CN106191277A - 一种y染色体微缺失检测试剂盒及方法 - Google Patents

一种y染色体微缺失检测试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106191277A
CN106191277A CN201610592823.7A CN201610592823A CN106191277A CN 106191277 A CN106191277 A CN 106191277A CN 201610592823 A CN201610592823 A CN 201610592823A CN 106191277 A CN106191277 A CN 106191277A
Authority
CN
China
Prior art keywords
site
seq
chromosome
detection
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610592823.7A
Other languages
English (en)
Inventor
卿志荣
郑帮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Rui Rui Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Jiangsu Rui Rui Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Rui Rui Biotechnology Co Ltd filed Critical Jiangsu Rui Rui Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201610592823.7A priority Critical patent/CN106191277A/zh
Publication of CN106191277A publication Critical patent/CN106191277A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及染色体缺失检测领域，尤其涉及一种Y染色体微缺失检测试剂盒及方法。其中试剂盒包括：盒体、PCR反应液I、PCR反应液II、阳性对照、阴性对照、空白对照。该试剂盒利用Taqman荧光探针PCR法检测Y染色体AZFa亚区sY84和sY86位点，Y染色体AZFb亚区sY127和sY134位点，Y染色体AZFc亚区sY254和sY255位点的基因缺失。该试剂盒采用针对检测位点设计的特异性引物探针实现对检测位点的高效稳定的多重PCR检测，并通过利用不同荧光基团对各检测位点探针的标记进而达到指示目标片段是否缺失的情况，从而实现在2管反应液中同时检测6个AZF缺失位点以及每管反应液均同时检测SRY和ZFY内控基因。采用本发明试剂盒可对男性Y染色体微缺失的6个位点进行检测，具有准确、快速、高通量和无污染等优点。

Description

一种Y染色体微缺失检测试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及染色体缺失检测领域，尤其涉及一种Y染色体微缺失检测试剂盒及方法。
背景技术
据估计不育症困扰着世界上超过10％的育龄夫妇,其中男性因素占了一半。引起男性不育的病因有很多,包括感染、生殖器官畸形、免疫功能异常、精索静脉曲张、勃起机能障碍、药物损伤以及染色体异常等。男性不育常伴随着精子数量减少,国内学者已对其进行了大量相关研究。Y染色体长臂无精子症因子(Azoospermia factor,AZF)微缺失是导致男性生精障碍主要的遗传学因素之一。研究表明,亚洲地区男性不育患者中AZF微缺失的发生率在2％～19.4％之间,与研究对象纳入标准、序列标签位点(Sequence Tag Site，STS)的选择、人群分布及遗传背景有关。AZF区微缺失的患者极少有自然生育能力,但近年来睾丸取精(Testicular sperm extraction,TESE)和卵母细胞质内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技术的发展,给无精子症、少精子症患者能够生育带来了希望,但也增加了将微缺失传递给下一代的风险。因此,对男性不育患者尽早进行Y染色体微缺失筛查有着重要意义,不仅可以明确患者真正病因,避免不必要的检查及无效的治疗,还可预知或者防止遗传缺陷的传递。Y染色体微缺失一般在染色体核型分析时不易发现，目前主要通过AZF区域的序列标签位点来诊断，根据欧洲男科协会建议的六个STS位点进行Y染色体微缺失的分析，即AZFa亚区sY84和sY86位点，Y染色体AZFb亚区sY127和sY134位点，Y染色体AZFc亚区sY254和sY255位点，对上述位点的分析，Y染色体微缺失的检测准确率可以达到95％。
目前应用于检测Y染色体微缺失的技术主要为通过PCR方法对Y染色体AZF区域的序列标签位点进行特异性扩增，再用电泳或Southern blot杂交等方法对PCR产物进行检测，这两种检测方法虽技术成熟，但同时也都存在缺陷，电泳检测的方法准确率不高、灵敏度低，Southern blot杂交方法耗时耗力、成本较高且操作繁琐。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种Y染色体微缺失检测试剂盒及方法。
本发明根据欧洲男科协会建议的六个STS位点和SRY及ZFY内参基因设计特异性引物和探针，通过Taqman荧光PCR法对其进行多重检测，可以快速、准确地检测Y染色体微缺失。
根据本发明的实施例，本发明提供一种用于Y染色体微缺失检测的引物和探针，所述引物和探针包括8组，可同时扩增检测Y染色体微缺失的六个STS位点和SRY及ZFY内参基因,所述引物探针组合包括用于检测SY84位点的引物探针组合、用于检测SY86位点的引物探针组合、用于检测SY127位点的引物探针组合、用于检测SY134位点的引物探针组合、用于检测SY254位点的引物探针组合、用于检测SY255位点的引物探针组合、用于检测SRY内参基因的引物探针组合以及用于检测ZFY内参基因的引物探针组合，其中：
用于检测SY84位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:1，下游引物为SEQID NO:2，特异性荧光探针为SEQ ID NO:3；
用于检测SY86位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:4，下游引物为SEQID NO:5，特异性荧光探针为SEQ ID NO:6；
用于检测SY127位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:7，下游引物为SEQID NO:8，特异性荧光探针为SEQ ID NO:9；
用于检测SY134位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:10，下游引物为SEQID NO:11，特异性荧光探针为SEQ ID NO:12；
用于检测SY254位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:13，下游引物为SEQID NO:14，特异性荧光探针为SEQ ID NO:15；
用于检测SY255位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:16，下游引物为SEQID NO:17，特异性荧光探针为SEQ ID NO:18；
用于检测SRY基因的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:19，下游引物为SEQID NO:20，特异性荧光探针为SEQ ID NO:21；
用于检测ZFY基因的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:22，下游引物为SEQID NO:23，特异性荧光探针为SEQ ID NO:24。
所述的该试剂盒中反应液分为反应液I和反应液II，其中反应液I中含有检测SY84位点、SY127位点、SY255位点、SRY和ZFY基因的引物探针组合，其中反应液II中含有SY86位点、SY134位点、SY254位点、SRY和ZFY基因的引物探针组合。
所述的PCR反应液I和PCR反应液II中SRY和ZFY基因的引物探针组合用于质控。
所述的PCR反应液I和PCR反应液II中用于检测SY84位点、SY86位点、SY254位点、SY255位点、SRY和ZFY基因的引物浓度均为200nM，探针浓度均为100nM，用于检测SY127位点、SY134位点的引物浓度均为200nM，探针浓度均为300nM。
所述的PCR反应液I和PCR反应液II中还包含有MgCL2、Taq酶、dUTP、dATP、dCTP、dGTP、UDG酶、10×PCR Buffer。
所述的MgCL2反应终浓度为4.5mM。
所述的Taq酶反应终浓度为5U。
所述的dUTP、dATP、dCTP、dGTP反应终浓度为0.5mM。
所述的UDG酶反应终浓度为0.3U。
所述的10×PCR Buffer反应终浓度为1×PCR Buffer。
进一步的本发明采用Taqman荧光探针PCR技术对Y染色体微缺失进行五重荧光检测。
本发明的有益效果是：本试剂盒和方法采用实时荧光定量PCR结合Taqman探针对Y染色体微缺失SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点进行多重荧光检测，内参基因SRY和ZFY基因检测的加入可有效控制本发明试剂盒和方法对Y染色体微缺失检测结果的有效性，该方法操作简单、检测通量高、快速、灵敏度高且特异性强，可有效缩短检测周期和成本。
附图说明
图1为PCR反应液I中SY84、SY127、SY255位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；
图2为PCR反应液II中SY86、SY134、SY254位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；
图3为PCR反应液I中SY127、SY255位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；
图4为PCR反应液II中SY134、SY254位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；
图5为PCR反应液I中SY84、SY255位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；
图6为PCR反应液II中SY86、SY254位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；
图7为PCR反应液I中SY84、SY127位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；
图8为PCR反应液II中SY86、SY134位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线。
具体实施方式
本发明采用五重荧光PCR方法分两管对Y染色体微缺失进行检测，检测位点包括SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点，其中PCR反应液I检测位点为SY84位点、SY127位点、SY255位点和SRY以及ZFY内参基因，其中PCR反应液II检测位点为SY86位点、SY134位点、SY254位点、SRY和ZFY内参基因，阳性对照采用正常已育男性DNA样本，阴性对照采用女性DNA样本，空白对照采用灭菌水以防止体系被污染。
用于检测SY84位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:1，下游引物为SEQID NO:2，特异性荧光探针为SEQ ID NO:3；
用于检测SY86位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:4，下游引物为SEQID NO:5，特异性荧光探针为SEQ ID NO:6；
用于检测SY127位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:7，下游引物为SEQID NO:8，特异性荧光探针为SEQ ID NO:9；
用于检测SY134位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:10，下游引物为SEQID NO:11，特异性荧光探针为SEQ ID NO:12；
用于检测SY254位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:13，下游引物为SEQID NO:14，特异性荧光探针为SEQ ID NO:15；
用于检测SY255位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:16，下游引物为SEQID NO:17，特异性荧光探针为SEQ ID NO:18；
用于检测SRY基因的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:19，下游引物为SEQID NO:20，特异性荧光探针为SEQ ID NO:21；
用于检测ZFY基因的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:22，下游引物为SEQID NO:23，特异性荧光探针为SEQ ID NO:24。
所述的SY84位点、SY86位点引物探针组合用于检测Y染色体AZFa区域是否存在缺失情况。
所述的SY127位点、SY134位点引物探针组合用于检测Y染色体AZFb区域是否存在缺失情况。
所述的SY254位点、SY255位点引物探针组合用于检测Y染色体AZFc区域是否存在缺失情况。
所述的SRY和ZFY基因的引物探针组合用于质控，检测反应体系即过程是否正常及检测结果可使用性。
所述的PCR反应液I和PCR反应液II中用于检测SY84位点、SY86位点、SY254位点、SY255位点、SRY和ZFY基因的引物浓度均为200nM，探针浓度均为100nM，用于检测SY127位点、SY134位点的引物浓度均为200nM，探针浓度均为300nM。
所述的PCR反应液I和PCR反应液II中还包含有MgCL2、Taq酶、dUTP、dATP、dCTP、dGTP、UDG酶、10×PCR Buffer。
所述的MgCL2反应终浓度为4.5mM。
所述的Taq酶反应终浓度为5U。
所述的dUTP、dATP、dCTP、dGTP反应终浓度为0.5mM。
所述的UDG酶反应终浓度为0.3U。
所述的10×PCR Buffer反应终浓度为1×PCR Buffer。
本发明所述的Y染色体微缺失检测包括以下步骤：
1.基因组DNA的提取：可通过柱式提取方法或Chelex法对EDTA抗凝全血或口腔拭子等来源的样本进行DNA提取。
2.荧光PCR扩增检测：所述的多重荧光PCR扩增检测包括本发明的PCR反应液I和PCR反应液II同时对待检样本DNA和阳性对照、阴性对照以及空白对照进行扩增检测。
3.PCR扩增检测反应条件：37℃5min；95℃5min；95℃15S，60℃60S,40cycles。
4.结果分析：根据扩增曲线的有无判断对应的SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点有无缺失。
实施例1
1.组DNA的提取：常规柱式提取方法或Chelex法提取200μl抗凝全血DNA作为模板。
2.荧光PCR扩增检测：以PCR反应液I和PCR反应液II同时对样本DNA和阳性对照、阴性对照以及空白对照进行扩增检测，其中PCR反应液I和PCR反应液II中用于检测SY84位点、SY86位点、SY254位点、SY255位点、SRY和ZFY基因的引物浓度均为200nM，探针浓度均为100nM，用于检测SY127位点、SY134位点的引物浓度均为200nM，探针浓度均为300nM。MgCL2反应终浓度为4.5mM,Taq酶反应终浓度为5U,dUTP、dATP、dCTP、dGTP反应终浓度为0.5mM,UDG酶反应终浓度为0.3U,10×PCR Buffer反应终浓度为1×PCR Buffer，样本基因组DNA、阳性对照、阴性对照、空白对照均加入5μl，加去离子水补足体积至50μl。引物探针信息如下：
SY84上游引物为5’-AGGCAGACACTAAAGAAAGGGTCCCA-3’(SEQ ID NO:1)
SY84下游引物为5’-AAAGAGAAGGGTCCTGAAAGCA-3’(SEQ ID NO:2)
SY84探针为5’-JOE-AGGCAAGCCCTTGAGCAAATTCCCT-BHQ1-3’(SEQ ID NO:3)
SY86上游引物为5’-GTGACACACAGACTATGCTTC-3’(SEQ ID NO:4)
SY86下游引物为5’-ACACACAGAGGGACAACCCT-3’(SEQ ID NO:5)
SY86探针为5’-JOE-TACAAAGAAATCCCAAAGACTGGGCCCCT-BHQ1-3’(SEQ ID NO:6)
SY127上游引物为5’-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3’(SEQ ID NO:7)
SY127下游引物为5’-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3’(SEQ ID NO:8)
SY127探针为5’-TAMRA-CAGCTTGTTTCCTTATATGGGTGAGCCAGAT-BHQ2-3’(SEQ IDNO:9)
SY134上游引物为5’-GTCTGCCTCACCATAAAACG-3’(SEQ ID NO:10)
SY134下游引物为5’-CATCATGCTATGCACTTCAGAAACT-3’(SEQ ID NO:11)
SY134探针为5’-TAMRA-AACATCTGGAACATTCTACTTGAAGCGTTCTGT-BHQ2-3’(SEQ IDNO:12)
SY254上游引物为5’-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3’(SEQ ID NO:13)
SY254下游引物为5’-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3’(SEQ ID NO:14)
SY254探针为5’-FAM-TCATGAACAATGGGATGTGGGCCCTGT-3’(SEQ ID NO:15)
SY255上游引物为5’-TGCTGAGTTACAGGATTCGGC-3’(SEQ ID NO:16)
SY255下游引物为5’-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3’(SEQ ID NO:17)
SY255探针为5’-FAM-CGCAGACGTTCTGAAACTGTGGTGGAGGA-3’(SEQ ID NO:18)
SRY基因上游引物为5’-CCTTCCTTTGCACTGAAAGCTGTA-3’(SEQ ID NO:19)
SRY基因下游引物为5’-ATTCTGGGATTCTCTAGAGCCATCT-3’(SEQ ID NO:20)
SRY基因探针为5’-ROX-AACGTCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCA-3’SEQ(ID NO:21)
ZFY基因上游引物为5’-AAGTTTACATAACCACCTGGAGAGC-3’(SEQ ID NO:22)
ZFY基因下游引物为5’-CCACACTCCACACAAATATGAGGAA-3’(SEQ ID NO:23)
ZFY基因探针为5’-CY5-CGCCACCTCTTGGCAGTCCACAGCAA-3’(SEQ ID NO:24)
PCR扩增检测反应条件：37℃5min；95℃5min；95℃15S，60℃60S,40cycles。
3.结果分析：
(1)检测结果可用条件：PCR反应液I和PCR反应液II中待检样本和阳性对照内参基因SRY和ZFY均可检测出荧光信号，曲线拐点清楚，阳性对照SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点均可检测出荧光信号，曲线拐点清楚,阴性对照只有ZFY检测出荧光信号，空白对照无扩增曲线，所有扩增检测曲线Ct值应处于17至32之间为正常，否则实验失败。
(2)对不同检测通道设置不同颜色，并根据不同通道扩增检测结果判定相应位点是否存在缺失情况。
图1-2为正常男性样本检测结果，其中SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点、SRY和ZFY内参基因均有扩增曲线，阴性对照和空白对照无扩增曲线，阳性对照各检测通道均有扩增曲线，表明该样本检测成功，检测过程无污染，该样本无Y染色体微缺失。
图3-4为一不育男性样本，其中SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点、SRY和ZFY内参基因均有扩增曲线，阴性对照和空白对照无扩增曲线，阳性对照各检测通道均有扩增曲线，表明该样本检测成功，检测过程无污染，该样本Y染色体存在SY84位点、SY86位点微缺失，其中图3显示SY84位点缺失,图4显示SY86位点缺失。
图5-6为一不育男性样本，其中SY84位点、SY86位点、SY254位点、SY255位点、SRY和ZFY内参基因均有扩增曲线，阴性对照和空白对照无扩增曲线，阳性对照各检测通道均有扩增曲线，表明该样本检测成功，检测过程无污染，该样本Y染色体存在SY127位点、SY134位点微缺失，其中图5显示SY127位点缺失，图6显示SY134位点缺失。
图7-8为一不育男性样本，其中SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SRY和ZFY内参基因均有扩增曲线，阴性对照和空白对照无扩增曲线，阳性对照各检测通道均有扩增曲线，表明该样本检测成功，检测过程无污染，该样本Y染色体存在SY254位点、SY255位点微缺失，其中图7显示SY254位点缺失，图8显示SY255位点缺失。
本发明的目的在于提供一种结合Taqman探针的多重荧光PCR方法对Y染色体微缺失进行检测的试剂盒和方法。实时荧光PCR通过对模板的扩增并对每一扩增循环产生的荧光信号进行收集，从而实现对起始模板的定量及定性分析。本发明通过两组反应液即PCR反应液I和PCR反应液II对SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点进行定性检测，PCR反应液I和PCR反应液II均同时检测SRY和ZFY内参基因作为质控，以正常男性样本作为阳性对照，以女性样本作为阴性对照，灭菌水作为空白对照以检测体系是否污染现象。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (9)

1.一种Y染色体微缺失检测试剂盒及检测方法，其特征在于，所述试剂盒包括：
用于检测SY84位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:1，下游引物为SEQ IDNO:2，特异性荧光探针为SEQ ID NO:3；
用于检测SY86位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:4，下游引物为SEQ IDNO:5，特异性荧光探针为SEQ ID NO:6；
用于检测SY127位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:7，下游引物为SEQ IDNO:8，特异性荧光探针为SEQ ID NO:9；
用于检测SY134位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:10，下游引物为SEQ IDNO:11，特异性荧光探针为SEQ ID NO:12；
用于检测SY254位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:13，下游引物为SEQ IDNO:14，特异性荧光探针为SEQ ID NO:15；
用于检测SY255位点的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:16，下游引物为SEQ IDNO:17，特异性荧光探针为SEQ ID NO:18；
用于检测SRY基因的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:19，下游引物为SEQ IDNO:20，特异性荧光探针为SEQ ID NO:21；
用于检测ZFY基因的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:22，下游引物为SEQ IDNO:23，特异性荧光探针为SEQ ID NO:24。
2.一种Y染色体微缺失检测试剂盒及检测方法，包括PCR反应液I和PCR反应液II,其特征在于：所述的PCR反应液I包含检测SY84位点、SY127位点、SY255位点和SRY以及ZFY内参基因的引物探针组合，所述的PCR反应液II包含检测SY86位点、SY134位点、SY254位点、SRY和ZFY内参基因的引物探针组合。
3.如权利要求2所述的Y染色体微缺失检测试剂盒，其特征在于，在PCR反应液I和PCR反应液II中包含用于检测SRY和ZFY的的引物探针组合用于质控，其中用于检测SRY基因的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:19，下游引物为SEQ ID NO:20，特异性荧光探针为SEQID NO:21；用于检测ZFY基因的引物探针组合中上游引物为SEQ ID NO:22，下游引物为SEQID NO:23，特异性荧光探针为SEQ ID NO:24。
4.如权利要求2所述的一种Y染色体微缺失检测试剂盒及检测方法，其特征在于，所述的MgCL反应终浓度为4.5mM。
5.如权利要求2所述的一种Y染色体微缺失检测试剂盒及检测方法，其特征在于，所述的Taq酶反应终浓度为5U。
6.如权利要求2所述的一种Y染色体微缺失检测试剂盒及检测方法，其特征在于，所述的dUTP、dATP、dCTP、dGTP反应终浓度为0.5mM。
7.如权利要求2所述的一种Y染色体微缺失检测试剂盒及检测方法，其特征在于，所述的UDG酶反应终浓度为0.3U。
8.如权利要求2所述的一种Y染色体微缺失检测试剂盒及检测方法，其特征在于，PCR扩增检测反应条件为37℃ 5min；95℃ 5min；95℃ 15S，60℃ 60S,40cycles。
9.一种Y染色体微缺失检测试剂盒及检测方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)组DNA的提取：可通过柱式提取方法或Chelex法对EDTA抗凝全血或口腔拭子等来源的样本进行DNA提取。
(2)荧光PCR扩增检测：所述的多重荧光PCR扩增检测包括本发明的PCR反应液I和PCR反应液II同时对待检样本DNA和阳性对照、阴性对照以及空白对照进行扩增检测。
(3)结果分析：根据扩增曲线的有无判断对应的SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点有无缺失。
CN201610592823.7A 2016-07-25 2016-07-25 一种y染色体微缺失检测试剂盒及方法 Pending CN106191277A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610592823.7A CN106191277A (zh) 2016-07-25 2016-07-25 一种y染色体微缺失检测试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610592823.7A CN106191277A (zh) 2016-07-25 2016-07-25 一种y染色体微缺失检测试剂盒及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106191277A true CN106191277A (zh) 2016-12-07

Family

ID=57495779

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610592823.7A Pending CN106191277A (zh) 2016-07-25 2016-07-25 一种y染色体微缺失检测试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106191277A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703578A (zh) * 2011-07-06 2012-10-03 郭奇伟 Y染色体微缺失多重实时荧光pcr检测试剂盒
CN102876776A (zh) * 2012-09-04 2013-01-16 骆子义 检测y染色体微缺失的实时荧光定量pcr试剂盒及方法
CN102912028A (zh) * 2012-11-06 2013-02-06 北京阅微基因技术有限公司 Y染色体微缺失检测的扩增组合物及检测试剂盒
CN104232779A (zh) * 2014-09-23 2014-12-24 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种检测人类y染色体微缺失的试剂盒
CN105018589A (zh) * 2014-07-16 2015-11-04 上海恒健生物技术有限公司 一种y染色体微缺失多重实时荧光pcr检测试剂盒及扩增引物对和探针
CN105132530A (zh) * 2015-07-22 2015-12-09 广州市达晖生物技术有限公司 一种快速检测人类y染色体微缺失的试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703578A (zh) * 2011-07-06 2012-10-03 郭奇伟 Y染色体微缺失多重实时荧光pcr检测试剂盒
CN102876776A (zh) * 2012-09-04 2013-01-16 骆子义 检测y染色体微缺失的实时荧光定量pcr试剂盒及方法
CN102912028A (zh) * 2012-11-06 2013-02-06 北京阅微基因技术有限公司 Y染色体微缺失检测的扩增组合物及检测试剂盒
CN105018589A (zh) * 2014-07-16 2015-11-04 上海恒健生物技术有限公司 一种y染色体微缺失多重实时荧光pcr检测试剂盒及扩增引物对和探针
CN104232779A (zh) * 2014-09-23 2014-12-24 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种检测人类y染色体微缺失的试剂盒
CN105132530A (zh) * 2015-07-22 2015-12-09 广州市达晖生物技术有限公司 一种快速检测人类y染色体微缺失的试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102703578B (zh) Y染色体微缺失多重实时荧光pcr检测试剂盒
CN104293920B (zh) 一种用于快速检测人类vkorc1和cyp2c9基因多态性的试剂盒及其使用方法
CN102912028B (zh) Y染色体微缺失检测的扩增组合物及检测试剂盒
CN102465174A (zh) 荧光定量pcr技术检测gjb2基因突变的方法及其试剂盒
CN102876776B (zh) 检测y染色体微缺失的实时荧光定量pcr试剂盒及方法
CN107385064A (zh) 一种同时扩增人常染色体snp和str位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN106434940A (zh) 一种用于他汀类降脂药个体化用药相关基因snp检测的试剂盒及其检测方法
KR101777161B1 (ko) 개의 고관절이형성증을 예측 또는 진단하기 위한 멀티플렉스 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 예측 또는 진단 방법
CN101575647A (zh) 一种y染色体微缺失的基因检测方法
CN102154527A (zh) 一种快速检测耐多药结核病的方法
CN107164524A (zh) 用于基因甲基化检测的引物和探针、采样方法、试剂盒
CN105176982A (zh) 利用Taqman MGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方法
CN106636390A (zh) 基因甲基化检测方法和检测试剂盒及其应用
CN106148484B (zh) 一种诊断y染色体微缺失的试剂盒
CN101555528B (zh) 一种染色体22q11.2区微缺失、微重复的测定方法
CN103146820B (zh) 一种推断未知来源个体汉、藏、维群体来源的方法和系统
CN102660635B (zh) 一种定性检测hla-b*1502基因亚型的荧光pcr试剂盒
CN106591442A (zh) 用于y染色体微缺失检测的引物组合及试剂盒
JP6164683B2 (ja) Ｙ染色体及びｙ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法
CN104498609A (zh) 一种遗传性耳聋基因检测的核酸膜条及试剂盒
CN103571957B (zh) 检测y染色体微缺失的引物和试剂盒
CN105002290A (zh) 一种芸薹属植物细胞质类型的分子检测试剂盒及应用
CN106191277A (zh) 一种y染色体微缺失检测试剂盒及方法
CN103993089A (zh) 一种耐万古霉素肠球菌的多重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
CN205974523U (zh) 一种y染色体微缺失检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20161207