CN105255865A - Tyms基因表达量荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Tyms基因表达量荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105255865A
CN105255865A CN201510671928.7A CN201510671928A CN105255865A CN 105255865 A CN105255865 A CN 105255865A CN 201510671928 A CN201510671928 A CN 201510671928A CN 105255865 A CN105255865 A CN 105255865A
Authority
CN
China
Prior art keywords
kit
tyms
pcr reaction
follows
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510671928.7A
Other languages
English (en)
Inventor
刘小龙
张云
杨诚
高运臻
李雨阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Beisimai Medical Instrument Co Ltd
Original Assignee
Suzhou Beisimai Medical Instrument Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Beisimai Medical Instrument Co Ltd filed Critical Suzhou Beisimai Medical Instrument Co Ltd
Priority to CN201510671928.7A priority Critical patent/CN105255865A/zh
Publication of CN105255865A publication Critical patent/CN105255865A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Abstract

本发明涉及一种检测人TYMS基因突变的荧光定量PCR试剂盒，主要包括特异性引物和PCR反应试剂；所述特异性引物序列如下：上游引物：5’-ATCTTCCTCTGATGGCGCTG-3’下游引物：5’-AAAGGTCTGGGTTCTCGCTG-3’。本发明的有益效果主要体现在：本发明试剂盒用于检测人TYMS基因表达量，特异性好，灵敏度高，具有较好应用前景。

Description

TYMS基因表达量荧光定量PCR检测试剂盒及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种类胸苷酸合成酶(Thymidylatesynthase，TYMS)基因荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。
(二)背景技术
类胸苷酸合成酶(Thymidylatesynthase，TYMS)基因定位于18p11.32，全长16Kb，含7个外显子。TYMS表达产物为胸苷酸合成酶(TS)，TS为两个相同单位组成的二聚体蛋白质，每个亚单位的分子量是36kDa。胸苷酸合酶广泛存在于人体的细胞质中，主要功能是结合5，10-2亚甲基四氢叶酸(CH2FH4)，催化脱氧尿苷酸(BUMP)甲基化为脱氧胸苷酸(dTMP)，是dTMP从头合成的限速酶，而dTMP是核酸生物合成所必需的，是细胞内胸苷的唯一来源，抑制TS活性便可抑制肿瘤细胞的增殖。
对56例NSCLC术后组织标本进行免疫组化及RI-PCR测定发现，在癌组织中TS蛋白总阳性率为56％，临床病理特征分析后发现TS蛋白及基因在鳞癌中表达水平显著高于腺癌，差异具有统计学义，同时研究发现TS表达与分化程度亦密切相关(P<0.05)。对培美曲赛和多西他赛二线治疗NSCLC头对头的III期随机研究进行的回顾性分析发现，在对鳞癌的患者培美综述曲赛和多西他赛的中位生存分别为6.2个月，7.4个月(P＝0.018)，多西他赛好于培美曲赛；在对非鳞癌的患者，培美曲赛和多西他赛的中位生存分别为9.3个月和8.0个月(P＝0.048)，培美曲赛好于多西他赛；此研究显示可能正是鳞癌中TS的过表达降低了其对抗叶酸药物的敏感性。采用免疫组化及TaqManRTPCR法检测非小细胞肺癌患者癌组织及癌旁正常组织中TS蛋白和基因的表达情况发现，TS蛋白及基因在癌组织中均呈高表达，且TS蛋白及TS基因具有密切相关性。RTPCR扩增TSmRNA时得到两种不同DNA片段，分别为三倍重复(3R)和双倍重复(2R)型等位基因，其中具有3R/3R基因型的癌组织中TS表达水平显著高于其它基因型。由上可知，TS表达水平对评估NSCLC的生物学特性有重要作用，TS可能是预测NSCLC预后的潜在的重要分子标志物。现有的证据己经向我们揭示了TS作为未来NSCLC个体化治疗的重要的分子标志物的潜力。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种人TYMS基因荧光定量PCR检测试剂盒，用于检测人TYMS基因的表达，特异性好，灵敏度高。
本发明采用的技术方案是：
一种检测人TYMS基因突变的荧光定量PCR试剂盒，主要包括特异性引物和PCR反应试剂；所述特异性引物序列如下：
上游引物：5’-ATCTTCCTCTGATGGCGCTG-3’
下游引物：5’-AAAGGTCTGGGTTCTCGCTG-3’。
所述PCR反应试剂为本领域常规试剂，主要包括：dNTP、反转录缓冲液、PCR缓冲液、Mg2+、双蒸水、逆转录酶、Tag酶等，也可直接采用市售PCRMix成品。
所述试剂盒还可包括人TYMS基因检测标准品，所述标准品序列如下：
5’-ATCTTCCTCTGATGGCGCTGCCTCCATGCCATGCCCTCTGCCAGTTCTATGTGGTGAACAGTGAGCTGTCCTGCCAGCTGTACCAGAGATCGGGAGACATGGGCCTCGGTGTGCCTTTCAACATCGCCAGCTACGCCCTGCTCACGTACATGATTGCGCACATCACGGGCCTGAAGCCAGGTGACTTTATACACACTTTGGGAGATGCACATATTTACCTGAATCACATCGAGCCACTGAAAATTCAGCTTCAGCGAGAACCCAGACCTTT-3’。
标准品的制备：以Genebank中发布的人TYMS的基因序列为标准，以健康体检人的外周血mRNA为模板，反转录为cDNA。以该cDNA为模板，用上述引物扩增出特异性的PCR片段，然后把该PCR片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，nanodrop2000测定浓度和纯度，以此质粒作为检测分析中的标准品。
本发明还涉及所述的试剂盒在检测人TYMS基因表达量中的应用。
具体的，所述应用方法如下：
(1)采集待测样本，提取RNA；样本可以是血液、穿刺组织、石蜡组织、手术切除组织等；
(2)以样品RNA为模板，进行反转录反应，得到样品cDNA；
反转录反应：RNA模板0.1ug，反转录反应试剂(promega试剂盒)，双蒸水；反转录反应：25℃15min；50℃1hour；85℃5min；4℃，5min。
(3)以梯度浓度的人TYMS基因检测标准品为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增，绘制标准曲线；
(4)以样品cDNA为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增，扩增结果对照标准曲线，获得TYMS基因表达量。可以样品cDNA为模板，加入内参18s特异性引物(F：5’-AGAAACGGCTACCACATCCA-3’；R：5’-CACCAGACTTGCCCTCCA-3’)和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增，监控实验体系的可行性。
所述PCR反应条件如下：95℃预变性2min；95℃变性15s、60℃退火20s、72℃延伸20s(此处收集荧光信号)，40个循环。
本发明的有益效果主要体现在：本发明试剂盒用于检测人TYMS基因表达量，特异性好，灵敏度高，具有较好应用前景。
(四)附图说明
图1为标准曲线及3对(癌组织和癌旁组织)临床样本的检测结果；
图2为内参18s的扩增曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
(1)样品准备：取患者手术切除组织，提取RNA(浓度不小于100ng，A260/280不小于1.9)。
(2)样品处理：取100ng的RNA，加入反转录试剂(promega试剂盒)5μl，补双蒸水到20μl，按如下条件进行反转录反应：25℃15分钟；50℃1小时；85℃5分钟；4℃，5分钟。
(3)荧光定量PCR反应：
利用(2)中反转录产物为模板进行：取上述反转录模板5μl，加入0.1ml的8联排管中(含荧光定量PCR反应试剂15μl)。同时在标准管中(含荧光定量PCR反应试剂15μl)加入相应梯度浓度的标准品；在内参管(含荧光定量PCR反应试剂15μl，引物为内参18s特异性引物)中加入5μl上述cDNA模板。混匀。然后加入荧光定量反应引物，上机检测。在ABIStepOnePlus仪器上，选择标准曲线法和SYBR染料，进行PCR反应；
荧光定量PCR反应试剂组成如下：总体积：15μl；PCRMix(DBIBioscience)(10μl)引物集(0.2μl)，双蒸水(4.8μl)；
PCR反应条件如下：95℃预变性2min；95℃变性15s、60℃退火20s、72℃延伸20s(此处收集荧光信号)，40个循环。
(4)结果判读。根据标准品建立标准曲线，利用待测样品的Ct值，从该曲线上读取相应的TYMS基因表达量，结果参见图1，内参18s的扩增曲线参见图2；由图可见：本发明试剂盒可用于检测人TYMS基因表达量，特异性好，灵敏度高。

Claims (5)

1.检测人TYMS基因突变的荧光定量PCR试剂盒，主要包括特异性引物和PCR反应试剂；其特征在于所述特异性引物序列如下：
上游引物：5’-ATCTTCCTCTGATGGCGCTG-3’
下游引物：5’-AAAGGTCTGGGTTCTCGCTG-3’。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括人TYMS基因检测标准品，所述标准品序列如下：
5’-ATCTTCCTCTGATGGCGCTGCCTCCATGCCATGCCCTCTGCCAGTTCTATGTGGTGAACAGTGAGCTGTCCTGCCAGCTGTACCAGAGATCGGGAGACATGGGCCTCGGTGTGCCTTTCAACATCGCCAGCTACGCCCTGCTCACGTACATGATTGCGCACATCACGGGCCTGAAGCCAGGTGACTTTATACACACTTTGGGAGATGCACATATTTACCTGAATCACATCGAGCCACTGAAAATTCAGCTTCAGCGAGAACCCAGACCTTT-3’。
3.权利要求1所述的试剂盒在检测人TYMS基因表达量中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用方法如下：
(1)采集待测样本，提取RNA；
(2)以样品RNA为模板，进行反转录反应，得到样品cDNA；
(3)以梯度浓度的人TYMS基因检测标准品为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增，绘制标准曲线；
(4)以样品cDNA为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增，扩增结果对照标准曲线，获得TYMS基因表达量。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述PCR反应条件如下：95℃预变性2min；95℃变性15s、60℃退火20s、72℃延伸20s，40个循环。
CN201510671928.7A 2015-10-16 2015-10-16 Tyms基因表达量荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 Pending CN105255865A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510671928.7A CN105255865A (zh) 2015-10-16 2015-10-16 Tyms基因表达量荧光定量pcr检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510671928.7A CN105255865A (zh) 2015-10-16 2015-10-16 Tyms基因表达量荧光定量pcr检测试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105255865A true CN105255865A (zh) 2016-01-20

Family

ID=55095795

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510671928.7A Pending CN105255865A (zh) 2015-10-16 2015-10-16 Tyms基因表达量荧光定量pcr检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105255865A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111363825A (zh) * 2020-04-28 2020-07-03 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种人类tyms基因表达水平检测试剂盒及使用方法
CN111455055A (zh) * 2020-04-28 2020-07-28 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种人类tyms基因表达量检测标准对照品

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103088122A (zh) * 2012-12-07 2013-05-08 周宏灏 一种检测 TYMS mRNA 基因表达量的试剂盒及方法
CN103757094A (zh) * 2013-11-15 2014-04-30 陕西佰美基因股份有限公司 一种基于荧光pcr检测tyms基因多态性的方法
CN104946639A (zh) * 2015-07-01 2015-09-30 益善生物技术股份有限公司 构建基因突变测序文库的引物和方法以及试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103088122A (zh) * 2012-12-07 2013-05-08 周宏灏 一种检测 TYMS mRNA 基因表达量的试剂盒及方法
CN103757094A (zh) * 2013-11-15 2014-04-30 陕西佰美基因股份有限公司 一种基于荧光pcr检测tyms基因多态性的方法
CN104946639A (zh) * 2015-07-01 2015-09-30 益善生物技术股份有限公司 构建基因突变测序文库的引物和方法以及试剂盒

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111363825A (zh) * 2020-04-28 2020-07-03 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种人类tyms基因表达水平检测试剂盒及使用方法
CN111455055A (zh) * 2020-04-28 2020-07-28 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种人类tyms基因表达量检测标准对照品
CN111455055B (zh) * 2020-04-28 2021-11-16 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种人类tyms基因表达量检测标准对照品

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sun et al. Increased expression of lncRNA HULC indicates a poor prognosis and promotes cell metastasis in osteosarcoma
EP3842554B1 (en) Biomarkers for response to pi3k inhibitors
Shibahara et al. IDH1/2 gene status defines the prognosis and molecular profiles in patients with grade III gliomas
CN109797219A (zh) 检测abracl表达水平的试剂的应用和试剂盒
CN105950706A (zh) 确定肝细胞癌亚型和检测肝癌干细胞的方法
CN103451282B (zh) 用于检测BRCA1mRNA的核酸检测试剂盒
Josefsson et al. Circulating tumor cells mirror bone metastatic phenotype in prostate cancer
JP2019537436A (ja) 進行性胃癌患者の手術後の予後または抗癌剤適合性予測システム
Argadal et al. Long noncoding RNA MALAT1 may be a prognostic biomarker in IDH1/2 wild-type primary glioblastomas
CN106148348A (zh) 一组胃癌rna分子标志物及其应用
CN114107492B (zh) 一种用于肿瘤分子分型、治疗用药评估的分子标志物及其检测引物和试剂盒
CN109182529A (zh) 检测egfr基因t790m、c797s及l798i位点的特异性探针及试剂盒
CN101445829B (zh) Egfr基因突变位点的检测探针、液相芯片及其检测方法
CN105255865A (zh) Tyms基因表达量荧光定量pcr检测试剂盒及其应用
CN106755309A (zh) 分子标记物在制备胰腺癌预后评估产品中的应用
Kubota et al. miR-125b and miR-100 are predictive biomarkers of response to induction chemotherapy in osteosarcoma
CN109852698A (zh) 检测环指蛋白32表达水平的试剂的应用和试剂盒
CN112813167B (zh) 标志物linc01977及其应用
Odenheimer-Bergman et al. Biology of circulating DNA in health and disease
WO2012088067A1 (en) Methods for predicting and/or determining responsiveness to a histone deacetylase (hdac) inhibitor
CN105603069A (zh) 一种Bim基因缺失荧光定量PCR检测引物及探针、检测试剂盒
CN102409087B (zh) 一种用于测定β-微管蛋白III 基因表达的引物、探针及检测试剂盒
CN110358829A (zh) 检测重组人肽基脯氨酰顺反异构酶-h表达水平的试剂的应用和试剂盒
Anderson et al. Reliable gene expression measurements from fine needle aspirates of pancreatic tumors: effect of amplicon length and quality assessment
CN101586154A (zh) 预测表皮生长因子受体抑制剂疗效的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160120