CN103103161A - 胎儿有核红细胞分离纯化方法及唐氏综合症筛查试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胎儿有核红细胞分离纯化方法及唐氏综合症筛查试剂盒，属于分子细胞生物学检测领域。它首先将孕妇外周血与CD45抗体标记磁珠充分混合以吸附白细胞，于磁分离器上弃之并将上层细胞转至含CD71抗体标记磁珠的试管中，充分混匀，于磁分离器上分离收获有核红细胞；再提取其基因组DNA；将SRY、DSCR和USC2特异探针以及DSCR和USC2竞争性引物及SRY特异性引物和待测DNA加入同一个竞争性荧光定量PCR反应体系，进行竞争性多重实时荧光定量PCR反应，获得DSCR和USC2的Ct，计算其差值进而判断待测样本是否DS高危。

Description

胎儿有核红细胞分离纯化方法及唐氏综合症筛查试剂盒

技术领域

本发明涉及一种有核红细胞(NRBC)分离纯化及快速基因筛查试剂盒制备，属于分子细胞生物学检测领域，具体是涉及一种孕妇外周血中的胎儿NRBC分离纯化和用NRBC进行唐氏综合症（Down’s syndrome,DS）的快速基因检测的试剂盒，可以应用于DS的产前筛查。

背景技术

唐氏综合征，又称为先天愚型，21三体综合征。在孕妇中胎儿DS的发病率为1/100，大多数在早期发生流产。在新生儿中，其发病率为1/600—800，且随着孕妇年龄的增大而递增，每个孕妇都有一定的风险，是人类最常见的一种染色体异常疾病，其临床表现为智力低下（智商在25－30%之间），先天性多发畸形，独特面容和生长发育障碍等，常伴有先天性心脏病和消化道畸形，是引起智力低下的主要病因之一。患者大多数生活不能自理，给家庭和社会带来了极大的精神负担和经济损失。

DS的发病机制是染色体减数不分离。正常情况下减数分裂时DNA复制一次，细胞连续分裂两次，第一次减数分裂配对的同源染色体分离到两个子细胞，第二次减数分裂两条姐妹染色体分别分离到两个细胞，卵子受精后从精子来的一条染色体单体和卵子的一条染色单体结合，恢复成受精卵的二倍体结构，而DS的发病原因大部分是由于第一次减数分裂时同源染色体不分离，造成子代细胞较正常细胞多一条染色体，第二次减数分裂时姐妹染色体既使分裂正常，受精后也会成为21三体，导致DS。还有少数情况是第二次减数分裂时姐妹染色体不分离所至，迄今为止，医学上对此类疾病尚无有效的预防和治疗措施，唯一可以采取的手段就是通过产前筛查、产前诊断尽可能早期发现，终止妊娠来防止患儿出生，国外许多国家在八十年代已将其列为必检项目。因此，开展唐氏综合征产前筛查、产前诊断对于提高我国人口素质具有重大意义，是优生的重要内容之一。

目前的临床上常规应用的DS筛查方法是先进行孕妇外周血中甲胎蛋白和绒毛膜促性腺激素等血清标记物含量筛查，通过专业软件运用统计学方法测算出该孕妇生DS患儿的风险率，高于设定值的孕妇建议作羊水穿刺，作染色体分析，以最终确诊。然而，上述筛查方法的在假阳性率高达99%以上时，而漏检率仍超过20%，因此远远不能满足实际需要。另外，目前确诊唐氏儿的方法是传统的羊膜腔穿刺取羊水或绒毛膜细胞培养后行染色体核型分析，这种技术诊断时间长，约3周左右，且具有一定的危险性。因此，该方法虽被认是一种较安全可靠的诊断方法，诊断精确度较高，但诊断率低，即使是高龄孕妇也不愿采用此法，病人依从性差，不能作为筛查技术应用。

因此建立无创性产前诊断取材方法，降低产前诊断的风险是产前诊断工作的一项重大课题。利用孕妇外周血胎儿细胞进行产前诊断即是最具前途的无创性产前诊断方法之一，因对于胎儿没有任何风险，对孕妇无痛苦，易被接受、推广，近年来研究十分活跃，是遗传病产前诊断的发展方向。

孕妇外周血存在胎儿细胞已被国内外许多研究所证实。孕妇外周血中胎儿细胞包括胎儿有核红细胞（Nucleated red blood cell、NRBC）、胎儿淋巴细胞、胎儿滋养细胞及粒细胞，可见通过胎盘屏障进入母体循环的胎儿细胞是一个混合群体。将适宜于进行产前诊断的靶细胞从母体外周血中分离出来是实施无创伤性产前诊断的前提。目前国内外学者的研究集中在胎儿有核红细胞上，并一致认为胎儿有核红细胞是最佳的靶细胞。理由是：NRBC具有如下特征：(1)可在妊娠早期出现，寿命短(不超过90天)，便于早期诊断；(2)可表达出特殊的抗原成分，便于富集；(3)可发生特殊的血红蛋白反应，便于鉴定；(4)携带胎儿全部遗传信息（基因组），便于遗传学和分子生物学分析。如何对上述细胞尤其是母体外周血中胎儿有核红细胞加以富集、分离并进行胎儿基因诊断，是目前产前诊断研究的一个热点。国内外学者大多利用各种胎儿细胞表面特异抗原的单克隆抗体，经流式细胞计数仪分离纯化胎儿细胞，但这些NRBC绝大多数为母源性，胎源性NRBC比例很低，Reading等报道用1.083和1.090g/ml两种不同密度梯度的Percoll分离液对母体外周血单个核细胞进行分离，经FISH和γ珠蛋白单抗标记后进行FACS证实，高密度梯度的分离液可显著提高胎儿细胞的产量。

综上所述，目前国内外关于这方面的研究都存在胎儿细胞富集、分离的数量少，纯度不够，操作过程复杂，并且应用于产前诊断的疾病范围非常有限，使得该项工作没有根本的突破。因此建立一套稳定可靠、操作简便、富集力强、分离纯度高的富集和分离胎儿有核红细胞的新方法，并用于产前多种遗传性疾病的诊断，然后能普及推广。

实时荧光定量PCR技术是近年来发展起来的能够对极微量特异DNA（基因）拷贝数进行精确定量的最先进的基因剂量定量新技术。由于唐氏综合征的每个体细胞中21号染色体为3条，而其它常染色体为2条，因此21号染色体上的单拷贝基因剂量是其它常染色体上的单拷贝基因剂量的1.5倍，因此可以选择21号染色体上的单拷贝基因如DSCR1和常染色体上的单拷贝同源序列，通过竞争性荧光定量PCR技术来检测出它们的相对拷贝数的比值来判断21号染色体的倍性，从而从微量DNA标本中检测出唐氏综合征。

将分离出的胎儿有核红细胞进行纯化，提取DNA后，再采用竞争性实时荧光定量PCR技术和多重PCR技术精确检测其21号染色体基因剂量，从而诊断唐氏综合征，必将使该遗传病的产前筛查和诊断更加快速准确和易于推广。

发明内容

本发明目的在于提供一种操作简便，能够快速分离纯化孕妇外周血存在胎儿NRBCs，进而用竞争性荧光定量共扩增聚合酶链反应技术进行唐氏综合症产前基因筛查的试剂盒。

本发明的技术方案是：一种胎儿有核红细胞的分离纯化方法：取孕期在10－18周的孕妇外周静脉血2－5ml，加入到含有10E+8个抗CD45抗体磁珠与肝素的抗凝采血管中负筛选，充分混匀以吸附白细胞，然后于磁分离器上分离后取上层血液转移到含有10E+7个抗CD71抗体磁珠与肝素的抗凝采血管中正筛选，磷酸缓冲盐溶液（PBS）充分洗涤，获得胎儿NRBC；然后于磁分离器上分离，去净PBS后加入超纯水，98℃下裂解细胞释放DNA，置－20℃冰箱保存备用。

一种唐氏综合症筛查试剂盒，包括DNA提取试剂、含有10E+8个抗CD45抗体磁珠与肝素的抗凝采血管、含10E+7个CD71抗体磁珠与肝素的抗凝采血管、DSCR和USC2特异的共用引物、双色荧光Taqman探针以及SRY基因特异的引物和探针；

所述DSCR和USC2特异的共用引物为：上游引物:5’-AAA GTT TCT TCT GGA TCT ACAG-3’（SEQ ID NO：1）；下游引物:5’-TCC TCT GTG CTC TGA GCT AAG-3’（SEQ ID NO：2）；DSCR特异TaqMan探针DSCRTM:5’-[FAM]ACA TTT TGG ATG CAC TGG GA[TAMRA]-3’（SEQ ID NO：3）；USC2特异TaqMan探针5’-[HEX]CAAAAC TCA CAG AGGGAC TC[TAMRA]-3’（SEQ ID NO：4）。

SRY基因特异的引物和探针：SRY上游引物:5’-CCA GTG GAA AAT GCT TAC TG-3’（SEQ ID NO：5）；SRY下游引物:5’-CTC TGT GCA TGG CCT GTA AT-3’（SEQ ID NO：6）；SRY特异的探针：5’-ROX-CCATTCTTCCAGGAGGCAC-TAMRA-3’（SEQ ID NO：7）。

上述试剂盒还含有1X PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶，Mg++、dNTPs及PCR反应缓冲液。

本发明的有益效果是：本发明采用抗CD45抗体磁珠负筛选，继之以抗CD71抗体磁珠正筛选，可以从母血中有效分离有核红细胞，再用高灵敏度与高准确性的竞争性荧光定量PCR技术检测DSCR区特异片段的相对剂量，辅以Y染色体特异片段SRY基因的相对剂量作为内部质控，可以快速精确地检测21号染色体的倍性。

具体实施方式

实施例1

1、胎儿NRBC的分离纯化和DNA提取

取孕期在10-18周的孕妇外周静脉血2-5ml，加入到含有10E+8个抗CD45抗体磁珠的肝素抗凝管中负筛选，充分混匀以吸附白细胞，然后于磁分离器上分离5分钟，取上层血液转移到含有10E+7个抗CD71抗体磁珠的肝素抗凝管中正筛选，磷酸缓冲盐溶液（PBS）充分洗涤，获得胎儿NRBC；然后于磁分离器上分离5分钟去净PBS后，加入超纯水，98℃下裂解细胞5min，释放DNA，置－20℃冰箱保存备用。

2、用21号染色体特异序列DSCR区段序列和2号染色体上的同源序列USC2分别合成其共用引物和片段特异的双色Taqman荧光探针以及Y染色体上特异单拷贝序列SRY基因特异的引物和探针。

上述引物和探针为专利‘一种双色竞争性荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒’（专利号CN200910020242.6）所述的竞争性PCR引物和探针及依据ENSG00000184895所设计合成的SRY特异的引物和探针：

竞争性PCR上游引物:5’-AAA GTT TCT TCT GGA TCT ACA G-3’（SEQ ID NO：1）；

竞争性PCR下游引物:5’-TCC TCT GTG CTC TGA GCT AAG-3’（SEQ ID NO：2）；

DSCR特异TaqMan探针DSCRTM:5’-[FAM]ACA TTT TGG ATG CAC TGG GA[TAMRA]-3’（SEQ ID NO：3）；USC2特异TaqMan探针5’-[HEX]CAA AAC TCA CAG AGGGAC TC[TAMRA]-3’（SEQ ID NO：4）。

SRY上游引物:5’-CCA GTG GAA AAT GCT TAC TG-3’（SEQ ID NO：5）；SRY下游引物:5’-CTC TGT GCA TGG CCT GTA AT-3’（SEQ ID NO：6）；

SRY特异的探针：5’-ROX-CCATTCTTCCAGGAGGCAC-TAMRA-3’（SEQ ID NO：7）

DSCR扩增产物171bp，序列为：AAAGTTTCTT CTGGATCTA CAGAAAAAATTTTTTTTTTT CAATCTAAAA ACTGGAAATT CTAGGGTTTT TGTACATTTTGGATGCACTG GGAATTTATT AGCACAAAAT CATTCTTTGC AACTCAAAATTCAGAAGGGA CTCTACCATAT CTTAGCTCAG AGCACAGAGGA（SEQ ID NO：8）；

USC2扩增产物169bp，序列为:AAAGTTTCTT CTGGATCTAC AGGAGTTTTTCATTTCCAAT CTAAAAACTA GAAGCTCTAG CATTTTGTACA TTTTTTGTTGTTGCACTGGAA GTTTAACTATT GGCACAAAAT CATTCTTCAAA ACTCACAGAGGGACTCTGCC ATTACTTAGC TCAGAGCACA GAGGA（SEQ ID NO：9）；

SRY特异扩增产物：CCAGTGGAAA ATGCTTACTG AAGCCGAAAA ATGGCCATTCTTCCAGGAGG CACAGAAATT ACAGGCCATG CACAGAG（SEQ ID NO：10）。

3．双色竞争性荧光定量PCR及多重PCR反应

50ul反应体系中含上述四个引物各10pmol，各探针各10pmol，待检测DNA100ng，1X PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶1.5u，Mg++终浓度2.0mmol/L，dNTPs终浓度0.2mmol/L然后在FTC2000实时荧光定量PCR仪上96℃下预变性2min，然后94℃变性10sec，50℃复性30sec，60℃延伸40sec，共45个循环，并在60℃延伸时采集荧光。每一个标本重复三次实验，取各标本的Ct值的平均值。

通过对26名唐氏综合征患者（男性17名，女性9名）和48位正常受试者（男性23名，女性25名）的多重PCR反应实验表明，唐氏综合征患者的USC2与DSCR1片段的Ct值的差值为0.79±0.26；其而正常人的USC2与DSCR1的差值为0.12±0.06，二者有显著性差异。女性患者和女性正常人的SRY基因检测均为阴性；男性患者和正常人的SRY基因检测为阳性，其Ct值与USC2的Ct值的差值为1.14±0.17。如果设定以正常人的USC2与DSCR1的差值的均数加其三倍的标准差为判断是否为正常的标准，则如果待测标本的USC2与DSCR1的差值大于0.3，可判断为DS高危；由于男性患者和正常人的SRY基因Ct值与USC2的Ct值的差值为1.14±0.17，可以对DS进一步确认。

Claims (3)

1.一种胎儿有核红细胞的分离纯化方法，其特征是，取孕期在10－18周的孕妇外周静脉血2－5ml，加入到含有10E+8个抗CD45抗体磁珠与肝素的抗凝采血管中负筛选，充分混匀以吸附白细胞，然后于磁分离器上分离后取上层血液转移到含有10E+7个抗CD71抗体磁珠与肝素的抗凝采血管中正筛选，磷酸缓冲盐溶液充分洗涤，然后于磁分离器上分离，去净磷酸缓冲盐溶液后加入超纯水，98℃下裂解细胞释放DNA，置－20℃冰箱保存备用。

2.一种使用权利要求1分离纯化的有核红细胞进行唐氏综合症筛查的试剂盒，其特征是，包括DNA提取试剂、含有10E+8个抗CD45抗体磁珠与肝素的抗凝采血管、含10E+7个CD71抗体磁珠与肝素的抗凝采血管、DSCR和USC2特异的共用引物、双色荧光Taqman探针以及SRY基因特异的引物和探针；

所述DSCR和USC2特异的共用引物为：上游引物:5’-AAA GTT TCT TCT GGA TCT ACAG-3’；下游引物:5’-TCC TCT GTG CTC TGA GCT AAG-3’；DSCR特异TaqMan探针DSCRTM:5’-[FAM]ACA TTT TGG ATG CAC TGG GA[TAMRA]-3’；USC2特异TaqMan探针5’-[HEX]CAAAAC TCA CAG AGG GAC TC[TAMRA]-3’；

所述SRY基因特异的引物和探针：SRY上游引物:5’-CCA GTG GAA AAT GCT TACTG-3’；SRY下游引物:5’-CTC TGT GCA TGG CCT GTA AT-3’；SRY特异的探针：5’-ROX-CCATTCTTCCAGGAGGCAC-TAMRA-3’。

3.如权利要求2所述的唐氏综合症筛查试剂盒，还含有1X PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶，Mg++、dNTPs及磷酸缓冲盐溶液。