CN103571957B - 检测y染色体微缺失的引物和试剂盒 - Google Patents

检测y染色体微缺失的引物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测Y染色体微缺失的引物和试剂盒及其使用方法。本发明所公开的引物为针对6个STS位点和内参基因的特异性引物，使用包括有该引物的试剂盒可通过多重PCR扩增结合DHPLC检测，可以快速、准确地检测Y染色体微缺失，检测程序简单，检测灵敏度高，结果重复性高，样品通量高。

Description

检测Y染色体微缺失的引物和试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及基因检测的引物和试剂盒，尤其涉及一种用于检测Y染色体微缺失的引物和试剂盒及其使用方法
背景技术
据估计全球约有10％的育龄夫妇不育，其中男性因素引起的生殖障碍约占一半，而因遗传性因素引发男性不育的比例为30％，其中发病率最高的两种是克氏综合症和Y染色体微缺失，有10～15％的无精症或少精症存在Y染色体的微缺失。
Y染色体是最短的近端着丝粒染色体，是男性特有的染色体，Y染色体上有多个基因参与生精过程，研究表明，Y染色体上存在一个关键的与生育相关的因子的区域，称为无精子因子(azoospermiafactor，AZF)，目前认为在AZF上存在三个精子发生亚区(AZFa、AZFb、AZFc)，各亚区包含的位点在男性生殖细胞发育不同时期起着不同的作用，位点的缺失可致患者表现为少、弱精症或无精症从而引发不育，而在AZFb于AZFc之间还存在AZFd座位，中等程度的少精子和精子数目正常却形态异常多与该区域的缺失有关。AZFa缺失的患者，主要表现为支持细胞综合症伴睾丸体积缩小，无精子生成；AZFb缺失的患者，主要表现为生精过程阻滞在精母细胞阶段，无精子生成；AZFc缺失的患者表现多样化，会出现无精子症和少精子症的不同临床表现。对于Y染色体微缺失的原因，普遍认为染色体内的非同源重组是该突变的主要机制。Y染色体微缺失一般在染色体核型分析不易发现，目前主要通过AZF区域的序列标签位点(Sequence tagged sites,STSs)来诊断，根据欧洲男科协会建议的六个STS位点进行Y染色体微缺失的分析，即：AZFa(SY84、SY86)，AZFb(SY127、SY134)，AZFc(SY254、SY255)，对上述位点的分析，Y染色体微缺失的检测准确率可以达到95％。
当前，Y染色体微缺失检测的主要方法是通过PCR特异性扩增Y染色体AZF区域的序列标签位点(STS)，再用电泳或Southern blot杂交等方法检测PCR扩增产物，但电泳灵敏度低、准确性不高，杂交操作繁琐、耗时耗力、成本高。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于检测Y染色体微缺失的引物，本发明还公开了包括有该引物的试剂盒及其使用方法。
本申请的发明人根据6个STS位点和内参基因设计特异性引物，通过多重PCR扩增结合DHPLC(变性高效液相色谱分析)检测，可以快速、准确地检测Y染色体微缺失。
根据本发明的实施例，提供了一种用于检测Y染色体微缺失的引物，所述引物包括8对引物，可同时扩增Y染色体上6个基因位点和两个内参基因；
所述Y染色体上6个基因位点为：SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255位点；所述两个内参基因为：SRY和TP53基因；
特异性扩增SY84位点的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，
SEQ ID NO:15’-AGAGGAGTCCTGATGCAGGT-3’
SEQ ID NO:25’-GCCCATTACCTGGAGCCTTC-3’
特异性扩增SY86位点的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，
SEQ ID NO:35’-GTGAACCACAGACATGCTTC-3’
SEQ ID NO:45’-ACACACAAGGCGAACCCCT-3’
特异性扩增SY127位点的引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，
SEQ ID NO:55’-GGCTCTCACACGAATAGAAA-3’
SEQ ID NO:65’-CTGCTGGCACTAATATGGGA-3’
特异性扩增SY134位点的引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，
SEQ ID NO:75’-GTCTCGCTCACACTAAAACG-3’
SEQ ID NO:85’-ACCAACGCCAATACATTCAA-3’
特异性扩增SY254位点的引物序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，
SEQ ID NO:95’-GGGTCTATCCAGAGAGCAAA-3’
SEQ ID NO:105’-GAACCTGATCTAGCAATGCAGC-3’
特异性扩增SY255位点的引物序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示，
SEQ ID NO:115’-GTTACGAGATTGCGCGTGAT-3’
SEQ ID NO:125’-CTCGCTATGTCGAGCCAC-3’
特异性扩增SRY基因的引物序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示，
SEQ ID NO:135’-TCGCACCTTCCTTTGTTTTG-3’
SEQ ID NO:145’-CGTTGTAGGGCGTGAAGT-3’
特异性扩增TP53基因的引物序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示，
SEQ ID NO:155’-GGACTCGATTCTCTAACTGC-3’
SEQ ID NO:165’-GCTTCTGTTCCTCGTTGCTT-3’。
根据本发明的实施例，还提供了一种用于检测Y染色体微缺失的试剂盒，其主要包括：1)上述用于扩增Y染色体上SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、SY255位点以及内参SRY和TP53基因的引物，引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:16所示；2)PCR MIX反应液、去离子水、质控对照品；3)分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。优选的，上述引物的浓度均为10pmol/μl。
其中，PCR MIX反应液为本领域常规的PCR MIX反应液；优选的，所述PCR MIX反应液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2；其中，所述Taq DNA聚合酶的浓度为50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为400μM，所述MgCl2的浓度为3mM。
其中，质控对照品为正常男性DNA。
本发明的引物和试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)使用常规方法提取待测样本的基因组DNA；
(2)进行多重PCR扩增，分成两管进行：A管扩增SY84位点、SY134位点、SY254位点、SRY和TP53基因；B管扩增SY86位点、SY127位点、SY255位点、SRY和TP53基因；
(3)按照DHPLC(变性高效液相色谱分析)常规操作方法，使用前先检查仪器状态是否正常，运行flush+equilibrate程序，除气泡并wash进样针2-3遍。上样前运行1-2针空白针(使用所需进样的检测方法)，将PCR扩增产物依次进行上机检测，判读结果。
通过以上技术方案，本发明的有益效果如下：
通过多重PCR扩增结合DHPLC检测，一次性扩增多个基因片段，无需针对每个基因位点单独扩增检测，简化了检测程序，减少了消耗品，降低了检测成本，通过DHPLC自动化分析检测结果，可快速得到检测结果，检测灵敏度高，结果重复性高，样品通量高。
附图说明
图1为使用本发明的实施例的试剂盒检测某患者Y染色体微缺失所得的DHPLC检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
用于检测Y染色体微缺失的试剂盒及其使用
1.该用于检测Y染色体微缺失的试剂盒中装有：
⑴引物
特异性扩增SY84位点的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，
SEQ ID NO:15’-AGAGGAGTCCTGATGCAGGT-3’
SEQ ID NO:25’-GCCCATTACCTGGAGCCTTC-3’
特异性扩增SY86位点的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，
SEQ ID NO:35’-GTGAACCACAGACATGCTTC-3’
SEQ ID NO:45’-ACACACAAGGCGAACCCCT-3’
特异性扩增SY127位点的引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，
SEQ ID NO:55’-GGCTCTCACACGAATAGAAA-3’
SEQ ID NO:65’-CTGCTGGCACTAATATGGGA-3’
特异性扩增SY134位点的引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，
SEQ ID NO:75’-GTCTCGCTCACACTAAAACG-3’
SEQ ID NO:85’-ACCAACGCCAATACATTCAA-3’
特异性扩增SY254位点的引物序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，
SEQ ID NO:95’-GGGTCTATCCAGAGAGCAAA-3’
SEQ ID NO:105’-GAACCTGATCTAGCAATGCAGC-3’
特异性扩增SY255位点的引物序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示，
SEQ ID NO:115’-GTTACGAGATTGCGCGTGAT-3’
SEQ ID NO:125’-CTCGCTATGTCGAGCCAC-3’
特异性扩增SRY基因的引物序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示，
SEQ ID NO:135’-TCGCACCTTCCTTTGTTTTG-3’
SEQ ID NO:145’-CGTTGTAGGGCGTGAAGT-3’
特异性扩增TP53基因的引物序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示，
SEQ ID NO:155’-GGACTCGATTCTCTAACTGC-3’
SEQ ID NO:165’-GCTTCTGTTCCTCGTTGCTT-3’。
上述引物的浓度均为10pmol/μl。
⑵PCR MIX反应液，其包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2；其中，所述Taq DNA聚合酶的浓度为50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为400μM，所述MgCl2的浓度为3mM；
⑶去离子水；
(4)质控对照品(正常男性DNA)；
(5)分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
2.试剂盒的使用方法如下：
⑴使用商业途径购买的DNA提取试剂盒提取样本DNA；
(2)进行多重PCR扩增，分成两管进行：A管扩增SY84位点、SY134位点、SY254位点、SRY和TP53基因；B管扩增SY86位点、SY127位点、SY255位点、SRY和TP53基因，反应体系如下：
成分 体积(total 25μl)
DNA模板 1.0μl
上游引物 1.0μl
下游引物 1.0μl
PCR MIX反应液 12.5μl
去离子水 9.5μl
上述上游引物和下游引物为每管所对应的五个位点、基因的引物混合物，在引物混合物中每种引物的浓度均为10pmol/μl。
反应程序为：
95℃，15min，1个循环；
95℃，50sec→从63℃，每个循环降0.5℃至56℃,30sec→72℃,60sec，15个循环；
95℃，50sec→56℃,50sec→72℃,50sec，25个循环；
72℃，10min，1个循环。
⑶按照DHPLC(变性高效液相色谱分析)常规操作方法，使用前先检查仪器状态是否正常，运行flush+equilibrate程序，除气泡并wash进样针2-3遍。上样前运行1-2针空白针(使用所需进样的检测方法)，将PCR扩增产物依次进行上机检测，判读结果。
判读依据如下：如各位点都存在，则检测位点和质控对照一一对应，若存在一个位点缺失，如sY134位点缺失，则和质控对照对应的134的位置没有检测峰型出现；如图1所示，提供该样本的患者各位点都存在，未出现Y染色体微缺失。
上面已经举例说明了本发明的实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种用于检测Y染色体微缺失的引物，其特征在于，所述引物包括8对引物，可同时扩增Y染色体上6个基因位点和两个内参基因；
所述Y染色体上6个基因位点为：SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255位点；
所述两个内参基因为：SRY和TP53基因；
特异性扩增SY84位点的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，
SEQ ID NO:15’-AGAGGAGTCCTGATGCAGGT-3’
SEQ ID NO:25’-GCCCATTACCTGGAGCCTTC-3’
特异性扩增SY86位点的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，
SEQ ID NO:35’-GTGAACCACAGACATGCTTC-3’
SEQ ID NO:45’-ACACACAAGGCGAACCCCT-3’
特异性扩增SY127位点的引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，
SEQ ID NO:55’-GGCTCTCACACGAATAGAAA-3’
SEQ ID NO:65’-CTGCTGGCACTAATATGGGA-3’
特异性扩增SY134位点的引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，
SEQ ID NO:75’-GTCTCGCTCACACTAAAACG-3’
SEQ ID NO:85’-ACCAACGCCAATACATTCAA-3’
特异性扩增SY254位点的引物序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，
SEQ ID NO:95’-GGGTCTATCCAGAGAGCAAA-3’
SEQ ID NO:105’-GAACCTGATCTAGCAATGCAGC-3’
特异性扩增SY255位点的引物序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示，
SEQ ID NO:115’-GTTACGAGATTGCGCGTGAT-3’
SEQ ID NO:125’-CTCGCTATGTCGAGCCAC-3’
特异性扩增SRY基因的引物序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示，
SEQ ID NO:135’-TCGCACCTTCCTTTGTTTTG-3’
SEQ ID NO:145’-CGTTGTAGGGCGTGAAGT-3’
特异性扩增TP53基因的引物序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示，
SEQ ID NO:155’-GGACTCGATTCTCTAACTGC-3’
SEQ ID NO:165’-GCTTCTGTTCCTCGTTGCTT-3’。
2.一种包括有权利要求1所述的引物的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：1)用于扩增Y染色体上SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、SY255位点以及内参SRY和TP53基因的引物，引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:16所示；2)PCR MIX反应液、去离子水、质控对照品；3)分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
3.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述引物的浓度均为10pmol/μl。
4.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR MIX反应液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2；其中，所述Taq DNA聚合酶的浓度为50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为400μM，所述MgCl2的浓度为3mM。
5.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述质控对照品为正常男性DNA。
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