CN101351563A - 用于预测或监测病人对于ErbB受体药物的响应的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测ErbB受体突变的方法，包括步骤：提供来自病人的生物流体样品；提取来自所述样品的DNA；和针对受体中改变酪氨酸激酶活性的一个或多个的突变的存在情况筛选所述DNA。

Description

用于预测或监测病人对于ErbB受体药物的响应的方法
技术领域
本发明涉及一种用于预测或监测病人对于ErbB受体药物，例如以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的吉非替尼(gefitinib)，的响应的方法。该方法提供了用于基因组DNA突变的敏感的和特异的筛选，该突变以低浓度出现在生物流体例如血清中。该方法适于检测那些已知增加ErbB酪氨酸激酶受体活性和看来似乎与对ErbB受体药物治疗的响应相关的突变。
背景技术
ErbB受体是蛋白酪氨酸激酶(TKs)，属于TK超家族，该超家族成员调控控制细胞生长和生存的信号传导途经。ErbB受体家族由四种密切相关的亚型构成：ErbB1(表皮生长因子受体[EGFR])、ErbB2(HER2/neu)，ErbB3(HER3)，和ErbB4(HER4)(Cell.2000；103：211-225)。
例如，来自EGFR的信号是由生长因子例如表皮生长因子(EGF)的结合引发的，造成EGFR分子的二聚化或与其它密切相关的受体例如HER2/neu的异二聚化。该受体通过它们的酪氨酸激酶结构域进行的自体磷酸化和转磷酸作用导致下游效应器的招募以及增生和细胞存活信号的激活(Exp.Cell.Res.2003；284：31-53)。当ErbB受体TKs被过表达或由突变激活时，其可以导致乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌、头部和颈部癌症、和许多其它实体肿瘤的发展(Exp.Cell.Res.2003；284：122-130)。EGFR在40-80％的非小细胞肺癌和许多其它上皮癌中被过表达(N.Engl.J.Med.2004；350(21)：2129-2139)。以这样的基因的产物为靶点的抗癌治疗已经被设计出来用于抑制它们的活性。例如，药物吉非替尼是EGFR酪氨酸激酶家族例如ErbB1的强力抑制剂，并且于2002年7月5日在日本被批准用于不宜手术的或再发性NSCLC的治疗中。
病人在其对于任一种处方药的应答上有所不同，包括其作用如何好(药物的有效性)和对它的不良反应(副作用)两方面。对于吉非替尼的情况，病人对于酪氨酸激酶抑制剂治疗显示出不同的响应，包括在一个小组中大约10％的病人显示出快速的和经常是明显的临床响应(N.Engl.J.Med.2004；350(21)：2129-2139)。因此需要在治疗前对那些将会对药物作出响应的病人进行识别，并且还需要治疗后对那些正在对药物进行响应的病人进行识别，从而使药物更加有效地被靶向。
最近发现，在患有非小细胞肺癌的病人的小组中，病人EGFR基因中携带特定的突变，其看来似乎与对于酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的临床响应相关联(Science 2004；304：1497-1500)。这些突变导致了生长因子信号的增长，使其对于抑制剂敏感。人们认为，筛选肺癌中的这些突变可以识别出那些将会对于吉非替尼有响应的病人(J.Clin.Oncol.23；2493-2501)。然而，至今为止，可靠地测量这些突变的唯一方法是通过取出病人肿瘤活组织检查样品对实体组织样品进行分析。这是一个困难的程序，对病人而言是非常不愉快的，并且有些时候当肿瘤不宜手术时是行不通的。
另一个筛选病人突变的问题在于在过多的野生型基因中检测出突变基因的困难性。这是一个本领域公知的问题，并且在低浓度突变DNA的识别对于肿瘤的早期检测或者对于早期病人适当治疗时程的识别可能非常重要的前提下，这显得尤为重要(Clin Cancer Res.2004；10(7)：2379-85)。因此，需要较少侵入性的和更加可靠的方法来监测和预测病人对于ErbB受体药物的响应，例如在治疗中使用它们之前，该治疗可能是非常有效的，但只对一小部分病人有效。
发明内容
我们已经发现了一种能够可靠地检测采自病人的生物流体样品中ErbB受体突变的方法，该方法可用于预测病人对ErbB受体药物的响应或生存优势(survival benefit)。具体而言，那些改变ErbB受体的酪氨酸激酶活性的突变的存在指出病人可能对药物有阳性应答，同时仅仅存在野生型等位基因指出病人可能不会对ErbB受体药物有响应。
按照本发明的第一方面，提供了一种用于检测ErbB突变的方法，包括步骤：-
(a)提供来自病人的生物流体样品
(b)从所述样品中提取DNA；和
(c)针对该受体中一个或多个突变(one or more mutations)的存在情况筛选所述DNA。
优选地，如上所述的用于检测ErbB突变的方法包括在ErbB受体中一个或多个能够改变所述受体中酪氨酸激酶活性的突变的检测。
最优选地，上述方法描述的ErbB受体是EGFR。
本发明人已经发现病人生物流体样品中的突变的测量可被用于预测和监测ErbB受体药物在体内的效果。
在一个优选的方面，本发明提供了一种用于预测病人对于ErbB受体药物的响应的方法，包括步骤：  -
(a)提供来自病人的生物流体样品
(b)从所述样品中提取DNA
(c)针对该受体中改变酪氨酸激酶活性的一个或多个突变的存在情况筛选所述DNA
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于监测病人对于ErbB受体药物的响应的方法，包括步骤：
(a)提供来自病人的生物流体样品
(b)从所述样品中提取DNA
(c)针对该受体中能够改变酪氨酸激酶活性的一个或多个突变的存在情况筛选所述DNA。
正如将会被该领域技术人员所知的，对于ErbB受体药物的响应的监测允许对已经被给予药物的病人的应答做出评价；因此，它可被用于治疗后的病人。然而，响应的预测是在未接触ErbB受体药物的病人中进行的，并且是治疗前进行的。
在另一个实施方案中，该方法包括如上所述的步骤，其中癌症病人对于ErbB受体药物的响应的预测预测了病人的生存优势。
优选地，如上所述的对于ErbB药物的响应的预测方法进一步包括步骤：
(d)做出结论：被检测出携带突变型和野生型等位基因的病人对ErbB受体药物的响应将为阳性，而被检测出仅携带野生型等位基因的病人对该药物不会做出阳性的响应。
在另一个实施方案中，如上所述的筛选方法包括使用聚合酶链反应，该聚合酶链反应使用检测单碱基突变、小的框内缺失或碱基替换的等位基因特异性引物。
优选地，筛选方法涉及使用实时聚合酶链反应(real time-PCR)，该实时聚合酶链反应使用检测单碱基突变、小的框内缺失或碱基替换的等位基因特异性引物。
在另一个实施方案中，对于ErbB药物的响应的预测方法如上所述，其中第一个引物对被用于检测野生型等位基因，第二个引物对被用于检测突变等位基因；并且其中每对中的一个引物包括：  -
(a)具有对特定突变有等位基因特异性的3′末端核苷酸的引物；和
(b)该引物3′末端的可能的附加的错配。
优选地，如上所述每对中的一个引物进一步包括：-
(a)含有引物序列和对靶序列特异的其他序列的单分子或核酸双链体(duplex)探针；
(b)在所述单分子或核酸双链体之内的与淬火剂(quencher)分子相近的附着于探针5′末端的荧光报道染料；
(c)在所述探针一末端的一个或多个非编码核苷酸残基；
(d)其中，所述报道染料和淬火剂分子在靶序列的扩增期间分离。
有利的是，该探针是
Figure A20058005178300091
探针。
优选地，如本发明所述的方法使用能够检测到以野生型序列10％水平存在的突变序列的技术。更优选地，该技术可以检测到占野生型序列9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％或0.01％水平的突变序列。
如上所述的荧光探针系统的好处在于不需要单独的探针与扩增的靶相结合，使得检测比其它系统更迅速又更加有效。本发明证明在ARMS扩增系统中使用
Figure A20058005178300092
引物提高了用于检测EGFR突变的方法的敏感性(见实施例4)。
优选地，上述方法描述的生物流体是血液、血清、血浆、汗液或唾液中的任一种。有利的是，生物流体是血清。
用于回顾研究，大多数以前的着眼于EGFR突变和NSCLC进展相关性的研究证明了在开始治疗以后取得的手术切除的肿瘤样品中这样的突变的存在。然而从早期病人的不宜手术的NSCLC肿瘤中取样的困难已经妨碍了在治疗开始以前进行具有选择病人潜力的预期研究的努力。
然而，本发明提供了一种用于检测来自癌症病人样品的突变EGFR的方法，该样品不是肿瘤样品。生物流体的采样比以前的分析癌症病人EGFR突变的方法的侵入性更小。与收集肿瘤样品相比，例如血清样品可以容易地被采集，以及试验可以被重复。此外已知肿瘤细胞释放DNA进入循环，富集于血清和血浆中，从而允许在癌症病人的血清DNA中检测到突变和微小的改变(microsatellite alterations)(Cancer Res.1999；59(1)：67-70)。
在本发明的另一个实施方案中，ErbB受体药物是ErbB受体酪氨酸激酶抑制剂。优选地，ErbB受体药物是EGFR酪氨酸激酶抑制剂。在优选的方法中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂选自由吉非替尼、埃罗替尼(erlotinib)(特罗凯(Tarceva)，OSI-774，CP-358774)、PKI-166、EKB-569、HKI-272(WAY-177820)、拉帕替尼(lapatinib)(GW2016，GW-572016，GSK572016)、canertinib(CI-1033，PD183805)、AEE788、XL647、BMS 5599626、ZD6474(ZactimaTM)或WO2004/006846或WO2003/082290中公开的任一种化合物构成的组。
在本发明的另一个实施方案中，ErbB受体药物是EGFR抑制剂。优选地，EGFR抑制剂是选自由西妥昔单抗(cetuximab)(爱必妥(Erbitux)，C225)、曲妥珠单抗(matuzumab)(EMD-72000)、帕尼单抗(panitumumab)(ABX-EGF/rHuMAb-EGFR)、MR1-1、IMC-11F8或EGFRL11构成的组的抗EGFR抗体。
优选地，任何之前的权利要求的方法包括用作单一治疗或与其他药物联合使用的ErbB受体药物。
在最优选的实施方案中，EFGR酪氨酸激酶抑制剂药物选自由吉非替尼、埃罗替尼(特罗凯，OSI-774，CP-358774)、PKI-166、EKB-569、HKI-272(WAY-177820)、拉帕替尼(GW2016，GW-572016，GSK572016)、canertinib(CI-1033，PD183805)、AEE788、XL647、BMS 5599626、ZD6474(ZactimaTM)或WO2004/006846或WO2003/082290公开的任一种化合物构成的组。
已发现本发明中的突变是作为核酸的插入、缺失或替换而发生的。突变优选地发生于ErbB受体的酪氨酸激酶结构域。优选地，突变发生于EGFR的酪氨酸激酶结构域。优选地，突变选自列在表5中的EGFR突变的组。有利的是，突变簇集在EGFR外显子18、19、20或21的ATP结合位点附近。优选地，突变选自列在表5中的EGFR突变的组。在最优选的实施方案中，突变是EGFR外显子19中的E746 A750del和EGFR外显子21中的L858R。
EGFR外显子18-21中的大约30个突变已经在肺肿瘤样本中被检测出来。在肿瘤样本中检测出来的NSCLC-相关的EGFR突变中，外显子19中的15-bp核苷酸的框内缺失(E746_A750del)和在外显子21中的密码子858的亮氨酸被精氨酸替换的点突变(L858R)占这些突变的大约90％(Cancer Res.2004；64：8919-8923，Proc.Natl.Acad.Sci USA2004；101：13306-13311)。
有利的是，病人所患的癌症选自由非实体肿瘤例如白血病、多发性骨髓瘤或淋巴瘤，以及实体肿瘤例如胆管、骨、膀胱、脑/CNS、恶性胶质瘤、乳房、结肠直肠、子宫颈、子宫内膜、胃、头和颈、肝、肺、肌肉、神经元、食管、卵巢、胰腺、胸膜/腹膜、前列腺、肾、皮肤、睾丸、甲状腺、子宫和外阴肿瘤构成的组。
本发明的另一个实施方案中，如上所述的方法进一步包括步骤：
(e)针对ErbB受体下游信号传导途径的元件中的一个或多个突变的存在情况筛选所述DNA。
本发明的第二方面包括组合物，其包括用于检测ErbB受体野生型等位基因的第一个引物对和用于检测ErbB受体突变等位基因的第二个引物对，其中，每对中的一个引物进一步包括：
(a)具有3′末端核苷酸的引物，其对于特定突变是等位基因特异的；
(b)该引物3′末端的可能的附加的错配；
(c)包括引物序列和特异于靶序列的另外的序列的单分子或核酸双链体探针；
(d)在所述单分子或核酸双链体之内的与淬火剂分子相近的附着于5′末端探针的荧光报道染料；
(e)在所述探针一末端的一个或多个非编码核苷酸残基；
(f)其中，所述报道基染料和淬火剂分子在靶序列扩增期间分离。
本发明的第三个方面包括特异于ErbB受体的引物在生物流体中进行的分析中的用途，用于预测病人对于ErbB药物的响应。
优选地，如上所述的用途包括用于测试生物流体的组合物的制造，其用于预测病人对于ErbB药物的响应。
有利的是，上述描述的用途进一步包括步骤：
(a)从所述样品中提取DNA
(b)针对该受体中改变酪氨酸激酶活性的一个或多个突变的存在情况筛选所述DNA。
附图说明
图1使用EGFR Scorpion试剂盒检测E746_A750del和L858R突变的敏感性。(a)使用不同的量的具有E746_A750del的标准DNA：10,000pg(104)、1,000pg(103)、100pg(102)、10pg(101)和1pg(100)。在同一个试验中，野生型标准DNA(野生)和蒸馏水(D.W.)被用作阴性对照。(b)浓度为1pg到10,000pg的具有E746_A750del的标准DNA与10,000pg的野生型标准DNA在1∶1(100)、1∶10(10-1)、1∶100(10-2)、1∶1,000(10-3)和1∶10,000(10-4)的比例下混合。(c)原始曲线和第二衍生曲线代表10,000pg的量的具有E746_A750del的标准DNA。第二衍生代表生长曲线斜率的变化速率。阈循环被定义为在第二衍生曲线的最高峰值的循环数(图1c中的垂直线)。(d)标准曲线来自每条曲线(如图1A和1B所示)的Ct对标准DNA量的log值作图。
图2采自肺癌细胞系的基因组DNA中的E746_A750del的检测。(a)具有E746_A750del的PC-9和野生型A431。(b)具有L858R和A431的11_18
图3关于非小细胞肺癌的EGFR突变状态的无进展生存(Progression free survival)(A)和总体生存(overall survival)(B)。(*)Log-rank测试。
具体实施方式
除非另外定义，否则这里使用的所有技术和科学术语的含义都与本领域普通技术人员通常理解的含义相同(例如在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)。标准技术用于分子、基因和生物化学方法中。一般性地参见Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2d ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.以及Ausubel等人，Short Protocols inMolecular Biology(1999)4th Ed，John Wiley & Sons，Inc.；以及Guthrie等人，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods inEnzymology，Vol.194，Academic Press，Inc.，(1991)，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis，等人1990.Academic Press，San Diego，Calif.)，McPherson等人，PCR Volume 1N.Y.)，以及GeneTransfer and Expression Protocols，pp.109-128，ed.E.J.Murray，TheHumana Press Inc.，Clifton，N.J.)。这些文献通过引用方式包含在此。Oxford University Press，(1991)，Culture of Animal Cells：A Manual ofBasic Technique，2nd Ed.(R.I.Freshney.1987.Liss，Inc.New York，N.Y.)，and Gene Transfer and Expression Protocols，pp.109-128，ed.E.J.Murray，The Humana Press Inc.，Clifton，N.J.)。这些文献通过引用方式包含在此。
生物标志
被称为生物标志的多种生物学标志已经在将生物化学和分子生物学应用到医学和毒理学状态的过程中被识别和研究。生物标志可以被发现于组织和生物流体中，其中血液是生物标志研究中最常见的生物流体(Proteomics 2000；1：1-13，Physiol.2005；563：23-60)。
生物标志可以被描述为“作为正常生物过程、致病过程、或对治疗干涉的药理响应的指示剂而被客观地测量和评估的特征”。生物标志是任何可被识别和测量的、与特定的状态或疾病相关联的指示剂，其中在此生物标志的存在或水平与该状态或疾病的某一方面之间有关联(包括所述状态或疾病的存在、水平或改变水平、类型、阶段、敏感性、或对于用于治疗所述状态或疾病的药物的响应)。该关联可以是定性的、定量的、或既定性又定量的。典型地，生物标志是化合物、化合物片段或化合物组。这些化合物可以是生物体中发现或产生的任何化合物，包括蛋白质(和肽)、核酸和其它化合物。
生物标志可以具有预言性的能力，如此可以被用于预测或检测特定的状态或疾病的存在、水平、类型或阶段(包括特定的微生物或毒素的存在或水平)、对特定的状态或疾病的敏感性(包括遗传的敏感性)、或对特定的治疗的响应(包括药物治疗)。人们认为生物标志在未来将会通过改进研究和开发项目的效率而对药物的发现和发展起到日益重要的作用。生物标志可被用作诊断剂、疾病发展的监视器、治疗的监视器和临床结果的预测器。例如，不同的生物标志研究计划正在尝试识别特定的癌症以及特定的心血管和免疫疾病的标志。
此处使用的术语“ErbB受体药物”包括对erbB受体酪氨酸激酶家族包括EGFR、ErbB2(HER)、ErbB3和ErbB4起作用的药物。在一个实施方案中，该ErbB受体药物是ErbB受体酪氨酸激酶抑制剂。在另一个实施方案中，该ErbB受体药物是EGFR酪氨酸激酶抑制剂。EGF受体酪氨酸激酶抑制剂的例子包括但是不局限于吉非替尼、埃罗替尼(OSI-774，CP-358774)、PKI-166、EKB-569、HKI-272(WAY-177820)、拉帕替尼(GW2016，GW-572016)、canertinib(CI-1033，PD183805)、AEE788、XL647、BMS 5599626或在WO2004/006846、WO2003/082831、或WO2003/082290中公开的任何化合物。具体而言，在国际专利申请WO 96/33980中公开的吉非替尼(又名易瑞沙TM(IressaTM)，代号为ZD1839和Chemical Abstracts登记号码为184475-35-2)是酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)家族例如ErbB1的强力抑制剂。
在另一个实施方案中，该ErbB受体药物是抗EGFR抗体例如cetuximab(C225)、matuzumab(EMD-72000)、帕尼单抗(ABX-EGF/rHuMAb-EGFr)、MR1-1、IMC-11F8或EGFRL11中的一种。此处提及的ErbB受体药物可以被用作单一治疗或与其他的同类或不同类别的药物结合使用。在一个具体实施方案中，该EGF受体酪氨酸激酶抑制剂是吉非替尼。
“生存”包括病人的“总体生存”和“无进展生存”。“总体生存”(OS)被定义为从开始给予吉非替尼到由任何原因引起的死亡的时间。“无进展生存(PFS)”被定义为从开始给予吉非替尼到第一次出现进行性疾病或由任何原因引起的死亡的时间。
“响应”由按照“实体瘤的响应评价标准(Response EvaluationCriteria in Solid Tumours)”(RECIST)而进行的测量所定义，涉及将病人分成两个主要的组：那些显示出部分响应或稳定疾病的病人和那些显示出进行性疾病的体征的病人。
“扩增”反应是那些导致靶核酸而不是非-靶核酸的特定的扩增的核酸反应。聚合酶链反应(PCR)是众所周知的扩增反应。
此处使用的“癌症”是指由细胞向肿瘤表型(neoplastic phenotype)的转化而导致的肿瘤生长。这样的细胞转化经常涉及基因突变；在本发明的上下文中，如此所述，转化涉及由一个或多个Erb基因的改变引起的基因突变。
术语“探针”是指单链的序列特异性寡核苷酸，其序列和待检测的等位基因的靶序列完全互补。
术语“引物”是指单链DNA寡核苷酸序列或特异引物，其能够作为与待复制的核酸链互补的引物延伸产物的合成起始点。引物的长度和序列必须使得它们能够启动延伸产物的合成。
本申请描述了ErbB核酸突变。如此处使用的术语“ErbB受体突变体”用于表示编码任何一种ErbB酪氨酸激酶受体家族成员的核酸。术语“ErbB受体”因此包括全部已知的人类ErbB受体同源物和变异体，以及其它核酸分子，该核酸分子显示出与将被识别为ErbB受体同源物的ErbB受体家族成员的足够的同源性。优选地，EGFR被识别为具有SEQ ID NO.1所示EGFR序列的核酸。
术语“核酸”包括那些在严格杂交条件下能够与上述被识别的天然存在核酸或其互补物杂交的多核苷酸。“严格杂交条件”是指在包括50％甲酰胺、5x SSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖和20pg/ml变性并剪切的鲑鱼精DNA的溶液中42℃隔夜培养，然后再在0.1x SSC中在大约65℃洗涤过滤器。
用于检测核酸的方法
在本发明的上下文中，编码ErbB受体的突变体核酸的检测可以被用于预测对于药物治疗的响应。因为ErbB受体基因中的突变通常发生在DNA水平，本发明的方法可以是基于对基因组DNA中的突变以及转录产物和蛋白质它们自己的检测。为了保证被检测到的突变的确被表达于受试者中，通过转录产物和/或多肽的分析来确认基因组DNA中的突变可能是令人期待的。
基因组核酸中的突变有利地通过基于迁移率改变(mobility shift)的技术从扩增的核酸片段中检测出来。例如，Chen et al.，Anal Biochem1996 Jul 15；239(1)：61-9描述了通过竞争性迁移率改变分析来检测单碱基突变。此外，从市场上还可以得到基于Marcelino et al.，BioTechniques 26(6)：1134-1148(June 1999)的技术的分析。
在一个优选的实施例中，毛细管异源双链体分析可以用来检测突变的存在，这基于由于错配的存在导致的毛细管系统中的双链核酸的迁移率改变。
从样品中产生用于分析的核酸通常需要核酸的扩增。许多扩增方法依靠酶催化的链反应(例如聚合酶链反应、连接酶链反应、或自维持的序列复制(self-sustained sequence replication))或取决于已被克隆进去的载体的全部或者一部分的复制。优选地，本发明所述的扩增是指数扩增，正如例如聚合酶链反应所显示的。
许多靶点和信号的扩增方法已在文献中被叙述，例如，Landegren，U.，et al.，Science 242：229-237(1988)和Lewis，R.，Genetic EngineeringNews 10：1，54-55(1990)中给出了这些方法的一般性综述。这些扩增方法可被用于我们的发明的方法中，包括聚合酶链反应(PCR)、原位PCR(PCR in situ)、连接酶扩增反应(LAR)、连接酶杂交、Qbeta噬菌体复制酶、基于转录的扩增系统(Transcription-based AmplificationSystem)(TAS)、基因组扩增转录同步测序法(genomic amplificationwith transcript sequencing)(GAWTS)、基于核酸序列的扩增技术(nucleic acid sequence based amplification)(NASBA)和原位杂交。适用于不同的扩增技术中的引物可以按照在该技术领域中已知的方法进行准备。
聚合酶链反应(PCR)
PCR是核酸扩增方法，在美国专利No.4,683,195和4,683,202等之中被描述。PCR由DNA聚合酶产生的引物延伸反应的重复循环构成。靶DNA被热变性，在待扩增DNA的相对链上的将靶序列夹在中间的两个寡核苷酸被杂交。这些寡核苷酸成为引物，与DNA聚合酶共同使用。DNA通过引物延伸获得双链的第二个副本来复制。通过重复热变性、引物杂交和延伸的循环，靶DNA可以在大约两至四小时内被扩增一百万倍或更多。PCR是一种分子生物学工具，其必须与检测技术联用来确定扩增结果。PCR的优越性在于它通过在大约4小时内将靶DNA的数量扩增一百万到十亿倍从而提高灵敏度。在诊断的环境中，PCR可用于扩增任一种已知的核酸(Mok et al.(1994)，Gynaecologic Oncology，52：247-252)。
自维持的序列复制(3SR)
自维持的序列复制(3SR)是TAS的变体，其涉及通过连续的几轮反转录酶(RT)、聚合酶和核酸酶活性来进行核酸模版的等温扩增，这些活性通过酶鸡尾酒(cocktail)和适当的寡核苷酸引物来介导(Guatelli etal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874)。使用RNA/DNA异源双链中的RNA的酶促降解代替加热变性。将RNase H和其它所有的酶加入反应中，所有的步骤发生在相同的温度下，没有加入其它试剂。遵循这个过程，106到109的扩增在42℃ 1小时内就已经完成。
连接扩增(LAR/LAS)
连接扩增反应或连接扩增系统使用DNA连接酶和四种寡核苷酸，每条靶链两种寡核苷酸。该方法在Wu，D.Y.和Wallace，R.B.(1989)Genomics 4：560中描述。寡核苷酸杂交到靶DNA的相邻序列上，并通过连接酶相连。该反应被加热变性，循环被重复。
Qβ复制酶
在这个技术中，复制单链RNA的噬菌体Qβ的RNA复制酶被用于扩增靶DNA，如Lizardi et al.，(1988)Bio/Technology 6：1197中所述。首先，靶DNA被杂交到包含T7启动子和Qβ5′序列区域的引物上。在该过程中，使用这个引物，反转录酶产生连接该引物到它的5′末端的cDNA。这两步类似于TAS试验方案。生成的异源双链被加热变性。接下来，使用包含Qβ3′序列区域的第二个引物开始第二轮cDNA的合成。这一步产生了包含Qβ噬菌体5′和3′末端以及活性T7 RNA聚合酶结合位点的双链DNA。T7 RNA聚合酶然后转录该双链DNA为新的模拟Qβ的RNA。在经过充分地洗涤除去任何未杂交的探针以后，从该靶中洗提出新的RNA，通过Qβ复制酶进行复制。后面的反应在大约20分钟内产生了107倍的扩增。
备选的扩增技术可以用于本发明中。例如，滚环扩增(rolling circleamplification)(Lizardi等人，(1998)Nat Genet 19：225)是一种商业上可用的扩增技术(RCATTM)，由DNA聚合酶驱动，可以在等温情况下采用线性的或几何动力学复制环形的寡核苷酸探针。
在两个合适地设计的引物存在的情况下，通过DNA链置换和高分枝(hyperbranching)在1小时内产生每一个环的1012或更多份拷贝，从而实现几何学扩增。
如果使用单个引物，RCAT在几分钟内就产生成千上万的依次连接靶的DNA拷贝的线性链，其以共价键衔接到该靶。
此外的技术，链置换扩增(strand displacement amplification)(SDA；Walker等人，(1992)PNAS(USA)80：392)从特定的靶独有的特殊定义的序列开始。但是不同于其他的依靠热循环的技术，SDA是一种使用一系列引物、DNA聚合酶和限制性内切酶来指数扩增独特的核酸序列的等温过程。
SDA包括靶生成阶段和指数扩增阶段。
在产生靶的时候，加热双链DNA使其变性来产生两个单链拷贝。一系列特殊制造的引物与DNA聚合酶(用于复制碱基序列的扩增引物和用于置换新生成的链的缓冲器引物(bumper primers))相结合产生能够指数扩增的改变的靶。
指数扩增过程以靶生成阶段产生的改变的靶(具有限制性内切酶识别位点的部分单链DNA链)为起点。
扩增引物结合于每一条链上的它的互补DNA序列上。然后DNA聚合酶使用引物来识别从它的3′末端延伸引物的位点，使用改变的靶作为模板用于增加各核苷酸。因此延伸的引物形成双链DNA片段，包括每个末端的完整的限制性内切酶识别位点。
然后限制性内切酶与双链DNA片段在其识别位点相结合。在切掉双边片段的仅一条链形成缺口(nick)以后，限制性内切酶从识别位点脱离。DNA聚合酶识别缺口并且从该位点延伸链，置换以前形成的链。因此该识别位点通过限制性内切酶和DNA聚合酶被重复地形成缺口和复原，含有靶片段的DNA链被连续置换。
然后每一个置换的链可以用来与扩增引物进行退火，如上所述。该过程持续进行重复的形成缺口、延伸和新DNA链的置换，结果形成原始DNA靶的指数扩增。
一旦核酸被扩增，就可以使用许多技术来检测单碱基对的突变。其中一种此类技术是单链构象多态性(single stranded conformationalpolymorphism)(SSCP)。SCCP检测基于电泳中单链突变DNA相对于参考DNA的异常的迁移。突变在单链DNA中产生构象变化，导致迁移率改变。荧光SCCP使用荧光标记的引物用于辅助检测。因此，使用荧光标记的引物来扩增参考和突变DNA。被扩增DNA被变性和骤冷以产生单链DNA分子，其通过非变性凝胶电泳进行检测。
化学错配裂解法(chemical mismatch cleavage)(CMC)基于通过羟胺、四氧化锇和哌啶的组合对DNA错配碱基对的识别和裂解。因此，参考DNA和突变DNA通过荧光标记的引物扩增。扩增子被杂交，然后使用与错配的T碱基结合的四氧化锇，或者与错配的C碱基结合的羟胺进行裂解，然后是哌啶在被修饰的碱基位点进行裂解。然后裂解的片段通过电泳被检测出。
还可以使用基于限制性片段多态性(restriction fragmentpolymorphism)(RFLPs)的技术。尽管许多单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphisms)(SNPs)不允许使用传统的RFLP分析，但引物诱导的限制性分析PCR(PIRA-PCR)可用于使用PCR引物以SNP-依赖的方式引入限制性位点。引入适当的限制性位点的用于PIRA-PCR的引物可以通过计算分析设计，例如如Xiaiyi et al.，(2001)Bioinformatics 17：838-839所述。
此外，基于WAVE分析的技术可被使用(Methods Mol.Med.2004；108：173-88)。这种DNA片段分析体系可用于检测单核苷酸多态性，其基于温度调控的液相色谱和高分辨率矩阵(Genet Test.1997-98；1(3)：201-6)
实时PCR(亦称定量PCR、实时定量PCR、或RTQ-PCR)是一种同时的DNA量化和扩增的方法(Expert Rev.Mol.Diagn.2005(2：209-19)。通过聚合酶链反应，DNA被特定地扩增。在每一轮扩增以后，DNA被量化。量化的常见方法包括使用那些插入双链DNA的荧光染料和那些与互补DNA杂交时发荧光的被修饰的DNA寡核苷酸(被称为探针)。
被称为“
Figure A20058005178300191
引物”的特定的引物能够被用于高灵敏度的和快速的DNA扩增系统。这样的引物在单个分子中将探针与特定的靶序列结合，产生具有单分子动力学的荧光检测系统(Nucl.Acids Res.2000；28：3752-3761)。这个系统优于其它的荧光探针系统例如分子灯标(Molecular Beacons)和Taq
Figure A20058005178300192
之处在于不需要与扩增靶相结合的单独的探针，使得检测既更迅速又更高效。三种检测方法的直接比较(Nucl.Acids Res 2000；28：3752-3761)指出
Figure A20058005178300193
比分子间探针系统运行更优，特别是在快速的循环条件下。某一版本的
Figure A20058005178300201
引物的结构是这样的，它通过大约六个碱基的互补茎序列(stem sequences)被约束在发夹环(hairpin loop)构象中，互补茎序列侧面是所关心靶的特异探针序列(Nat.Biotechnol.1999；17：804-807)。茎还用来将荧光报告染料(附着于5′末端)与淬火剂分子定位于非常接近的区域内。在这种构象中，不产生信号。PCR-阻断剂将发夹环与引物序列分离开，形成
Figure A20058005178300202
的3′末端。该阻断剂防止通读，在没有特定的靶的情况下，通读将会导致发夹环的解折叠。在PCR期间，延伸通常从引物开始。在随后的变性和退火步骤后，发夹环解折叠，并且如果正确的产物已经被扩增的话，在新合成的链中，探针序列与特定的靶序列在引物下游相结合。这个新结构在热力学上比原来的发夹环更加稳定。现在荧光信号被产生，因为荧光染料不再非常接近于淬火剂。荧光信号与靶DNA的数量成正比。
另一个
Figure A20058005178300203
引物包括两个标记的互补寡核酸双链体。双链中的一条寡核苷酸被5′末端报告染料标记，并携带阻断剂非编码核苷酸和PCR引物元件，而另一条寡核苷酸被3′末端淬火剂染料标记。作用的原理则本质上与上面描述的
Figure A20058005178300204
发夹引物相同：在实时定量PCR期间，5′末端报告染料和3′末端淬火剂染料彼此分离，导致荧光发射的显著增加。
Figure A20058005178300205
可与扩增阻滞突变系统(Amplification Refractory MutationSystem，ARMS)(Nucl.Acids Res.1989；17：2503-2516，Nat.Biotechnol.1999；17：804-807)联合使用使得单碱基突变能够被检测到。在适当的PCR条件下，位于引物3′末端的单碱基错配足以满足完全匹配的等位基因的优先扩增(Newton等人，1989)，允许非常相关物种间的区分。使用上面描述的引物的扩增系统的基础是在适当情况下那些带有错配的3′残基的寡核苷酸不会在PCR中起引物作用。这个扩增系统允许仅仅通过在琼脂糖凝胶电泳以后对反应混合物的检查来进行基因分型。它是简单的和可靠的，并且能够明确地将任一等位基因在某一基因座的杂合子与纯合子区别开来。ARMS不需要限制性内切酶消化、通常应用的等位基因特异性寡核苷酸或PCR产物的序列分析。
实施例1-临床试验和血清样品的收集
进行本研究，作为吉非替尼单一治疗的多中心临床II期试验的相关研究。该研究的进行，基于涉及人类受试者的生物医学研究Helsinki声明的推荐，得到了适当的伦理审查委员会(ethical review boards)的批准。IIIB或IV阶段的组织学或细胞学证实为化疗-NSCLC的日本病人参与这个试验。全部病人口服给予吉非替尼，固定剂量为每天250毫克。使用“实体瘤的响应评价标准(Response Evaluation Criteria in SolidTumours，RECIST)”的指导方针评估有效性(J.Natl.Cancer Inst.2000；92：205-216)。
28位病人在2002年10月23日到2003年8月3日之间被登记(表1)。全部病人的响应被评估，并且其无进展生存和总体生存被追踪。来自27位病人的血液样品(2毫升)在开始给予吉非替尼之前被采集。在所有27份样品中提取的血清DNA浓度最高达1720ng/ml。
样品采集和DNA提取。来自26位NSCLC病人的血液样品在开始给予吉非替尼之前被采集。分离的血清于-80℃存放直至使用。使用Qiamp Blood试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)提取并纯化血清DNA，按照以下修改的试验方案进行。一个柱子被反复使用，直到全部样品已经被处理。得到的DNA通过50μl无菌双蒸馏缓冲液洗提出。提取的DNA的浓度和纯度通过分光光度测定法确定。提取的DNA保存于-20℃直至使用。
实施例2-利用Scorpion引物和扩增阻滞突变系统(ARMS)来检 测E746 A750 del和L858R EGFR突变
EGFR ScorpionTM试剂盒的敏感性
通过初步试验来评估EGFR Scorpion试剂盒的敏感性(图1)。当达到最多45个循环时，量从1pg到10,000pg的E746_A750del标准DNA的全部曲线增长(图1a)。当野生型标准DNA和水被用作阴性对照时，曲线不是增长的，并且在达到50循环数之前保持平坦(图1a)。使用稀释的E746_A750del标准DNA和野生型标准DNA，比例为100到10-5，当达到最多45循环数时，表明存在E746_A750del的全部曲线增长(图1b)。在这个研究中的测量量范围内的标准曲线是线性的，r2值为0.997和0.987。两曲线斜率几乎平行(图1c)。稀释的E746_A750del标准DNA与野生型DNA的Ct和那些仅仅是E746_A750del标准DNA的Ct相比，在每个量的E746_A750del标准DNA中都接近。尽管在比例小于10-3时，稀释的E746_A750del标准DNA与野生型DNA的峰值荧光水平比没有野生型DNA标准的低，但E746_A750del的存在可以被清楚地检测到。最多达到1pg量的E746_A750del DNA的曲线不受野生型EGFRDNA混入的影响。在使用人类癌细胞系基因组DNA的基于细胞的试验中，正如所料，使用来源于PC-9细胞的DNA的信号被检测到，来自A431细胞的未被检测到。
我们使用结合了ARMSTM和ScorpionTM这两种技术的EGFRScorpionTM试剂盒(DxS有限公司，曼彻斯特，英国)来检测实时PCR反应中的突变。用于检测在外显子19和外显子21中的E746_A750del、L858R和野生型的四种scorpion引物被DxS Ltd.(曼彻斯特，英国)设计且合成出。用于E746_A750 del和L858R的scorpion引物的序列基于GenBank-存档的人类EGFR序列(登记号码：AY588246)。所有反应在25μl体积中进行，包括1μl模板DNA、7.5μl反应缓冲混合液、0.6ml引物混合液和0.1ml Taq聚合酶。全部的试剂都包含在这个试剂盒中。实时PCR使用Smart
Figure A20058005178300221
II(Cepheid，Sunnyvale，CA)进行，按照下述条件：在95℃进行初始变性10分钟，50循环的95℃30秒、62℃60秒以及每个循环末的荧光读数(设置在FAM，允许光激发在480nm以及在520nm测量)。使用Cepheid SmartCycler软件(Ver.1.2b)进行数据分析。阈循环(threshold cycle)(Ct)被定义为在第二衍生曲线的最高峰值的循环，其代表了生长曲线的最大曲率点。Ct和最大荧光(Fl)用于结果的分析。阳性结果被定义为：Ct≤45和Fl≥50。每个样品中的这些分析进行两份。为了证实检测E746_A750del的灵敏度，我们使用EGFR Scorpion试剂盒中包括的标准DNA。使用量为1、10、100、1,000或10,000pg的具有E746_A750del的标准DNA，以及10,000pg的野生型标准DNA和量分别为1、10、100、1,000或10,000 pg的E746_A750del标准DNA的混合物。为了量化，将Ct循环数对已知标准的DNA量的log值作图，得到标准曲线。线性相关系数(R2)的数值和斜率的公式被计算。用于阳性对照的DNA提取自已知包含E746_A750del的日本人腺癌PC-9细胞系和已知包含外显子19野生型的人类上皮癌A431细胞系，10,000pgDNA被使用。
通过ARMS检测血清DNA的EGFR突变状态
采自27位NSCLC病人的血清DNA的E746_A750del或L858R被检查。外显子19和外显子21的野生型在全部的血清样品中都被检测出来。E746_A750del在12位病人的样品中被检测出来。L858R在一位病人中被检测出来(表2)。全部地，EGFR突变在27位病人的13位(48.1％)中被检测出来。23位血清中携带EGFR突变的病人的原始肿瘤的组织学亚型被总结在表3a中。23个腺癌病例中的11个(47.8％)、2个鳞状细胞癌病例中的1个、和2个大细胞癌病例中的1个对于EGFR突变呈阳性。统计上EGFR突变状态与组织学类型无关。来源于女性病人的EGFR突变比来源于男性的更经常在样品中被检测到(10位中的7位，70％；对应于17位中的6位，29.4％，表3b)。
血清中EGFR突变状态和对于吉非替尼的响应
来自显示部分响应(PR)或稳定疾病(SD)(17个病例中的11个，75％)的病人样品中的EGFR突变比来自进行性疾病(PD，10个病例中的2个，18％)的病人样品中的显著更频繁地被观测到(p＝0.046，Fisher′s exact测试，表3c)。
实施例3：血清中EGFR突变状态和对于生存的影响
统计学分析。Fisher′s exact测试用于比较具有不同特性，包括性别、肿瘤类型和对于吉非替尼的响应，的NSCLC病人中EGFR突变的存在。关于对于吉非替尼的响应的分析，根据RECIST标准，病人被分为部分响应或稳定疾病(PR/SD)和进行性疾病(PD)两个组。我们使用标准log-rank测试，比较总体生存和无进展生存的Kaplan-Meier曲线。“总体生存”(OS)被定义为从开始给予吉非替尼到由任何原因引起的死亡的时间；在分析的时候已知仍然存活的病人在他们最后一次追踪调查的时候被检查。“无进展生存(PFS)”被定义为从开始给予吉非替尼到第一次出现进行性疾病或由任何原因引起的死亡的时间；在分析的时候已知存活且没有进行性疾病的病人在他们最后一次追踪调查的时候被检查。0.05的P值在统计学上被认为是显著的。使用版本5.0的Stat View程序包进行统计分析。
接受吉非替尼治疗的全部病人的PFS中值是98天，OS中值是306天。血清中携带EGFR突变的病人与没有EGFR突变的病人相比，具有显著更长的PFS中值(200天对比于46天，P＝0.005，图3a)。携带EGFR突变的病人与没有EGFR突变的病人相比，具有更长的OS中值，尽管没有统计显著性(611天相对于232天，P＝0.078，图3b)。这些结果提示血清EGFR突变对于无进展生存和总体生存起到预后因子的作用，同时还可以作为病人对于吉非替尼治疗的响应的预测器(predictor)。
实施例4：通过直接测序和与ARMS的比较来分析血清中的EGFR 突变
通过从27位病人中的10位(37.0％)中提取的血清DNA的直接测序(direct sequence)来检测删除突变(E746_A750del)。
PCR扩增和直接测序。对从血清和组织样本中获得的每一个样品进行两份扩增和直接测序。在25μl体积中进行PCR，使用15μl模板DNA、0.75单位的Ampli Taq Gold DNA聚合酶(Perkin-Elmer，RocheMolecular Systems Inc.，Branchburg，NJ)、2.5μl PCR缓冲液、0.8mMdNTP、0.5μM的每种引物、以及取决于多态性标志的不同浓度的MgCl2。成套引物的序列和扩增的程序遵循如以前所描述的(Nuc.AcidsRes.1989；17：2503-2516)进行。使用热循环仪(Perkin-Elmer，FosterCity，CA)进行扩增。使用ABI prism 310(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行测序。序列与GenBank存档的人类序列(登记号：AY588246)针对EGFR进行比较。
外显子18、19、20和21中的点突变未在来自血清样品的PCR产物中检测到。通过直接测序检测出来的血清EGFR状态与组织学类型、性别、对于吉非替尼的响应(表3)和生存优势(PFS∶P＝0.277，OS∶P＝0.859，补充数据2)在统计学上都不相关联。通过直接测序得到的EGFR突变状态与27个成对样品(paired samples)中的15个(55.6％)通过ARMS得到的相一致。4个病例中的EGFR突变(E746_A750del)通过直接测序呈阳性，通过ARMS呈阴性。8个病例通过直接测序呈阴性，通过ARMS呈阳性。
实施例5：肿瘤中EGFR突变与血清中EGFR突变的比较
回顾来看，20个肿瘤样品从15位病人中获得。
组织样品采集和DNA提取。肿瘤标本的获得按照经伦理委员会(Institutional Review Board)批准的试验方案进行。回顾来看，在治疗以前，来自15位病人的肿瘤材料的20个石蜡块被收集起来用于诊断。通过经支气管肺活组织检查(trans bronchiallung biopsy)，11个原发癌的肿瘤样品被采集，1个被手术切除，9个来自于转移性位点(4个来自于骨、3个来自于淋巴结、1个来自于脑和1个来自于结肠)。全部样本经过组织学检查以证实NSCLC的诊断。使用DEXPATTM试剂盒(TaKaRa Biomedicals，Shiga，日本)进行肿瘤样品的DNA提取。
EGFR外显子19和21的测序在相同的PCR条件下进行。来自12位病人的肿瘤样品被测序(表4)。在4个病例中检测到EGFR突变(25.0％)；其中的3个病例中外显子19中被删除了15bp(E746_A750del)，以及1个病例中外显子21是L858R。具有EGFR突变的病人的组织学类型：3个是腺癌和1个是大细胞癌。这4个病人对于吉非替尼的响应：2位病人是PR，1位病人是SD，以及1位病人是PD。其他的3个样品由于PCR产物的扩增太低而没有被评估。
回顾来看，数对肿瘤样品和血清样品采自于11位病人(表4)。在成对的样品中，8/11(72.7％)的肿瘤的EGFR突变状态与血清中的相一致。两位病人肿瘤中的E746_A750del呈阳性以及血清中的呈阴性，一位病人肿瘤中的E746_A750del呈阴性以及血清中的呈阳性。
表1病人特征
Figure A20058005178300261
PS，行为状态；Ad，腺癌；Scc，鳞状细胞癌；Large，大细胞癌；PR，部分响应；SD，稳定疾病；PD，进行性疾病。
表2病人特征和使用EGFR ARMS-Scorpion方法从血清DNA中检测的EGFR突变状态
Figure A20058005178300271
SD，稳定疾病；PD，进行性疾病；PR，部分响应；M，男性；F，女性；Ad，腺癌；Large，大细胞癌；Scc，鳞状细胞癌；+，SmartCycler检测到的曲线；-，不是SmartCycler检测到的曲线；
表3根据组织学(a)、性别(b)、和对于吉非替尼的响应(c)，肺癌病人血清DNA中的EGFR突变的频率。总体27个样品来源于治疗以前的28位病人。
a组织学和EGFR突变状态
Figure A20058005178300281
b性别和EGFR突变状态
c对于吉非替尼的响应和EGFR突变状态
Figure A20058005178300283
Ad，腺癌
PR，部分响应；SD，稳定疾病；PD，进行性疾病；
表4肿瘤样品和血清样品中的EGFR突变状态。数对肿瘤和血清样品来源于12位病人。
Figure A20058005178300291
M，男性；F，女性；SD，稳定疾病；PD，进行性疾病；PR，部分响应；Scc，鳞状细胞癌；Ad腺癌；Large，大细胞癌
*具有来自肿瘤来源的DNA和血清来源的DNA的不同状态EGFR突变的病人。
表5
蛋白质
位置    野生型    突变
688     L         P
694     P         L/S
709     E         K
709     E         V
715     I         S
720     S         F
718     L         P
719     G         S/C/A/D
724     G         S
730     L         F
733     P         L
735     G         S
742     V         A
delE746_A750
delE746_S752V
delE746_P753insLS
delL747_A750insP
delL747_T751insP
746     E         K
del750_754
751     T         I
752     S         Y
755     A         P
del756_758
761     D         N
768     S         I
769     V         L
770     D         N
772     H         L
772     P         S
773     V         M
776     R         C
778     G         F
781     C         R
783     T         I
784     S         F
790     T         M
792     L         P
798     L         F
810     G         S
820     Q         STOP
826     N         S
834     V         M
835     H         Y
836     R         C
847    T    I
850    H    N
851    V    A
853    I    T
857    G    R
858    L    M
858    L    R
859    A    T
861    L    Q
863    G    D
864    A    T/V
866    E    K
873    G    E
877    P    S
880    W    STOP
882    A    T
893    H    Q
895    S    G
897    V    I
958    R    P
核苷酸
2063   C    T
2080   C    T
2081   C    T
2118   C    T
2125   G    A
2126   A    T
2142   G    A
2144   T    G
21 53  T    C
2155   G    T/A/C
2156   G    C/A
2159   C    T
2169   C    T
2170   G    A
2188   C    T
2198   C    T
2203   G    A
2225   T    C
2236   G    A
del2247_2262
2252   C    T
del2268_2275
2281   G    A
2303   T    G
2305   G    C
2308   G    A
2314   C    T
2326    C    T
2340    C    T
2341    T    C
2348    C    T
2351    C    T
2364    C    T
2369    C    T
2375    T    C
2392    C    T
2406    C    T
2428    G    A
2421    C    T
2458    C    T
2477    A    G
2484    G    A
2500    G    A
2502    G    A
2503    C    T
2506    C    T
2508    C    T
2523    G    A
2540    C    T
2548    C    A
2552    T    C
2553    C    T
2563    A    T
2565    G    A
2569    G    A
2570    G    T
2571    G    T
2572    C    A
2575    G    A
2582    T    A
2588    G    A
2588    T    C
2590    G    A
2591    C    T
2596    G    A
2607    C    T
2618    G    A
2629    C    T
2639    G    A
2644    G    A
2676    C    T
2679    C    A
2683    A    G
2689    G    A
2877    A    G
序列表
SEQ ID NO.1
<SEQ01；DNA；HOMO SAPIENS>3633
ATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGC
TCTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCAAGGCACGAGTAACAAGCTCACGCAGTTGGGCACTTTTGAAGATCATT
TTCTCAGCCTCCAGAGGATGTTCAATAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTTGGAAATTACCTATGTGCAG
AGGAATTATGATCTTTCCTTCTTAAAGACCATCCAGGAGGTGGCTGGTTATGTCCTCATTGCCCTCAACAC
AGTGGAGCGAATTCCTTTGGAAAACCTGCAGATCATCAGAGGAAATATGTACTACGAAAATTCCTATGCCT
TAGCAGTCTTATCTAACTATGATGCAAATAAAACCGGACTGAAGGAGCTGCCCATGAGAAATTTACAGGAA
ATCCTGCATGGCGCCGTGCGGTTCAGCAACAACCCTGCCCTGTGCAACGTGGAGAGCATCCAGTGGCGGGA
CATAGTCAGCAGTGACTTTCTCAGCAACATGTCGATGGACTTCCAGAACCACCTGGGCAGCTGCCAAAAGT
GTGATCCAAGCTGTCCCAATGGGAGCTGCTGGGGTGCAGGAGAGGAGAACTGCCAGAAACTGACCAAAATC
ATCTGTGCCCAGCAGTGCTCCGGGCGCTGCCGTGGCAAGTCCCCCAGTGACTGCTGCCACAACCAGTGTGC
TGCAGGCTGCACAGGCCCCCGGGAGAGCGACTGCCTGGTCTGCCGCAAATTCCGAGACGAAGCCACGTGCA
AGGACACCTGCCCCCCACTCATGCTCTACAACCCCACCACGTACCAGATGGATGTGAACCCCGAGGGCAAA
TACAGCTTTGGTGCCACCTGCGTGAAGAAGTGTCCCCGTAATTATGTGGTGACAGATCACGGCTCGTGCGT
CCGAGCCTGTGGGGCCGACAGCTATGAGATGGAGGAAGACGGCGTCCGCAAGTGTAAGAAGTGCGAAGGGC
CTTGCCGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAAT
ATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGA
CTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAG
GGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATA
CGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATT
ACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATA
CAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAAC
AGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAG
GGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTG
AGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAAC
ATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGT
CAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATG
TGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAAT
GGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGG
GATCGGCCTCTTCATGCGAAGGCGCCACATCGTTCGGAAGCGCACGCTGCGGAGGCTGCTGCAGGAGAGGG
AGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACT
GAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGGACTCTGGATCCCAGA
AGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGG
AAATCCTCGATGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGC
CTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACA
CAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGGCATGAACTACTTGG
AGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAG
ATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGT
GCCTATCAAGTGGATGGCATTGGAATCAATTTTACACAGAATCTATACCCACCAGAGTGATGTCTGGAGCT
ACGGGGTGACTGTTTGGGAGTTGATGACCTTTGGATCCAAGCCATATGACGGAATCCCTGCCAGCGAGATC
TCCTCCATCCTGGAGAAAGGAGAACGCCTCCCTCAGCCACCCATATGTACCATCGATGTCTACATGATCAT
GGTCAAGTGCTGGATGATAGACGCAGATAGTCGCCCAAAGTTCCGTGAGTTGATCATCGAATTCTCCAAAA
TGGCCCGAGACCCCCAGCGCTACCTTGTCATTCAGGGGGATGAAAGAATGCATTTGCCAAGTCCTACAGAC
TCCAACTTCTACCGTGCCCTGATGGATGAAGAAGACATGGACGACGTGGTGGATGCCGACGAGTACCTCAT
CCCACAGCAGGGCTTCTTCAGCAGCCCCTCCACGTCACGGACTCCCCTCCTGAGCTCTCTGAGTGCAACCA
GCAACAATTCCACCGTGGCTTGCATTGATAGAAATGGGCTGCAAAGCTGTCCCATCAAGGAAGACAGCTTC
TTGCAGCGATACAGCTCAGACCCCACAGGCGCCTTGACTGAGGACAGCATAGACGACACCTTCCTCCCAGT
GCCTGAATACATAAACCAGTCCGTTCCCAAAAGGCCCGCTGGCTCTGTGCAGAATCCTGTCTATCACAATC
AGCCTCTGAACCCCGCGCCCAGCAGAGACCCACACTACCAGGACCCCCACAGCACTGCAGTGGGCAACCCC
GAGTATCTCAACACTGTCCAGCCCACCTGTGTCAACAGCACATTCGACAGCCCTGCCCACTGGGCCCAGAA
AGGCAGCCACCAAATTAGCCTGGACAACCCTGACTACCAGCAGGACTTCTTTCCCAAGGAAGCCAAGCCAA
ATGGCATCTTTAAGGGCTCCACAGCTGAAAATGCAGAATACCTAAGGGTCGCGCCACAAAGCAGTGAATTT
ATTGGAGCATGA
<SEQ02；PROTEIN/1；HOMO SAPIENS>1210
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQ
RNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQE
ILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKI
ICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGK
YSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATN
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RGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGEN
SCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMN
ITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTN
GPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKET
EFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGIC
LTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVK
ITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEI
SSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTD
SNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSF
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EYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEF
IGA

Claims (33)

1.用于检测ErbB受体中一个或多个突变的方法：-
(a)提供来自病人的生物流体样品；
(b)从所述样品中提取DNA；和
(c)针对该受体中一个或多个突变的存在筛选所述DNA。
2.如权利要求1所述的方法，包括检测ErbB受体中一个或多个突变，该突变改变所述受体中酪氨酸激酶的活性。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该ErbB受体是EGFR。
4.如之前任一项权利要求所述的方法，用于预测病人对于ErbB受体药物的响应，包括步骤：-
(a)提供来自病人的生物流体样品；
(b)从所述样品中提取DNA；和
(c)针对该受体中改变酪氨酸激酶活性的一个或多个突变的存在情况筛选所述DNA。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，用于监测病人对于ErbB受体药物的响应，包括步骤：-
(a)提供来自病人的生物流体样品；
(b)从所述样品中提取DNA；和
(c)针对该受体中改变酪氨酸激酶活性的一个或多个突变的存在情况筛选所述DNA。
6.如权利要求4所述的方法，其中癌症病人对于ErbB受体药物的响应的预测预言了该病人的生存优势。
7.如权利要求4所述的方法，进一步包括步骤：
(d)做出结论：被检测出携带突变型和野生型等位基因的病人对于ErbB受体药物的响应将为阳性，而仅被检测出野生型等位基因的病人对该药物不会做出阳性的响应。
8.如之前任一项权利要求所述的方法，其中筛选方法包括使用聚合酶链反应，该聚合酶链反应使用用于检测单碱基突变、小的框内缺失或碱基替换的等位基因特异性引物。
9.如权利要求8所述的方法，其中筛选方法涉及使用实时聚合酶链反应(real time-PCR)，该实时聚合酶链反应使用检测单碱基突变、小的框内缺失或碱基替换的等位基因特异性引物。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中第一个引物对被用于检测野生型等位基因，第二个引物对被用于检测突变等位基因；其中每对中的一个引物包括：-
(a)具有对特定突变为等位基因特异性的3′末端核苷酸的引物；和
(b)该引物3′末端的可能的附加的错配。
11.如权利要求10所述的方法，其中每对中的一个引物包括：-
(a)含有引物序列和对靶序列特异的其他序列的单分子或核酸双链体探针；
(b)在所述单分子或核酸双链体之内的与淬火剂分子相近的附着于探针5′末端的荧光报道染料；
(c)在所述探针一末端的一个或多个非编码核苷酸残基；
(d)其中，所述报道染料和淬火剂分子在靶序列的扩增期间分离。
12.如权利要求11所述的方法，其中该探针是
Figure A2005800517830003C1
探针。
13.如之前任一项权利要求所述的方法，其中通过使用能够检测以野生型序列10％水平存在的突变序列的技术来检测突变。
14.如之前任一项权利要求所述的方法，其中该生物流体是血液、血清、血浆、汗液或唾液中的任何一种。
15.如权利要求11所述的方法，其中该生物流体是血清。
16.如之前任一项权利要求所述的方法，其中该ErbB受体药物是ErbB受体酪氨酸激酶抑制剂。
17.如之前任一项权利要求所述的方法，其中该ErbB受体药物是EGFR酪氨酸激酶抑制剂。
18.如权利要求16所述的方法，其中药物选自由吉非替尼、埃罗替尼(特罗凯，OSI-774，CP-358774)、PKI-166、EKB-569、HKI-272(WAY-177820)、拉帕替尼(GW2016，GW-572016，GSK572016)、canertinib(CI-1033，PD183805)、AEE788、XL647、BMS 5599626、ZD6474(ZactimaTM)或WO2004/006846或WO2003/082290中公开的任何化合物构成的组。
19.如权利要求15所述的方法，其中最优选的EGFR酪氨酸激酶抑制剂是吉非替尼或厄洛替尼。
20.如权利要求14所述的方法，其中ErbB受体药物是抗EGFR抗体，选自由西妥昔单抗(爱必妥，C225)、曲妥珠单抗(EMD-72000)、帕尼单抗(ABX-EGF/rHuMAb-EGFR)、MR1-1、IMC-11F8或EGFRL11构成的组。
21.如之前任一项权利要求所述的方法，其中ErbB受体药物被用作单一治疗或与其它药物的联合使用。
22.如之前任一项权利要求所述的方法，其中突变是核酸的插入、缺失或替换。
23.如权利要求22所述的方法，其中突变发生于ErbB受体的酪氨酸激酶结构域。
24.如之前任一项权利要求所述的方法，其中突变发生于EGFR的酪氨酸激酶结构域。
25.如权利要求22所述的方法，其中突变簇集于EGFR外显子18、19、20或21的ATP结合位点附近。
26.如权利要求22所述的方法，其中突变选自列在表5中的EGFR突变的组。
27.如权利要求24所述的方法，其中突变是EGFR外显子19中的E746_A750del和EGFR外显子21中的L858R。
28.如之前任一项权利要求所述的方法，其中病人所患的癌症选自由非实体肿瘤例如白血病、多发性骨髓瘤或淋巴瘤，以及实体肿瘤例如胆管、骨、膀胱、脑/CNS、恶性胶质瘤、乳房、结肠直肠、子宫颈、子宫内膜、胃、头和颈、肝、肺、肌肉、神经元、食管、卵巢、胰腺、胸膜/腹膜、前列腺、肾、皮肤、睾丸、甲状腺、子宫和外阴肿瘤构成的组。
29.如权利要求4所述的方法，进一步包括步骤：
(d)针对ErbB受体下游信号传导途径的元件中的一个或多个突变的存在情况筛选所述DNA。
30.组合物，其包括用于检测ErbB受体野生型等位基因的第一个引物对和用于检测突变等位基因的第二个引物对，其中，每对中的一个引物进一步包括：
(a)具有对特定突变有等位基因特异性的3′末端核苷酸的引物；
(b)该引物3′末端的可能的附加的错配；
(c)包括引物序列和对靶序列特异的另外的序列的单分子或核酸双链体探针；
(d)在所述单分子或核酸双链体之内的与淬火剂分子相近的附着于5′末端的荧光报道染料；
(e)在所述探针一末端的一个或多个非编码核苷酸残基；
(f)其中，所述报道染料和淬火剂分子在靶序列扩增期间分离。
31.特异于ErbB受体的引物在用于预测病人对于ErbB药物的响应的在生物流体中进行的分析中的用途。
32.特异于ErbB受体的引物在制造组合物中的用途，该组合物用于测试生物流体从而预测病人对于ErbB药物的响应。
33.如权利要求31所述的用途，进一步包括步骤：
(a)从所述样品中提取DNA；和
(b)针对ErbB受体中改变酪氨酸激酶活性的一个或多个突变的存在情况筛选所述DNA。
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