CN103757094A - 一种基于荧光pcr检测tyms基因多态性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于荧光PCR快速准确检测TYMS基因1494del6多态性的方法。该方法针对TYMS基因1494del6多态性所对应的两条等位基因，分别设计等位基因特异性引物，结合SYBR green技术，在荧光PCR完成后便可以通过扩增曲线准确判断样本TYMS基因1494del6多态性位点的具体基因型。本发明设计的特异性引物具有很高的位点特异性；检测灵敏度高；节省耗材和时间。

Description

一种基于荧光PCR检测TYMS基因多态性的方法
技术领域
本发明涉及一种检测TYMS基因多态性的方法。
背景技术
胸苷合成酶(Thymidylate Synthase,TS)是嘧啶核苷酸合成的限速酶，由TYMS基因编码。TS催化脱氧鸟苷酸(dUMP)转化为脱氧胸苷酸(dTMP)，是DNA合成过程中必需的一步。TYMS基因3’非编码区(untranslated region,UTR)具有6bp缺失(1494del6)基因多态性。
本发明是检测发生在TYMS基因3’非编码区(untranslated region,UTR)的6bp缺失(1494del6)基因多态性(表现为+6bp/+6bp、+6bp/-6bp及-6bp/-6bp三种基因型)。
传统检测TYMS基因1494del6多态性的技术主要有直接测序和PCR-凝胶电泳。这两种方法成本低，准确性高，然而都需要PCR后处理步骤，既操作复杂，又容易发生污染，产生假性结果。商品化试剂盒利用MGB荧光探针，弥补了传统方法的不足，然而成本大大增加。
等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR)，也称为ARMS(Amplification RefractoryMutation System)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。其原理是根据PCR过程中DNA聚合酶引导的引物延伸从引物的3′末端开始，而引物3′末端的碱基与模板的互补程度强烈影响聚合酶的识别作用和PCR反应的进行：若这个碱基与模板正常互补配对(A-T,G-C)，则引物可以不间断延伸，PCR得以高效进行，得到完整的产物；反之，若这个碱基与模板非正常配对，则引物的延伸受到阻滞，PCR效率大大降低。故只需将与突变位点对应的碱基放置在引物的3′末端，进而达到选择性扩增某种等位基因的作用。
SYBR Green是一种DNA结合染料，可以紧密结合在DNA双链小沟位置。在游离状态下SYBR Green只有本底水平荧光，而与DNA结合后其荧光强度增强1000倍以上。利用SYBR green进行PCR检测，随着产物量以指数形式增加，荧光强度也随之倍增，起到实时准确监控PCR反应过程的作用，即为荧光定量PCR。将ARMS技术与SYBR Green技术结合起来，便可以达到快速准确检测基因多态性的目的。
发明内容
为了克服传统检测技术的缺陷，本发明提供一种基于荧光PCR快速准确检测TYMS基因1494del6多态性的方法，通过设计等位基因特异性引物，结合SYBR Green技术，实现快速准确检测TYMS基因1494del6多态性。
为实现以上发明目的，本发明的基本技术方案如下：
一种基于荧光PCR检测TYMS基因多态性的方法，包括以下环节：
(1)等位基因特异性引物的设计：
针对TYMS基因1494del6多态性对应的两条等位基因分别设计等位基因特异性引物，作为上游引物，序列如下：
+6bp:5’-GTAGAGTGTGGTTATGAACTTTAA-3’
-6bp:5’-GTAGAGTGTGGTTATGAACTTTGT-3’
针对两条等位基因设计一条共通的下游引物，序列如下：
Rp:5’-ACAAAGCGTGGACGAATG-3’
(2)模板的制备:
提取被测样本的基因组DNA；
(3)实时定量PCR:
针对步骤(1)中的两条特异性上游引物和共通下游引物，建立被测样本的检测体系；
对被测样本同时设置两个反应体系；在第一个反应体系中，加入+6bp特异性引物、下游引物、2×SYBR Green Mastermix、被测样本基因组DNA，PCR等级的H2O补足体积；在第二个反应体系中，加入-6bp特异性引物、下游引物、2×SYBR Green Mastermix、被测样本基因组DNA，PCR等级的H2O补足体积；两个反应体系中对应组分的量相等；
将配制好的两个反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，观察被测样本在两个反应体系中扩增曲线，判断得出被测样本的基因型。
基于上述基本方案，本发明还做如下优化限定和改进：
扩增过程的最佳扩增参数为：95℃，2～5min；95℃，5～10sec；60℃，20-30sec；68℃，20～30sec；35～40个循环。
上述两个反应体系的总量均为20μL；在第一个反应体系中，加入+6bp特异性引物100nM-500nM、下游引物100nM-500nM、2×SYBR Green Mastermix 10μL、被测样本基因组DNA约10-50ng、PCR等级的H2O补足体积20μL；在第二个反应体系中，加入-6bp特异性引物100nM-500nM、下游引物100nM-500nM、2×SYBR Green Mastermix 10μL、被测样本基因组DNA约10-50ng、PCR等级的H2O补足体积20μL。
本发明与现有技术相比具有明显的有益效果：
1.避免假性结果产生。在本发明中，针对TYMS基因1494del6多态性设计的特异性引物具有很高的位点特异性；同时没有PCR后操作，避免了交叉污染，二者共同保证了检测的准确性，避免了假性结果的产生。
2.灵敏度高。在本发明中，只需10ng基因组DNA便可以进行准确的TYMS基因1494del6多态性检测，相比于传统的技术，大大提高了检测的灵敏度。
3.节省耗材和时间。基于本实验中特异性引物设计和PCR反应的特点，使得该方法可以很大程度上节省实验时间和耗材，检测过程只需要60min，整个实验也可以在4小时内全部完成。
附图说明
图1为按照本发明的方法+6bp/+6bp基因型样本的检测结果。
图2为按照本发明的方法+6bp/-6bp基因型样本的检测结果。
图3为按照本发明的方法-6bp/-6bp基因型样本的检测结果。
具体实施方式
本发明是一种利用荧光等位基因特异性PCR检测TYMS基因1494del6多态性的技术，可应用于体外TYMS基因1494del6多态性的分析。
本发明针对TYMS基因1494del6多态性所对应的两条等位基因，分别设计等位基因特异性引物，结合SYBR green技术，在荧光PCR完成后便可以通过扩增曲线准确判断样本TYMS基因1494del6多态性位点的具体基因型。包括以下步骤：
(1)等位基因特异性引物的设计：
针对TYMS基因1494del6多态性对应的两条等位基因设计分别设计等位基因特异性引物，作为上游引物，序列如下：
+6bp:5’-GTAGAGTGTGGTTATGAACTTTAA-3’
-6bp:5’-GTAGAGTGTGGTTATGAACTTTGT-3’
针对两条等位基因设计一条共通的下游引物，序列如下：
Rp:5’-ACAAAGCGTGGACGAATG-3’
(2)模板的制备:提取被测样本的基因组DNA
(3)实时定量PCR:针对步骤(1)中的两种特异性引物和共通下游引物，建立被测样本的检测体系；
每个被测样本均同时设置两个反应体系，总量均为20μL。
在第一个反应体系中，加入+6bp等位基因特异性引物100nM-500nM、下游引物100nM-500nM、2×SYBR Green Mastermix 10μL、被测样本基因组DNA约10-50ng、PCR等级的H2O补足体积20μL；
在第二个反应体系中，加入-6bp等位基因特异性引物100nM-500nM、下游引物100nM-500nM、2×SYBR Green Mastermix 10μL、被测样本基因组DNA约10-50ng、PCR等级的H2O补足体积20μL；
扩增过程的最佳扩增参数为：95℃，2～5min；95℃，5～10sec；60℃，20-30sec；68℃，20～30sec；35～40个循环。
将配制好的各反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，观察被测样本在两个反应体系中扩增曲线，进而判断被测样本的基因型。
如图1所示，该样本在第一个反应中(加入引物为+6bp等位基因特异性引物，下同)呈现出明显的扩增迹象(“S”曲线，下同)，而在第二个反应中(加入引物为-6bp等位基因特异性引物，下同)未呈现出明显的扩增迹象，表明该样本只含有+6bp等位基因，即为+6bp/+6bp基因型；
如图2所示，该样本在第一个和第二个反应中均呈现出明显的扩增迹象，表明该样本同时含有+6bp等位基因和-6bp等位基因，即为+6bp/-6bp基因型；
如图3所示，该样本在第一个反应中未呈现出明显的扩增迹象，而在第二个反应中呈现出明显的扩增迹象，表明该样本只含有-6bp等位基因，即为-6bp/-6bp基因型。
Figure BDA0000415171630000051
Figure BDA0000415171630000061

Claims (3)

1.一种基于荧光PCR检测TYMS基因多态性的方法，包括以下环节：
(1)等位基因特异性引物的设计：
针对TYMS基因1494del6多态性对应的两条等位基因分别设计等位基因特异性引物，作为上游引物，序列如下：
+6bp:5’-GTAGAGTGTGGTTATGAACTTTAA-3’
-6bp:5’-GTAGAGTGTGGTTATGAACTTTGT-3’
针对两条等位基因设计一条共通的下游引物，序列如下：
Rp:5’-ACAAAGCGTGGACGAATG-3’
(2)模板的制备:
提取被测样本的基因组DNA；
(3)实时定量PCR:
针对步骤(1)中的两条特异性上游引物和共通下游引物，建立被测样本的检测体系；
对被测样本同时设置两个反应体系；在第一个反应体系中，加入+6bp特异性引物、下游引物、2×SYBR Green Mastermix、被测样本基因组DNA，PCR等级的H2O补足体积；在第二个反应体系中，加入-6bp特异性引物、下游引物、2×SYBR Green Mastermix、被测样本基因组DNA，PCR等级的H2O补足体积；两个反应体系中对应组分的量相等；
将配制好的两个反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，观察被测样本在两个反应体系中扩增曲线，判断得出被测样本的基因型。
2.根据权利要求1所述的基于荧光PCR检测TYMS基因多态性的方法，其特征在于：扩增过程的扩增参数为：95℃，2～5min；95℃，5～10sec；60℃，20-30sec；68℃，20～30sec；35～40个循环。
3.根据权利要求1所述的基于荧光PCR检测TYMS基因多态性的方法，其特征在于：所述两个反应体系的总量均为20μL；在第一个反应体系中，加入+6bp特异性引物100nM-500nM、下游引物100nM-500nM、2×SYBR Green Mastermix 10μL、被测样本基因组DNA约10-50ng、PCR等级的H2O补足体积20μL；在第二个反应体系中，加入-6bp特异性引物100nM-500nM、下游引物100nM-500nM、2×SYBR Green Mastermix 10μL、被测样本基因组DNA约10-50ng、PCR等级的H2O补足体积20μL。
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