CN109182529A - 检测egfr基因t790m、c797s及l798i位点的特异性探针及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测EGFR基因T790M、C797S及L798I位点的特异性探针及试剂盒，所述特异性探针为核酸序列并包含非配对区、突变检测区、配对区；非配对区和配对区的碱基序列分别与待测位点的特异性序不配对和配对；突变检测区的碱基种类与待测位点的突变位点突变前或突变后的碱基种类相配对；所述非配对区的一个碱基修饰有第一修饰基团，配对区的第一个碱基修饰有第二修饰基团；第一修饰基团和第二修饰基团为相配合的荧光基团和淬灭基团。本发明提供的特异性探针及试剂盒，具有高灵敏度、高特异性，并对假阳性现象有强烈抑制的特点，可帮助肿瘤病人进行微创的基因突变检测，在肿瘤早筛，用药指导及预后监测等方面有重要作用的临床应用。

Description

检测EGFR基因T790M、C797S及L798I位点的特异性探针及试 剂盒
技术领域
本发明涉及基因突变检测技术领域，尤其涉及检测EGFR基因T790M、C797S及L798I位点的特异性探针及试剂盒。
背景技术
表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是酪氨酸激酶家族成员，同时是原癌基因HER-1的表达产物。EGFR作为介导表皮生长因子(EGF)，同时也是启动细胞增殖和信号传导的重要受体，其在体细胞中的基因突变或者表达异常，与诸多实体瘤的发生发展紧密相关，特别是非小细胞肺癌。数据显示，40％以上中国的非小细胞肺癌患者存在EGFR基因突变。对于EGFR基因突变引起的肺癌，国际上公认的治疗方案是采用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)进行治疗。研究表明，EGFR的不同突变类型将改变TKI制剂的敏感性。因此，在肺癌患者的治疗中，针对EGFR基因突变的靶标检测及靶向治疗，对于患者在治疗中的受益至关重要。
研究还发现，部分EGFR-TKI初始有效的患者后期会发生耐药，该现象与EGFR 20号外显子的T790M、C797S突变的产生密切相关。即以上EGFR基因突变位点对使用了第一代、第二代酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，如厄洛替尼和吉非替尼会产生抗性，从而发生耐药现象，临床提示需要更换第三代TKI药物如AZD9291进行治疗。更进一步来说，C797S与T790M在体内的顺/反式突变直接关系到了采用一代与三代联合TKI能否解决突变组合带来的药物结合受阻问题。最新数据显示，当针对EGFR的T790M突变位点的第三代不可逆转的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)使用后，仍将出现耐药现象，即EGFR的L798I和C797S作为继发性耐药基因突变位点，可导致第一、第三代EGFR-TKI耐药。
目前在临床上，EGFR的突变检测大部分是基于肿瘤的组织样本，而肿瘤组织样本大部分来源自穿刺和活检钳活检，该技术作为一种有创检测，一方面给病人带来极大的痛楚，另一方面在后期由于样本难以获取，导致无法对病人靶向用药的情况进行实时监测。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是肿瘤患者体内从肿瘤细胞释放到外周血循环中的肿瘤DNA，可作为一种新的肿瘤标志物,代替肿瘤组织样本检测，从而对肿瘤的早期筛查、鉴定、预后和治疗检测方面具有重要意义。有研究表明，在对癌症患者治疗过程中进行多次的液体活检，发现检测ctDNA可以预测治疗结果，如对术后化疗的抗性，并且在一些情况下比传统临床方法能更提早发现复发情况，使得患者在治疗中受益。而目前针对ctDNA液体活检技术大多操作复杂，具有强烈的仪器依赖性，不适用于大规模临床推广。
基于此现状，有必要提供一种可针对上述3个EGFR基因位点的检测试剂，其检测下限低，特异性高，能够在EGFR-TKI治疗过程中实时、定量监测ctDNA上T790M、C797S及L798I位点的突变及其变化情况，指导患者及时更换治疗方案，便于患者从EGFR-TKI的治疗中受益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可针对上述3个EGFR基因位点的检测试剂，其检测下限低，特异性高，能够在EGFR-TKI治疗过程中实时、定量监测ctDNA上T790M、C797S、L798I位点的突变及其变化情况，指导患者及时更换治疗方案，便于患者从EGFR-TKI的治疗中受益。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了检测EGFR基因的特异性探针，适用于EGFR基因T790M或C797S或L798I位点的基因突变检测；所述特异性探针为一核酸序列，沿其5'端至3'端的方向依序包含非配对区、突变检测区、配对区；
所述非配对区的碱基序列与待测位点的特异性序列不配对，所述配对区的碱基序列与待测位点的特异性序列配对；所述突变检测区包含一个核苷酸，该核苷酸的碱基种类与待测位点的突变位点突变前或突变后的碱基种类相配对；
所述非配对区沿所述方向的第一个核苷酸的碱基修饰有第一修饰基团；所述配对区沿所述方向的第一个核苷酸的碱基修饰有第二修饰基团；第一修饰基团和第二修饰基团为相互配合的荧光基团和淬灭基团。
在图1中示意性地描述了本发明特异性探针的结构，可以看到，该特异性探针1沿5'端至3'端的方向，包括非配对区11、突变检测区12、配对区13。
其中，非配对区11的碱基序列与待测基因2相应位点的特异性序列不配对，而配对区13的碱基序列与待测基因2相应位点的一段特异性序列相匹配。所述突变检测区12则包含一个核苷酸，该核苷酸的碱基种类与待测基因2相应突变位点在突变前或突变后的碱基种类相配对。
由于EGFR基因的T790M、C797S、L798I位点的耐药突变均表现为在某一特定位置的碱基由原有的C突变为T，因而，为检测待测基因的相应位点是否发生如上突变，所述特异性探针还具有如下结构：所述非配对区11沿5'端至3'端方向的第一个核苷酸的碱基修饰有第一修饰基团，所述配对区13沿5'端至3'端方向的第一个核苷酸的碱基修饰有第二修饰基团，第一修饰基团和第二修饰基团为相互配合的荧光基团和淬灭基团。
这样，进一步参照图2a-2b，其示出了待测基因的相应位点发生耐药突变或未发生耐药突变时的探针杂交原理图。在图示的实施例中，所述突变检测区12所包含的核苷酸的碱基种类与待测基因2相应突变位点在突变后的碱基种类相配对。
在图2a中，待测基因2的相应突变位点发生耐药突变。在图示中，该突变位点的碱基发生突变后，其与突变检测区12所包含的核苷酸的碱基相配对，在待测基因2变性并解开双链后，特异性探针1与待测基因2从该突变位点开始杂交结合。
在目的为基因检测的PCR扩增反应中，常采用Taq酶作为DNA聚合酶，并结合引物及游离的dNTP，完成后续的退火和延伸步骤。在此过程中，Taq酶还起到切断探针，使其产生相应的荧光信号的作用，这是由于Taq酶具有5'端→3'端的外切酶活性，能够将遇到的的杂交后的探针从其第一个匹配的碱基后开始逐个切割。
因而，图2a示出了发生突变后，特异性探针1与待测基因2从该突变位点，也即为突变检测区12开始杂交结合。Taq酶则从下一个匹配的碱基位置，也即为配对区13沿5'端至3'端方向的第一个碱基，开始逐个切割。由于该位置核苷酸的碱基修饰有第二修饰基团，且第一修饰基团和第二修饰基团为相互配合的荧光基团和淬灭基团，因而，相远离的两修饰基团中的荧光基团发出荧光信号。在图示实施例中，第二修饰基团为荧光基团，其发出荧光信号，在模版被一定量扩增过后，该荧光信号被相应的荧光检测设备检测。
在图2b中示出了未发生突变的情况，其中突变位点的碱基由于未发生突变，其与突变检测区12所包含的核苷酸的碱基不配对，此时，特异性探针1与待测基因2从配对区13的第一个碱基位置起杂交结合，这使得Taq酶则从下一个匹配的碱基位置开始切割，从而荧光基团和淬灭基团未发生远离，从而未产生荧光信号，因而即便经过多次扩增，也无法检测到荧光信号。如此，从检测结果反推即可获得作为扩增模版的待测ctDNA的EGFR基因的相应位点是否发生耐药突变。
在现有技术中，常采用ARMS+Taqman探针的方法进行定量PCR检测。然而，常规的ARMS+Taqman探针的检测方法，由于ARMS技术的原理是引物的3'端碱基只有完全匹配才会延伸扩增，但是实际应用时，即使是不匹配的碱基也会延伸并产生信号，导致非特异的产生，因而其产生的假阳性现象是困扰检测判断的重要因素。本发明提供的特异性探针，其与待测模版的结合能力强，结合PCR定量检测技术，具有高灵敏度、高特异性，并对假阳性现象有强烈抑制的特点，从而为患者EGFR-TKI用药、耐药研究及提供强有力的工具。
在某一可能的实施例中：所述突变检测区所包含的核苷酸的碱基种类与待测位点的突变位点突变后的碱基种类相配对，这样的配置使得在待测基因发生突变的情况下，具有荧光信号，以被检测，否则在相反的配置情况下，未发生突变时具有荧光信号，仍然可能需要以其他更为复杂的方式来鉴别在大量待测基因中是否存在发生耐药突变的少量待测基因。
在某一可能的实施例中：所述特异性探针的3'端末位碱基修饰一C3Spacer基团，用于封闭3'端，避免探针延伸；
所述荧光基团采用以下所述基团中的一种，其包括但不限于：ALEXA350、FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Texas Red、Cy5、Cy5.5、TAMRA；
所述淬灭基团采用以下所述基团中的一种，其包括但不限于：Dabcyl、BHQ、QYS-7。
在某一可能的实施例中：所述非配对区的长度为包括3-5个碱基对；所述配对区的长度为包括15-25个碱基对，以使得探针与模版的结合更为稳定。
在某一可能的实施例中：所述特异性探针为T790M-P，其用于T790M位点的基因突变检测；T790M-P的碱基序列为：5'-CAC-A-TGATGAGCTGCACGGTGGA-3'SEQ ID NO:1；
其中，所述非配对区包含的碱基序列为CAC，所述突变检测区的包含的碱基序列为A，所述配对区包含的碱基序列为TGATGAGCTGCACGGTGGA。
在某一可能的实施例中：所述特异性探针为C797S-P，其用于C797S位点的基因突变检测；C797S-P的碱基序列为：5'-ATC-A-GCCGAAGGGCATGAGCTGCGT-3'SEQ ID NO:2；
其中，所述非配对区包含的碱基序列为ATC，所述突变检测区的包含的碱基序列为A，所述配对区包含的碱基序列为GCCGAAGGGCATGAGCTGCGT。
在某一可能的实施例中：所述特异性探针为L798I-P，其用于L798I位点的基因突变检测；L798I-P的碱基序列为：5'-CAC-A-TCCTGGACTATGTCCGGGAACAC-3'SEQ ID NO:3；
其中，所述非配对区包含的碱基序列为CAC，所述突变检测区的包含的碱基序列为A，所述配对区包含的碱基序列为TCCTGGACTATGTCCGGGAACAC。
基于以上的发明精神，为实现上述目的，本发明的第二方面提供了检测EGFR基因的试剂盒，该试剂盒适可用于EGFR基因T790M或C797S或L798I位点的基因突变检测，所述试剂盒包含上述技术方案中所述的特异性探针。
基于以上的发明精神，为实现上述目的，本发明的第三方面提供了一种检测EGFR基因的试剂盒，所述试剂盒适用于同时对EGFR基因T790M、C797S及L798I位点进行基因突变检测，其包含已构建的3种PCR反应体系，所述3种反应体系分别包含以下3种特异性探针和对应的3对特异性引物中的一种，以及Taq酶；
特异性探T790M-P，其碱基序列为：5'-CAC-A-TGATGAGCTGCACGGTGGA-3'SEQ IDNO:1，所述5'端标记有BHQ淬灭基团，所述3'端标记有C3Spacer基团，由5'端至3'端的第一个T碱基标记有HEX荧光基团；
特异性探C797S-P，其碱基序列为：5'-ATC-A-GCCGAAGGGCATGAGCTGCGT-3'SEQ IDNO:2，所述5'端标记有BHQ淬灭基团，所述3'端标记有C3Spacer基团，由5'端至3'端的第一个G碱基标记有HEX荧光基团；
特异性探L798I-P，其碱基序列为：5'-CAC-A-TCCTGGACTATGTCCGGGAACAC-3'SEQID NO:3，所述5'端标记有BHQ淬灭基团，所述3'端标记有C3Spacer基团，由5'端至3'端的第一个T碱基标记有FAM荧光基团；
所述3对特异性引物包括：
用于扩增T790M待测位点的上游引物序列T790M-F：5'-CCGAAGGGCATGAGGTGCA-3'SEQ ID NO:4，以及下游引物序列T790M-R：5'-CAGCGTGGACAACCCCCA-3'SEQ ID NO:5；
用于扩增C797S待测位点的上游引物序列C797S-F：5'-CATCTGCCTCACCTCCACCG-3'SEQ ID NO:6，以及下游引物序列C797S-R：5'-TCCCGGACATAGTCCAGGAT-3'SEQ ID NO:7；
用于扩增L798I待测位点的上游引物序列L798I-F：5'-CTCATGCCCTTCGGCGGCA-3'SEQ ID NO:8，以及下游引物序列L798I-R：5'-TGAGCAGGTACTGGGAGCCA-3'SEQ ID NO:9。
在某一可能的实施例中：所述反应体系还包含内控引物和内控探针，以对检测结果提供参照；所述内控引物和内控探针的碱基序列如下：
内控上游引物Globin-F：5'-GTCTGCCGTTACTGCCCTG-3'SEQ ID NO:10；
内控下游引物Globin-R：5'-AACCTTGATACCAACCTGCC-3'SEQ ID NO:11；
内控探针Globin-P：5'-VIC-GCAAGGTGAACGTGGATGAAGTT-BHQ-3'SEQ ID NO:12，其中所述VIC基团为荧光基团，所述BHQ基团为淬灭基团。
附图说明
图1示出了本发明实施例中特异性探针的结构示意图；
图2a示出了图1所示的实施例中特异性探针与待测基因相应位点的杂交结合情况，其中待测基因相应位点发生突变；
图2b示出了图1所示的实施例中特异性探针与待测基因相应位点的杂交结合情况，其中待测基因相应位点未发生突变；
图3a-3c分别示出了实施例一中对应T790M位点、C797S位点及L798I位点的突变质粒模板和野生型质粒模版在扩增过程中的扩增曲线；
图4a-4c分别示出了实施例二中对应T790M位点、C797S位点及L798I位点的突变质粒模板扩增过程中的梯度稀释扩增曲线。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例选择以上所述的特异性探针T790M-P、C797S-P、L798I-P以及相应的特异性引物，构建PCR反应体系。
具体的，选择浓度均为2×103copies/μl的人工构建的EGFR基因在T790M、C797S及L798I位点的突变质粒标准品和2×106copies/μl野生型质粒标准品作为反应模板，突变质粒与野生型型质粒的比例为1：1000。分3管10μl的PCR反应体系分别检测以上3个突变位点。第一管内含有1μl T790M突变质粒和1ul野生型质粒模板，10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl，0.5U Taq酶，3.5mmol/L Mg2+，10mM/L dNTP,0.45μmol/L的T790M-P探针，0.3μmol/L T790M上游引物，0.3μmol/T790M下游引物。第二管内含有1μl C797S突变质粒和1ul野生型质粒模板，10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl，0.5U Taq酶，3.5mmol/LMg2+，10mM/L dNTP,0.45μmol/L的C797S-P探针，0.3μmol/L C797S上游引物，0.3μmol/C797S下游引物。第三管内含有1μl L798I突变质粒和1ul野生型质粒模板，10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl，0.5U Taq酶，3.5mmol/L Mg2+，10mM/L dNTP,0.45μmol/L的L798I-P探针，0.3μmol/L L798I上游引物，0.3μmol/L798I下游引物。PCR反应程序为：95℃5分钟；95℃15秒，60℃20秒，72℃20秒，45个循环；在60℃退火阶段采集荧光信号。
结果如图3a、3b、3c所示，其分别为对应T790M位点、C797S位点及L798I位点的突变质粒模板和野生型质粒模版在扩增过程中所呈现的实验结果。可以看出，各突变质粒模板在1:1000的野生型对参背景下均有如图示的荧光信号的变化和扩增曲线1A、1B、1C的生成，而分别如图示的2A、2B、2C，野生型模板均无特异性扩增，未检测到荧光信号的变化。因而本发明所提供的特异性探针及特异性引物具有特异性良好、准确的检测效果。
实施例二
本实施例选择以上所述的特异性探针T790M-P、C797S-P、L798I-P以及相应的特异性引物，构建PCR反应体系。
选择用量为2×106copies/ul、2×105copies/ul、2×104copies/ul、2×103copies/ul、2×102copies/ul、2×101copies/ul、2×100copies/ul(即10倍梯度稀释)的人工构建的EGFR基因在T790M、C797S及L798I位点的突变基因质粒标准品作为反应模板。10μl的PCR反应体系分别对以上3个突变位点进行灵敏度考察分析。第一管到第七管内皆含有10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl，0.5U Taq酶，3.5mmol/L Mg2+，10mM/LdNTP，0.45μmol/L的T790M-P探针，0.3μmol/L T790M上游引物，0.3μmol/T790M下游引物，第一管到第七管依次加入以上浓度的T790M突变基因质粒标准品1ul作为模板。第八管到第十四管内皆含有，10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl，0.5U Taq酶，3.5mmol/LMg2+，10mM/L dNTP，0.45μmol/L的C797S-P探针，0.3μmol/L C797S上游引物，0.3μmol/C797S下游引物，第八管到第十四管依次加入以上浓度的C797S突变基因质粒标准品1ul作为模板。第十五管到第二十一管内含有10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl，0.5UTaq酶，3.5mmol/L Mg2+，10mM/L dNTP，0.45μmol/L的L798I-P探针，0.3μmol/L L798I上游引物，0.3μmol/L798I下游引物，第十五管到第二十一管依次加入以上浓度的T790M突变基因质粒标准品1ul作为模板。PCR反应程序为：95℃5分钟；95℃15秒，60℃20秒，72℃20秒，45个循环；在60℃退火阶段采集荧光信号。
结果如图4a、4b、4c所示，其分别为对应T790M位点、C797S位点及L798I位点的突变质粒模板在扩增过程中呈现的扩增曲线，从曲线中可看出对应该三个位点的10倍梯度稀释样本的扩增曲线均具有较好的梯度，且从图示分别对应的3A、3B、3C的扩增曲线说明该检测体系的检测下限达到单拷贝级别，因而本发明所提供的特异性探针具有较高的灵敏性。
实施例三
本实施例以EGFR基因T790M位点为研究对象，将86个非小细胞肺癌患者样本利用本文所述检测方法对这86个样本进行T790M位点突变检测，并以厦门艾德生物推出的人类EGFR基因突变检测试剂盒为参照。本实施例选择以上所述的特异性探T790M-P以及相应的特异性引物，构建PCR反应体系。运用该两种检测方法的检测结果见表1。
表1本发明实施例与艾德生物试剂盒的检测结果对照表
T790M位点突变 本实施例检测方法 艾德生物试剂盒
是 2 2
否 84 84
从该表1中看出，本发明提供的特异性探针和试剂盒与市场上成熟产品的检测结果相同，具有良好的检测水平，可得到准确可信的检测结果。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制其专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 厦门基科生物科技有限公司
<120> 检测EGFR基因T790M、C797S及L798I位点的特异性探针及试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
cacatgatga gctgcacggt gga 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
atcagccgaa gggcatgagc tgcgt 25
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 3
cacatcctgg actatgtccg ggaacac 27
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgaagggca tgaggtgca 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 5
cagcgtggac aaccccca 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 6
catctgcctc acctccaccg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 7
tcccggacat agtccaggat 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcatgccct tcggcggca 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 9
tgagcaggta ctgggagcca 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 10
gtctgccgtt actgccctg 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 11
aaccttgata ccaacctgcc 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 12
gcaaggtgaa cgtggatgaa gtt 23

Claims (10)

1.检测EGFR基因的特异性探针，所述探针适用于EGFR基因T790M或C797S或L798I位点的基因突变检测，其特征在于：所述特异性探针为一核酸序列，沿其5'端至3'端的方向依序包含非配对区、突变检测区、配对区；
所述非配对区的碱基序列与待测位点的特异性序列不配对，所述配对区的碱基序列与待测位点的特异性序列配对；所述突变检测区包含一个核苷酸，该核苷酸的碱基种类与待测位点的突变位点突变前或突变后的碱基种类相配对；
所述非配对区沿所述方向的第一个核苷酸的碱基修饰有第一修饰基团；所述配对区沿所述方向的第一个核苷酸的碱基修饰有第二修饰基团；第一修饰基团和第二修饰基团为相互配合的荧光基团和淬灭基团。
2.如权利要求1所述的特异性探针，其特征在于：所述突变检测区所包含的核苷酸的碱基种类与待测位点的突变位点突变后的碱基种类相配对。
3.如权利要求2所述的特异性探针，其特征在于：所述特异性探针的3'端末位碱基修饰一C3 Spacer基团；
所述荧光基团采用以下所述基团中的一种，其包括但不限于：ALEXA350、FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Texas Red、Cy5、Cy5.5、TAMRA；
所述淬灭基团采用以下所述基团中的一种，其包括但不限于：Dabcyl、BHQ、QYS-7。
4.如权利要求3所述的特异性探针，其特征在于：所述非配对区的长度为包括3-5个碱基对；所述配对区的长度为包括15-25个碱基对。
5.如权利要求3所述的特异性探针，其特征在于：所述特异性探针为T790M-P，其用于T790M位点的基因突变检测；T790M-P的碱基序列为：5'-CAC-A-TGATGAGCTGCACGGTGGA-3'SEQ ID NO:1；
其中，所述非配对区包含的碱基序列为CAC，所述突变检测区的包含的碱基序列为A，所述配对区包含的碱基序列为TGATGAGCTGCACGGTGGA。
6.如权利要求3所述的特异性探针，其特征在于：所述特异性探针为C797S-P，其用于C797S位点的基因突变检测；C797S-P的碱基序列为：5'-ATC-A-GCCGAAGGGCATGAGCTGCGT-3'SEQ ID NO:2；
其中，所述非配对区包含的碱基序列为ATC，所述突变检测区的包含的碱基序列为A，所述配对区包含的碱基序列为GCCGAAGGGCATGAGCTGCGT。
7.如权利要求3所述的特异性探针，其特征在于：所述特异性探针为L798I-P，其用于L798I位点的基因突变检测；L798I-P的碱基序列为：5'-CAC-A-TCCTGGACTATGTCCGGGAACAC-3'SEQ ID NO:3；
其中，所述非配对区包含的碱基序列为CAC，所述突变检测区的包含的碱基序列为A，所述配对区包含的碱基序列为TCCTGGACTATGTCCGGGAACAC。
8.检测EGFR基因的试剂盒，所述试剂盒适用于EGFR基因T790M或C797S或L798I位点的基因突变检测，其特征在于：所述试剂盒包含如权利要求5-7中任一一项所述的特异性探针。
9.检测EGFR基因的试剂盒，所述试剂盒适用于同时对EGFR基因T790M、C797S及L798I位点进行基因突变检测，其特征在于：所述试剂盒包含已构建的3种PCR反应体系，所述3种反应体系分别包含以下3种特异性探针和对应的3对特异性引物中的一种，以及Taq酶；
特异性探针T790M-P，其碱基序列为：5'-CAC-A-TGATGAGCTGCACGGTGGA-3'SEQ ID NO:1，所述5'端标记有BHQ淬灭基团，所述3'端标记有C3 Spacer基团，由5'端至3'端的第一个T碱基标记有HEX荧光基团；
特异性探针C797S-P，其碱基序列为：5'-ATC-A-GCCGAAGGGCATGAGCTGCGT-3'SEQ IDNO:2，所述5'端标记有BHQ淬灭基团，所述3'端标记有C3 Spacer基团，由5'端至3'端的第一个G碱基标记有HEX荧光基团；
特异性探针L798I-P，其碱基序列为：5'-CAC-A-TCCTGGACTATGTCCGGGAACAC-3'SEQ IDNO:3，所述5'端标记有BHQ淬灭基团，所述3'端标记有C3 Spacer基团，由5'端至3'端的第一个T碱基标记有FAM荧光基团；
所述3对特异性引物包括：
用于扩增T790M待测位点的上游引物序列T790M-F：5'-CCGAAGGGCATGAGGTGCA-3'SEQID NO:4，以及下游引物序列T790M-R：5'-CAGCGTGGACAACCCCCA-3'SEQ ID NO:5；
用于扩增C797S待测位点的上游引物序列C797S-F：5'-CATCTGCCTCACCTCCACCG-3'SEQID NO:6，以及下游引物序列C797S-R：5'-TCCCGGACATAGTCCAGGAT-3'SEQ ID NO:7；
用于扩增L798I待测位点的上游引物序列L798I-F：5'-CTCATGCCCTTCGGCGGCA-3'SEQID NO:8，以及下游引物序列L798I-R：5'-TGAGCAGGTACTGGGAGCCA-3'SEQ ID NO:9。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述反应体系还包含内控引物和内控探针；所述内控引物和内控探针的碱基序列如下：
内控上游引物Globin-F：5'-GTCTGCCGTTACTGCCCTG-3'SEQ ID NO:10；
内控下游引物Globin-R：5'-AACCTTGATACCAACCTGCC-3'SEQ ID NO:11；
内控探针Globin-P：5'-VIC-GCAAGGTGAACGTGGATGAAGTT-BHQ-3'SEQ ID NO:12，其中所述VIC基团为荧光基团，所述BHQ基团为淬灭基团。
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