CN110760576B - 用于男性生育力诊断的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分子标记物miR‑122,核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。还公开了一种用于男性生育力诊断试剂盒,用于测定精液中所述的分子标记物miR‑122表达量的试剂，通过所述miR‑122的表达量提示受精率和囊胚形成率。本发明通过检测精液中miR‑122的表达量，可以判断受精、胚胎发育及临床妊娠情况，为男性生育力判断提供了一种简便易操作，灵敏度高的方法，可作为评估男性生育能力的新指标。

Description

用于男性生育力诊断的试剂盒

技术领域

本发明涉及医疗检测领域，特别是涉及一种用于男性生育力诊断的试剂盒。

背景技术

不育症是一种特殊的生殖健康缺陷，常给家庭、社会造成严重影响。全世界不孕不育的发病率高达15％，在不孕不育患者中，单纯男性因素导致的不育症占20％，男女双方因素占30-40％。准确判断男性生育力是诊断不育及合理治疗的前提。精子浓度、精液体积、精子总数、精子活力、精子形态等常规精液指标是评估男性生育力的“金标准”，但研究指出常规精液参数并不能准确反映男性生育状态，约15％常规参数正常的患者患有不育症。目前，不育症评估缺乏分子诊断指标，因此，有必要寻找指示男性生育力的新指标。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种分子标记物miR-122，通过该分子标记物的表达量，可判断受精、胚胎发育及临床妊娠情况。

本发明还有一个目的是提供一种用于男性生育力诊断的试剂盒，采用该试剂盒的试剂可检测分子标记的表达量。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种分子标记物miR-122，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的是，所述miR-122来源于精液。

本发明还提供一种用于男性生育力诊断的试剂盒,用于测定精液中所述的分子标记物miR-122表达量的试剂，通过所述miR-122的表达量提示受精率和囊胚形成率。

优选的是，所述试剂盒包括反转录体系、PCR反应体系和内参U6。

优选的是，所述反转录体系每25μL包含：5×pap/RT Buffer 5μL，RTase Mix 1μL，25U/μL PoLy A PoLymerase 1μL，模板RNA 18μL。

优选的是，反转录的反应条件为：37℃60min，85℃5min，将RNA反转为cDNA。

优选的是，PCR扩增体系每20μL包括：2×qPCR Mix 10μL，通用引物2μL，正向引物2μL,50×ROX染料0.1μL，cDNA 2μL，ddH₂O 3.9μL。

优选的是，扩增条件为：95℃10min；95℃10sec，60℃30sec，45个循环。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供了一种分子标记miR-122，该分子标记miR-122来源于精液中，并且可以根据其表达量无创性评估受精能力、胚胎体外发育能力在内的男性生育力，为不育患者的早期发现、诊断和治疗提供依据。

本发明公开的用于男性生育力诊断的试剂盒，具体以定量PCR为基础，从精液中直接提取miR-122，检测其表达量，用于结果评估，相比传统精子活力和计数方法，本发明可以更快速和准确的评估男性生育力，有利于为男性生育力医学实验提供一种新的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明miR-122在妊娠与未妊娠患者配偶精子中的表达量的箱线图；

图2为本发明miR-122用于诊断男性生育力灵敏性和特异性的受试者工作特征曲线图；

图3为本发明miR-122表达与精子受精能力的相关性分析结果；

图4为本发明miR-122表达与D3优胚率的相关性分析结果；

图5为本发明miR-122表达与囊胚形成率的相关性分析结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

用于男性生育力诊断的试剂盒的临床使用方法

1、研究对象收集：

主要以行辅助生殖技术的夫妇为研究对象，纳入标准：①精液常规参数基本正常，可行IVF技术助孕的患者(前向精子运动总数≥20×10⁶，精子正常形态比例≥1％)；②女方输卵管因素不孕夫妇。患者均知情同意。

2、RNA提取反转录及定量PCR：

患者禁欲2-7天后手淫采集精液，应用试剂盒(Invitrogen)提取精子总RNA，DEPC水溶解，测定总RNA浓度及纯度。

采用qRT-PCR检测miR-122及内参U6表达。其中，25μL反转录体系如表1所示。

表1

试剂	用量
		5×pap/RT Buffer	5μL
RTase Mix	1μL
		25U/μL PoLy A PoLymerase	1μL
模板RNA	18μL

反转录反应条件：37℃60min，85℃5min，将RNA反转为cDNA。

定量PCR采用20vL反应体系，如表2所示。

表2

试剂	用量
		2×qPCR Mix	10μL
通用引物(2μM，SEQ ID NO：2)	2μL
		正向引物(2μM，SEQ ID NO：3)	2μL
50×ROX染料	0.1μL
		cDNA	2μL
ddH<sub>2</sub>O	3.9μL

定量PCR扩增条件：95℃10min；95℃10sec，60℃30sec，45个循环。

应用2^-ΔΔCT方法计算miR-122的相对表达量，ΔΔCT＝(CT_miRNA-CT_U6)未妊娠患者-(CT_miRNA-CT_U6)妊娠患者。

RT-qPCR方法检测miR-122、U6表达量，采用2^-ΔΔCT方法分析miR-122在妊娠、未妊娠患者配偶精子中的表达量，结果表明未妊娠患者配偶精子中miR-122表达量显著低于妊娠患者(1.03±0.29vs.1.54±0.35，P＜0.01)。采用MedCaLc软件绘制箱线图，各样本miR-122表达量分布如图1所示，箱线图由上到下依次指示最大值、第1个四分位数、中位数、第3个中位数、最小值。

3、利用MedCaLc软件绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积，评价miR-122诊断男性生育力的灵敏性及特异性。

如图2所示，结果表明miR-122的ROC曲线下面积为0.862(95％CI＝0.748-0.976)，灵敏度为84.62％，特异度为76.47％，临界值为1.27，约登指数为0.6109。

4、精液处理、受精及胚胎发育评估

采用Spermgrad(VitroLife)密度梯度离心法优化精液，在离心管中加入1.5mL45％Spermgrad梯度液，随后在离心管底部加入1.5mL 90％Spermgrad梯度液，保持梯度液界面分层，将精液缓慢加至45％梯度液界面上方(如精液体积＞3.0mL则分管配置)。300g离心15min后弃上清，将沉淀转移至2mL G-IVF PLus(VitroLife)，混匀后200g离心10min，弃上清，将沉淀转移至2mL G-IVF PLus中，混匀后200g离心10min，弃上清，加入0.5mL G-IVF PLus，混匀，吸取适量混悬液镜检观察精子浓度与活力并记录，将处理后的精液放入培养箱待用。

女方患者HCG注射39-40h加精，取出处理好的精子，按受精浓度10-20万/mL，计算每位患者600μL受精液中所需的原精量。受精当天记为D0，受精后16-18h(D1)观察受精情况，有原核出现及D2卵裂的0PN胚胎记为受精，双原核为正常受精。受精后观察胚胎发育情况，D2记录卵裂情况，D3记录优胚形成数量，D5、D6记录囊胚形成数量。

卵裂期胚胎评分标准：

Ⅰ级：卵裂球数目符合发育时段(D2为3-4个细胞，D3为7-9个细胞)，胚胎卵裂球连接紧密，且均匀、规则、有中等折光性，透明带连续完整，碎片≤5％；

Ⅱ级：卵裂球形态规则或轻度不规则，均匀或稍欠均匀，折光度有轻微变化，碎片≤20％；

Ⅲ级：卵裂球数目与发育时段不符，胚胎内碎片少于50％，碎片外卵裂球形态同Ⅱ级，具有一定折光性，透明带完整；

Ⅳ级：胚胎内碎片≥50％，碎片外卵裂球具生存活力。

D3优质胚胎定义：正常受精胚胎，卵裂球数目≥7个，形态评分为Ⅰ级或Ⅱ级的胚胎。

如图3所示，采用SPSS软件分析miR-122表达量与受精率的相关性。结果表明miR-122表达量与受精率显著正相关(r＝0.509，P<0.01)。

如图4所示，采用SPSS软件分析miR-122表达量与胚胎发育能力的相关性。结果表明miR-122表达量与D3优质胚胎形成率无明显相关性(r＝0.089，P>0.05)，但与囊胚形成率呈显著正相关(r＝0.452，P<0.01)(如图5所示)。

通过上述实施例1可以看出，检测男性精子miR-122含量，无创性地评估包括受精能力、胚胎体外发育能力在内的男性生育力，为不育患者的早期发现、诊断及治疗提供依据。此方法操作简单、灵敏度高，可作为评估男性生育能力的新指标。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于测定精液中miR-122表达量的试剂在制备提示受精率和囊胚形成率用于男性生育力诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括用于测定精液中miR-122表达量的试剂，通过所述miR-122的表达量提示受精率和囊胚形成率。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括反转录体系、PCR反应体系和内参U6。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述反转录体系每25μL包含：5×pap/RTBuffer 5μL，RTase Mix 1μL，25U/μL PoLy A PoLymerase 1μL，模板RNA18μL。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，反转录的反应条件为：37℃60min，85℃5min，将RNA反转为cDNA。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，PCR扩增体系每20μL包括：2×qPCR Mix 10μL，通用引物2μL，正向引物2μL，50×ROX染料0.1μL，cDNA 2μL，ddH₂O 3.9μL。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，扩增条件为：95℃10min；95℃10sec，60℃30sec，45个循环。

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