT、D21S11、D21S1411和D21S1412。

PCR扩增体系如下：

DNA模板               2～40ng

引  物                2～20pmol

热启动TaqDNA聚合酶    2U

10×PCR缓冲液         2.5μl

MgCl₂                 1.5mmol/L

dNTP                  200μmol/L

加水至总体积          25μl

PCR扩增条件为：95℃预变性11分钟，94℃变性1分钟，59℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行30个循环，最后在60℃下延伸60分钟；

E.PCR产物的检测：将PCR产物按现有遗传分析仪的操作说明进行处理，根据扩增产物片段大小及荧光素的不同进行区分，通过样本DNA扩增产物的STR形式的定量分析，参照业内制订的分子遗传学检测标准，判断被检者的染色体的数目是正常的二体，还是异常的三体，或是暂不能判定其染色体数目的情况；

F.第三体系的PCR扩增反应：

对于步骤E中未能达到上述检测标准的样本，再进行第三体系的PCR扩增反应，第三体系包括以下位点的引物：D18S51、D18S386和D13S317；PCR扩增体系和PCR扩增条件均与步骤D相同；

G.PCR产物的检测：与步骤E相同。

优选地，所述步骤A中，外周血样本的收集与处理为：抽取1ml静脉血，加枸橼酸钠抗凝后用于步骤B。

优选地，所述步骤A中，羊水样本的收集与处理为：抽取的羊水在4000rpm离心10min，弃上清液，用生理盐水洗涤沉淀一次，4000rpm离心10min，弃上清液，收集底部的细胞用于步骤B。

优选地，所述步骤A中，脐带血样本的收集与处理为：抽取1ml脐带血，加枸橼酸钠抗凝后用于步骤B。

优选地，所述步骤A中，绒毛样本的收集与处理为：选出具有明显分支结构的绒毛组织，用生理盐水洗涤二次，用于步骤B。

本发明的另一目的是提供一种准确、可靠的定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的试剂盒。

本发明所述的一种定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的试剂盒，包括三种不同的反应体系，每个反应体系均含有以下试剂：

10×PCR缓冲液，含15mmol/L MgCl₂，反应体系中稀释为1×PCR缓冲液；

dNTP，浓度为10mmol/L，反应体系中稀释为200μmol/L；

热启动TaqDNA聚合酶，浓度为5U/μl，反应体系中用量为2U；

引物，浓度为0.5～5μmol/L，反应体系中用量为2～20pmol；

其中，所述引物为针对12个位点分别设计的特异性引物，并在每对引物的反向链5’端加一段GTT CTT序列；其中11个位点是分布在第21、18、13号染色体和性别染色体上的STR位点，包括：21号染色体的三个STR位点：D21S11、D21S1411和D21S1412；18号染色体的四个STR位点：MBP、D18S535、D18S51和D18S386；13号染色体的三个STR位点：D13S631、D13S634和D13S317；X染色体的一个STR位点：XHPRT；另选择性别染色体上特异性的AMXY位点；上述位点可在人类基因组数据库即GDB网站中查询获得；

将所述引物分为三组，分别构成三个反应体系，其中，第一体系包括以下位点的引物：MBP、AMXY、D13S631和D13S634；第二体系包括以下位点的引物：D18S535、XHPRT、D21S11、D21S1411和D21S1412；第三体系包括以下位点的引物：D18S51、D18S386和D13S317。

本发明所述的定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法，结合了定量荧光PCR灵敏、精确的特点与短串联重复序列(short tandem repeat，STR)分布广、均匀、多态性、杂合度高的特点，可应用在外周血及羊水、脐带血、绒毛等产前样本的常见染色体病数目的检测上。

定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法及试剂盒结合了定量荧光PCR灵敏、精确的特点与短串联重复序列(STR)分布广、均匀、多态性、杂合度高的特点。短串联重复序列是2～6bp的重复序列，其多态性来源于串联片段重复数量的变化，是定量检测染色体数目异常最有力的遗传标记。本发明选择常见染色体三体所在染色体(第21、18、13号染色体)上的几个多态性、杂合度高、特异性强的标记物，用不同的荧光素对引物进行标记，根据扩增产物片段大小及荧光素的不同进行区分，通过样本DNA扩增产物的STR形式的分析，对该条染色体数目进行半定量的判断。另外还有一个性别染色体上特异性的AMXY位点，以增加对伴性遗传病性别的检测。

正常人的STR位点有两种表现形式：①如该STR位点是由两个不同等位基因组成的杂合子，则出现相对应的两个比率为1∶1的荧光峰；②如该STR位点是纯合子，则会出现一个高强度的荧光峰。

而三体者的STR位点有三种表现形式：①如该STR位点是由三种不同等位基因组成的杂合子，则出现相对应的三个比率为1∶1∶1的荧光峰；②如该STR位点是由两个相同的等位基因和一个不同的等位基因组成的杂合子，则出现二个比率为2∶1的荧光峰；③如该STR位点是纯合子，则会出现一个高强度的荧光峰。

因此，本发明所述的定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法是一种准确、可靠的方法，其优势能在样本量日益增大的产前检测中得到充分的体现。

本发明所述方法与试剂盒，还具有以下独创性：

(1)选择了11个在中国人群中具有高的杂合度和强的多态性、分布在21、18、13号染色体上的STR位点。每条染色体上都选用了3～4个STR位点，其中21号染色体有三个，18号染色体有四个，13号染色体有三个，选用的有检测意义、杂合度高的、合适数目的STR位点，可提高21、18、13号染色体数目的检出率，减少无法下检测结论的样本数。另有一个性别染色体上特异性位点，可增加对伴性遗传病性别的检测。在现有技术的报道中，未见这样的设计。通过这种独创的合理的设计，既有两个保证大部分样本检出的反应体系，又有一个补充的提高检出率的反应体系，使对于常见染色体三体的定量荧光PCR检测更为完整。

经验证，19例21三体和1例18三体的检出率达到了100％，没有出现漏诊和假阴性；106例正常样本的21、18、13号染色体数目的检出率分别达到了85.8％，93.4％，92.5％。

(2)对各体系中选择的STR位点设计了独特的引物。由于TaqDNA聚合酶会在部分PCR产物的3’端非特异性地添加一个碱基，导致每个等位基因有大小相差1bp的两个片段，出现肩膀峰(shoulder peak)，对结果的判定带来困难。因此我们在每对引物的反向链5’端加一段GTT CTT序列，使产物未端全部都添加一个碱基，避免相差1bp肩膀峰的出现，以保证结果判定的准确性，减少结果判定时带来的困难。每对引物的上游序列5’端用6-羧基荧光素(6-FAM)或六氯-6-甲基荧光素(HEX)进行荧光素标记，以便对产物进行区分。

附图说明

图1为本发明所述的定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法的流程图；

图2为正常样本(46，XY)扩增产物的电泳图；图中，x轴代表PCR产物的大小(bp)，y轴代表队荧光强度的大小(RIU)；其中，(A)图显示：D13S631、D13S634和MBP(B)均为杂合，呈现两个荧光强度之比为1∶1的峰而MBP(A)为纯合的单峰。AMXY(Y)在250bp处有一个与Y染色体相对应的峰AMXY(X)在432 bp处有一个与X染色体相对应的峰；(B)图显示：D21S11、D21S1411和D21S1412均为杂合，呈现两个荧光强度之比为1∶1的峰，D18S535和XHPRT为纯合的单峰；

图3为21三体(47，XY，+21)样本扩增后的电泳图；图中，x轴代表PCR产物的大小(bp)，y轴代表队荧光强度的大小(RIU)；该图显示：除D21S1412为纯合的单峰外，D21S11和D21S1411分别出现三个荧光强度之比为1∶1∶1的峰和呈现两个荧光强度之比为2∶1的峰，提示为21三体。

图4为18三体样本(47，XX，+18)扩增后的电泳图；图中，x轴代表PCR产物的大小(bp)，y轴代表队荧光强度的大小(RIU)；4-A图显示：MBP(A)、MBP(B)均为纯合，呈现单峰，AMXY在432 bp处产生一个与X染色体相对应的峰；4-B图显示：D18S535呈现两个荧光强度之比为1∶2的峰4-C图显示：增做反应体系三，D18S51和D18S386均呈现三个荧光强度之比为1∶1∶1的峰。

图5为母源性减数分裂I不分离Down’s患儿和父母扩增产物的电泳图；该图显示：患者D21S11的231 bp、235 bp，D21S1411的282 bp，286 bp和D21S1412的383bp，417 bp两个不同的等位基因均来源于母亲，由此可推断此额外的21号染色体来源于母亲减数分裂I不分离。

图6为母源性减数分裂II不分离Down’s患儿和父母扩增产物的电泳图；该图显示：患者D21S11的223bp，D21S1412的383bp均有两个相同的拷贝数，且都来源于母亲，由此可推断此额外的21号染色体来源于母亲减数分裂II不分离。

图7为妊娠早期筛查高风险绒毛样本和母亲血样扩增后的电泳图；

图8为有严重血污染的羊水样本及母亲血样扩增后的电泳图；

图9为葡萄胎绒毛及父母血样扩增后的电泳图；

图10为DMD产前性别检测羊水样本扩增后的电泳图；

图11为疑为45，XO或45，XO/46，XX样本扩增后的电泳图；

图12为G组多一条染色体绒毛样本扩增后的电泳图。

具体实施方式

本发明所述的一种定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法，如图1所示，包括以下步骤：

(1)样本的收集与处理：

包括：外周血样及羊水、脐带血、绒毛等产前样本。

采用外周血或孕妇产前样本，包括：孕16周以后采集的羊水，孕18周以后采集的脐带血，或者孕13周前采集的绒毛，采用常规方法处理；

优选的处理方法是：

外周血样本的收集与处理为：抽取1ml静脉血，加枸橼酸钠抗凝，备用。

羊水样本的收集与处理为：抽取的羊水在4000rpm离心10min，弃上清液，用生理盐水洗涤沉淀一次，4000rpm离心10min，弃上清液，收集底部的细胞，备用。

脐带血样本的收集与处理为：抽取1ml脐带血，加枸橼酸钠抗凝，备用。

绒毛样本的收集与处理为：选出具有明显分支结构的绒毛组织，用生理盐水洗涤二次，备用。

(2)DNA提取：

按常规苯酚-氯仿法提取前述样本的DNA，用紫外分光光度仪测OD₂₈₀及OD₂₆₀值以确定浓度和纯度，所需DNA纯度要求OD₂₆₀/OD₂₈₀的值为1.6～1.8；

(3)引物设计和合成及荧光素标记：

选择分布在第21、18、13号染色体和性别染色体上的11个短串联重复序列位点即STR位点，包括：21号染色体的三个STR位点：D21S11、D21S1411和D21S1412；18号染色体的四个STR位点：MBP、D18S535、D18S51和D18S386；13号染色体的三个STR位点：D13S631、D13S634和D13S317；X染色体的一个STR位点：XHPRT；另选择性别染色体上特异性的AMXY位点；上述位点可在人类基因组数据库即GDB网站(http://www.gdb.org/)中查询获得。

针对上述12个位点分别设计特异性引物，并在每对引物的反向链5’端加一段GTT CTT序列；用不同的荧光素对已合成的引物进行标记。

分为三个反应体系，见下面的表1、表2和表3。

表1检测常见染色体三体所用的STRs和荧光素(体系1)

表2检测常见染色体三体所用的STRs和荧光素(体系2)

(4)PCR扩增反应：

在PCR反应管中加入缓冲液、MgCl₂、dNTP、反应体系1或2的引物、DNA聚合酶及DNA模板。

在PCR扩增仪上按一定的反应程序进行扩增反应。

PCR扩增体系如下：

DNA模板               2～40ng

引  物                2～20pmol

热启动TaqDNA聚合酶    2U

10×PCR缓冲液         2.5μl

MgCl₂                 1.5mmol/L

dNTP                  200μmol/L

加水至总体积          25μl

PCR扩增条件为：95℃预变性11分钟，94℃变性1分钟，59℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行30个循环，最后在60℃下延伸60分钟；

(5)PCR产物的检测：

PCR产物与变性剂、分子量内标混合，高温变性后，放入遗传分析仪，进行毛细管电泳，结果用专门的软件进行定量分析。

例如，1μl PCR产物与10μ去离子甲酰胺、0.5μl 6-羧基-若丹明(ROX)-500分子量内标混合，95℃变性5分钟，立即冰浴5分钟，将待测管放入遗传分析仪，自动上样，毛细管凝胶电泳30min，结果用仪器中的软件进行定量分析。

(6)结果判定：

参照业内制订的分子遗传学检测标准，判断被检者的染色体的数目是正常的二体，还是异常的三体，或是暂不能判定其染色体数目的情况(参照临床分子遗传学协会2007年标准，http://cmgsweb.shared.hosting.zen.co.uk/)。

峰面积比率在0.8～1.4间的两个峰认为是正常的二体，而比率介于0.45～0.65或1.8～2.4的两个峰，或1∶1∶1的三个峰被认为是异常的三体。而在上述范围之外的比率和单个峰，没有检测意义。染色体上有检测意义、杂合性的STR位点达到两个或两个以上，才能对该染色体的数目下检测结论。

对于正常二体：如某条染色体上的STR位点出现纯合的单峰，或(和)比率为(0.65～0.8或1.4～1.8)的两个峰，致使比率为(0.8～1.4)两个峰的STR位点数未能达到两个或两个以上，则不能对该染色体的数目下检测结论。

对于异常三体：如该条染色体上的STR位点出现纯合的单峰，或(和)比率不在0.45～0.65或1.8～2.4的两个峰，致使比率为(0.45～0.65或1.8～2.4)两个峰的STR位点数加上比率为(1∶1∶1)的三个峰的STR位点数的总和数未能达到两个或两个以上，则不能对该染色体的数目下检测结论。

(7)对部分未能达到检测标准的样本，需增做第三反应体系中的STR位点(见表3)。

表3增做的STRs位点和荧光素

样本的收集与处理、DNA提取、PCR扩增反应、PCR产物的检测及结果的判定同反应体系1、2。

实验结果：

(1)外周血样本：

①50例正常样本的21、18、13号染色体数目的检出率分别是82％、76％和64％，增加STR位点后，18、13号染色体数目的检出率分别提高到96％和96％；假阳性率为2％；

②17例21三样本的检出率达到了100％，没有漏诊和假阴性；

③性别检测的准确率为100％；

(2)产前检测样本：

①羊水样本(54例)：

a.检测出1例21三体和1例18三体；

b.未检测出1例平衡易位和1例臂间倒位；

c.50例正常羊水样本21、18、13号染色体数目的检出率分别是90％、72％和78％，增加STR位点后，18、13号染色体数目的检出率分别提高到92％和90％，无假阳性，性别检测的准确率为100％；

其中1例有严重母血污染的羊水获得了与染色体核型分析相符的结果。

②脐带血样本(7例)：

检出1例21三体。

③绒毛样本(5例)：

a.对经腹或经阴道抽取的微量绒毛进行了个体识别，判定组织的来源，了解了染色体的情况；

b.对葡萄胎流产的绒毛组织及父母血样的分析，可确定葡萄胎遗传物质的来源及受精的类型。

(3)106例正常样本(来源于外周血、羊水、脐带血)：

21、18、13号染色体数目的检出率分别是85.8％，72.6％，71.7％，增加STR位点后，18、13号染色体数目的检出率分别提高到93.4％，92.5％，假阳性率为0.94％，性别检测的准确率达到了100％；

(4)20例三体样本(来源于外周血、羊水、脐带血)：

①检出19例21三体，1例18三体，检出率达到了100％，没有漏诊和假阴性；

②21三体样本中：单纯型占89.5％，易位型占10.5％；11例患者家庭中，除3例额外的21号染色体来源不能判定外，8例均来源于母亲，其中7例来源减数分裂I不分离，1例来源减数分裂II不分离；男性患者占78.9％，女性占21.1％。

临床应用：

(1)应用于高风险孕妇的产前检测中，可及早获得检测结果和处理(见图2、图3、图4)；

(2)通过对唐氏综合征患者及父母双方STR扩增产物的比对，可以判定额外21号染色体的来源，为唐氏综合征的发病机制的研究提供依据(见图5、图6)；

(3)应用于妊娠早期(孕9～13周)，经腹或经阴道抽取绒毛等样本量少，染色体核型分析困难的情况，有助于了解染色体的情况，还可用于个体识别(见图7)；

(4)应用于血污染的羊水样本中，通过羊水及血的比对，确定胎儿染色体的情况(见图8)；

(5)通过对葡萄胎患儿及父母STR产物的比对，可以判定葡萄胎遗传物质的来源和受精类型，为葡萄胎的深入研究和临床随访或治疗效果的前瞻性研究提供科学的依据(见图9)；

(6)可应用于某些伴性遗传病的性别检测，如DMD(进行性肌营养不良症)产前性别检测(见图10)；。

(7)对某些染色体核型分析结果不明确的情况有帮助，例如，分析45，XO或45，XO/46，XX样本(见图11)，分析G组多一条染色体绒毛样本(见图12)。

根据上述检测方法，可设计出相应的检测试剂盒。

本发明所述的一种定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的试剂盒，包括三种不同的反应体系，每个反应体系均含有以下试剂：

10×PCR缓冲液，含15mmol/L MgCl₂，反应体系中稀释为1×PCR缓冲液；

dNTP，浓度为10mmol/L，反应体系中稀释为200μmol/L；

热启动TaqDNA聚合酶，浓度为5U/μl，反应体系中用量为2U；

引物，浓度为0.5～5μmol/L，反应体系中用量为2～20pmol；

其中，所述引物为针对12个位点分别设计的特异性引物，并在每对引物的反向链5’端加一段GTT CTT序列；其中11个位点是分布在第21、18、13号染色体和性别染色体上的STR位点，包括：21号染色体的三个STR位点：D21S11、D21S1411和D21S1412；18号染色体的四个STR位点：MBP、D18S535、D18S51和D18S386；13号染色体的三个STR位点：D13S631、D13S634和D13S317；X染色体的一个STR位点：XHPRT；另选择性别染色体上特异性的AMXY位点；上述位点可在人类基因组数据库即GDB网站中查询获得；

将所述引物分为三组，分别构成三个反应体系，其中，第一体系包括以下位点的引物：MBP、AMXY、D13S631和D13S634；第二体系包括以下位点的引物：D18S535、XHPRT、D21S11、D21S1411和D21S1412；第三体系包括以下位点的引物：D18S51、D18S386和D13S317。

Claims (6)

1、一种定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.样本的收集与处理：样本为外周血或孕妇产前样本，包括：孕16周以后采集的羊水，孕18周以后采集的脐带血，或者孕13周前采集的绒毛，采用常规方法处理；

B.DNA提取：按常规苯酚-氯仿法提取前述样本的DNA，用紫外分光光度仪测OD₂₈₀及OD₂₆₀值以确定浓度和纯度，所需DNA纯度要求OD₂₆₀/OD₂₈₀的值为1.6～1.8；

C.引物设计和合成：

选择分布在第21、18、13号染色体和性别染色体上的11个短串联重复序列位点即STR位点，包括：21号染色体的三个STR位点：D21S11、D21S1411和D21S1412；18号染色体的四个STR位点：MBP、D18S535、D18S51和D18S386；13号染色体的三个STR位点：D13S631、D13S634和D13S317；X染色体的一个STR位点：XHPRT；另选择性别染色体上特异性的AMXY位点；上述位点可在人类基因组数据库即GDB网站中查询获得；

针对上述12个位点分别设计特异性引物，并在每对引物的反向链5’端加一段GTT CTT序列；用不同的荧光素对已合成的引物进行标记；

D.第一体系和第二体系的PCR扩增反应：

进行两个反应体系的PCR扩增反应，第一体系包括以下位点的引物：MBP、AMXY、D13S631和D13S634；第二体系包括以下位点的引物：D18S535、XHPRT、D21S11、D21S1411和D21S1412。

PCR扩增体系如下：

DNA模板              2～40ng

引物                 2～20pmol

热启动TaqDNA聚合酶   2U

10×PCR缓冲液        2.5μl

MgCl₂                1.5mmol/L

dNTP                 200μmol/L

加水至总体积         25μl

PCR扩增条件为：95℃预变性11分钟，94℃变性1分钟，59℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行30个循环，最后在60℃下延伸60分钟；

E.PCR产物的检测：将PCR产物按现有遗传分析仪的操作说明进行处理，根据扩增产物片段大小及荧光素的不同进行区分，通过样本DNA扩增产物的STR形式的定量分析，参照业内制订的分子遗传学检测标准，判断被检者的染色体的数目是正常的二体，还是异常的三体，或是暂不能判定其染色体数目的情况；

F.第三体系的PCR扩增反应：

对于步骤E中未能达到上述检测标准的样本，再进行第三体系的PCR扩增反应，第三体系包括以下位点的引物：D18S51、D18S386和D13S317；PCR扩增体系和PCR扩增条件均与步骤D相同；

G.PCR产物的检测：与步骤E相同。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A中，外周血样本的收集与处理为：抽取1ml静脉血，加枸橼酸钠抗凝后用于步骤B。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A中，羊水样本的收集与处理为：抽取的羊水在4000rpm离心10min，弃上清液，用生理盐水洗涤沉淀一次，4000rpm离心10min，弃上清液，收集底部的细胞用于步骤B。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A中，脐带血样本的收集与处理为：抽取1ml脐带血，加枸橼酸钠抗凝后用于步骤B。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A中，绒毛样本的收集与处理为：选出具有明显分支结构的绒毛组织，用生理盐水洗涤二次，用于步骤B。

6、一种定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的试剂盒，其特征在于：包括三种不同的反应体系，每个反应体系均含有以下试剂：

10×PCR缓冲液，含15mmol/L MgCl₂，反应体系中稀释为1×PCR缓冲液；

dNTP，浓度为10mmol/L，反应体系中稀释为200μmol/L；

热启动TaqDNA聚合酶，浓度为5U/μl，反应体系中用量为2U；

引物，浓度为0.5～5μmol/L，反应体系中用量为2～20pmol；

其中，所述引物为针对12个位点分别设计的特异性引物，并在每对引物的反向链5’端加一段GTT CTT序列；其中11个位点是分布在第21、18、13号染色体和性别染色体上的STR位点，包括：21号染色体的三个STR位点：D21S11、D21S1411和D21S1412；18号染色体的四个STR位点：MBP、D18S535、D18S51和D18S386；13号染色体的三个STR位点：D13S631、D13S634和D13S317；X染色体的一个STR位点：XHPRT；另选择性别染色体上特异性的AMXY位点；上述位点可在人类基因组数据库即GDB网站中查询获得；

将所述引物分为三组，分别构成三个反应体系，其中，第一体系包括以下位点的引物：MBP、AMXY、D13S631和D13S634；第二体系包括以下位点的引物：D18S535、XHPRT、D21S11、D21S1411和D21S1412；第三体系包括以下位点的引物：D18S51、D18S386和D13S317。

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