CN110106237B

CN110106237B - Dys14多态性检测引物及试剂盒

Info

Publication number: CN110106237B
Application number: CN201910408690.7A
Authority: CN
Inventors: 段佳丽
Original assignee: Rgi Fuzhou Genetic Medicine Laboratory Co ltd
Current assignee: Fujian Aji'an Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2039-05-16
Also published as: CN110106237A

Abstract

本发明公开了一种DYS14多态性检测引物及试剂盒，属于体外核酸检测领域，所述DYS14多态性检测引物包括：一对DYS基因引物，一对SRY基因引物和一对GAPDH内参基因引物，所述DYS14多态性检测试剂盒包括上述DYS14多态性检测引物。本发明提供的DYS14多态性检测引物检测限度为20copies/ml，游离DNA小于170bp，更适用于检测游离DNA；同时检测DYS14和SRY 2个基因，检测结果准确性更高；本发明提供的包含DYS14多态性检测引物试剂盒不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。

Description

DYS14多态性检测引物及试剂盒

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，具体涉及一种DYS14多态性检测引物及试剂盒。

背景技术

妊娠期间胎儿血循环和母体血循环是相互独立的，它们之间通过胎盘进行物质交换，交换部位主要在血管和体膜，血管和体膜由和体滋养细胞、和体滋养细胞基底膜、绒毛间质、毛细血管基底膜和毛细血管内皮细胞5层组成的薄膜。然而这种屏障具有不完整性。研究证实在母体和胎儿之间存在胎盘面的胎儿向母体输血，少量胎儿细胞通过胎盘进入母体血液循环，所以孕妇外周血中存在胎儿细胞及胎儿游离DNA。近年来，从孕妇外周血中直接提取胎儿游离DNA进行产前诊断日益受到重视，并且发现随着妊娠月份的增长，孕妇外周血中的胎儿游离DNA的含量明显升高。这种孕妇外周血中胎儿游离DNA检测对于发展非侵入性的产前诊断具有很重要的临床意义，尤其与预后和治疗指导方面相联系。

母血中胎儿基因检测在产前基因诊断中有着明显的优势，采用孕妇血液作为检测材料，对胎儿没有创伤性，可在孕早期做出诊断，克服了传统产前诊断技术在取材以及检测时间等方面的缺陷和限制，并可为一些遗传性疾病的产前治疗提供依据。可对性别分化异常、性连锁遗传病及部分异常妊娠的诊断提供依据，开创一种新的无创性产前基因诊断的方法。

体外受精和胚胎移植(IVF-ET)俗称"试管婴儿"。是一种特殊的临床辅助生殖技术，卵子和精子在体外完成受精，然后把早期胚胎移植到女性的子宫中，在子宫中孕育，在胚胎发育成桑椹胚后，桑椹胚进一步分裂，同时宫腔中的分泌液通过透明带渗入细胞而逐渐形成一囊腔，成为囊胚腔。包围在囊胚腔外的为扁平细胞层，该层细胞个体较小的，将演变为胎盘的一部分，称为滋养层细胞。由于滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘，所以做基因诊断时，通常可取少量滋养层细胞检测，这样不会影响正常胎盘的形成，更不会影响胎儿发育。

DYS14基因是Y染色体短臂上特异的单拷贝序列，它与常染色体无交叉序列，不易出现假阳性。通过对Y染色体上的特异序列DYS14基因进行检测，判定胎儿性别，从而对某些遗传病作出产前诊断，采取措施预防遗传病患儿的出生。

用于母血中胎儿游离DNA检测的方法很多，由于胎儿游离DNA的含量极少，常规扩增效果较差，利用实时荧光定量技术有助于提高检测的敏感性。凭借其具有的实时监测、快速、灵敏和精确等优点，已经逐步取代常规技术。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种从孕妇血浆样本和囊胚滋养层细胞中进行DYS14多态性检测的引物及试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：DYS14多态性检测引物，包括：

一对DYS基因引物，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

一对SRY基因引物，其序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

一对GAPDH内参基因引物，其序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供一种DYS14多态性检测试剂盒，包括上述DYS14多态性检测引物。

本发明的有益效果在于：本发明提供的DYS14多态性检测引物检测限度为20copies/ml，游离DNA小于170bp，针对游离DNA片段大小设计检测引物目的片段小于170bp，更适用于检测游离DNA；荧光定量PCR曲线结合溶解曲线结果更易判读，准确可靠；在人类Y染色体上决定睾丸分化基因SRY上设计引物，同时检测DYS14和SRY2个基因，检测结果准确性更高；本发明提供的包含DYS14多态性检测引物的试剂盒不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。

附图说明

图1所示为本发明具体实施方式的DYS14多态性检测试剂盒检测6例孕妇血浆游离DNA样本的DYS14扩增曲线图；

图2所示为本发明具体实施方式的DYS14多态性检测试剂盒检测6例孕妇血浆游离DNA样本的DYS14融解曲线单峰图；

图3所示为本发明具体实施方式的DYS14多态性检测试剂盒检测6例孕妇血浆游离DNA样本的SRY扩增曲线图；

图4所示为本发明具体实施方式的DYS14多态性检测试剂盒检测6例孕妇血浆游离DNA样本的SRY融解曲线单峰图；

图5所示为本发明具体实施方式的DYS14多态性检测试剂盒检测10例囊胚滋养层细胞WGA纯化产物样本的DYS14扩增曲线图；

图6所示为本发明具体实施方式的DYS14多态性检测试剂盒检测10例囊胚滋养层细胞WGA纯化产物样本的DYS14融解曲线单峰图；

图7所示为本发明具体实施方式的DYS14多态性检测试剂盒检测10例囊胚滋养层细胞WGA纯化产物样本的SRY扩增曲线图；

图8所示为本发明具体实施方式的DYS14多态性检测试剂盒检测10例囊胚滋养层细胞WGA纯化产物样本的SRY融解曲线单峰图；

图9所示为本发明具体实施方式的DYS14多态性检测试剂盒检测10例囊胚滋养层细胞WGA纯化产物样本的GAPDH扩增曲线图；

图10所示为本发明具体实施方式的DYS14多态性检测试剂盒检测10例囊胚滋养层细胞WGA纯化产物样本的GAPDH融解曲线单峰图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于：在人类Y染色体上决定睾丸分化基因SRY上设计引物，同时检测DYS14和SRY2个基因。

本发明的DYS14多态性检测引物，包括：

一对DYS基因引物，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

一对SRY基因引物，其序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

具体引物的序列如表1所示：

表1

	名称	序列(5’-3’)	碱基数
				SEQ ID NO：1	DYS14-F	GTCAGGTGAGCCGTTAGTTGG	21
SEQ ID NO：2	DYS14-R	AAGGAGCCTCAGTTTCTACATTTCT	25
				SEQ ID NO：3	SRY-F	ATAAGTATCGACCTCGTCGGAAG	23
SEQ ID NO：4	SRY-R	ACGATTAAGTCAAATTCGC	19
				SEQ ID NO：5	GAPDH-F	GTGAAGCAGGCGTCGGAG	18
SEQ ID NO：6	GAPDH-R	GCGTCAAAGGTGGAGGAGTG	20

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明提供的DYS14多态性检测引物检测限度为20copies/ml，游离DNA小于170bp，针对游离DNA片段大小设计检测引物目的片段小于170bp，更适用于检测游离DNA；荧光定量PCR曲线结合溶解曲线结果更易判读，准确可靠；在人类Y染色体上决定睾丸分化基因SRY上设计引物，同时检测DYS14和SRY2个基因，检测结果准确性更高；本发明提供的包含DYS14多态性检测引物的试剂盒不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。

进一步的，所述DYS14多态性检测试剂盒还包括qPCR混合液，阳性对照、阴性对照和灭菌水。

进一步的，所述qPCR混合液包括PCR缓冲液、ROX、脱氧核苷三磷酸和Tap聚合酶。

进一步的，所述阳性对照为人类男性基因组，所述阴性对照为人类女性基因组。

本发明的实施例一为：

一种DYS14多态性检测试剂盒，具体包括以下成分，见表2：

表2

上述DYS14多态性检测试剂盒的储存条件及有效期为：于-18℃以下避光保存，有效期为12个月，试剂盒内各组分有效期与试剂盒相同。反复冻融建议不超过3次，建议采用4℃以下温度运输。

上述DYS14多态性检测试剂盒使用的仪器有：ABI 7500/7500 Fast、ViiA 7^TM、QuantStudio^TM系列、Stratagene

/3005P^TM/4000。/>

本发明的实施例二为：

1、样本采集

(1)孕妇血浆游离DNA，使用游离DNA样本保存管采集孕妇外周血(江苏康为世纪生物科技有限公司的游离DNA样本保存管(5ml)，CW2817)，离心分离出的血浆使用试剂盒(广州美基生物科技有限公司的游离核酸提取试剂盒MagPure Circulating DNA LQ Kit(400μl)，12919W)进行游离核酸提取，操作步骤参考游离核酸提取试剂盒说明书，2-3管样本合为一管洗脱，终体积30μl。

(2)囊胚滋养层细胞WGA产物纯化，每个样本取30μl，1倍体积磁珠(AMPure XP磁珠(Beckman))进行纯化，终体积30μl。

2、PCR反应体系配制及加样

计算出所需反应体系份数n(n＝样本数+阴性对照+阳性对照+空白对照)，反应体系配制参照取出实施例1的DYS14多态性检测试剂盒的qPCR混合液、DYS14引物、SRY引物、内参引物短暂离心使溶液集中管底，按照表3计算出各组份所需要用量，PCR反应体系A-C各配置n管，取适当体积于离心管中，混匀后分装于n个PCR反应管中，每管加入10.5μL，转移至样本处理区，贮存于-18℃以下直至样本提取完成。

阳性对照：为男性基因组DNA，浓度为0.2ng/μL。

阴性对照：为女性基因组DNA，浓度为0.2ng/μL。

表3

3、PCR扩增检测

将上述PCR反应管放入荧光PCR仪中，程序设置如表4所示，溶解曲线分析如表5所示：

表4

荧光信号收集在阶段365℃40s(*标记)，收集的荧光信号。

表5

荧光信号收集在阶段2 60℃升温至95℃30s(*标记)，收集的荧光信号。

4、结果分析

4.1试剂盒有效性判定

扩增反应完后，通过收集得到的荧光信号进行检测结果分析。

(1)阳性对照：

反应体系A(DYS14基因)Ct值≤24；Tm值82.3℃±1℃；

反应体系B(SRY基因)Ct值≤25；Tm值82.6℃±1℃；

反应体系C(对照基因)Ct值≤27；Tm值82.2℃±1℃；

扩增曲线均有明显指数增长期。

(2)阴性对照

反应体系A(DYS14基因)无扩增曲线或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，Ct值>33或无值；

反应体系B(SRY基因)无扩增曲线或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，Ct值>33或无值；

反应体系C(对照基因)Ct值27±1；Tm值82.2℃±1℃，且扩增曲线有明显指数增长期。

(3)空白对照

反应体系A(DYS14基因)、反应体系B(SRY基因)、反应体系C(对照基因)均无扩增曲线或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，Ct值>33或无值；

本说明书中的Ct值和Tm值是在特定ABI 7500仪器上所得的常见值作为参考值。当使用其他仪器时，Ct值和Tm值可能略有变动，以当次试验阳性对照所得的Tm值为准。

Ct值和Tm值以仪器自动判读所得为准，当仪器给出一个以上Tm值时，参考阳性对照及阴性对照的峰型选择有效Tm值。当出现仪器无法自动给出Ct值和Tm值得情况时，可通过调整基线或直接人工判读的方法获得Tm值。

如果上述条件之一不符，重新检测。

4.2样本有效性判定

对照基因：Ct值≤30，融解曲线与阳性对照、阴性对照一致

如样本对照基因不满足以上要求，视为样本无效。满足样本有效性条件方可进行后续分析判断。

4.3检测结果判定

根据阳性样本扩增曲线和融解曲线对样本实验结果进行分析。

(1)检测样本对照基因Ct值≤30，融解曲线与阳性对照、阴性对照一致；

检测样本SRY基因Ct值≤32，融解曲线与阳性对照一致；

检测样本DYS14基因Ct值≤33，融解曲线与阳性对照一致，判断为阳性；

(2)检测样本对照基因Ct值≤30，融解曲线与阳性对照、阴性对照一致；

检测样本SRY基因Ct值≤32，融解曲线与阳性对照不一致；

检测样本DYS14基因Ct值≤33，融解曲线与阳性对照不一致，判断为阴性或低于本试剂盒检测下限。

(3)检测样本对照基因Ct值≤30，融解曲线与阳性对照、阴性对照一致；

检测样本DYS14基因Ct值≥32，融解曲线与阳性对照不一致；

检测样本SRY基因Ct值≥33，融解曲线与阳性对照不一致，判断为阴性或低于本试剂盒检测下限。

本发明的实施例三为：

取6例孕妇血浆游离DNA样本，使用实施例二的方法进行检测，检测结果与B超结果比较，结果如表6和图1-4所示；

表6

检测结果与B超结果一致性为100％。

本发明的实施例四为：

取10例WGA产物(7例男性样本，3例女性样本)，使用实施例二的方法进行检测，检测结果如图5-10所示，结果准确性为100％。

综上所述，本发明提供的DYS14多态性检测引物检测限度为20copies/ml，游离DNA小于170bp，针对游离DNA片段大小设计检测引物目的片段小于170bp，更适用于检测游离DNA；荧光定量PCR曲线结合溶解曲线结果更易判读，准确可靠；在人类Y染色体上决定睾丸分化基因SRY上设计引物，同时检测DYS14和SRY2个基因，检测结果准确性更高；本发明提供的包含DYS14多态性检测引物的试剂盒不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

/>

/>

序列表

<110> 阿吉安（福州）基因医学检验实验室有限公司

<120> DYS14多态性检测引物及试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtcaggtgag ccgttagttg g 21

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaggagcctc agtttctaca tttct 25

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ataagtatcg acctcgtcgg aag 23

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgattaagt caaattcgc 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtgaagcagg cgtcggag 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcgtcaaagg tggaggagtg 20

Claims

1.用于胎儿游离DNA检测的DYS14多态性检测引物，其特征在于，包括：

一对DYS基因引物，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

一对SRY基因引物，其序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

2.用于胎儿游离DNA检测的DYS14多态性检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的DYS14多态性检测引物。

3.根据权利要求2所述的用于胎儿游离DNA检测的DYS14多态性检测试剂盒，其特征在于，还包括qPCR混合液，阳性对照、阴性对照和灭菌水。

4.根据权利要求3所述的用于胎儿游离DNA检测的DYS14多态性检测试剂盒，其特征在于，所述qPCR混合液包括PCR缓冲液、ROX、脱氧核苷三磷酸和Tap聚合酶。

5.根据权利要求3所述的用于胎儿游离DNA检测的DYS14多态性检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为人类男性基因组，所述阴性对照为人类女性基因组。