CN109112187A - 一种封闭探针介导的ARMS-ddPCR检测基因突变的试剂盒 - Google Patents
一种封闭探针介导的ARMS-ddPCR检测基因突变的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种封闭探针介导的ARMS‑ddPCR检测基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括：ARMS引物，与ARMS引物配对进行PCR扩增的下游引物或上游引物，野生型封闭探针，和检测探针。本发明的封闭探针与ARMS引物方向相同，封闭探针与ARMS引物在模板结合区有重叠或者封闭探针不能被水解，从而达到封闭ARMS引物对野生型模板的非特异性扩增的效果。
Description
技术领域
本发明涉及微液滴数字PCR技术领域，具体涉及一种封闭探针介导的ARMS-ddPCR检测基因突变的试剂盒。
背景技术
等位基因特异性PCR(ARMS-PCR)已在多个文献和专利中进行描述，已知引物3’末端核苷酸是区分是否与目标序列完全匹配的核苷酸，但该核苷酸并不能完全决定扩增特异性，等位基因特异性PCR中的特异性主要是错配引物远远低于完全匹配引物的延伸速度，从而降低了错配目标的相对扩增效率。但该过程是动态平衡的，降低的延伸动力学及由此而来的PCR扩增特异性还受其他许多因素影响：包括酶的错配碱基识别能力、反应组分、退火延伸温度及引物全部序列背景。这些因素对每一个具体引物的影响都可能不相同，无法定量估计。因此，等位基因特异性PCR引物的设计存在很多不确定性，需要大量的反复实验。为了提高扩增特异性，也有报道在除了3’末端核苷酸之外的其他序列位置人为引入错配碱基，从而降低非特异扩增；或者通过引入某些核苷酸的化学修饰来降低非特异性扩增。但这些人工错配碱基或额外的化学修饰在提高扩增特异性的同时，可能会降低完全匹配引物的扩增效率，造成检测灵敏度下降。
随着数字PCR发展，基于微液滴的数字PCR技术(ddPCR)在稀有突变检测中凸显出极大优势，该技术基于微流控芯片，可生成数微米到数百微米的液滴，液滴的体积通常为皮升到纳升级别，可以包裹单分子。为了便于生化反应，微液滴可以是惰性油通过生物相容性的表面活性剂包裹水相的形式。微液滴可以看作皮/纳升尺度的试管，常见的生物化学可以在微液滴中实现。ddPCR独特的优势如下：(1)灵敏度高，一个液滴可包含单个分子或细胞，在物理层面实现单分子级检测；(2)准确性强，每次微流体芯片可生成数百万个微液滴，对逐个微液滴统计，通过泊松分布计算模板数量，可实现数字化，结论可靠；(3)反应全封闭，生化反应局限于惰性油包裹的水相中，不会对下次反应造成污染；(4)全集成，微液滴的生成、融合、注射、分割、计数、分选、检测都是在流体运动中，易于集成；(5)试剂成本低，每次皮升级的进样量可节省昂贵的生物试剂。目前，基于微液滴技术的研究工作和各种应用领域发表在Cell、Nature、Nature Biotechnology、PNAS等高水平杂志上。可以预见，随着检测技术的不断改进，敏感性和特异性的不断提高，微液滴技术将在核酸检测和分子诊断领域发挥巨大的应用价值。
近年来，肺癌仍是威胁人类健康的首要恶性肿瘤。据WHO报道，全球肺癌新发病例约161万例，死亡约138万例，分别占恶性肿瘤新发病例及死亡病例的13％及18％，居恶性肿瘤第一位，其中非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)占肺癌的80％以上。尽管肺癌的诊断方法和治疗手段不断提高，肺癌的死亡率仍未得到有效控制，患者的预后较差，5年生存率仍<20％。我国肺癌发病率和死亡率持续高居首位，每年新增肺癌病例约73万，严重危害大众健康。随着个体化医疗观念的不断深入，精准医疗正逐渐成为肿瘤治疗的新方向，检测特定基因突变可以为医生的个体化诊疗提供靶向用药的参考。受体酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是近年来肺癌治疗的热点靶向药物，与传统放化疗药物相比，靶向药可明显延长肿瘤患者生存期，改善生存质量。
研究表明，表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制物(TKI)吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼等被证明对具有EGFR激活突变的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者具有显著疗效，EGFR-TKI成为非小细胞肺癌靶向治疗的里程碑。当EGFR酪氨酸激酶区(tyrosine kinase，TK)发生突变时，可使酪氨酸激酶抑制剂治疗晚期NSCLC患者的有效率达到80％以上。
表皮生长因子受体EGFR，也称为HER-1或ErbB1，是生长因子受体的I类酪氨酸激酶家族成员，这些膜结合蛋白可调控Ras/MAPK/PI3K/AKT等信号通路，从而调节细胞增殖、分化和存活。EGFR基因位于七号染色体(7p12)，长188307bp，共有28个外显子，其酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码，在调节细胞增殖及分化中起着至关重要的作用。EGFR基因突变是一种体细胞突变。已知EGFR突变主要位于外显子18-21；NSCLC患者其EGFR突变80％以上发生的突变为外显子l9的缺失突变(D19)及外显子21的L858R突变。EGFR-TKI药物对于EGFRL858R和EGFR外显子19缺失突变的患者作用显著，其中D19缺失突变占约46％，而L858R突变占约42％。EGFR基因19外显子缺失突变类型多，已报道的有20种以上，这些19外显子突变均为缺失型非移码突变，例如缺失9个、12个、15个、18个和24个核苷酸的缺失突变，有效检测这些缺失型非移码突变可以为靶向治疗提供参考依据，同时可对肺癌患者进行高灵敏度早期复发监测，及用药期间耐药性突变监测，具有重要临床意义。EGFR突变检测结果将对患者的治疗策略进行指导。因此，仍然需要进一步提高EGFR基因突变的检测灵敏度，以达到精确指导临床的目的。
发明内容
在一种实施方式中，本发明提供一种封闭探针介导的ARMS-ddPCR检测基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括：a.ARMS引物，其是等位基因特异性扩增引物，同时作为PCR扩增的上游引物或下游引物；b.与ARMS引物配对进行PCR扩增的下游引物或上游引物；c.野生型封闭探针，其与待扩增等位基因的野生型模板互补结合，从而封闭ARMS引物在野生型模板上的延伸；和d.检测探针；且所述封闭探针、检测探针与ARMS引物在同一个方向，所述封闭探针在ARMS引物和检测探针之间，所述封闭探针与所述ARMS引物在野生型模板结合区有重叠，或者所述封闭探针不能被水解，从而达到封闭ARMS引物对野生型模板的非特异性扩增的效果。
在一种实施方式中，上述各个引物在扩增体系中的终浓度为200-800nM，上述各个探针在扩增体系中的终浓度为100-600nM。
在一种实施方式中，所述试剂盒是用于检测同一个基因一个或多个等位基因突变位点的试剂盒，所述试剂盒中包括一个或多个ARMS引物，其对应于等位基因每个突变位点，同时作为PCR扩增的上游引物或下游引物；和一个与ARMS引物配对进行PCR扩增的下游引物或上游引物，当所述试剂盒中包括多个ARMS引物时，所述下游引物或上游引物为共同下游引物或共同上游引物。
在一种实施方式中，所述试剂盒是检测人表皮生长因子EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒。
在一种实施方式中，所述试剂盒检测以下等位基因的突变位点中的一个或多个的试剂盒：del9(2235_2248>AATTC)，del9(2238-2248>GC)，del9(2239-2247)，del9(2239-2248>C)，del12(2235_2251>AATTC)，del12(2237-2253>TTGCT)，del12(2238_2252>GCA)，del12(2239-2251>C)，del12(2240-2251del12)，del12(2235-2246del12)，del15(2233-2247del15)，del15(2235_2252>AAT)，del15(2235-2249del15)，del15(2236-2250del15)，del15(2237-2251del15)，del15(2237_2252>T)，del15(2238-2252del15)，del15(2239_2256>CAA)，del15(2239-2253del15)，del15(2240-2254del15)，del18(2235-2255>AAT)，del18(2236-2253del18)，del18(2237_2257>TCT)，del18(2237-2254del18)，del18(2237-2255-T)，del18(2238-2255del18)，del18(2239-2256DEL18)，del18(2239-2258>CA)，del18(2240-2257DEL18)，和del24(2253-2276del24)。
在一种实施方式中，用于检测所述试剂盒检测中作为上游引物的ARMS引物、共同下游引物、野生型封闭探针和检测探针如下表所示，所示野生型封闭探针是选自D19野生型封闭探针1、D19野生型封闭探针2和D19野生型封闭探针3中的任一个；
在一种实施方式中，所述野生型封闭探针在扩增体系中的终浓度为200-400nM。
在一种实施方式中，所述试剂盒包括阳性对照，所述阳性对照是含有待测突变位点的质粒DNA样本与商品化正常人基因组DNA混合后制备：和/或还包括阴性对照，所述阴性对照是商品化正常人基因组片段化DNA。
ddPCR在检测稀有突变中具有极大优势，但在设计反应体系时，如果是基于ARMS引物进行ddPCR，ARMS引物与错配模板的结合和解离存在一个动态平衡，在ddPCR中，当ARMS引物与错配模板结合时一旦被DNA聚合酶捕获，则开始聚合反应，而得到的扩增产物则作为下一轮扩增的完全匹配模板，实现单分子的指数扩增。因此，基于ARMS引物的ddPCR比其他PCR方法，例如实时定量PCR(qPCR)在扩增特异性上要求则更高，一种办法是在ARMS引物上引入修饰碱基或人工错配碱基，降低非特异性扩增，但同时会降低检测灵敏度，影响对突变型的检测灵敏度。因此，本发明提出在ddPCR中使用ARMS引物进行检测时，需要使用封闭探针和检测探针进行检测，具体要求如下：(1)封闭探针和检测探针与ARMS引物在同一个方向；(2)封闭探针在ARMS引物和检测探针之间；(3)封闭探针与ARMS引物在野生型模板结合区有重叠，或者封闭探针不能被水解，从而达到封闭ARMS引物对野生型模板的非特异性扩增的效果。如图1所示。
本发明的一个方面是提供一种检测人表皮生长因子EGFR基因19外显子缺失型突变的方法，包括：将样本中核酸与本发明的引物和探针混合，在合适条件下使封闭探针与野生型模板结合，且引物在突变型模板存在下与其结合，从而产生包括EGFR核酸目标序列的扩增产物，并检测扩增产物的存在，从而确定核酸中突变的存在。
本发明的另一个方面是提供一种治疗患者的方法，所述患者的肿瘤细胞可能具有EGFR基因19外显子缺失突变，所述方法包括：将患者样本中核酸与本发明的引物和探针混合，在合适条件下使封闭探针与野生型模板结合，且引物在突变型模板存在下与其结合，从而产生包括EGFR核酸目标序列的扩增产物，并检测扩增产物的存在，从而确定核酸中突变的存在。如果确定存在突变，则向患者使用抑制由突变基因编码的EGFR蛋白信号通路的化合物药物。可以进一步研究EGFR突变频率与抑制由突变基因编码的EGFR蛋白信号通路的化合物药物的治疗效果的相关性。
本发明的另一个方面是测定使用EGFR抑制剂对患有恶性肿瘤的患者的治疗是否成功的方法，包括：将患者样本中核酸与本发明的引物和探针混合，在合适条件下使封闭探针与野生型模板结合，且引物在突变型模板存在下与其结合，从而产生包括EGFR核酸目标序列的扩增产物，并检测扩增产物的存在，从而确定核酸中突变的存在。如果确定存在突变，则测定治疗方案可能是成功的。
本发明中可检测的样本来源多样，既可以是肿瘤组织，也可以是血浆，扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围。
在一种实施方式中中，本发明是用表1公开的引物和探针检测EGFR基因19外显子缺失突变的诊断方法。本方法包括表1中的封闭探针与野生型模板结合，仅在存在突变型模板情况下，表1中的引物与突变型模板结合，在DNA聚合酶作用下延伸，并通过表1中的检测探针的荧光信号进行检测，从而来检测样本中是否存在EGFR基因19外显子缺失突变。
在具体实施方案中，用封闭探针对野生型模板进行封闭，阻止其发生延伸反应，封闭探针选自表1，通常在封闭探针的羟基末端标记磷酸基团或MGB基团以阻止封闭探针的延伸，或使用不被DNA聚合酶5’-3‘外切酶活性水解的肽核酸(PNA)，或5’端使用硫代修饰的碱基防止水解，封闭探针不标记荧光基团，从而不显示荧光信号。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明封闭探针介导的ARMS-ddPCR法原理图，其中，图A：封闭探针和检测探针与ARMS引物同向，封闭探针与野生型互补，且与ARMS引物在野生型模板互补区域有重叠，因此在ddPCR扩增中，由于封闭探针与野生型模板结合，而封闭ARMS引物与野生型模板的结合；图B：封闭探针和检测探针与ARMS引物同向，封闭探针与野生型互补，且5’端不被DNA聚合酶的5’-3’外切酶切割，因此在ddPCR扩增中，由于封闭探针与野生型模板结合且不被切割，从而封闭ARMS引物在野生型模板上的延伸；图C：当检测突变型模板时，ARMS引物与模板完全结合，而封闭探针不与模板结合，从而可对突变型进行检测；和
图2是本发明不同浓度的封闭探针的封闭作用效果图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
实施例1.微液滴数字PCR反应
本发明封闭探针介导的ARMS-ddPCR法原理如图1所示。用于检测引物探针性能的微液滴数字PCR反应条件示例如下：PCR扩增反应混合物包括：50mMTris-HCl(pH8.5)、80-100mM氯化钾、dNTP(each 200uM)、1×稳定剂、1-2U Taq DNA聚合酶、0.4U UNG酶、200-1000nM引物、100-800nM检测探针、100-800nM封闭探针、模板DNA、2-4mM MgCl2，补水到30ul，将试剂混匀。用样本制备仪(新羿制造科技(北京)有限公司)根据说明书进行微液滴制备。然后将含有微液滴的8联排管放到PCR仪上进行扩增，扩增条件设定如下：
检测人表皮生长因子EGFR基因19外显子缺失突变的数字PCR方法，包括以下步骤：
1)配制含表1中所述寡核苷酸的反应体系，其中野生型封闭探针探针是D19野生型封闭探针1；
2)用样本制备仪把反应体系制备为微液滴；
3)将含反应体系的微液滴放入PCR仪中，进行PCR扩增；
4)用芯片阅读仪测定PCR反应后的荧光信号。
PCR扩增后，用芯片阅读仪(新羿制造科技(北京)有限公司)参照仪器使用说明书进行液滴检测和数据分析。
表1用于检测EGFR基因D19缺失的引物和探针序列
实施例2封闭探针的封闭作用实验
使用表1中的引物探针进行封闭探针的实验。对体系中加入终浓度为0、100、200、400nM的序列为SEQ ID NO：32的封闭探针，引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：31，其他试剂按照上述实施例1进行添加，然后进行PCR和检测，考察封闭探针对野生型的非特异性扩增的封闭效果。
结果如下图2所示。不加入封闭探针，野生型有明显的非特异性扩增，而加入100nM封闭探针后，大部分非特异性被封闭，仅有极少的非特异性扩增；加入200nM及以上的封闭探针，则野生型的非特异性扩增完全被封闭，此时可以特异地检测突变型。
实施例3用于检测人表皮生长因子EGFR基因D19缺失突变的引物和探针
D19缺失突变是EGFR基因19外显子中第746-752位密码子的缺失突变，可导致EGFR蛋白中氨基酸序列丢失，从而改变了受体ATP结合域。用于检测D19缺失突变的引物和探针显示于上述表1中。可以使用选自SEQ ID NOs：1-30的等位基因特异性引物任一条或多条进行检测，任选地，通用引物可以是SEQ ID NO：31。使用与等位基因特异性引物和通用引物之间(含等位基因特异性引物区域)的区域杂交的探针进行封闭和检测扩增。任选地，封闭探针可以是SEQ ID NO：32-34，检测探针可以是SEQ ID NO：35。以上所有引物和探针序列在同一个反应体系中，然后制备液滴，并进行PCR扩增和数据分析。
根据上述反应条件，使用本实施例中公开的19外显子缺失突变的引物和探针可对表1中列出的特定的EGFR基因19外显子缺失突变进行特异性的检测。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 北京天健惠康生物科技有限公司
清华大学
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<400> 31
ctctgtcata gggactctgg a 21
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cggagatgtt gcttctctta attccttgat a 31
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tgcttctctt aattcc 16
<210> 34
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tgcttctctt aattcc 16
<210> 35
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ccagaaggtg agaaag 16
Claims (8)
1.一种封闭探针介导的ARMS-ddPCR检测基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括：
a.ARMS引物，其是等位基因特异性扩增引物，同时作为PCR扩增的上游引物或下游引物；
b.与ARMS引物配对进行PCR扩增的下游引物或上游引物；
c.野生型封闭探针，其与待扩增等位基因的野生型模板互补结合，从而封闭ARMS引物在野生型模板上的延伸；和
d.检测探针；
且所述封闭探针、检测探针与ARMS引物在同一个方向，所述封闭探针在ARMS引物和检测探针之间，所述封闭探针与所述ARMS引物在野生型模板结合区有重叠，或者所述封闭探针不能被水解，从而达到封闭ARMS引物对野生型模板的非特异性扩增的效果。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，各个引物在扩增体系中的终浓度为200-800nM，各个探针在扩增体系中的终浓度为100-600nM。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是用于检测同一个基因一个或多个等位基因突变位点的试剂盒，所述试剂盒中包括一个或多个ARMS引物，其对应于等位基因每个突变位点，同时作为PCR扩增的上游引物或下游引物；和一个与ARMS引物配对进行PCR扩增的下游引物或上游引物，当所述试剂盒中包括多个ARMS引物时，所述下游引物或上游引物为共同下游引物或共同上游引物。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是检测人表皮生长因子EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是检测以下等位基因的突变位点中一个或多个的试剂盒：del9(2235_2248>AATTC)，del9(2238-2248>GC)，del9(2239-2247)，del9(2239-2248>C)，del12(2235_2251>AATTC)，del12(2237-2253>TTGCT)，del12(2238_2252>GCA)，del12(2239-2251>C)，del12(2240-2251del12)，del12(2235-2246del12)，del15(2233-2247del15)，del15(2235_2252>AAT)，del15(2235-2249del15)，del15(2236-2250del15)，del15(2237-2251del15)，del15(2237_2252>T)，del15(2238-2252del15)，del15(2239_2256>CAA)，del15(2239-2253del15)，del15(2240-2254del15)，del18(2235-2255>AAT)，del18(2236-2253del18)，del18(2237_2257>TCT)，del18(2237-2254del18)，del18(2237-2255-T)，del18(2238-2255del18)，del18(2239-2256DEL18)，del18(2239-2258>CA)，del18(2240-2257DEL18)，和del24(2253-2276del24)。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，用于检测所述试剂盒检测中作为上游引物的ARMS引物、共同下游引物、野生型封闭探针和检测探针如下表所示，所示野生型封闭探针是选自D19野生型封闭探针1、D19野生型封闭探针2和D19野生型封闭探针3中的任一个；
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述野生型封闭探针在扩增体系中的终浓度为200-400nM。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括阳性对照，所述阳性对照是含有待测突变位点的质粒DNA样本与商品化正常人基因组DNA混合后制备：和/或还包括阴性对照，所述阴性对照是商品化正常人基因组片段化DNA。
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