CN105018589A - 一种y染色体微缺失多重实时荧光pcr检测试剂盒及扩增引物对和探针 - Google Patents

Abstract

本发明涉及为生物分子诊断试剂公开了一种Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，包括以下用于检测SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、SY255、SY157、SY242、SY1191和SY1291的扩增引物对和荧光探针；还包括用于检测以下位点的扩增引物对和荧光探针：(1)SY82、SY88、SY1064和SY1065位点中的至少一个；(2)SY105、SY121、SY143和SY153位点中的至少一个；(3)SY160；(4)用于检测AZFd区域缺失的SY145和SY152位点中的至少一个。本发明最多可检测21个STS位点，缺失覆盖率大于99％，采用多重实时荧光定量PCR技术平台，能够快速、高通量的检测出Y染色体微缺失位点，区分AZF？a、b、c、d区是全部缺失还是部分缺失，获得更全面的Y染色体微缺失信息。

Description

一种Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒及扩增引物对和探针

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体为生物分子诊断试剂，尤其是检测Y染色体微缺失的试剂盒。

背景技术

近年来，我国育龄人口中不孕不育人数呈现出大规模增长，数量已超过2000万。20年前我国育龄人群中不孕不育率仅为3％，而如今已经攀升到15％，这其中由男性不育引起的不孕占到50％，比10年前增加了15％。

由于男性不育症临床表现、治疗方法和治疗效果根据发病原因的不同而存在着较大的差异，因此男性不育症治疗的重点是要找到具体的致病原因，进行病因治疗。男性不育症的病因有：泌尿生殖道畸形，生殖道感染，精索静脉曲张，内分泌紊乱，遗传学因素和免疫因素等。但是目前仍有50％的患者找不到明确原因，属于特发性男性不育，其体检及内分泌检查均正常，精液分析显示有少精、弱精和畸形精子，被称为中重度少弱精症。随着近几年临床诊疗技术的发展，人们发现这种疾病的发生往往与个体存在着某些染色体或遗传上的缺陷有一定关系。

Y染色体不仅是性别决定的关键因素，也在人类精子发生过程中发挥重要作用。1976年，Tiepolo等首先报道Y染色体长臂(Yq11)常染色质区存在精子发生相关基因，称为无精子因子(Azoospermia factor,AZF)。并由此揭开了研究Y染色体微缺失与男性不育关系的序幕。国外研究报道，少精子症和无精子症患者约有8.2％的Y染色体微缺失率。其中AZF区域微缺失与男性异常生精表型密切相关，被认为是导致男性无精症与严重少精症的最常见分子遗传学机制。AZF分为a、b、c、d四个亚区，其中与精子发生相关的基因有DAZ(deleted inazoospermia)、DFFRY(the Y-linked homologue of the DFFRX)、DBY(dead boxon the Y)、RBMY(RNA-binding motif Y)等。DFFRY与DBY是a区的候选基因，而RBMY和DAZ则分别是b区和c区的候选基因。d区位于b区和c区之间，目前尚无任何候选基因。

目前Y染色体微缺失常用的检测方法主要是多重PCR扩增后电泳检测序列位点标签(Sequence tagged sites，STS)或候选基因。尽管目前该方法已经成为Y染色体微缺失检测的行业标准，然而仍然存在许多不足：首先电泳的方法容易造成PCR产物污染导致假阳性；其次，该方法耗时、工序多，不利于大批量样本的检测。

2004年欧洲男科学研究会和欧洲质量监控组织公布的Y染色体微检测指南中推荐在每个AZF区域使用2个STS：sY84(AZFa)、sY86(AZFa)、sYl27(AZFb)、sY134(AZFb)、sY254(AZFc)，sY255(AZFc)。这也是目前市面上许多商业试剂盒所检测的位点。然而，仅仅对这6个STS检测会出现较大比例的假阴性，对Y染色体微缺失的覆盖率只有95％,且不能判断AZF各亚区的缺失类型，从而不能很好的指导临床干预及治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒，该试剂盒能稳定、快速、准确、高通量、高覆盖地对男性Y染色体微缺失基因进行检测，且其对临床干预或治疗的指导作用更加明确。

本发明提供了一种检测试剂盒，其中包括了针对2004年欧洲男科协会(EAA)和欧洲分子遗传实验质控协作网(EMQN)联合发布的Y染色体微缺失检测指南中的所有检测位点的引物序列(SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、SY255)，还包括了4个中国人群缺失较多的STS位点(SY157、SY242、SY1191、SY1291)，并包括了若干扩展分析位点。在初步筛查后，进行扩展分析，可以真正确定a、b、c区缺失发生的情况——部分还是完全缺失。

用于多重实时荧光PCR检测Y染色体微缺失的组合物，包括以下特征性扩增引物对及荧光探针：用于检测a区域的SY84和SY86的扩增引物对和荧光探针，检测b区域的SY127和SY134的扩增引物对和荧光探针，检测c区域的SY254、SY255、SY157、SY242、SY1191、SY1291的扩增引物对和荧光探针；还包括用于检测以下位点的扩增引物对和荧光探针：

(1)用于检测a区域(AZFa)缺失的SY82、SY88、SY1064和SY1065位点中的至少一个；和

(2)用于检测b区域(AZFb)缺失的SY105、SY121、SY143和SY153位点中的至少一个；和

(3)用于检测c区域(AZFc)缺失的SY160；和

(4)用于检测d区域(AZFd)缺失的SY145和SY152位点中的至少一个。

优选的，还包括检测c区域的SY157、SY242、SY1191、SY1291位点的扩增引物对和荧光探针。

上述的荧光探针是连接荧光基团和淬灭基团的核苷酸，所述的荧光基团选自ALEX-350、FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS RED、CY3、CY5和CY5.5。淬灭基团选自DABCYL、BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA和ECLIPE。荧光探针的类型可选用TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、分子信标、改良分子信标、双链荧光置换探针、LightCycler探针以及双环探针，优选为TaqMan-MGB探针。

优选的，所述各位点的扩增引物对和探针序列分别为：

特异性扩增Y染色体AZF a区SY82位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：CTTTCTGTTTCTGAGTTGTTTTACTTGAG(SEQ ID No.1)，Tm58℃，下游：GGATGATGGGATGTTTGGATAAATA(SEQ ID No.2)，Tm59℃；SY82荧光探针的核苷酸序列：AATTGCCTCCAGTTCTA(SEQ ID No.45)，Tm69℃。

特异性扩增Y染色体AZF a区SY84位点的引物对，其核苷酸序列如SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所示；上游：CCCTATTTGTTTTAAGGTGCCATTC(SEQID No.3)，Tm60℃，下游：ATCTCCAGCCCATGTTTCGT(SEQ ID No.4)，Tm58℃；SY84荧光探针的核苷酸序列：CTCTACCTCCTTCCC(SEQ IDNo.46)，Tm69℃。

特异性扩增Y染色体AZF a区SY86位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：GGTAATGGCTTCCCAGAGTTGT(SEQ ID No.5)，Tm58℃，下游：TCTAGCCTCAAGGACTGTGAGAATC(SEQ ID No.6)，Tm59℃；SY86荧光探针的核苷酸序列：CCAAAGACTGGGCCC(SEQ ID No.47)，Tm70℃。

特异性扩增Y染色体AZF a区SY88位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：TAGCATTAATAGACCACCATGTTGTTC(SEQ ID No.7)，Tm59℃，下游：CCTGCCTCAGCTTCCCAAA(SEQ ID No.8)，Tm60℃；SY88荧光探针的核苷酸序列：AGTGGCTCATGTCTGTAAT(SEQ ID No.48)，Tm69℃。

特异性扩增Y染色体AZFb区SY105位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：GGTGTTGTTGGTACGAGCATAAGA(SEQ ID No.9)，Tm59℃，下游：ATGGATATTGCAAGTGATGTGAAAG(SEQ ID No.10)，Tm58℃；SY105荧光探针的核苷酸序列：AACCCCAGAGAGATCA(SEQ ID No.49)，Tm70℃。

特异性扩增Y染色体AZFb区SY121位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：TTGTGATCTTTGGCCCTGAAC(SEQ ID No.11)，Tm59℃，下游：GTAAGAGTTACAGAGTAGGGATCTGAGATG(SEQ ID No.12)，Tm59℃；SY121荧光探针的核苷酸序列：CCTTTGAACCCAAGATG(SEQ ID No.50)，Tm70℃。

特异性扩增Y染色体AZFb区SY127位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：GGCTCACAAACGAAAAGAAAAAG(SEQ ID No.13)，Tm58℃，下游：CATATAAGGAAACAAGCTGTGACACA(SEQ ID No.14)，Tm58℃；SY127荧光探针的核苷酸序列：AATCTACCAAAGCCC(SEQ ID No.51)，Tm69℃。

特异性扩增Y染色体AZFb区SY134位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：ACTGTCTGCCTCACCATAAAACG(SEQ ID No.15)，Tm59℃，下游：TATGCACTTCAGAAACTTAGCTAGTTCAGT(SEQ ID No.16)，Tm59℃；SY134荧光探针的核苷酸序列：CATCTGGAACATTCTACTTGA(SEQ IDNo.52)，Tm69℃。

特异性扩增Y染色体AZFb区SY143位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：CACTCCAGATTGTGGGTCATTGT(SEQ ID No.17)，Tm60℃，下游：AAAGTTCACCTGGGAGGATGAG(SEQ ID No.18)，Tm58℃；SY143荧光探针的核苷酸序列：AACATTGATTAGTCTCCAGCAC(SEQ ID No.53)，Tm68℃。

特异性扩增Y染色体AZFd区SY145位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：TTCATAACTTCAACACAAAAACACTCAT(SEQ ID No.19)，Tm58℃，下游：AGTGGCACTTGAGAATAATTGTATGTTAC(SEQ ID No.20)，Tm58℃；SY145荧光探针的核苷酸序列：ACTCGACTTTTGGCTGGG(SEQ ID No.54)，Tm69℃。

特异性扩增Y染色体AZFd区SY152位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：TCTGCCATGTTTCAGCTCTTTG(SEQ ID No.21)，Tm59℃，下游：AATATTTTGACAGGAGGGTACTTAGCA(SEQ ID No.22)，Tm59℃；SY152荧光探针的核苷酸序列：TCATGCTGAAACCAAGAC(SEQ ID No.55)，Tm68℃。

特异性扩增Y染色体AZFb区SY153位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：TTCTAGCAAAGCAAACTTAAAATCCA(SEQ ID No.23)，Tm59℃，下游：TTAACATCTTGCAGCATCACTAAGAAC(SEQ ID No.24)，Tm59℃；SY153荧光探针的核苷酸序列：AATGCAATAGACAAACCCA(SEQ ID No.56)，Tm70℃。

特异性扩增Y染色体AZFc区SY160位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：CAAATCATTGCATTCCTTTCCATT(SEQ ID No.25)，Tm60℃，下游：AGCTACGGGTCTCGAATGGAATA(SEQ ID No.26)，Tm60℃；SY160荧光探针的核苷酸序列：CATTGCATTACATTCTATGAC(SEQ ID No.57)，Tm68℃。

特异性扩增Y染色体AZFc区SY242位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：GTCTCTATCTTTACCTCACAGCCAATC(SEQ ID No.27)，Tm59℃，下游：GCTTCGGTTGGACTAGCAATG(SEQ ID No.28)，Tm59℃；SY242荧光探针的核苷酸序列：CGCTGTCAGCCTTG(SEQ ID No.58)，Tm69℃。

特异性扩增Y染色体AZFc区SY254位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：CTGCAAATCCTGAGACTCCAAAC(SEQ ID No.29)，Tm59℃，下游：CCCTAGCATCAATTCCACCAA(SEQ ID No.30)，Tm59℃；SY254荧光探针的核苷酸序列：CACCCAGTCTTCATC(SEQ ID No.59)，Tm68℃。

特异性扩增Y染色体AZFc区SY255位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：GCTCGTCATGTGCAGCCAC(SEQ ID No.31)，Tm60℃，下游：AACGTGCTGAGTTACAGGATTCG(SEQ ID No.32)，Tm59℃；SY254荧光探针的核苷酸序列：CCAAACACTGAAACCTACCT(SEQ ID No.60)，Tm70℃。

特异性扩增Y染色体AZFc区SY157位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：CGGCTTCACTTTTTCCTAAGCTT(SEQ ID No.33)，Tm60℃，下游：AAGCTTAGGAAAAAGTGAAGCCG(SEQ ID No.34)，Tm59℃；SY157荧光探针的核苷酸序列：CAATGATTTCCAAGATATTC(SEQ ID No.61)，Tm70℃。

特异性扩增Y染色体AZFa区SY1064位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：AGCCCCCAGCCTCACAGT(SEQ ID No.35)，Tm59℃，下游：GCCTCCCCACACTTCCTGAT(SEQ ID No.36)，Tm60℃；SY1064荧光探针的核苷酸序列：ACCACCAACAAATCAGAG(SEQ ID No.62)，Tm70℃。

特异性扩增Y染色体AZFa区SY1065位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：AGACCAAAGAGCCAAAGCAACT(SEQ ID No.37)，Tm58℃，下游：TTCATTGGTCTGTCTGTTTTTACACA(SEQ ID No.38)，Tm59℃；SY1065荧光探针的核苷酸序列：CAAACAAAACTAACGGCATCA(SEQ ID No.63)，Tm70℃。

特异性扩增Y染色体AZFc区SY1191位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：TCAGGCTAGAGTGTGGTAACTGGAT(SEQ ID No.39)，Tm59℃，下游：GTGGTGGCAGGCGTCTGTA(SEQ ID No.40)，Tm59℃；SY1191荧光探针的核苷酸序列：TCGGCTCACTGCAAC(SEQ ID No.64)，Tm69℃。

特异性扩增Y染色体AZFc区SY1291位点的引物对，其核苷酸序列为，上游：CGGGTTCACGCCATTCTC(SEQ ID No.41)，Tm59℃，下游：TGGCTCACGCCTGTAATCC(SEQ ID No.42)，Tm59℃；SY1291荧光探针的核苷酸序列：CAGGCGCCCGCCG(SEQ ID No.65)，Tm70℃。

一种Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，包括上述用于多重实时荧光PCR检测Y染色体微缺失的组合物，即检测上述位点的特异性扩增引物和荧光探针。即包括用于检测a区域的SY84和SY86的扩增引物对和荧光探针，检测b区域的SY127和SY134的扩增引物对和荧光探针，检测c区域的SY254、SY255、SY157、SY242、SY1191、SY1291的扩增引物对和荧光探针；还包括用于检测以下位点的扩增引物对和荧光探针：

(1)用于检测a区域(AZFa)缺失的SY82、SY88、SY1064和SY1065位点中的至少一个；和

(2)用于检测b区域(AZFb)缺失的SY105、SY121、SY143和SY153位点中的至少一个；和

(3)用于检测c区域(AZFc)缺失的SY160；和

(4)用于检测d区域(AZFd)缺失的SY145和SY152位点中的至少一个。

优选的，试剂盒中还包括用于特异性扩增男性特有SRY基因(SY14位点)的引物对和荧光探针，引物对的核苷酸序列为，上游：AGATGCTGCCGAAGAATTGC(SEQ ID No.43)，Tm59℃，下游GTTGCACTTCGCTGCAGAGTAC(SEQ ID No.44)Tm60℃；荧光探针的核苷酸序列TTTGCTTCCCGCAGATC(SEQ ID No.66)，Tm70℃。

试剂盒中还有用于特异性扩增管家基因ALB基因的引物对和荧光探针，引物对上游和下游的核苷酸序列为，GCCCATTGTCCTGTTCTGACTT(SEQ ID No.6)和TTCCACTGCTGAGCCATCAC(SEQ ID No.68)。荧光探针的核苷酸序列为TATGATGCGGTACACAGAGCCATCCAAG(SEQ ID No.69)所示。

所述试剂盒还包括实时荧光PCR反应所需试剂：MgCl2、热启动Taq酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP和PCR反应缓冲液。

所述的MgCl2浓度为1.0～5.0mmol/L。

所述的dATP、dCTP、dGTP浓度均为50～400μmol/L，dUTP浓度为10～1000μmol/L。

检测时，可将试剂盒中各组引物对和探针分别加在6～8个反应管内，每个反应管含有2组、3组或4组用于检测位点缺失的特异性扩增引物对及荧光探针，所述的位点选自SY14、SY82、SY84、SY86、SY88、SY105、SY121、SY127、SY134、SY143、SY145、SY152、SY153、SY160、SY254、SY255、SY157、SY242、SY1064、SY1065、SY1191、SY1291中的至少一个。优选的，每组反应管内还含有特异性扩增管家基因ALB基因的引物对和相应的荧光探针。反应管内，荧光探针上的发光基团各不相同。

特异性扩增ALB基因的引物，引物对上游和下游的核苷酸序列如SEQ IDNo.67和SEQ ID No.68所示。荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.69所示。

一般PCR仅采用一对引物，而本发明采用多重PCR法(multiplex PCR)即多重核酸扩增法，同一PCR反应体系中含有两对以上引物对多个靶序列进行PCR检测。多重PCR有优势也有劣势，优势为：多重PCR具有高效性、经济简便性等特点，可以在同一反应管内同时检出多种目标序列，可大大节省时间和成本，更能满足临床的要求；劣势为：多重PCR往往因为引物过多，引物之间发生相互反应，影响彼此的扩增效率。因此，在设计引物和探针的时候要格外注意应该避免引物与引物之间、引物与探针之间和探针与探针之间的交叉反应，尽量做到引物和探针越短越好、越少越好，相互之间无交叉反应，此劣势也为设计上的一大难点。本发明采用TaqMan MGB探针，在退火温度不变的情况下可减少探针长度，从而降低和引物及其他探针交叉反应的几率，提高扩展效率，提高产品的灵敏度。

本发明最多可检测21个STS位点，比现有技术(一般为6个)多；其中包括4个中国人群特有位点；缺失覆盖率大于99％，而现有技术一般为95％。现有技术与现有试剂盒及相关技术相比，本发明具有以下突出优点：

采用多重实时荧光定量PCR技术平台，能够快速(90分钟)、高通量的检测出Y染色体微缺失位点。

采用比欧洲标准更多的STS位点能够获得更全面的Y染色体微缺失信息。能够知道AZF a、b、c、d区是全部缺失还是部分缺失，现有技术不能区分完全还是部分缺失。

从PCR到读取检测结果均为闭管操作，极大程度上降低污染的可能性，避免假阳性。

附图说明

图1为实施例1中各位点的特异性扩增引物序列及探针的核苷酸序列

图2为实施例2中样品检测结果

图3为实施例2样品中正常男性Y染色体荧光检测结果。

图4为实施例2样品中样本3荧光检测结果

图5为实施例2样品中样本5荧光检测结果

具体实施方式

实施例1

一、引物设计

如图1所示，用于检测SY14、SY82、SY84、SY86、SY88、SY105、SY121、SY127、SY134、SY143、SY145、SY152、SY153、SY160、SY254、SY255、SY157、SY242、SY1064、SY1065、SY1191、SY1291位点的特异性扩增引物对和荧光探针核苷酸序列如图1所示。

二、试剂盒

将上述引物对和探针分装在8个反应管内，A-H管的引物和探针序列及反应体系中的浓度分别如表1-1～表1-8所示，F为上游引物，R为下游引物，P为探针。

表1-1 A管引物与探针列表

表1-2 B管引物与探针列表

表1-3 C管引物与探针列表

表1-4 D管引物与探针列表

表1-5 E管引物与探针列表

表1-6 F管引物与探针列表

表1-7 G管引物与探针列表

表1-8 H管引物与探针列表

实施例2

(1)试剂准备:TaqMan2×PCR Master mix(含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，Mg²⁺，热启动酶，UNG酶，dNTP)，或者全血抽提试剂盒。

(2)基因组DNA的提取：用常规分子生物学方法或市售试剂盒从抗凝全血中提取人基因组DNA。

(3)实时荧光PCR扩增与检测。

a.实时荧光PCR反应体系如表2，包括3mmol/L Mg²⁺，200μmol/L dATP、dCTP、dGTP、400μmol/L dUTP，200nmol/L各特异性引物，200nmol/L各探针，1U热启动酶，0.3U UNG酶，50ng人基因组DNA，并加上标签。384孔板内反应。

表2反应体系

b.实时荧光PCR反应在ABI 7900仪器上进行，按以下条件进行扩增检测。

反应程序：第一阶段95℃10min；第二阶段95℃15sec，60℃60sec(荧光采集)，40个循环。

四个荧光检测频道分别为NED、VIC、FAM、ROX。

共检测11个样本，并用PCR检测作为对照。结果如表3。

注：仁济医院采用普通PCR电泳方法，6位点。

(3)实验质量控制

阴性对照：以纯水作为模板的反应管内，应无任何扩增曲线产生。

阳性对照：以正常男性基因组DNA作为模板的反应管内，四个荧光频道应均有扩增曲线产生。

内对照：以待测男性基因组DNA作为模板的反应管内，ALB序列对应的荧光通道应有扩增曲线产生。

缺失判定：当满足上述三个要求时，无扩增曲线产生的荧光通道指示相应AZF区域的缺失。

正常男性Y染色体、样本3和5的荧光检测结果如图3、4和5。

具体的，11个样本在ABI 7900仪器上的荧光检测结果如图2，本实验结果与EAA/EMQN出版AZF检测指南标准推荐的检测方法(多重PCR加电泳法)的结果(6个欧标位点)完全一致，提示我们设计的实验方法有着较好的灵敏度和特异性。相比之下，我们的方法与多重PCR加电泳法相比，有着明显的优势；

第一，检测位点覆盖全，与欧标6位点检测的“UN”结果相比之下，本发明21位点检测结果更加全面，结果解读更加可靠，可用于临床“完全缺失”和“部分缺失”结果的判读；第二，本实施例中采用四重荧光定量PCR实验技术，灵敏度高、特异性强，实验周期短。

如图2，第一排表示对欧标6个位点进行多重PCR加电泳法已测得的各种缺失类型，如b+c表示b区和c区缺失；阳性表示阳性对照。UN表示缺失。第二排标记1～11表示检测的Y染色体微缺失样本。从下图可以看出，仅仅对欧标6个位点检测无法区分a、b、c区是部分还是完全缺失。但通过我们的试剂盒则可以精确判断缺失的类型。如从我们的试剂盒检测结果看样本1和2实际上为c区部分缺失；样本3和4实际上为a区完全缺失；样本5和7实际上为b区完全缺失，c区部分缺失；样本6和8实际上为b和c区均完全缺失；样本9实际上为b区完全缺失，同时c区部分缺失；样本10实际上为b区完全缺失；样本11为a、b和c区均完全缺失。这样获得的信息量比仅仅6个欧标位点的丰富多了，本试剂盒对临床诊断的意义更大。

比如：c区部分缺失患者样本1和2，从遗传学推断睾丸内生精小管组织结构基本正常，TESE(睾丸活组织穿刺取精)有较大可能性。该遗传学损害可垂直传递至后代男性胚胎。部分人群中，睾丸生精能力随年龄增长快速衰减，因此，或许可以进行尽早保存精液。再如，样本5到8虽然从欧标6个位点检测看均为b和c区缺失，但是事实上样本5和7比6和8的睾丸生精能力要强一些，c区并非完全缺失。而样本9比样本10的睾丸生精能力更弱，因为在b区完全缺失的同时还存在c去部分缺失。

Claims (10)

1.用于多重实时荧光PCR检测Y染色体微缺失的组合物，其特征在于，包括以下特征性扩增引物对及荧光探针：用于检测AZFa区域缺失的SY84和SY86的扩增引物对和荧光探针，检测AZFb区域缺失的SY127和SY134的扩增引物对和荧光探针，检测AZFc区域缺失的SY254、SY255、的扩增引物对和荧光探针；还包括用于检测以下位点的扩增引物对和荧光探针：

(1)用于检测AZFa区域缺失的SY82、SY88、SY1064和SY1065位点中的至少一个；和

(2)用于检测AZFb区域缺失的SY105、SY121、SY143和SY153位点中的至少一个；和

(3)用于检测AZFc区域缺失的SY160；和

(4)用于检测AZFd区域缺失的SY145和SY152位点中的至少一个。

2.权利要求1所述用于多重实时荧光PCR检测Y染色体微缺失的组合物，其特征在于，还包括用于检测AZFc区域缺失的SY157、SY242、SY1191、SY1291的扩增引物对和荧光探针。

3.权利要求1所述用于多重实时荧光PCR检测Y染色体微缺失的组合物，其特征在于：

特异性扩增AZF a区域SY82位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；SY82荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.45；

特异性扩增AZF a区域SY84位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；SY84荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.46；

特异性扩增AZF a区域SY86位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；SY86荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.47；

特异性扩增AZF a区域SY88位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；SY88荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.48；

特异性扩增AZFb区域SY105位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；SY105荧光探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.49；

特异性扩增AZFb区域SY121位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12；SY121荧光探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.50；

特异性扩增AZFb区域SY127位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14；SY127荧光探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.51；

特异性扩增AZFb区域SY134位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16；SY134荧光探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.52)；

特异性扩增AZFb区域SY143位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18；SY143荧光探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.53；

特异性扩增AZFd区域SY145位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20；SY145荧光探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.54；

特异性扩增AZFd区域SY152位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22；SY152荧光探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.55；

特异性扩增AZFb区域SY153位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；SY153荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.56；

特异性扩增AZFc区域SY160位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26；SY160荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.57；

特异性扩增AZFc区域SY254位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.29和SEQ ID No.30；SY254荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.59；

特异性扩增AZFc区域SY255位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.31和SEQ ID No.32；SY254荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.60；

特异性扩增AZFa区域SY1064位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.35和SEQ ID No.36；SY1064荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.62；

特异性扩增AZFa区域SY1065位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38；SY1065荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.63。

4.权利要求2所述用于多重实时荧光PCR检测Y染色体微缺失的组合物，其特征在于，

特异性扩增AZFc区域SY242位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.27和SEQ ID No.28；SY242荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.58；

特异性扩增AZFc区域SY157位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.33和SEQ ID No.34；SY157荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.61；

特异性扩增AZFc区域SY1191位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.39和SEQ ID No.40；SY1191荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.64；

特异性扩增AZFc区域SY1291位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.41和SEQ ID No.42；SY1291荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.65。

5.权利要求1所述用于多重实时荧光PCR检测Y染色体微缺失的组合物，其特征在于，所述的荧光探针是连接荧光基团和淬灭基团的核苷酸。

6.权利要求5所述用于多重实时荧光PCR检测Y染色体微缺失的组合物，其特征在于，所述的荧光基团选自NED、ALEX-350、FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS RED、CY3、CY5和CY5.5；淬灭基团选自MGB、DABCYL、BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA和ECLIPE。

7.权利要求1所述用于多重实时荧光PCR检测Y染色体微缺失的组合物，其特征在于，所述的荧光探针类型为TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、分子信标、改良分子信标、双链荧光置换探针、LightCycler探针或双环探针。

8.一种Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述用于多重实时荧光PCR检测Y染色体微缺失的组合物。

9.权利要求8所述Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括用于特异性扩增男性特有SRY基因SY14位点和ALB基因的引物对和荧光探针；

特异性扩增SY14位点的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ IDNo.42和SEQ ID No.44；SY14荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.66；

10.权利要求9所述Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增ALB基因的引物对，上游和下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.67和SEQ ID No.68；ALB荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.69。