KR20070048645A

KR20070048645A - 상피 성장 인자 수용체 유전자 프로모터에 있어서의 다형성

Info

Publication number: KR20070048645A
Application number: KR1020067020515A
Authority: KR
Inventors: 마크 제이 라테인; 왕칭 류; 페데리코 이노센티
Original assignee: 더 유니버시티 오브 시카고
Priority date: 2004-03-01
Filing date: 2005-03-01
Publication date: 2007-05-09
Also published as: WO2005085473A3; CA2558753A1; JP2007527241A; US20070275386A1; WO2005085473A2; CN101056990A; EP1730306A2

Abstract

본 발명은 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 유전자내 다형성에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 EGFR 발현에 영향을 미치는 EGFR 유전자의 프로모터내 단일의 뉴클레오타이드 다형성(SNP)와 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다. EGFR 발현 또는 활성과 관련된 다형성을 확인함으로써, 신규 방법 및 조성물이 제공되어 EGFR-표적화 치료제의 잠재 효능 및 독성을 평가하기 위한, 환자의 임상 예후를 예측하며, EGFR 조절곤란과 관련된 질병에 대한 환자의 발병 위험성을 평가할 수 있다.

상피 성장 인자 수용체(EGFR) 유전자, 뉴클레오타이드 다형성(SNP)

Description

상피 성장 인자 수용체 유전자 프로모터에 있어서의 다형성{Polymorphisms in the epidermal growth factor receptor gene promoter}

발명의 배경

본 발명은 본원에 참조로 인용된, 2004년 3월 1일자로 출원된 미국 가 특허원 제60/549,069호에 대한 우선권을 주장한다. 정부는 국립보건원으로부터 승인 번호 제U01GM61393호에 따라 본 발명에서의 권리를 소유한다.

본 발명은 일반적으로 분자생물학 및 종양학 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 발현 및 활성과 관련된 EGFR 유전자내 다형성에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 EGFR 발현에 영향을 미치는 EGFR 유전자의 프로모터내 단일의 뉴클레오타이드 다형성(SNP)을 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

사람 상피 성장 인자 수용체(EGFR)는 세포 증식, 분화 및 생존의 시그날 전환 경로에서 중요한 역활을 담당한다. EGFR의 과발현은 사람 원발 종양의 약 30% 에서 발견된다. 이러한 종양에서 이의 활성화는 세포 증식, 운동성, 부착, 침입능을 증가시키고, 아폽토시스(apoptosis)를 차단시킴에 의해 종양 성장을 촉진하는 것으로 나타난다(참조: Tysnes et al., 1997). EGFR 과발현 및 조절곤란(dysregulation)은 환자에서 더욱 불량한 예후, 및 전이, 말기 질병, 및 화학치료요법, 호르몬 치료요법 및 방사선치료에 대한 내성과 관련되어져 왔다(참조: Salomon et al., 1995; Akimoto et al., 1999; Wosikowski et al., 2000).

EGFR 5' 조절 영역은 엑손 1의 2kb 업스트림 및 2kb 하부에 이르는 약 4kb를 차지한다. 조절 성분은 프로모터 영역 및 2개의 별개의 인핸서 영역을 포함한다. EGFR 프로모터 및 인핸서의 작용은 잘 연구되어 있으며 보고되었다(참조: Ishii et al., 1985; Haley et al., 1987; Johnson et al., 1988; Kageyama et al., 1988; Maekawa et al., 1989). 요약하면, 프로모터에서는 TATA 또는 CAAT 박스가 발견되지 않는다. 대신에, 다수의 전사 개시 부위가 존재한다(참조: Ishii et al., 1985; Haley et al., 1987 ; Johnson et al., 1988; Kageyama et al., 1988). 다수의 시스- 및 트랜스- 조절인자는 발견되어 왔다. 이들 조절인자는 DNA-결합 단백질(ERDBP-1)에 반응성인 EGF, p53, p63, Spl, 비타민 D-반응성 성분(VDRE), 및 EGFR의 복잡한 조절을 반영하는 에스트로겐 반응성 성분을 포함한다.

데옥시리보뉴클레아제 I 풋프린팅(footprinting)은, Spl이 EGFR 유전자 프로모터내에서 4개의 CCGCCC 서열(-457 내지 -440, -365 내지 -286, -214 내지 -200, 및 -110 내지 -84)에 결합할 수 있으므로, 유전자 조절에서 중요한 역활을 담당할 수 있음을 나타내었다(참조: Johnson et al., 1998). 겝하르트(Gebhardt)와 동료 들(1999)에 의한 연구는, 14 내지 21개의 반복단위 범위에 이르는 EGFR(하부 인핸서 근처)의 인트론 1내에 디뉴클레오타이드(CA)_n 반복 다형성이 EGFR 발현을 조절하는 것으로 여겨짐을 입증하였다. 21개의 반복단위를 지닌 보다 긴 대립형질유전자는, 16개의 반복단위를 지닌 보다 짧은 대립형질유전자와 비교하여 유전자 발현이 80% 감소함을 나타내었다(참조: Gebhardt et al., 1999; Buerger et al., 2000). 다형성 CA 반복단위에 대한 연구로부터의 데이타는, 당해 다형성 부위가 암 감수성에 역활을 담당할 수 있음을 제안하고 있다(참조: Brandt et al., 2004).

종양 생물학에서 EGFR의 중요성때문에, 수개의 EGFR-표적화 암 치료법이 현재 개발중에 있다. EGFR-표적화제는 통상적으로 EGFR 인산화를 억제하거나 EGF 결합을 차단하는 것에 집중되고 있다. 최근에 전이성 비-소세포 폐암의 치료용으로 입증된 한가지 약물은 게피티니브이다. 게피티니브는 EGF-자극된 EGFR 자가인산화를 억제하는 선택적인 EGFR-타이로신 키나제 억제제이다.

EGFR은 다수의 항암 약물의 직접적인 표적이므로, EGFR의 가변성 발현은 약물 반응 및 독성에 직접 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 유전자 발현 또는 활성과 관련된 EGFR 유전자내 다형성은 세포 시그날 형질도입을 추가로 이해하여 약물 반응/독성을 유추하는 것 둘다에 중요할 것이다. EGFR 유전자내 다형성의 연구는 또한 장래의 약물 설계에 유용할 수 있다.

EGFR 발현은 또한 암 이외의 질병과 관련되어 있다. 예를 들어, EGFR 마이크로세틀라이트(microsatellite) 다형성 및 상염색체 우성 다낭콩팥병(ADPKD)의 진행정도와의 관련성이 보고되었다(참조: Magistroni et al., 2003). EGFR의 기능 또는 발현에 영향을 미치는 돌연변이는 염증성 창자병에 걸리기 쉽다는 것이 제안되었다(참조: Martin et al., 2002). 즉, EGFR의 발현 또는 활성과 관련된 EGFR 유전자내 다형성의 확인은 EGFR 조절곤란과 관련된 각종 질병의 진행을 추가로 이해하는데 있어 중요할 것이다.

발명의 요약

본 발명은 EGFR 5'-조절 영역내 12개의 다형성을 기술하고 있다. 더욱 특히, 본 발명자는, -216G>T 다형성이 EGFR 프로모터 영역으로부터의 증가된 발현과 관련됨을 입증하였다. EGFR 발현과 관련된 다형성의 확인은 EGFR-표적화 치료제의 잠재 효능 및/또는 독성을 평가하고, 환자의 임상 진단을 예측하며, EGFR 조절곤란과 관련된 질병으로 진행될 환자의 위험성을 평가하기 위한 신규 방법 및 조성물이 가능하도록 한다.

본 발명은 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169, 및 2034에서 EGFR 유전자 좌내 다형성 부위를 기술한다. EGFR 유전자 좌 중 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169, 및 2034는 +1로 정의된 해독 개시 부위와 관련하여 이들의 위치에 의해 확인된다. 0으로 지정된 뉴클레오타이드 위치는 없다. 이러한 명명법에 따라서, +1의 뉴클레오타이드에 바로 인접한 5' 는 -1이고, +1의 뉴클레오타이드에 바로 인접한 3'는 2이다. 해독 개시 부위(+1)은 EGFR 유전자의 유전자위치 중 뉴클레오타이드 9,385번(참조: 본원에 참조로 인용된 GenBank 수탁 번호 제AF288738호) 및 서열번호 1의 뉴클레오타이드 505번에 상응한다. 서열번호 1은 AF288738의 뉴클레오타이드 8,881번 내지 9,405번을 포함한다.

본 발명자에 의해 발견된 특정 다형성은 -1435 C>T,-1300 G>A, -1249 G>A, -1227 G>A, -761 C>A, -650 G>A, -544 G>A, -486 C>A, -216 G>T, -191 C>A, 169 G>T, 및 2034 G>A이다. 이들 다형성은 EGFR 유전자의 5' 조절 영역내에 위치하며, 이들은 유전자 조절과 관련될 수 있다.

즉, 하나의 양태에서, 본 발명은 세포내 하나 또는 둘다의 EGFR 유전자상에서 하나 이상의 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169, 또는 2034에서 서열을 측정함을 포함하여, 세포 또는 세포들내 EGFR의 발현 수준을 예측하는 방법을 제공한다. 결과적으로, 이러한 세포를 지닌 환자는 일반적인 수준의 EGFR 발현을 지닌 것으로 예측할 수 있다. 바람직한 양태에서, 당해 방법은 세포내 EGFR 유전자의 하나 또는 둘다의 대립형질 유전자내 -216 위치에서 서열을 측정함을 포함한다. 하나의 또는 둘다의 대립형질유전자내 -216 위치에서 T의 존재는 보다 높은 발현 수준의 지표이다. "보다 높은 발현 수준"은 EGFR 유전자의 대립형질유전자 둘다에서 -216 위치에 G를 지닌 세포내 발현 수준보다 더욱 높은 발현 수준이다. 용어 "측정하다"는 이의 명료하고 통상적인 의미에 따라 사용되며; 이는 관찰, 추론 또는 계산에 의해 결론이 발견되거나 도출됨을 의미한다.

EGFR 유전자 좌의 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169, 또는 2034에서의 다형성과 연결 불균형 상태 인 다형성은 당해 분야의 숙련가의 방법에 의해 또한 측정할 수 있다. "연결 불균형"(본원에 사용된 것으로서 "LD", 당해 분야에서는 또한 "LED"로 언급됨)은 당해 분야의 숙련가에게 이의 명료하고 통상적인 의미에 따라 사용된다. LD는, 대립형질의 특정 조합(즉, 제공된 유전자의 변이체 형태) 또는 2개의 유전자 좌에서 다형성이 예측되는 것보다 더욱 빈번히 존재하는 상태를 말한다. 당해 분야의 숙련가에 의해 측정된 것으로서 연결 불균형과 관련하여 사용된 "현저한"은 0.25 또는 0.1일 수 있고 0.1, 0.05, 0.001, 0.00001 또는 그 이하일 수 있는 통계학적 ρ 또는 α 값인 것으로 고려된다. EGFR 일배체형 및 EGFR 단백질의 발현 수준사이의 관계를 사용하여 유전자형(즉, 유기체의 유전자 구성)을 표현형(즉, 유기체 또는 세포에 의해 나타난 물리적 성질)에 연관시킬 수 있다. "일배체형"은 당해 분야의 숙련가에게 이의 명료하고 통상적인 의미에 따라 사용된다. 이는 이종 염색체중 하나를 따라 2개 이상의 대립형질 유전자 또는 다형성의 유전자형을 언급한다.

EGFR 유전자 좌 중 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169 및 2034에서, 또는 이와 연결 불균형 상태인 서열은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 방법으로도 측정할 수 있다. 서열은 직접 또는 간접적으로 측정할 수 있다. 목적한 뉴클레오타이드 위치의 서열은 예를 들면, 흥미있는 위치에서 특정 핵산과 연결 불균형 상태인 것으로 공지된 위치에서 뉴클레오타이드 서열을 측정함으로써 간접적으로 측정할 수 있다. 특정의 뉴클레오타이드 위치에서 서열의 측정 방법은 예를 들면, 하이브리드화 검정, 대립형질유전자 특이적인 증폭 검정, 서열분석 검정, 미세서열분석 검 정(microsequencing assay), 침입성 분해 검정, 및 제한 효소 검정을 포함한다. 특정 양태에서, -216 G>T 다형성의 존재는 제한 효소 BseR1을 사용한 분해로 측정한다. -216 위치에서 T와의 대립형질 유전자는 BseR1 으로 절단할 수 있으나, -216 위치에서 G와의 대립형질유전자는 절단될 수 없다.

다른 양태에서, 본 발명은 환자의 하나 또는 둘다의 EGFR 유전자내 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169 또는 2034에서 서열을 측정함을 포함하여, 환자에서 EGFR의 조절곤란과 관련된 질병을 치료하기 위한 EGFR-표적화 치료제의 잠재 효능을 평가하기 위한 방법을 제공한다.

EGFR의 조절곤란과 관련된 질병은, EGFR이 비교가능한 정상 세포내 발현과 비교하여 과발현되거나, 저발현되거나, 또는 부적절한 시기에 발현되는 특정 질병일 수 있다. EGFR 발현의 부적절한 조절과 관련된 질병의 예는 암, 상염색체 우성 다낭콩팥염, 및 염증성창자병과 같은 염증 질환을 포함한다.

EGFR-표적화 치료제는 EGFR 활성을 직접 또는 간접적으로 조절할 수 있는 어떠한 제제일 수 있다. 당해 분야에 공지되어 있는 EGFR-표적화 치료제는 통상적으로 EGF 결합을 차단하거나 EGFR 인산화를 억제하는 것을 지시한다. 2개의 EGFR-표적화 치료제가 FDA 승인을 받았는데, 하나는 이레싸(게피티니브)이고 다른 것은 에르비툭스(케툭시마브)이다. 다른 EGFR-표적화 치료제, 타르케바(에를로티니브)는 시험 III 단계에 있다. 이레싸 및 타르케바는 작은 분자인 반면, 에르비툭스는 모노클로날 항체이다. 다른 EGFR-표적화제는 EGFR의 전사를 조절함으로써 EGFR 활성 을 조절한다. 예를 들어, EGFR mRNA 생산은 세포를 EGF, 덱사메티손, 티로이드 호르몬, 레틴산, 인터페론 α 또는 야생형 p53으로 처리함으로써 직접 또는 간접적으로 자극할 수 있다.

특정의 측면에서, 본 발명은 환자에서 하나 또는 둘다의 EGFR 유전자내 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169 또는 2034에서 서열을 측정함을 포함하여, 환자에서 암 치료용 EGFR-표적화 치료제의 잠재 효능을 평가하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, EGFR-표적화 치료제는 게피티니브, 에를로티니브 또는 케툭시마브이다. -216 위치에서 서열을 측정하는 것이 바람직하다. 일부 양태에서, EGFR 유전자의 하나 또는 둘다의 대립형질 유전자상의 -216 위치에서 T를 갖는 환자는 대립형질 유전자 둘다의 -216 위치에서 G를 지닌 환자와 비교하여 EGFR-표적화 치료제의 감소된 효능의 지시인자이다.

일부 양태에서, 본 발명의 방법은 또한 샘플을 수득하는 것을 포함한다. 샘플은, 하나 또는 둘다의 EGFR 유전자내 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169 또는 2034에서 서열이 측정될 수 있는 게놈 DNA를 함유하는 어떠한 샘플일 수 있다. 샘플은 예를 들면, 생검, 정맥천자, 흡인 또는 도포(swabbing)에 의해 수득할 수 있다. 샘플은 어떠한 조직 또는 체액으로부터 수득할 수 있다. 특정의 양태에서, 샘플은 협측 세포, 단핵 세포 또는 암 세포를 포함한다.

특정의 측면에서, 본 발명의 방법은 또한 EGFR-표적화 치료제를 환자에게 투 여함을 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 환자에서 하나 또는 둘다의 EGFR 유전자내 하나 이상의 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169 또는 2034에서 서열을 측정하거나, 또는 이들 위치와 연결 불균형 상태인 서열을 측정함을 포함하여, EGFR의 조절곤란과 관련된 질병을 지닌 환자의 임상적 예후를 예측하기 위한 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 다형성은 -216 G>T이다. 대립형질 유전자상에서 위치 -216에서 T의 존재는 EGFR 단백질의 증가된 발현의 지시인자이다. 특정 측면에서, EGFR 단백질의 증가된 발현은 불량한 예후의 지시인자이다. 일부 양태에서, EGFR의 조절곤란과 관련된 질병은 암이다. 암 환자의 경우, 불량한 예후는 예를 들면 화학치료요법, 호르몬 치료요법 또는 방사선치료요법에 대한 내성의 증가를 나타낸다. 불량한 예후는 또한 전이 위험의 증가 또는 생존 시간의 감소를 나타낼 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명은 환자의 하나 또는 둘다의 EGFR 유전자내 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169 또는 2034에서 다형성의 존재를 측정함을 포함하여, EGFR-표적화 치료제에 대한 환자의 독성 위험성을 평가하는 방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 다형성은 -216 G>T이다. 하나의 양태에서, 하나 또는 둘다의 대립형질 유전자상의 -216 위치에서 T의 존재는 EGFR-표적화 치료제의 독성 감소의 지시인자이다.

다른 양태에서, 본 발명은 환자의 하나 또는 둘다의 EGFR 유전자내 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169 또는 2034에서 다형성의 존재를 측정함을 포함하여, 환자의 암으로 진행될 위험성을 평가하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서 다형성은 -216 G>T이다.

본 발명의 특정의 측면에서, 당해 방법은 또한 환자 병력을 참조함을 추가로 포함하며, 여기서, 당해 환자는 암으로 진행될 위험성이 있거나 EGFR-표적화 치료제가 요구되는 것으로 확인된다.

본 발명은 또한 키트를 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169, 또는 2034에서 다형성을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 당해 키트는 다형성의 존재를 측정하기 위한 핵산을 함유한다. 핵산은 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 일부 양태에서, 프로브는 올리고뉴클레오타이드 배열 또는 미세배열내에 포함된다. 다른 양태에서, 키트는 다형성의 존재를 측정하기 위한 제한 효소를 함유한다. 특정 양태에서, 키트는 핵산 및 제한 효소 둘다를 함유한다. 조절 핵산은 당해 키트속에 포함될 수 있다.

일부 양태에서, 당해 키트의 핵산은 서열번호 2의 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 또는 그 이상의 보존성(consensus) 뉴클레오타이드를 포함한다.

특정의 측면에서, 본 발명은 EGFR 유전자 좌내에서 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169, 또는 2034에서 다형성의 존재를 측정하기 위한 핵산을 포함하는, 환자에서 EGFR-표적화 치료제의 잠재 효능을 평가하기 위한 키트를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 EGFR 유전자 좌내 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169 또는 2034에서 다형성의 존재를 측정하기 위한 제한 효소를 포함하는, 환자에서 EGFR-표적화 치료제의 잠재 효능을 평가하기 위한 키트를 제공한다.

본원에 기술된 어떠한 방법 또는 조성물도 본원에 기술된 다른 어떠한 방법 또는 조성물과 관련하여 제공될 수 있음이 고려된다.

청구의 범위에서 용어 "또는"의 사용은, 비록 당해 기술이 단지 대안 및 "및/또는"을 언급하는 정의를 지지한다고 해도, 단지 대안을 언급하기 위해 명확히 나타내거나 대안이 상호 배타적이지 않는다면 "및/또는"을 의미하는데 사용된다.

당해 출원 전체에서, 용어 "약"은, 값이 이러한 값을 측정하는데 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함함을 나타내는데 사용된다.

장기-존속 특허법에 따라, 용어 "a" 및 "an"은 청구의 범위 또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, 특별하게 나타내지 않는 한 하나 이상을 나타낸다.

본 발명의 기타 목적, 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예들은, 본 발명의 특정 양태를 나타낸다고 해도, 본 발명의 취지 및 영역내에서 다양한 변화 및 변형이 당해 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백해질 것이므로, 단지 나열의 방법으로만 제공된다.

다음 도면들은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 나타낸 특정 양태의 상세한 기술과 함게 하나 이상의 이들 도면을 참조하여 더욱 잘 이해할 수 있다.

도 1은 EGFR 유전자 좌의 유전자지도이다. EGFR 조절 영역은 프로모터, 인핸서 및 엑손 1으로 확장된다. 조절 영역내에서 발견된 12개의 단일 뉴클레오타이드 다형성의 위치는 화살표로 나타낸다.

도 2는 EGFR 프로모터 영역의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열은 -504 내지 +21이며, 여기서, +1은 해독 개시 코돈의 제1 뉴클레오타이드를 지정하며 0으로 지정된 뉴클레오타이드는 없다. -216 G>T 다형성, -191 C>A 다형성, -191 C>A 다형성, Sp1 결합 부위, 전사 개시 부위, SacI 절단 부위 및 업스트림 프라이머의 위치가 또한 나타나 있다.

도 3은 루시퍼라제 활성 검정을 위해 작제한 벡터 유전자지도를 나타낸다. EGFR 프로모터의 405bp KpnI-SacI 단편을 루시퍼라제 유전자의 폴리클로날 부위 업스트림내로 클로닝시킨다. 클로닝된 단편을 서열분석하는데 사용었던 프라이머, RVP3 및 GLP2의 위치도 또한 나타나 있다.

도 4는 루시퍼라제 리포터 작제물을 사용한 일시적인 형질감염 검정에서 EGFR 다형성 -216 G>T 및 -191 C>A에 대한 4개의 일배체형의 발현 활성을 나타낸다. 루시퍼라제 유전자의 상대적 발현은 pRL-TK 벡터내에서 레닐라(renilla) 유전 자 수준으로 표준화하였다.

도 5는 -216G 및 -216T 대립형질유전자에 대한 핵 단백질의 결합 효능을 시험하는 전기운동성 쉬프트 검정(electromobility shift assay)을 나타낸다. Spl 보존성 프로브를 대조군으로 사용하였다. EMSA에서 사용된 당해 프로브 및 경쟁 서열은 표 4에 나열되어 있다. 핵 단백질의 현저히 높은 결합 효능은 -216G 대립형질(레인 1)과 비교하여 -216T 대립형질(레인 3)을 사용하여 관측하였다.

도 6A 내지 6B는 MDA-MB-231, MCF-7, HEK-293 및 SL-2 세포에서 pGL3EGFRluc (^*1 내지 ^*4)의 일시적인 형질감염을 도시한 것이다(A). 사람 세포주의 경우, 1.6 ㎍의 pGL3EGFRluc을 160 ng의 pRL-TK 벡터를 사용하여 공-형질감염시켰다. SL-2 세포의 경우, 300 ng의 pGL3EGFRluc를 100 ng의 pPac-Spl 벡터로 형질감염시키고 200개 광 단위의 루시퍼라제 활성/총 단백질 ㎍/ml를 1로 설정하였다. 프로모터 활성의 현저한 차이는 -216G/T-191 C/A의 G-C 및 T-C 일배체형사이에서 관측되었다 (모든 p 값은 0.04 미만이다). 데이타는 평균±SEM으로 나타내었다. MDA-MB-231, MCF-7 및 HEK293 세포주중 EGFR의 상대적 발현 및 -216G/T 및 -191C/A 다형성의 상응하는 유전자형은 (B)에 나타내었다. EGFR mRNA 수준은 1000개 카피의 ß-액틴 유전자로 표준화하였다. 시험을 3회 반복하고 데이타를 평균 ±SEM으로 나타내었다.

A. 상피 성장 인자 수용체

사람 상피 성장 인자 수용체(EGFR)는 막관통(transmembrane protein) 단백질이다. 상피 성장 인자 및 TGF-α와 같은 리간드와, 세포외 표면상에서 자체의 N-말단의 결합은 수용체 이량체화(dimerization)를 유도하고 세포내 도메인의 타이로신 키나제 활성을 활성화시킨다. EGFR의 활성화는 궁극적으로 DNA 합성, 및 세포 증식, 성숙, 생존 및 아폽토시스를 초래하는 세포 현상의 캐스케이드를 가져온다.

EGFR의 발현은 주로 전사 수준에서 조절된다(참조: Xu et al., 1984). EGFR mRNA 생산이 EGF, 덱사메타손, 티로이드 호르몬, 레틴산, 인터페론 α, 또는 야생형 p53으로 세포를 처리함에 의해 직접 또는 간접적으로 자극될 수 있음은 입증되어 있다(참조: Deb et al., 1994; Grandis et al., 1996; Hudson et al., 1989; Subler et al., 1994; Xu et al., 1993).

EGFR 5' 조절 영역은 엑손 1의 업스트림 2kb 및 하부 2kb를 차지하는 약 4kb에 해당한다. 조절 성분은 프로모터 영역 및 2개의 별개의 인핸서 영역을 포함한다. EGFR 프로모터 및 인핸서의 작용은 잘 연구되어 있고 보고되었다(참조: Ishii et al., 1985; Haley et al., 1987; Johnson et al., 1988; Kageyama et al., 1988; Maekawa et al., 1989; 이들 각각은 참조로 인용된다). 요약하면, 프로모터에서 TATA 또는 CAAT 박스는 발견되지 않는다. 대신에, 다수의 전사 개시 부위가 존재한다(참조: Ishii et al., 1985; Haley et al., 1987; Johnson et al., 1988; Kageyama et al., 1988). 다수의 시스- 및 트랜스- 조절인자도 발견되었다. 이들 조절인자는 EGF 반응성 DNA-결합 단백질(ERDBP-1), p53, p63, Spl, 비타민 D-반응성 성분(VDRE) 및 EGFR의 복잡한 조절을 반영하는 에스트로겐 반응성 성분을 포함한다.

데옥시리보뉴클레아제 I 풋프린팅(footprinting)은, Sp1이 EGFR 유전자 프로모터내에서 4개의 CCGCCC 서열(-457 내지 -440, -365 내지 -286, -214 내지 -200, 및 -110 내지 -84)에 결합할 수 있으므로 유전자 조절에 중요한 역활을 한다는 사실을 나타낸다(참조: Johnson et al., 1998). 겝하르트(Gebhardt) 및 동료들의 연구(1999)는 14 내지 21개 반복단위의 범위에 이르는 EGFR(하부 인핸서 근처)의 인트론 1내 디뉴클레오타이드 (CA)_n 반복단위 다형성이 EGFR 발현을 조절하는 것으로 여겨짐을 입증하였다. 21개의 반복단위를 지닌 보다 긴 대립형질 유전자는 16개의 반복단위를 지닌 보다 짧은 대립형질 유전자와 비교하여 유전자 발현의 80% 감소를 나타내었다(참조: Gebhardt et al., 1999; Buerger et al., 2000). 다형성 CA 반복단위에서의 연구로부터의 데이타는, 당해 다형성 부위가 암 민감성에 역활을 담당할 수 있음을 제안한다(참조: Brandt et al., 2004).

EGFR의 과발현은 사람 원발 종양중 약 30%에서 발견된다. 이들 종양에서 이의 활성화는 세포 증식, 운동성, 부착, 침입능을 증가시키고, 아폽토시스를 차단시킴에 의해(참조: Tysnes et al., 1997) 종양 성장을 촉진하는 것으로 나타난다. EGFR 과발현 및 조절곤란은 환자에서 보다 불량한 예후, 및 전이, 말기 단계 질병 및 화학치료법, 호르몬 치료법 및 방사선치료법에 대한 내성과 관련되어 있다(참조: Salomon et al., 1995; Akimoto et al., 1999; Wosikowski et al., 2000).

EGFR의 과 발현이 일부 암과 관련되어 있으며 이것이 종양 성장을 촉진시키는 것으로 나타난다는 관측을 바탕으로 하여, 유전자 발현과 관련된 EGFR 유전자내 다형성의 확인은 개인의 암으로 진행될 위험성을 예측하고 암 환자의 예후를 예측하는데 중요할 수 있다. 또한, EGFR 발현과 관련된 다형성을 또한 사용하여 독성, 용량 및 EGFR-표적화제의 잠재 효능을 평가할 수 있다.

일부 EGFR-표적화된 암 치료법이 현재 개발중에 있다. EGFR-표적화제는 통상적으로 EGFR 인산화를 억제하거나 EGF 결합을 차단하는 것에 관한 것이다. 2개의 EGFR-표적화 약물인 이레싸(게피티니브) 및 에르비툭스(세툭시마브)가 입증되어 있으며 타르케바(에를로티니브)가 시험 III 단계에 있다. EGFR은 다수의 항암약물의 직접적인 표적이므로, EGFR의 다양한 발현은 약물 반응 및 독성에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 유전자 발현 또는 활성과 관련된 EGFR 유전자내 다형성은 세포 시그날 형질도입을 추가로 이해하여 약물 반응/독성을 유추하는데 모두 중요할 것이다. EGFR 유전자내 다형성의 연구는 또한 장래의 약물 설계에 유용할 수 있다.

EGFR 발현은 또한 암이외의 질병과 관련된다. EGFR은 신장 관 증식에 있어 주요 성분이다. 최근에, EGFR 마이크로세틀라이트(microsatellite) 다형성 및 상염색체 우성 다낭콩팥염(ADPKD)의 진행정도와의 관련성이 보고되었다[참조: Magistroni et al., (2003)]. 또한, 특이적인 타이로신 키나제 억제제(EKI-785)를 사용하여 EGFR을 억제하는 것이 ADPKD의 쥐 모델에서 질병 진행을 늦춘다는 것이 입증되었다(참조: Sweeney et al., 1999).

사람 EGFR는 염증성창자병에 연결된 영역인 염색체 7p12에 대해 맵핑되었다(참조: Satsangi et al., 1996). 또한, EGFR 면역반응성에 있어서의 현저한 증가는 대장염의 동물 모델에서 관측되었다(참조: Reinshagen et al., 1993). EGFR의 작용 또는 발현에 영향을 미치는 돌연변이가 염증성창자병에 걸리기 쉽게할 수 있음이 제안되어 있다(참조: Martin et al., 2002).

세포 증식을 조절하는데 있어서 EGFR의 중요성때문에, 이의 발현 또는 활성과 관련된 EGFR 유전자내 다형성이 EGFR 조절곤란과 관련된 질병의 진행을 추가로 이해하는데 중요할 것이다. 본 발명은 EGFR 유전자의 5' 영역내 12개의 다형성, -1435 C>T, -1300 G>A, -1249 G>A, -1227 G>A, -761 C>A, -650 G>A, -544 G>A, -486 C>A, -216 G>T, -191 C>A, 169 G>T, 및 2034 G>A를 확인하였다. 다형성은 +1로 지정된 해독 개시 부위로부터의 이들의 위치와 관련하여 확인된다. 당해 명명법에 따라서, +1의 뉴클레오타이드에 바로 인접한 5'는 -1이고, +1의 뉴클레오타이드에 바로 인접한 3'는 2이다. 해독 개시 부위(+1)은 EGFR 유전자 좌의 뉴클레오타이드 9,385(참조: GenBank 수탁번호 제AF288738호) 및 서열번호 1의 뉴클레오타이드 505에 상응한다. 서열번호 1은 EGFR 유전자 좌의 뉴클레오타이드 8,881 내지 9,405를 포함한다.

하나의 SNP, -1249 G>A는 업스트림 인핸서내에 있는 반면, -216 G>T 및 -191 C>A는 프로모터 영역내에 있다. 흥미롭게도, -216 G>T는 Spl 결합 부위내에 위치하고 G를 T로 치환하는 것은 Spl 결합을 변경시킬 수 있다. -191 C>A는 전사 개시 부위에 근접해 있다. 따라서, 이들 SNP는 EGFR 전사에 현저히 영향을 미칠 수 있다.

B. 핵산

본 발명의 특정의 양태는 게놈 DNA의 분석시 포함되는 프로모터, 증폭 프라이머, 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 기타 핵산 성분을 포함하는, 각종 핵산에 관한 것이다. 특정 측면에서, 핵산은 야생형, 돌연변이체, 또는 다형성 핵산을 포함한다.

용어 "핵산"는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 본원에 사용된 것으로서 "핵산"은 일반적으로 핵산염기를 포함하는 DNA, RNA, 또는 이의 유도체 또는 유사체의 분자(즉, 쇄)를 말한다. 핵산염기는 예를 들면, DNA에서 발견된 천연적으로 존재하는 퓨린 또는 피리미딘 염기(예: 아데닌 "A", 구아닌 "G", 티민 "T" 또는 사이토신 "C") 또는 RNA(예: A, G, 우라실 "U" 또는 C)를 포함한다. 용어 "핵산"은 각각 용어 "핵산"의 아속으로서 용어 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"을 포함한다.

용어 "올리고뉴클레오타이드"는, 길이가 약 3 내지 약 100 핵산염기인 분자를 말한다. 용어 "폴리뉴클레오타이드"는, 길이가 약 100 핵산염기 이상인 하나 이상의 분자를 말한다. "유전자"는 유전자 산물의 암호화 서열, 및 유전자 산물의 인트론 및 프로모터를 말한다. EGFR 유전자외에, EGFR에 대한 프로모터 및 인핸서와 같은 기타 조절 영역이 청구된 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위한 핵산으로서 고려된다.

이들 정의는 일반적으로 일본쇄 분자를 말하나, 특정 양태에서는 또한 부분적으로, 실질적으로, 또는 완전히 일본쇄 분자에 상보성인 추가의 쇄를 포함할 것이다. 즉, 핵산은 하나 이상의 상보성 쇄(들) 또는 분자를 포함하는 특정 서열의 "상보체(들)"을 포함하는 이본쇄 분자 또는 삼본쇄 분자를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 일본쇄 핵산은 접두어 "ss"로서, 이본쇄 핵산은 접두어 "ds"로서, 및 삼본쇄 핵산은 접두어 "ts"로서 나타낼 수 있다.

용어 "유전자"는 폴리펩타이드 쇄를 생산하는데 관여된 DNA의 절편을 말하며; 이는 암호하 영역의 전방 및 후방 영역 및 개개의 암호화 절편(엑손)사이의 중재 서열(인트론)을 포함한다. "프로모터"는 전사의 개시 및 속도를 조절하는 핵산 서열의 영역이다. 이는, 조절 단백질 및 분자, 예를 들면, RNA 폴리머라제 및 기타 전사 인자가 결합하여 핵산 서열의 특정 전사를 개시할 수 있는 성분을 함유할 수 있다. 용어 "인핸서"는 핵산 서열의 전사 활성화에 포함된 시스-작용의 조절 서열을 말한다. 인핸서는 한쪽 배향으로 작용할 수 있고 프로모터의 업스트림 또는 하부일 수 있다.

1. 핵산의 제조

핵산은 예를 들면, 화학 합성, 효소적 생산 또는 생물학적 생산과 같이, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 기술로도 제조할 수 있다. 합성 핵산(예: 합성 올리고뉴클레오타이드)의 비-제한적 예는 포스포트리에스테르, 포스파이트 또는 포스포르아미디트 화학을 사용한 시험관내 화학 합성 및 본원에 참조로 인용한 유럽 특허 제266,032호에 기술된 바와 같은 고체상 기술, 또는 본원에 각각 참조로 인용된 문헌(참조: Froehler et al. 1986) 및 미국 특허 제5,705,629호에 기술된 바와 같은 데옥시뉴클레오사이드 H-포스포네이트 중간체에 의해 제조된 핵산을 포함한다. 본 발명의 방법에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드가 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 합성의 각종의 상이한 메카니즘은 예를 들면, 각각 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제4,659,774호, 제4,816,571호, 제5,141,813호, 제5,264,566호, 제4,959,463호, 제5,428,148호, 제5,554,744호, 제5,574,146호, 제5,602,244호에 기술되어 있다.

효소적으로 생산된 핵산의 비-제한적 예는 PCR^TM(참조: 예를 들면 각각 본원에 참조로 인용된호 미국 특허 제4,683,202호 및 미국 특허 제4,682,195호)과 같은 증폭 반응, 또는 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,645,897호에 기술된 올리고뉴클레오타이드의 합성에서 효소에 의해 생산된 것을 포함한다. 생물학적으로 생산된 핵산의 비-제한적 예는 세균에서 복제된 재조합 DNA 벡터(참조: 본원에 참조로 인용된 문헌, Sambrook et al. 2001)와 같이 살아있는 세포에서 생산(즉, 복제된) 재조합 핵산을 포함한다.

2. 핵산의 정제

핵산은 폴리아크릴아미드 겔상에서, 세슘 클로라이드 원심분리 구배, 크로마토그래피 컬럼 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기타 어떠한 수단으로도 정제할 수 있다(참조: 본원에 참조로 인용된 문헌, Sambrook et al., 2001).

특정 측면에서, 본 발명은 분리된 핵산인 핵산에 관한 것이다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "분리된 핵산"은 하나 이상의 세포의 총 게놈 및 전사된 핵산 다량으로부터 자유로이 분리된, 또는 한편 분리된 핵산 분자(예: RNA 또는 DNA 분자)를 말한다. 특정 양태에서, "분리된 핵산"은 세포 성분 다량 또는 예를 들면, 지질 또는 단백질과 같은 거대분자, 생물학적 소분자 등과 같은 시험관내 반응 성분으로부터 자유로이 분리된 핵산을 말한다.

3. 핵산 절편

특정 양태에서, 핵산은 핵산 절편이다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "핵산 절편"은 EGFR 유전자 서열의 단지 일부를 암호화하는 것과 같은 핵산의 분획이다. 즉, "핵산 절편"은 약 2개의 뉴클레오타이드로 부터, 폴리아데닐화 시그날에 대한 조절 영역 및 모든 암호화 영역을 포함하는 어떠한 길이를 포함하는 완전한 길이의 유전자를 포함하는 유전자 서열의 어떠한 부분도 포함할 수 있다.

각종의 핵산 절편은 특정 핵산 서열을 기준으로 설계할 수 있으며 어떠한 길이일 수 있다. 서열에 수치를 지정함으로써, 예를 들면 첫번째 잔기를 1로 하고, 두번째 잔기를 2로 함으로써, 모든 핵산 절편을 정의하는 알고리듬이 창조될 수 있다:

n 내지 n + y

상기 알고리듬에서,

n은 1 내지 서열의 마지막 수의 정수이고,

y는 핵산 절편의 길이 -1이며,

n + y는 서열의 최대 수를 넘지 않는다.

즉, 10-량체의 경우, 핵산 절편은 염기 1 내지 10, 2 내지 11, 3 내지 12...등에 상응한다. 15-량체의 경우, 핵산 절편은 염기 1 내지 15, 2 내지 16, 3 내지 17... 등에 상응한다. 20-량체의 경우, 핵산 절편은 염기 1 내지 20, 2 내지 21, 3 내지 22... 등에 상응한다. 특정 양태에서, 핵산 절편은 프로브 또는 프라이머일 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "프로브"는 일반적으로 검출 방법 또는 조성물에 사용된 핵산을 말한다. 본원에 사용된 것으로서, "프라이머"는 일반적으로 연장 또는 증폭 방법 또는 조성물에 사용된 핵산을 말한다.

4. 핵산 상보체

본 발명은 또한 핵산에 상보적인 핵산을 포함한다. 핵산이 표준 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen), 또는 역 후그스틴 결합 상보성 규칙에 따라 다른 핵산과 염기-쌍을 이룰수 있는 경우, 이를 "상보체(들)" 또는 다른 핵산에 대한 "상보성"이라 한다. 본원에 사용된 것으로서, "다른 핵산"은 동일한 분자의 별개의 분자 또는 부분 분리된 서열을 언급할 수 있다. 바람직한 양태에서, 상보체는 핵산 다형성을 검출하기 위한 하이브리드화 프로브 또는 증폭 프라이머이다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "상보성" 또는 "상보체"는 또한 모든 핵산염기가 대응하는 핵산염기와 쌍을 이루는 경우에서 조차 다른 핵산 쇄 또는 이본쇄에 하이브리드화할 수 있는 연속 핵산염기 또는 반연속 핵산염기(예를 들면, 하나 이상의 핵산염기 잔기가 분자내에 존재하지 않는다)의 서열을 포함하는 핵산을 말한다. 그러나, 일부 진단 또는 검출 양태에서, 완전한 상보성 핵산이 바람직하다.

C. 핵산 검출

본 발명의 일부 양태는 표현형에 대한 유전자형 또는 일배체형과 관련된, EGFR내 다형성을 확인한 후 EGFR-표적화 약물 또는 화합물을 지니거나 제공될 환자의 다형성을 확인하는 것에 관한 것이며, 여기서, 표현형은 낮거나 변형된 EGFR 활성 또는 발현이다. 즉, 본 발명은 다형성을 확인하기 위한 검정 및 기타 핵산 검출 방법을 포함한다. 따라서, 핵산은 핵산 하이브리드화를 포함하는 양태에 대한 프로브 또는 프라이머로서의 용도를 지닌다. 이들은 본 발명의 방법을 진단하거나 스크리닝하는데 사용할 수 있다. EGFR을 암호화하는 핵산, 및 EGFR 폴리펩타이드 또는 전사체의 발현 또는 안정성에 관여하는 핵산의 검출이 본 발명에 포함된다. 핵산 검출의 일반적인 방법은 일본쇄 뉴클레오타이드 다형성(SNP)을 포함하는, 다형성의 확인을 위해 사용된 특정 실시예를 수반하여 하기에 제공된다.

1. 하이브리드화

길이가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 17 내지 100개 뉴클레오타이드, 또는 본 발명의 일부 측면에서, 1 내지 2 킬로염기 이상인 프로브 또는 프라이머의 사용은 둘다 안정하고 선택적인 이본쇄 분자를 형성하도록 한다. 길이가 20개 염기 이상인 근접한 길이에 걸쳐 상보성 서열을 갖는 분자가 일반적으로 수득된 하이브리드 분자의 안정성 및/또는 선택성을 증가시키는데 바람직하다. 하나는 일반적으로 20 내지 30개, 심지어 경우에 따라 그 이상의 뉴클레오타이드의 하나 이상의 상보성 서열을 지닌 하이브리드화용 핵산 분자를 설계하는데 바람직할 것이다. 이러한 단편은 예를 들면 화학적 수단에 의해 단편을 직접 합성하거나, 또는 재조합 생산을 위해 선택된 서열을 재조합 벡터내로 도입시킴에 의해 용이하게 제조할 수 있다.

특정의 양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열번호 1의 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열번호 2의 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.

따라서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 DNA 및/또는 RNA의 상보성 길이를 지닌 이본쇄 분자를 선택적으로 형성하거나, 또는 샘플로부터 DNA 또는 RNA의 증폭용 프라이머를 제공하기 위한 자체의 능력을 위해 사용할 수 있다. 상상한 적용에 따라, 표적 서열에 대한 프로브 또는 프라이머의 변화된 선택도를 달성하기 위한 하이브리드화의 변화된 조건을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

높은 선택성이 요구되는 적용의 경우에, 통상적으로 상대적으로 높은 엄중 조건(stringency condition)을 사용하여 하이브리드를 형성하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 상대적으로 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건, 예를 들면 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.10M의 NaCl이 제공된다. 이러한 높은 엄중 조건은, 프로브 또는 프라이머와 주형 또는 표적 쇄사이에 불일치되는 경우, 거의 허용하지 않으며 특수 유전자를 분리하거나 특수 다형성을 검출하는데 특히 적합할 것이다. 조건들이 포름아미드의 증가된 양을 첨가함으로써 더욱 엄격해질 수 있다는 것은 일반적으로 인지되어 있다. 예를 들어, 높은 엄중 조건하에서, 여과기-결합된 DNA에 대한 하이브리드화는 65℃에서 0.5 M NaHP0₄, 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 1 mM EDTA 속에서 수행하고 68℃에서 0.1 x SSC/0.1% SDS로 세척하여 수행할 수 있다(참조: Ausubel et al., 1996).

조건은 염 농도를 증가시키고/시키거나 온도를 강하시킴으로써 덜 엄격하게 할 수 있다. 예를 들어, 중간 엄중 조건은 약 37℃ 내지 약 55℃의 온도에서 약 0.1 내지 0.25M의 NaCl로 제공할 수 있는 반면, 낮은 엄중 조건은 약 20℃ 내지 약 55℃ 범위의 온도에서 약 0.15M 내지 약 0.9M 염으로 제공할 수 있다. 낮은 엄중 조건, 예를 들면, 약한 엄중 조건하에서, 세척은 예를 들면 42℃에서 0.2 x SSC/0.1% SDS속에서 수행할 수 있다(참조: Ausubel et al., 1996). 하이브리드화 조건은 목적한 결과에 따라 용이하게 조작할 수 있다.

다른 양태에서, 하이브리드화는 예를 들면, 대략 20℃ 내지 약 37℃의 온도에서 50mM 트리스-HCl (pH 8.3), 75mM KC1, 3mM MgCl₂, l.OmM 디티오트레이톨의 조건하에 수행할 수 있다. 이용된 다른 하이브리드화 조건은 대략 40℃ 내지 약 72℃ 범위의 온도에서 대략 lOmM 트리스-HCl(pH 8. 3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂를 포함한다.

특정 양태에서, 하이브리드화를 측정하기 위해 표지와 같은 적절한 수단과 함께 본 발명의 정의된 서열의 핵산을 사용하는 것이 유리할 것이다. 검출할 수 있는 형광성, 방사성, 효소 또는 기타 리간드, 예를 들면, 아비딘/바이오틴을 포함하는 광범위한 적절한 지시 수단은 당해 분야에 공지되어 있다. 바람직한 양태에서, 방사성 시약 또는 기타 환경적으로 바람직하지 않은 시약 대신에 우레아제, 알칼린 포스파타제, 또는 퍼옥시다제와 같은 효소 태그 또는 형광성 표지를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 효소 태그의 경우에, 가시적으로 또는 분광광도계적으로 검출가능한 검출 수단을 제공하거나, 또는 상보성 핵산 함유 샘플과의 특정 하이브리드화를 확인하기 위한 열량측정 지시제 물질이 알려져 있다. 다른 측면에서, 특정의 뉴클레아제 분해 부위가 존재할 수 있으며, 특정 뉴클레오타이드 서열의 검출은 핵산 분해의 존재 또는 부재에 의해 측정할 수 있다.

일반적으로, 본원에 기술된 프로브 또는 프라이머는 상응하는 유전자의 발현 또는 유전자형을 검출하기 위한 PCR^TM에서와 같은 용액 하이브리드화에서, 및 고체 상을 사용하는 양태에서 시약으로서 유용할 것이다. 고체 상을 포함하는 양태에서, 시험 DNA(또는 RNA)는 흡착되거나, 또는 달리는 선택된 매트릭스 또는 표면에 고정된다. 이렇게 고정된 일본쇄 핵산은 이후에 바람직한 조건하에서 선택된 프로브와 하이브리드화된다. 선택된 조건은 특정 상황(예를 들면, G+C 함량, 표적 핵산의 유형, 핵산 공급원, 하이브리드화 프로브의 크기 등)에 의존할 것이다. 목적한 특정 적용을 위한 하이브리드화 조건의 최적화는 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 하이브리드화 분자를 세척하여 비-특이적으로 결합된 프로브 분자를 제거한 후, 하이브리드화를 검출하고/하거나 결합된 표지의 양을 측정함으로써 적량화한다. 대표적인 고체상 하이브리드화 방법은 미국 특허 제5,843,663호, 제5, 900,481호 및 제5,919,626호에 기술되어 있다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 하이브리드화의 다른 방법은 미국 특허 제5,849,481호, 제5,849,486호 및 제5,851,772호에 기술되어 있다. 본 명세서의 당해 단락에서 확인된 이러한 및 기타 참조 문헌의 관련 부분은 본원에 참조로 인용된다.

2. 핵산의 증폭

증폭용 주형으로서 사용된 핵산은 표준 방법(참조: Sambrook et al., 2001)에 따라 세포, 조직 또는 기타 샘플로부터 분리할 수 있다. 특정 양태에서, 분석은 전체 세포 또는 조직 균등질 또는 생물학적 유액 샘플상에서 주형 핵산의 실질적인 정제로 또는 이러한 정제없이 수행한다. 핵산은 게놈 DNA 또는 분획화되거나 전체 세포 RNA일 수 있다. RNA가 사용되는 경우, 이는 RNA를 상보성 DNA로 우선 전환시키는 것이 바람직할 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "프라이머"는 주형-의존성 과정에서 초기 핵산의 합성을 프라이밍할 수 있는 어떠한 핵산도 포함하는 것을 의미한다. 통상적으로, 프라이머는, 길이가 10 내지 12개 및/또는 30개 염기 쌍인 올리고뉴클레오타이드이나, 더욱 긴 서열도 사용할 수 있다. 프라이머는, 비록 일본쇄 형태가 바람직하다고 해도, 이본쇄 및/또는 일본쇄 형태일 수 있다.

EGFR 유전자 좌(Genbank 수탁 번호 제AF288738호) 또는 이의 변이체, 및 이의 단편에 상응하는 핵산에 선택적으로 하이브리드화하도록 설계된 프라이머 쌍을 선택적인 하이브리드화를 허용하는 조건하에 주형 핵산과 접촉시킨다. 서열번호 1은 EGFR 유전자의 해독 개시 부위에 상응하는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 505번을 지닌 EGFR 유전자 좌의 뉴클레오타이드 8,881번 내지 9,405번을 포함하므로, 해독 개시 부위는 제AF288738호의 뉴클레오타이드 9,385번에 위치한다. 바람직한 적용에 따라, 프라이머에 완전하게 상보성인 서열에 하이브리드화하도록 할 높은 엄중 하이브리드화 조건을 선택할 수 있다. 다른 양태에서, 하이브리드화는 프라이머 서열과 하나 이상의 불일치를 함유하는 핵산의 증폭을 허용하도록 하는 완화된 엄중 조건하에서 일어날 수 있다. 일단 하이브리드화되면, 주형-프라이머 착물을 주형-의존성 핵산 합성을 촉진시키는 하나 이상의 효소와 접촉시킨다. 또한 "주기"로 언급되는 다수 회의 증폭을, 충분한 양의 증폭 산물이 생성될 때까지 수행한다.

증폭 산물은 검출, 분석 또는 적량화할 수 있다. 특정 적용에서, 검출은 가시적 수단으로 수행할 수 있다. 특정의 적용시, 검출은 화학발광, 혼입된 방사선표지 또는 형광성 표지물의 방사활성 섬광계수법 또는 심지어 전기 및/또는 열 충격 시그날을 사용하는 시스템을 통해 생성물을 간접적으로 확인함을 포함할 수 있다(참조: Affymax technology; Bellus, 1994).

다수의 주형 의존적인 과정은 제공된 주형 샘플에 존재하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는데 유용하다. 가장 잘 공지된 증폭 방법 중 하나는 이들의 전문이 본원에 각각 참조로 인용된 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 상세히 기술되어 있는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR^TM으로 칭함)이다.

다른 증폭 방법은 본원에 이의 전문이 참조로 인용된 유럽 특허원 제320,308호에 기술된 리가제 쇄 반응("LCR")이다. 미국 특허 제4,883,750호는 표적 서열에 프로브 쌍을 결합시키는 LCR과 유사한 방법을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,912,148호에 기술된 PCR^TM 및 올리고뉴클레오타이드 리가제 검정(OLA)을 기초로 한 방법(하기에 더욱 상세히 기술)을 또한 사용할 수 있다.

본 발명을 실시하는데 사용할 수 있는 표적 핵산 서열을 증폭시키기 위한 대안적인 방법은 이들의 전문이 각각 본원에 참조로 인용된, 미국 특허 제5,843,650호, 제5,846,709호, 제5,846,783호, 제5,849,546호, 제5,849,497호, 제5,849,547호, 제5,858,652호, 제5,866,366호, 제5,916,776호, 제5,922,574호, 제5,928,905호, 제5,928,906호, 제5,932,451호, 제5,935,825호, 제5,939,291호 및 제5,942,391호, 영국 특허원 제2 202 328호 및 PCT 특허원 제PCT/US89/01025호에 기술되어 있다. PCT 특허원 제PCT/US87/00880호에 기술된 Qbeta 레플리카제도 또한 본 발명에서 증폭 방법으로 사용할 수 있다.

제한 엔도뉴클레아제 및 리가제를 사용하여 제한 부위의 하나의 쇄내에 뉴클레오타이드 5'-[알파-티오]-트리포스페이트를 함유하는 표적 분자의 증폭을 달성하는 등온성 증폭 방법이 본 발명에서 핵산의 증폭에 유용할 수 있다(참조: Walker et al., 1992). 미국 특허 제5,916,779호에 기술된 표준 대체 증폭(SDA)은 다수 회의 쇄 치환 및 합성, 즉, 닉 해독을 포함하는 핵산의 등온성 증폭을 수행하는 다른 방법이다.

다른 핵산 증폭 과정은 핵산 서열 기준 증폭(NASBA) 및 3SR(참조: Kwoh et al., 1989 ; 본원에 이의 전문이 참조로 인용된 PCT 특허원 제WO 88/10315호)을 포함하는 전사-기준 증폭 시스템(TAS)을 포함한다. 유럽 특허원 제329 822호는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 일본쇄 RNA("ssRNA"), ssDNA, 및 이본쇄 DNA(dsDNA)를 임상적으로 합성함을 포함하는 핵산 증폭 방법을 기술하고 있다.

PCT 특허원 제WO 89/06700호(본원에 이의 전문이 참조로 인용됨)는 표적 일본쇄 DNA("ssDNA")에 대한 프로모터 영역/프라이머 서열의 하이브리드화에 이은 서열의 많은 RNA 카피의 전사를 기초로 한 핵산 서열 증폭 반응식을 기술하고 있다. 당해 반응식은 사이클이 아니며, 즉, 신규 주형이 수득되는 RNA 전사체로부터 생산되지 않는다. 다른 증폭 방법은 "RACE" 및 "일방향(one-sided) PCR"을 포함한다(참조: Frohman, 1994; Ohara et al., 1989).

3. 핵산의 검출

증폭에 이어서, 주형 및/또는 과량의 프라이머로부터 증폭 생성물을 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 하나의 양태에서, 증폭 생성물은 아가로즈, 아가로즈-아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 표준 방법(참조: Sambrook et al., 2001)을 사용하여 분리한다. 분리된 증폭 생성물은 추가의 조작을 위해 겔로부터 절단하여 용출시킬 수 있다. 저 융점 아가로즈 겔을 사용하여, 분리된 밴드를 겔을 가열한 후 핵산을 추출함으로써 제거할 수 있다.

핵산의 분리는 또한 당해 분야에 공지된 스핀 컬럼 및/또는 크로마토그래피 기술로 수행할 수 있다. 흡착, 분배, 이온-교환, 하이드록실아파타이트, 분자체, 역-상, 컬럼, 제지, 박층 및 가스 크로마토그래피, 및 HPLC를 포함하여, 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있는 많은 종류의 크로마토그래피가 있다.

특정의 양태에서, 증폭 산물은 분리하거나, 또는 분리하지 않고 가시화시킨다. 통상적인 가시화 방법은 겔을 에티디움 브로마이드로 염색하고 밴드를 UV 광하에 관찰하는 것을 포함한다. 달리는, 증폭 산물을 방사선- 또는 형광측정-표지된 뉴클레오타이드로 통합적으로 표지하는 경우, 분리된 증폭 생성물을 x-선 필름에 노출시키거나 적절한 여기 스펙트럼하에 가시화시킬 수 있다.

하나의 양태에서, 증폭 산물을 분리한 후, 표지된 핵산 프로브를 증폭된 마커 서열과 접촉시킨다. 프로브는 바람직하게는 발색단에 접합시키지만 방사선표지시킬 수 있다. 다른 양태에서, 프로브는 항체 또는 바이오틴과 같은 결합 파트너, 또는 검출가능한 잔기를 수반하는 다른 결합 파트너에 접합시킨다.

특정 양태에서, 검출은 서던 블롯팅 및 표지된 프로브를 사용한 하이브리드화에 의해 수행한다. 서던 블롯팅에 포함된 기술은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다(참조: Sambrook et al., 2001). 앞서의 하나의 예는 핵산의 자동화된 전기 영동 및 전달을 위한 장치 및 방법을 기술하고 있는, 본원에 참조로 인용된호 미국 특허 제5,279,721호에 기술되어 있다. 장치는 겔의 외부 조작없이 전기영동 및 블롯팅을 허용하며 본 발명에 따른 방법을 수행하기에 이상적으로 적합하다.

본 발명을 실시하는데 사용할 수 있는 다른 핵산 검출 방법은 각각 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,840,873호, 제5,843,640호, 제5,843,651호, 제5,846,708호, 제5,846,717호, 제5,846,726호, 제5,846,729호, 제5,849,487호, 제5,853,990호, 제5,853,992호, 제5,853,993호, 제5,856,092호, 제5,861,244호, 제5,863,732호, 제5,863,753호, 제5,866,331호, 제5,905,024호, 제5,910,407호, 제5, 912,124호, 제5,912,145호, 제5,919,630호, 제5,925,517호, 제5,928,862호, 제5,928,869호, 제5,929,227호, 제5,932,413호 및 제5,935,791호에 기술되어 있다.

4. 다른 검정

유전 스크리닝을 위한 다른 방법을 예를 들면 게놈 DNA, cDNA 및/또는 RNA 샘플에서 돌연변이를 검출하기 위해 본 발명의 영역내에서 사용할 수 있다. 점 돌연변이를 검출하는데 사용된 방법은 변성 구배 겔 전기영동("DGGE"), 제한 단편 길이 다형성 분석("RFLP"), 화학적 또는 효소적 분해 방법, PCR^TM 에 의해 증폭된 표적 영역의 직접적인 서열분석(상기 참조), 일본쇄 구조 다형성 분석("SSCP") 및 당해 분야에 공지된 기타 방법을 포함한다.

점 돌연변이의 한가지 스크리닝 방법은 RNA/DNA 또는 RNA/RNA 이종이본쇄에서 염기쌍 불일치의 RNase 분해에 기초한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "불일치"는 이본쇄 RNA/RNA, RNA/DNA 또는 DNA/DNA 분자내 하나 이상의 쌍을 이루지 않거나, 또는 쌍이 없는 뉴클레오타이드의 영역으로 정의된다. 따라서, 당해 정의는 삽입/결실 돌연변이, 및 단일 또는 다수의 염기 점 돌연변이로 인한 불일치를 포함한다.

미국 특허 제4,946,773호는 RNA 프로브에 대해 일본쇄 DNA 또는 RNA 시험 샘플을 어닐링한 후 핵산 이본쇄를 RNaseA로 처리하는 것을 포함하는 RNaseA 불일치 분해 검정을 기술하고 있다. 불일치를 검출하기 위해, 크기에 따라 전기영동적으로 분리한, RNaseA 처리의 일본쇄 산물을 유사하게 처리한 대조군 이본쇄와 비교한다. 대조군 이본쇄에서 관측되지 않는 보다 작은 단편(분해 산물)을 함유하는 샘플은 양성으로 기록한다.

다른 시험자는 불일치 검정에서 RNaseI의 사용을 기술하고 있다. 불일치 검출을 위한 RNaseI의 사용은 프로메가 바이오테크(Promega Biotech)로 부터의 문헌에 기술되어 있다. 프로메가는 4개의 공지된 불일치중 3개를 분해하기 위해 보고된 RNaseI을 함유하는 키트를 시판한다. 일본쇄-염기 불일치의 검출용 MutS 단백질 또는 다른 DNA-복구 효소를 사용하는 다른 것들도 기술되어 있다.

본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이의 검출용 대안 방법은 각각 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,849,483호, 제5,851,770호, 제5,866,337호, 제5,925,525호 및 제5,928,870호에 기술되어 있다.

5. SNP 스크리닝 방법의 특정 예

유기체의 게놈내 진화 과정동안에 발생한 자발적 돌연변이는 흔히 다수의 종 모두를 통해 즉지 전달되지 않으므로 종 집단에서 공동으로 존재하는 다형성 대립형질 유전자를 생성한다. 흔히 다형성은 유전자 질병의 원인이다. 몇몇 부류의 다형성이 확인되었다. 예를 들어, 가변성 뉴클레오타이드 유형 다형성(VNTR)은 뉴클레오타이드의 디- 또는 트리뉴클레오타이드 반복 모티프의 자발적인 무작위 중복으로부터 발생한다. 이러한 변이가 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 생성된 DNA 단편의 길이를 변형시키는 경우, 이러한 변이를 제한 단편 길이 다형성(RFLP)으로 언급한다. RFLP는 사람 및 동물 유전 분석에서 광범위하게 사용된다.

다형성의 다른 부류는 단일 뉴클레오타이드의 치환에 의해 생성된다. 이러한 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)은 드물게 제한 엔도뉴클레아제 부위에서의 변화를 초래한다. 즉, SNP는 제한 단편 길이 분석에 의해 드물게 검출가능하다. SNP는 가장 일반적인 유전 변이이며 매 100 내지 300개 염기당 1회씩 일어나며 수개의 유전 질병을 실제로 유발하기에 충분한 방식으로 단백질을 암호화하는 유전자내 단일 뉴클레오타이드에 영향을 미치는 SNP 돌연변이가 발견되었다. SNP 질병은 혈우병, 겸상 적혈구 빈혈, 유전성 혈색소침착증, 말기 발병 알츠하이머 병 등으로 예시된다.

본 발명과 관련하여, EGFR 유전자 산물의 활성 및/또는 수준에 영향을 미치는 다형성 돌연변이는 일련의 스크리닝 방법으로 측정할 것이다. 스크리닝 방법 중 한가지 세트는 시험관내 또는 생체내 검정에서 EGFR 유전자 산물의 유도성, 활성 및/또는 수준에 영향을 미치는 SNP를 확인하는데 목표를 둔다. 이후에 스크리닝 방법의 다른 세트를 수행하여 상기 확인된 SNP의 출현에 대해 개개인을 스크리닝할 것이다. 이를 수행하기 위해, 샘플(예: 혈액 또는 기타 체액 또는 조직 샘플)을 유전자형 분석을 위한 환자로부터 취할 것이다. SNP의 존재 또는 부재는 EGFR 발현 및/또는 활성 수준을 측정할 것이다. 본 발명에 의해 제공된 방법에 따라, 이들 결과를 사용하여 약물 부작용을 감소시키기 위해 개인에게 제공된 EGFR-표적화 치료제의 투여량을 조절하고/하거나 변경할 수 있을 것이다.

SNP는 결실, 점 돌연변이 및 삽입의 결과일 수 있다. 일반적으로, 어떠한 단일 염기 변형도, 원인에 상관없이, SNP를 초래할 수 있다. SNP의 보다 큰 발생은, 이들이 다른 부류의 다형성보다 더욱 용이하게 확인될 수 있음을 의미한다. 이들의 분포의 보다 큰 균일성은 목적한 특정 성향에 "보다 근접한" SNP의 확인을 허용한다. 이들 2개의 기여의 배합 효과는, SNP가 매우 가치있도록 한다. 예를 들어, 특정의 성향(예: EGFR의 과발현)이 특정 유전자 좌에서 돌연변이를 반영하는 경우, 특정 유전자 좌에 연결된 어떠한 다형성을 사용하여 개인이 이러한 성향을 나타낼 가능성을 예측할 수 있다. 일부 경우에, SNP는 이러한 성향의 원인일 수 있다. 예를 들어, EGFR 조절 영역의 Sp1 결합 부위에서 SNP는 Sp1 결합을 변경시켜 EGFR의 전사를 수행할 수 있다.

다형성을 스크리닝하기 위해 개발된 몇가지 방법 및 일부 예들이 하기 나열되어 있다. 문헌[참조: Kwok and Chen (2003) and Kwok (2001)]은 이들 방법의 일부의 개관을 제공하며; 이들 참조 문헌 둘다는 본원에 참조로 인용되어 있다.

EGFR 유전자 발현의 조절과 관련된 SNP는 이들 방법 중 어느 것 또는 이의 적합한 변형의 사용으로 특징화될 수 있다. 이러한 방법은 부위의 직접 또는 간접적인 서열분석, 제한 효소의 사용(여기서, 부위의 대립형질 유전자 각각은 제한 부위를 생성시키거나 파괴한다), 또는 대립형질 유전자-특이적인 하이브리드화 프로브의 사용을 포함한다.

환자에 관한 유용한 정보를 생성하는 방법으로 정보를 적용하고 다형성을 확인하는 예는 본원에 이들 모두가 참조로 인용된 미국 특허 제6,472,157호; 미국 특허원 제 20020016293호, 제20030099960호, 제2004203034호; 제WO 0180896호에서 찾을 수 있다.

a) DNA 서열분석

다형성을 특징화하는 가장 일반적으로 사용되는 방법은 플랭킹되고 다형성을 포함하는 유전자 좌의 직접적인 DNA 서열분석이다. 이러한 분석은 "생거법(Sanger Method)" (참조: Sanger et al., 1975)으로 또한 공지된 "디데옥시-매개된 쇄 종결법" 또는 "맥삼-길버트법(Maxam-Gilbert method)" (참조: Maxam et al., 1977)으로 또한 알려져 있는 "화학적 분해법"을 사용하여 달성할 수 있다. 폴리머라제 쇄 반응과 같은 게놈 서열-특이적인 증폭 기술과 함께 서열분석을 이용하여 목적한 유전자의 회수를 용이하게 할 수 있다(참조: Mullis et al., 1986; 유럽 특허원 제50,424호; 유럽 특허원 제84,796호, 유럽 특허원 제258,017호, 유럽 특허원 제237,362호; 유럽 특허원 제201,184호; 미국 특허 제4,683,202호; 제4,582,788호; 및 제4,683,194호; 이들 모두는 본원에 참조로 인용됨).

b) 엑소뉴클레아제 내성

다형성 부위에서 존재하는 뉴클레오타이드의 정체를 측정하기 위해 사용할 수 있는 기타 방법은 특수화된 엑소뉴클레아제-내성 뉴클레오타이드 유도체를 이용한다(참조: 미국 특허 제4,656,127호). 다형성 부위에 대해 대립형질 유전자 서열 이미디어틀리 3'에 상보성인 프라이머를 조사하에 DNA에 하이브리드화시킨다. DNA상의 다형성 부위가 존재하는 특수 엑소뉴클레오타이드-내성 뉴클레오타이드 유도에에 상보성인 뉴클레오타이드를 함유하는 경우, 유도체는 폴리머라제에 의해 하이브리드화된 프라이머의 말단에 혼입될 것이다. 이러한 혼입은, 프라이머가 엑소뉴클레아제 분해에 내성이 되도록 함으로써 이의 검출을 허용한다. 엑소뉴클레오타이드-내성 유도체의 실체는 알려져 있으므로 DNA의 다형성 부위에 존재하는 특정 뉴클레오타이드를 측정할 수 있다.

c)미세서열분석 방법

DNA내 다형성 부위를 검정하기 위한 몇몇의 다른 프라이머-인도된 뉴클레오타이드 혼입 과정이 문헌(참조: Komher et al., 1989; Sokolov 1990; Syvanen 1990; Kuppuswamy et al., 1991; Prezant et al., 1992; Ugozzoll et al., 1992; Nyren et al., 1993)에 기술되어 있다. 이들 방법들은 다형성 부위에서 염기들간에 식별하기 위한 표지된 데옥시뉴클레오타이드의 혼입에 의존한다. 시그날은 다수의 혼입된 데옥시뉴클레오타이드의 수에 비례하므로, 동일한 뉴클레오타이드의 수행시 발생하는 다형성은 수행 길이에 비례하는 시그날을 생성한다(참조: Syvanen et al., 1990).

d) 용액속에서 연장

프랑스 특허 제2,650,840호 및 PCT 특허원 제WO91/02087호는 다형성 부위의 뉴클레오타이드의 실체를 측정하기 위해 용액에 기초한 방법(solution-based method)을 논의하고 있다. 당해 방법에 따르면, 다형성 부위의 3'에 인접한 대립형질 유전자에 상보성인 프라이머가 사용된다. 이러한 부위의 뉴클레오타이드의 실체는 다형성 부위의 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 경우 프라이머의 말단에 혼입된 표지된 디데옥시뉴클레오타이드 유도체를 사용하여 측정한다.

e) 유전자 비트 분석(Genetic Bit Analysis) 또는 고체상 연장

PCT 특허원 제WO92/15712호는 다형성 부위의 3' 서열에 상보성인 프라이머 및 표지된 종결인자의 혼합물을 사용하는 방법을 기술한다. 혼입된 표지된 종결인자는 평가되는 표적 분자의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오타이드에 상보성이므로 확인된다. 여기서, 프라이머 또는 표적 분자는 고체상에 고정된다.

f) 올리고뉴클레오타이드 연결 검정(OLA)

이는 상이한 방법(참조: Landegren et al., 1988)을 사용하는 다른 고체상 방법이다. 표적 DNA의 일본쇄의 인접한 서열에 하이브리드화할 수 있는 2개의 올리고뉴클레오타이드를 사용한다. 이들 올리고뉴클레오타이드중 하나는 바이오티닐화되는 반면, 다른 것은 검출가능하게 표지된다. 정확하게 상보성인 서열이 표적 분자에서 발견되는 경우, 올리고뉴클레오타이드는 하이브리드화되어 이들의 말단이 접촉하여 연결 물질을 생성할 것이다. 연결은 아비딘을 사용함으로써 표지된 올리고뉴클레오타이드가 회수되도록 한다. 이러한 방법에 기초하여, PCR과 결합시킨 다른 핵산 검출 검정이 또한 기술되어 있다(참조: Nickerson et al., 1990). 여기서, PCR은 표적 DNA의 기하급수적 증폭을 달성하는데 사용되며, DNA는 이후에 OLA를 사용하여 검출한다.

g) 리가제/폴리머라제-매개된 유전자 비트 검정

미국 특허 제5,952,174호는 표적 분자의 인접한 서열에 하이브리드화할 수 있는 2개의 프라이머를 포함하는 방법을 기술한다. 하이브리드화된 생성물은, 표적이 고정된 고체 지지체상에서 형성된다. 여기서, 하이브리드화는, 프라이머가 한쪽으로부터 단일 뉴클레오타이드의 공간에 의해 분리되도록 일어난다. 폴리머라제, 리가제 및 하나 이상의 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트를 함유하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 당해 하이브리드화된 생성물을 항온처리하면 근접한 하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드의 어떠한 쌍도 연결되도록 한다. 리가제의 첨가는 시그날, 연장 및 연결을 생성하는데 요구되는 2개의 현상을 초래한다. 이는 연장 또는 연결 단독을 사용하는 방법보다 및 폴리머라제에 기초한 검정과는 다른 보다 높은 특이성 및 보다 낮은 "노이즈(noise)"를 제공하며, 당해 방법은 이를 제2 하이브리드화와 결합시킴에 의한 폴리머라제 단계 및 고체상에 부착될 시그날에 대한 연결 단계의 특이성을 증진시킨다.

h) 침입성 분해 반응

침입성 분해 반응을 사용하여 특정 다형성에 대한 세포 DNA를 평가할 수 있다. INVADER^®로 명명된 기술은 이러한 반응물을 사용한다(참조: de Arruda et al., 2002; Stevens et al., 2003, 본원에 참조로 인용). 일반적으로, 3개의 핵산 분자가 존재한다: 1) 표적 부위의 올리고뉴클레오타이드 업스트림("업스트림 올리고"), 2) 표적 부위를 덮는 프로브 올리고뉴클레오타이드("프로브"), 및 3) 표적 부위("표적")을 지닌 일본쇄 DNA. 업스트림 올리고 및 프로브는 중첩되지 않으나 이들은 연속된 서열을 함유한다. 당해 프로브는 플루오레세인과 같은 공여체 형광단, 및 다브실과 같은 수용체 염료를 함유한다. 업스트림 올리고의 3' 말단에서 뉴클레오타이드는 프로브-표적 이본쇄의 제1 염기쌍과 중첩("침범")된다. 이후에 프로브는 형광단/퀀처 쌍을 분리시키는 구조-특이적인 5' 뉴클레아제에 의해 분해되며, 이는 검출할 수 있는 형광성의 양을 증가시킨다(참조: Lu et al., 2004). 일부 경우에, 검정은 고체-표면 또는 어레이 형식으로 수행한다.

h) SNP를 검출하기 위한 기타 방법

SNP 검출 및 확인을 위한 몇가지 기타 특이적인 방법이 하기에 나타나 있으며 그 자체로 또는 본 발명에서 EGFR 유전자의 다형성을 확인하면서 적합하게 변형시켜 사용할 수 있다. 몇가지 다른 방법이 또한 본원에 참조로 인용한 웹사이트 www. ncbi. nlm. nih. gov/SNP에서 NCBI의 SNP 웹 사이트에 기술되어 있다.

특정 양태에서, 연장된 일배체형은 집단내 어떠한 제공된 유전자 좌에서도 측정할 수 있으며, 이는 어떠한 SNP가 풍부한지 및 어떤 것이 연합 연구에 필수적일지를 정확히 확인할 수 있도록 한다. 후자가 연결 불균형의 영역 또는 유전자의 일배체형을 포획하는 마커인, "일배체형 태그 SNP(htSNP)'로서 언급된다[참조: 예시적인 방법을 위해 본원에 각각 참조로 인용된 문헌, Johnson et al. (2001) 및 Ke and Cardon (2003)].

VDA-검정은 TaKaRa LA Taq 시약 및 기타 표준 반응 상태를 사용하는 긴 PCR 방법에 의한 게놈성 절편의 PCR 증폭을 이용한다. 긴 증폭은 DNA 크기를 약 2,000 내지 12,000bp 증폭시킬 수 있다. 변이체 검출인자 배열(VDA)에 대한 생성물의 하이브리드화는 어피메트릭스 하이 트로우풋 스크리닝 센터(Affymetrix High Throughput Screening Center)에 의해 수행할 수 있으며 컴퓨터화된 소프트웨어로 분석할 수 있다.

칩 분석으로 불리는 방법은 표준 또는 긴 PCR 프로토콜에 의한 게놈성 절편의 PCR 증폭을 이용한다. 하이브리드화 생성물은 VDA(참조: 본원에 참조로 인용된 문헌, Halushka et al., 1999)로 분석한다. SNP는 일반적으로 하이브리드화 패턴의 컴퓨터 분석에 기초한 "특정의" 또는 "유사하게"로 분류된다. 뉴클레오타이드 서열 분석과 같은 대안적 검출 방법과 비교함으로써, "특정의" SNP가 시간중에 100% 확인되며; "유사한" SNP가 당해 방법에 의해 시간중에 73% 확인되었다.

다른 방법은 단순히 PCR 증폭에 이어 관련된 제한 효소를 사용한 분해를 포함한다. 다른 것은 공지된 게놈성 영역으로부터의 정제된 PCR 산물의 서열분석을 포함한다.

다른 방법에서, 개개의 엑손 또는 거대 엑손의 중첩된 단편을 PCR-증폭시킨다. 프라이머를 공지된 또는 데이타베이스 서열로부터 설계하고 게놈성 DNA의 PCR-증폭을 다음 조건을 사용하여 수행한다: 200 ng DNA 주형, 0.5 μM의 각각의 프라이머, 80μM의 각각의 dCTP, dATP, dTTP 및 dGTP, 5% 포름아미드, 1.5mM MgCl₂, 0.5U의 Taq 폴리머라제 및 0.1 용량의 Taq 완충액. 열 주기를 수행하고 수득되는 PCR-생성물을 다양한 조건, 즉, 15% 우레아를 함유하고 5% 글리세롤을 함유하거나 함유하지 않는 5 또는 10% 폴리아크릴아미드 겔하에 PCR- 일본쇄 구조 다형성(PCR-SSCP) 분석으로 분석한다. 전기영동을 밤새 수행한다. 이동성 쉬프트를 나타내는 PCR-생성물을 재증폭시키고 서열분석하여 뉴클레오타이드 변이를 확인한다.

CGAP-GAI(DEMIGLACE)라고 불리는 방법에서, 서열 및 정렬 데이타(PHRAP. ace 파일로부터), 서열 염기 콜에 대한 품질 점수(PHRED 품질 파일로부터), 거리 정보(PHYLIP dnadist 및 이웃한 프로그램으로부터) 및 염기-콜링 데이타(PHRED '-d' 스위치로부터)를 기억장치에 로딩한다. 서열을 정렬시키고 불일치에 대해 수득되는 조립의 각각의 수직 덩어리('슬라이스')에 대해 시험한다. 어떠한 이러한 슬라이스도 SNP(DEMIGLACE)의 후보물로 고려된다. 다수의 여과기가 DEMIGLACE에 의해 사용되어 실제로 다형성을 나타내는 것 같지 않는 슬라이스를 제거한다. 이들은 (i) 인접한 서열 품질이 40% 이상 저하되는 것은 경우에 SNP 고려로부터 제공된 어떠한 슬라이스내 서열을 제외시키고; (ii) 피크 크기가 이러한 뉴클레오타이드 유형에 대한 모든 기본 요청의 15% 이하인 요청을 제외시키며; (iii) SNP 계산에 관여하는 것에서 보존성 서열과 많은 수가 불일치하는 서열의 영역을 박탈하고; (iv) 피크가 피크로 불리는 영역의 25% 이상을 차지하는 대안적 요청을 어떠한 염기 콜로부터 제거하며; (v) 단지 하나의 판독 방향에서 일어나는 변화를 제외하는 여과기를 포함한다. PHRED 품질 점수는 슬라이스내 각각의 뉴클레오타이드에 대한 오차 가능성(probability-of-error) 값으로 전환되었다. 표준 바예시안(Bayesian) 방법을 사용하여 제공된 위치에서 뉴클레오타이드 이질성이 발생된 후속 가능성을 계산한다.

CU-RDF(RESEQ)로 불리는 방법에서, PCR 증폭을 각각의 SNP에 대한 특이적인 프라이머를 사용하여 혈액으로부터 분리한 DNA로부터 수행하고, 사용하지 않는 프라이머 및 유리된 뉴클레오타이드를 제거하기 위한 통상의 세정 프로토콜 후, 동일하거나 자체 프라이머를 사용하여 직접 서열분석한다.

DEBNICK(방법-B)로 불리는 방법에서, 클러스터된 EST 서열의 비교 분석을 수행하여 형광성에 기초한 DNA 서열분석으로 확인한다. DEBNICK(방법-C)라 불리는 관련 방법에서, 불일치 부위에서 프레드(phred) 품질이 >20이고, 평균 프레드 품질이 5개 염기 5'-FLANK 및 SNP에 대한 3'에 걸쳐서 >=20이며, SNP에 대해 5개 염기 5' 및 3'내에 불일치가 없고 각각의 대립형질 유전자가 2개 이상 발생한 클러스터된 EST 서열의 비교분석을 수행하고 미량을 시험하여 확인한다.

ERO(RESEQ)라고 정의된 방법에서는, 새로운 프라이머 세트를 인터넷으로 공지된 STS에 대해 설계하고 10개의 상이한 마우스 종으로부터 DNA를 증폭시키는데 사용하였다. 이후에 각각의 종으로부터의 증폭 산물을 겔 정제하고 ³³P-표지된 종결인자를 사용하는 표준 디데옥시, 사이클 서열분석 기술을 사용하여 서열분석하였다. 이후에 모든 ddATP 종결된 반응물을 서열분석 겔의 근접한 레인내에 로딩한 후 ddGTP 반응물 모두를 로딩한다. SNP는 방사선사진을 가시적으로 스캐닝하여 확인한다.

ERO(RESEQ-HT)라고 정의된 다른 방법에서는, 신규 프라이머 세트를 인터넷상에 공지된 쥐 DNA 서열에 대해 설계하고 10개의 상이한 마우스 종으로부터 DNA를 증폭시키는데 사용하였다. 각각의 종으로부터의 증폭 산물을 엑소뉴클레아제 I 및 쉬림프(Shrimp) 알칼린 포스파타제로 처리하여 서열분석용으로 제조하였다. 서열분석을 키트[ABI Prims Big Dye Terminator Ready Reaction Kit: 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) 제조원]을 사용하여 수행하고 서열 샘플을 3700 DNA 분석기[96 모세관 서열분석기(Capillary Sequencer)]상에서 분석하였다.

FGU-CBT(SCA2-SNP)는, SNP를 함유하는 영역을 프라이머 SCA2-FP3 및 SCA2-RP3을 사용하여 PCR 증폭시키는 방법을 확인한다. 대략 100ng의 게놈 DNA를 최종 농도의 5mM 트리스, 25mM KCl, 0.75mM MgCl₂, 0.05% 젤라틴, 20pmol의 각각의 프라이머 및 0.5U의 Taq DNA 폴리머라제를 함유하는 50ml의 반응 용적속에서 증폭시킨다. 샘플을 변성시키고, 어닐링하며 연결시키고 PCR 생성물을 예를 들면 QIAqiuck 겔 추출 키트[퀴아젠(Qiagen) 제조원]를 사용하여 아가로즈 젤을 절단한 밴드로부터 정제하고 PCR 프라이머를 사용하는 ABI 프리즘 377 자동화 DNA 서열분석기(ABI Prism 377 automated DNA sequencer) 상에서 염료 종결인자 화학을 사용하여 서열분석한다.

JBLACK (SEQ/RESTRICT)로 정의된 방법에서는, 2개의 독립된 PCR 반응을 게놈 DNA를 사용하여 수행한다. 제1 반응으로부터의 생성물을 서열분석하여 독특한 FspI 제한 부위를 나타냄으로써 분석한다. 돌연변이를 Fsp I으로 분해함으로써 제2 PCR 반응의 생성물속에서 확인한다.

KWOK(1)로 기술된 방법에서는, SNP를 PCR 생성물을 염료-종결인자 화학(참조: Kwok et al., 1996)을 사용하여 직접적인 DNA 서열분석으로 무작위적으로 선택한 4개의 개개인으로부터 고 품질의 게놈 서열 데이타를 비교하여 확인한다. KWOK(2)로 정의된 관련 방법에서는 SNP를 세균 인공 염색체(BACs) 또는 P1-기초 인공 염색체(PAC)와 같은 중첩된 거대-삽입물 클론으로부터 고 품질의 게놈 서열 데이타를 비교하여 확인한다. 이후에, SNP를 함유하는 STS를 현상시키고 각종 집단에서 SNP의 존재를 혼주된 DNA 서열분석(참조: Taillon-Miller et al., 1998)으로 확인한다. KWOK(3)으로 불리는 다른 유사한 방법에서는, SNP를 중첩된 거대-삽입체 클론 BAC 또는 PAC로부터 고 품질 게놈 서열 데이타를 비교하여 확인한다. 당해 시도로 밝혀진 SNP는 2개의 공여체 염색체사이의 DNA 서열 변이를 나타내지만 일반적인 집단에서의 대립형질 출현율은 아직 측정되지 않았다. 방법 KWOK(5)에서는, SNP를 동종접합 DNA 샘플 및 PCR 생성물의 직접적인 DNA 서열분석에 의한 하나 이상의 혼주된 DNA 샘플로부터의 고 품질 게놈 서열을 염료-종결인자 화학과 비교하여 확인한다 사용된 STS는 공지된 데이타베이스에서 발견되는 서열로부터 개발된다. 상세하게는, 이들 STS는 80 CEPH 모체로부터의 DNA 샘플의 혼주물 및 모든 유전자 좌에서 동종접합인 것으로 밝혀진 완전한 포상기태 몰(CHM)에 대해 PCR로 증폭시킨다(참조: Kwok et al., 1994).

이러한 다른 방법, KWOK[폴리바이어를 사용한 중첩 SNP 검출(OverlapSnpDetectionWithPolyBayes)에서는, SNP가 거대-삽입체 사람 게놈 클론 서열의 중첩된 영역의 자동화된 컴퓨터 분석으로 발견된다. 데이타 획득을 위해, 클론 서열을 대규모 서열분석 센터에서 직접 입수한다. 이는, 염기 품질 서열이 GenBank를 통해서는 존재/유용하지 않기 때문에 필수적이다. 원 데이타 처리는 클론 서열의 분석 및 일치를 위한 염기 품질 정보의 동반을 포함한다. 관련 염기 품질 서열이 없는 종결된('염기 퍼펙트', 10,000bp중 1개 이하의 오차율) 서열을 40(10,000bp 중 1개의 오차율)의 균일한 염기 품질로 지정한다. 염기 품질 값이 없는 초벌 서열은 거절된다. 가공된 서열을 국소 데이타베이스에 넣는다. 차폐된 공지의 사람 반복단위를 지닌 각각의 서열의 버젼을 또한 저장한다. 반복된 차폐는 프로그램 "MASKERAID으로 수행한다. "중첩 검출: 추정적 중첩은 프로그램 "WUBLAST"을 사용하여 수행한다. 거짓된 중첩 검출 결과, 즉 실제 중첩과 대치되는 것으로서 서열 중복으로 인해 발생하는 클론 서열의 쌍사이의 유사성을 제거하기 위하여 몇가지 여과 단계를 수행한다. 중첩의 총 길이, 중첩 퍼센트 유사성, 고 염기 품질 값 "고-품질 불일치"를 갖는 뉴클레오타이드간의 서열 차이의 수. 결과를 또한 워싱톤대 게놈 서열분석 센터(Washington University Genome Sequencing Center), 중첩에 대한 완성자 보고서에서 게놈 클론의 제한 단편 맵핑의 결과, 및 NCBI에서 서열 콘티그 빌딩 효과(sequence contig building effort)의 결과와 비교한다. SNP 검출: 클론 서열의 중첩 쌍을 'POLYBAYES' SNP 검출 소프트웨어를 사용하여 후보물 SNP 부위에 대해 분석한다. 서열 쌍사이의 서열 차이점을 서열분석 오차와 대치되는 것으로서 실제 서열 변이를 나타낼 가능성에 대개 점수를 매긴다. 당해 과정은 서열 둘다에 대한 염기 품질 값의 퍼센트를 필요로 한다. 고-점수 후보물을 추출한다. 조사는 치환형 단일 염기 쌍 변이에 한정된다. 후보물 SNP의 신뢰 점수는 POLYBAYES 소프트웨어로 컴퓨터처리한다.

KWOK(TaqMan 검정)으로 확인된 방법에서, TaqMan 검정을 사용하여 90명의 무작위로 선택한 개인에 대한 유전자형을 측정한다. KYUGEN(Q1)으로 확인된 방법에서, 나타낸 집단의 DNA 샘플을 혼주하고 PLACE-SSCP로 분석한다. 혼주된 분석에서 각각의 대립형질의 피크 높이는 이형접합체에서의 것과 관련되며, 후속적으로 대립형질 유전자 출현율의 계산에 사용된다. 10%보다 높은 대립형질 유전자 출현율을 당해 방법으로 신뢰성있게 적량한다. 대립형질 유전자 출현율 = 0(제로)는, 대립형질 유전자가 개개인중에 발견되지 않았음을 의미하나, 상응하는 피크는 혼주물의 시험에서 관측되지 않는다. 대립형질 유전자 출현율 = 0 내지 0.1은, 소량의 대립형질 유전자가 혼주물에서 검출되나 피크가 신뢰성있게 검출하기에 너무 낮음을 나타낸다.

KYUGEN(방법 1)로 확인된 다른 방법에서, PCR 생성물은 형광성 염료로 후-표지되며 SSCP 조건(PLACE-SSCP)하에 자동화된 모세관 전기영동으로 분석된다. 4개 이상의 개개 DNA를 2개의 혼주된 DNA(일본인 혼주물 및 CEPH 모계 혼주물)의 존재 또는 부재하에 일련의 시험에서 분석한다. 대립형질 유전자를 가시적 관측으로 확인한다. 상이한 유전자형을 지닌 개개의 DNA를 서열분석하고 SNP를 확인한다. 대립형질 유전자 발생율을 이형접합체에서 피크 높이를 사용하여 시그날 성형의 정정후 혼주된 샘플속에서 피크 높이로부터 평가한다. PCR 프라이머를 태그하여 쇄 둘다의 후-표지를 위해 이들의 말단에 5'-ATT 또는 5'-GTT를 지니도록 한다. DNA(10 ng/㎕) 샘플을 완충액(lOmM 트리스-HCl, pH 8.3 또는 9.3, 50mM KCl, 2.OmM MgCl₂), 0.25μM의 각각의 프라이머, 200μM의 각각의 dNTP, 및 0.025단위/㎕의 항-Taq 항체와 예비혼합된 Taq DNA 폴리머라제를 함유하는 반응 혼합물속에서 증폭시킨다. PCR 생성물의 2개 쇄를 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편의 교환 반응에 의해 R110 및 R6G로 변형시킨 뉴클레오타이드로 차등적으로 표지한다. 반응을 EDTA를 첨가하여 종결시키고, 혼입되지 않는 뉴클레오타이드를 송아지 장 알칼린 포스파타제를 첨가하여 탈인산화한다. SSCP를 위해: 형광 표지된 PCR 생성물 및 TAMRA-표지된 내부 마커의 분취량을 탈이온화된 포름아미드에 가하고 변성시킨다. 전기영동을 모세관속에서 ABI 프리즘 310 유전 분석기(ABI Prism 310 Genetic Analyzer)를 사용하여 수행한다. 진스캔 소프트웨어(Genescan softwares)[피-이 바이오시스템스(P-E Biosystems) 제조원]을 데이타 수집 및 데이타 처리에 사용한다. SSCP에서 상이한 유전자형을 나타내는 것들을 포함하는 개인의 DNA를 빅-염료 종결인자 화학(big-dye terminator chemistry)을 사용하여, ABI 프리즘 310 서열분석기상에서 직접적인 서열분석에 적용시킨다. ABI 프리즘 310을부터 수득된 다수의 서열 트레이스 파일을 처리하고 Phred/Phrap로 정렬시키고 Consed 관측기로 관찰한다. SNP를 폴리프레드 소프트웨어(PolyPhred software) 및 가시적 관측으로 확인한다.

KYUGEN(방법 2)로 확인된 다른 방법에서, 상이한 유전자형을 가진 개개인을 HPLC (DHPLC) 또는 PLACE-SSCP(Inazuka et al., 1997)을 변형시켜 찾고 이들의 서열을 측정하여 SNP를 확인한다. PCR을 쇄 둘다의 후-표지화에 대해 이들의 말단에서 5'-ATT 또는 5'-GTT를 사용하여 태그한 프라이머로 수행한다. DHPLC 분석을 WAVE DNA 단편 분석 시스템[트랜스게노믹(Transgenomic)]을 사용하여 수행한다. PCR 생성물을 DNASep 컬럼에 주입하고 WAVEMaker 프로그램(트랜스게노믹)을 사용하여 측정한 조건하에 분리한다. 뉴클레오타이드로 차등 표지된 PCR 생성물의 2개 쇄를 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편의 교환 반응에 의해 R110 및 R6G로 변형시킨다. 반응물을 EDTA를 가하여 정지시키고, 혼입되지 않은 뉴클레오타이드를 송아지 장 알칼린 포스파타제를 가하여 탈인산화한다. SSCP에 이은 전기영동을 ABI 프리즘 310 유전 분석기[진스캔 소프트웨어(피-이 바이오시스템스 제조원)]를 사용하여 모세관내에서 수행한다. DHPLC 또는 SSCP에서 상이한 유전자형을 나타낸 것들을 포함하는 개개인의 DNA를 ABI 프리즘 310 서열분석기상에서 빅-염료 종결인자 화학을 사용하여 직접적인 서열분석에 적용시킨다. ABI 프리즘 310으로부터 수득한 다수 서열 추적 파일을 가공하고 프레드/프렙(Phred/Phrap)으로 정렬하고 콘세드 뷰어(Consed viewer)를 사용하여 가시화한다. SNP를 폴리프레드 소프트웨어(PolyPhred software)로 확인하고 가시적으로 관측한다. 유니젠(Unigene)에서 EST 서열의 추적 크로마토그램 데이타를 PHRED로 진행시킨다. SNP와 유사하게 확인하기 위하여, 단일 염기 불일치를 각각의 유니젠 클러스터(Unigene cluster)에 대해 프로그램 PHRAP, BRO 및 POA로 생산된 다수의 서열 정렬로부터 기록한다. BRO는 가능한 보고되지 않는 EST 배향을 정정하는 반면, POA는 가짜 SNP를 생산할 수 있는 유전자 혼합/키메라의 비-선형 정렬 구조 지표를 분석한다. 바예시안 추론을 사용하여 실제 다형성 대 서열분석 오차, 비정렬(misalignment) 또는 불명료, 미스클러스터링(misclustering) 또는 키메라 EST 서열, 원래의 크로마토그램 높이, 예리함, 중첩 및 스페이싱(spacing)과 같은 평가 데이타; 서열분석 오차율; 배경-감도(context-sensitivity); cDNA 라이브러리 오리진 등에 대한 확신을 평가한다.

MARSHFIELD (방법-B)로서 확인된 방법에서, 추정된 삽입/결실 다형성을 함유한 오우버래핑된 사람 DNA 서열을 공개된 데이타베이스의 탐색을 통해 확인한다. 각각의 다형성 부위를 플랭킹한 PCR 프라이머를 보존성 서열로부터 선택한다. 프라이머를 사용하여 개개의 또는 혼주된 사람 게놈 DNA를 증폭시킨다. 수득되는 PCR 생성물을 변성된 폴리아크릴아미드 겔에 용해하고 포스포르이미저(PhosphorImager)를 사용하여 DNA 혼주물로수터 대립형질 유전자 발생율을 평가한다.

6. 연결 불균형

EGFR 유전자 좌의 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169, 또는 2034에서 다형성과의 연결 불균형에 있어서 다형성을 또한 본 발명의 방법과 함께 사용할 수 있다. "연결 불균형"(비록 당해 분야에서 "LED"로 언급하지만, 본원에서 "LD"로 언급)은 특정 대립형질 유전자의 조합(즉, 제공된 유전자의 변이체 형태) 또는 2개의 유전자 좌에서 다형성이 변화에 의해 예측되는 것보다 더욱 흔한 것으로 여겨지는 경우의 상태를 말한다. 당해 분야의 숙련가에 의해 측정된 것으로서, 연결 불균형과 관련하여 사용된 "현저한"은 0.25 또는 0.1일 수 있고 0.1, 0.05. 0.001, 0.00001 이하일 수 있는 통계적 p 또는 α 값으로 고려된다. EGFR 일배체형과 EGFR 단백질의 발현 수준사이의 관계를 사용하여 표현형(즉, 유기체 또는 세포에 의해 나타난 물리적 특징)에 대한 유전자형(즉, 유기체의 유전자 제조)과 관련시킨다. "일배체형"은 당해 분야의 숙련가에게 통상의 의미 및 자체 계획에 따라 사용된다. 이는 동종 염색체중 하나를 따라 2개 이상의 대립형질 유전자 또는 다형성의 총칭적인 유전자형을 말한다.

D. 키트

본원에 기술된 조성물 중 어느 것도 키트속에 포함될 수 있다. 비-제한적 예에서, 하나 또는 둘다의 EGFR 유전자의 유전자형을 측정하기 위한 시약은 키트속에 포함된다. 키트는 또한 EGFR 유전자의 특정 핵산 서열을 증폭시키고/시키거나 검출할 수 있는 개개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 이는 하나 이상의 프라이머 및/또는 프로브를 포함한다. 핵산 분자는 표지, 염료, 또는 형광단과 같은 이에 부착된 기타 시그날 분자를 포함한다. 이는 또한 DNA 분리 완충액, 증폭 완충액 또는 하이브리드화 완충액과 같은 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 키트는 또한 화합물 및 시약을 함유하여 DNA 주형을 제조하거나 샘플로부터 DNA를 분리할 수 있다. 키트는 또한 각종의 표지 시약 및 화합물을 포함할 수 있다.

키트의 화합물은 수성 매질 또는 동결건조시킨 형태속에 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 일반적으로 하나 이상의 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 기타 용기 수단을 포함하며, 이에 성분이 위치하고, 바람직하게는 적합하게 분취된다. 키트내에 하나 이상의 성분이 존재하는 경우(표지 시약 및 표지가 함게 포장될 수 있다), 키트는, 또한 일반적으로 추가의 성분이 별도로 위치할 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가의 용기를 함유할 것이다. 그러나, 성분의 각종 조합을 바이알속에 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 통상적으로 핵산을 함유하는 수단, 및 상업적 규모의 밀폐된 제한내 다른 어떠한 시약 용기로 포함할 것이다. 이러한 용기는, 목적한 바이알이 보유되는 주사 또는 취입-성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.

키트의 성분들이 하나 및/또는 그 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 수용액이며, 멸균 수용액이 특히 바람직하다. 그러나, 키트의 성분은 건조된 분말로 제공될 수 있다. 시약 및/또는 성분이 무수 분말로 제공되는 경우, 분말은 적합한 용매를 첨가하여 재구성할 수 있다. 용매는 또한 다른 용기 수단으로 제공될 수 있음이 고찰된다.

키트는 또한 키트 성분을 사용하는 구조 및 키트에 포함되지 않는 다른 어떠한 시약의 사용을 위한 지침서를 포함할 것이다. 지침서는 이행할 수 있는 변형을 포함할 수 있다.

이러한 시약이 본 발명의 키트의 양태임은 고려된다. 그러나, 이러한 키트는 상기 정의한 특정 항목으로 한정되지 않으며 EGFR 유전자내 다형성의 검출 또는 EGFR 유전자의 발현 수준에 있어 직접 또는 간접적으로 사용된 어떠한 시약도 포함할 수 있다.

하기 실시예를 포함시켜 본 발명의 바람직한 양태를 입증한다. 당해 분야의 숙련가에게는, 본 발명자에 의해 발견된 기술을 하기 나타내는 실시예에서 기술된 기술이 본 발명을 실시하는데 잘 작용할 것으므로, 이의 실시를 위한 바람직한 유형을 구성하는 것으로 고려될 수 있음을 인지하여야 한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가들은, 본 기술의 측면에서, 많은 변화가 기술된 특정 양태내에서 이루어질 수 있고 여전히 본 발명의 취지 및 영역에 벗어남이 없이 동일한 또는 유사한 결과를 수득할 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예 1

EGFR 조절 영역에서 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 발견

코리엘 세포 호흡기로부터의 DNA 샘플을 재서열분석에 사용하였다. 샘플은 22명의 백인종, 23명의 아프리카계 미국인 및 23명의 아시아인을 포함한다. SNP 발견을 위해, PCR을 사용하여 표 1에서의 프라이머로 업스트림 및 하부 인핸서, 프로모터, 엑손 1 및 인트론 1의 일부를 함유하는 대략 4.5kb 단편을 증폭시켰다. 정제된 PCR 산물을 양쪽 말단으로부터 직접 서열분석하였다. ABI-3700 모세관 서열분석기 및 phred/phrap/polyphred/consed 파이프라인(참조: WWW. phrap. org/)을 사용하여 다형성을 확인하였다.

프로모터 및 인핸서를 포함하는, 4kb의 EGFR 5' 조절 영역을 재서열분석함으로써, 21개의 단일 뉴클레오타이드 다형성을 22명의 백인종, 23명의 아프리카계 미국인 및 23명의 아시아인으로 이루어진 68개의 DNA 샘플로부터 확인하였다(참조: 도 1 및 표 2). 5개의 SNP는 다른 7개의 드믄 것과 비교하여 적어도 1개 집단에서 상대적으로 보다 높은 출현율(드문 대립형질 유전자 출현율 > 10%)을 나타내었다. 9개의 SNP가 프로모터 또는 인핸서 영역에서 관측되었고 이중 3개가 빈번하였다. 하나의 SNP, -1249 G>A (아프리카계 미국인중 10%)는 업스트림 인핸서내에 존재하는 반면, -216 G>T (아프리카계 미국인중 29% 및 백인중 34%) 및 -191 C>A는 프로모터 영역(백인중 18%)내에 존재한다(참조: 도 1 및 표 2). 흥미롭게도, -216 G>T는 Spl 결합 부위(-216)내에 위치하고 G의 T로의 치환은 Spl 결합을 변경시킬 수 있다. 한편, -191 C>A는 전사 개시 부위와 근접해 있다(참조: 도 2) (참조: Ishii et al., 1985; Haley et al., 1987; Johnson et al., 1988 ; Kageyama et al., 1988). 따라서, 이들 SNP는 EGFR 전사에 있어 큰 영향을 지닐 수 있다.

실시예 2

2개의 프로모터 SNPs(-216G>T 및 -191 C>A)의 작용적 특성화.

EGFR 프로모터 영역에서 2개의 SNP(-216 G>T 및 -191 C>A)의 강력한 작용을 시험관내 일시적 형질감염 검정 및 전기영동 이동성 쉬프트 검정(EMSA)에 의해 특성화하였다.

일배체형.

본 발명자가 상이한 인종간 그룹으로부터 68개 심플을 서열분석하였을 때, SNP-216 G>T는 아프리카계 미국인(29%) 및 백인(34%)에서 흔히 발견되었으나 아시아인(9%)에서는 상대적으로 드물었던 반면, -191 C>A는 백인(18%)에서만 발견되었다(참조: 표 3). 연결 불균형 및 일배체형 분석은, -216 G>T 및 -191 C>A이 강력한 LD (D'= 0.5562, p>0.05) 상태에 있지 않음을 나타내었으며, 3개의 일배체형은 샘플: G-C, G-A 및 T-C에서 관측되었다(참조: 하기 표 3). 이들 3개의 일배체형을 함유하는 DNA 단편을 증폭시키고 클로닝시키는 한편, T-A 일배체형을 Dra III 분해시킨 G-A 및 T-C 일배체형으로부터의 T 단편 및 A 단편을 연결시켜 작제하였다(참조: 도 3).

벡터 및 검출 시스템

4개의 표적 DNA 단편 각각을 수반하는 PGL3-luc+ 기본 리포터 벡터[프로메가(Promega) 제조원] 및 헤르페스 단성 바이러스 티미딘 키나제(HSV-TK) 프로모터에 의해 구동된 레닐라 유전자를 함유하는 pRL-TK 리포터 벡터(프로메가 제조원)를 MDA-MB-231 세포내로 공-형질감염시켜 루시퍼라제 유전자의 상대적 발현을 비교하였다. 이중-루시퍼라제 리포터 검정 시스템(프로메가 제조원)을 사용하여 루시퍼라제 발현 수준을 검출하였다. PGL3-luc+ 기본 벡터 및 PGL3-luc+ SV40-프로모터 벡터를 각각 네가티브 및 포지티브 대조군으로서 사용하였다.

결실 맵핑 연구는, 이들 2개의 SNP를 함유하는 엑손 1의 업스트림의 384bp 단편이 필수적인 프로모터 기능을 가짐을 나타낸다(참조: 도 2)(참조: Johnson et al., 1988). 따라서, 당해 단편을 고 정확(high-fidelity) DNA 증폭을 위해 변형시키는 프루프스타트(Proofstart) DNA 폴리머라제[퀴아젠(Qiagen) 제조원]를 사용하는 PCR에 의해 특정 일배체형을 지닌 개개인으로부터 증폭시켰다. 프라이머를 설계하여 도 2에 나타낸 515bp 앰플리콘을 증폭시켰다. 프라이머 서열은 정배향 프라이머: 5'-CCACCGGTACCGGCGGCCGCTGGCCTTG-3' (서열번호 25) 및 역배향 프라이머: 5'-CGGCGAGACACGCCCTTACCTTT-3' (서열번호 26)이었다. 당해 515 bp 앰플리콘은 3' 말단에서 Sad 절단 부위를 함유하였다(참조: 도 2). 아클로닝을 촉진시키기 위해, 정배향 프라이머를 KpnI 부위를 함유하도록 설계하였다. 단편을 Kpnl 및 SacI으로 분해하고 405 bp 생성물을 이후에 pGL3-luc+ 기본 벡터의 KpnI/SacI 부위내로 클로닝하였다. 삽입된 DNA 단편을 확인하기 위해, 모든 플라스미드를 서열분석하여 PCR 오차를 제외시키고, 단편의 배향을 체크하고 형질감염전에 일배체를 보증하였다.

일시적인 형질감염.

MDA-MB-231 세포주를 10% FBS 및 2mM L-글루타민을 함유하는 RPMI1640 배지[인비트로겐(Invitrogen) 제조원] 속에서 유지시켰다. 일시적인 형질감염을 제조업자의 지시에 따라 트랜스펙타민2000(Transfectamine)[인비트로겐(Invitrogen) 제조원]으로 수행하였다. 모든 형질감염을 3회 수행하고 3회 반복하였다. 세포를 pRL-TK 벡터로 공-형질감염시켜 형질감염 효율을 표준화하였다. 형질감염 후, 세포를 24시간 동안 배양하고, 세척하고, 분해하고 이중 루시퍼라제 키트(Dual Luciferase kit)(프로메가 제조원)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 분석하였다.

4개의 일배체로부터 기원한 루시퍼라제의 시험관내 전사 효능을 비교하였다. G-C 일배체형 벡터에서 보다 T-C 일배체형 벡터에서 현저하게 높은 루시퍼라제 활성이 관측되었다(참조: 도 4, p<0.01). T-C 및 G-C 일배체형은 백인, 아프리카계 미국인 및 아시아인 집단에서 가장 흔한 일배체형이다(참조: 표 3). 또한, -216 G>T 다형성은 -191 C>A 다형성보다 루시퍼라제 활성에 더욱 기여하였다(참조: 도 4; 도 6A 모든 비교에 대해 p<0.04). 당해 효과는 세포의 EGFR 발현 수준과는 독립적이었다(참조: 도 6B). 평균적으로, G 대립형질의 T 대립형질에 의한 치환은, 루시퍼라제 유전자 발현에 있어서 약 30% 증가를 입증하였다.

프로모터 활성에 있어서 DNA 변경 및 Sp1의 잠재적인 협력 효과를 또한 확인하기 위하여, 일시적인 형질감염을 또한 Sp1이 결실된 드로소필라 멜라노가스터 쉬나이더 세포주(Drosophila melanogaster Schneider cell line) 2(SL-2)내에서 수행하였다(참조: Courey et al., 1988). 그 결과, Spl 발현 벡터를 사용한 pGL3EGFRluc의 공-형질감염으로 pGL3EGFRluc 단독의 형질감염과 비교하여 프로모터 활성이 약 100배 유도되었다. pPac-Spl 및 4개의 pGL3EGFRluc 작제물 각각의 공-형질감염은 T-C 일배체형과 비교하여 G-C 일배체형으로부터 구동된 현저히 낮은 프로모터 활성을 입증하였다(p<0.03. 참조: 도 6A).

전기영동적 이동성 쉬프트 검정(EMSA).

EMSA를 사용하여 -216G>T 다형성 부위에서 핵 단백질 결합을 평가하였다. 핵 단백질을 MDA-MB-231 세포로 부터 NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약을 사용하여 제조업자의 프로토콜[피어스(Pierce) 제조원, 미국 록포드 소재]에 따라 추출하였다. G 대립형질 유전자, T 대립형질 유전자 및 Sp1 결합 보존성 서열에 상응하는 프로브 및 경쟁자를 표 4에 나타낸다.

프로브를 일본쇄로 합성하고 바이오틴을 사용하여 말단 표지하였다. 동일한 서열을 지닌 표지하지 않는 올리고뉴클레오타이드를 경쟁자로 사용하였다. 이본쇄 DNA를 2개의 상보성 올리고뉴클레오타이드를 어닐링하여 제조하였다. EMSA를 제조업자의 지시에 따라 키트[LightShift Chemiluminescent EMSA Kit(피어스 제조원, 미국 록포드 소재)를 사용하여 수행하였다.

요약하면, 결합 반응을 핵 추출물과 결합 완충액(100 mM 트리스-HCl, pH 7. 5; 500 mM NaCl, 25 mM MgCl₂, 및 5 mM 디티오트레이톨), 1 ㎍ 폴리(dI-dC), 및 0.2 pmol (200,000 cpm) 표지된 프로브를 사용하여 20분 동안 실온에서 항온처리함으로써 수행하였다. 경쟁 검정을 위해, 100 배 몰 과량의 표지되지 않은 올리고뉴클레오타이드(특이적, 비특이적 또는 Spl 특이적)를 결합 반응에 포함시켰다. 결합시킨 후, 샘플을 0.5x TBE중 5% 비변성 폴리아크릴아미드 겔속에서 2시간 동안 4℃에서 분리하였다. 이후에 결합 반응물을 나일론 막[애머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech) 제조원]에 0.5x TBE 속에서 전기영동으로 40분 동안 100V에서 전달시켰다. 전달 후, DNA를 254nm UV 광하에서 120mJ/cm² 으로 교차-결합시켰다. 바이오틴-표지된 DNA를 검출하고 케미독 시스템(ChemiDoc system)[바이오-라드(Bio- Rad) 제조원]속에서 화학발광에 기초한 검출 과정을 사용하여 가시화하였다.

EMSA를 각각의 대립형질 유전자 특이적인 프로브에 대한 핵 단백질의 결합 효능을 시험하기 위해 수행하였다. Spl 보존성 프로브를 대조군으로 사용하여 결합 및 쉬프팅 위치를 나타내었다. MDA-MB-231 세포로부터 핵 단백질의 현저히 높은 결합 효능을 G 대립형질 유전자 프로브와 비교하여 T 대립형질 유전자 프로브로 관측하였다(참조: 도 5).

생체내에서 EGFR mRNA 발현과 관련된 -216G/T-191C/A의 일배체형.

사람 섬유아세포(이는 EGFR을 발현한다)를 선택하여 -216G/T-191C/A 일배체형 및 EGFR 전사사이의 관련성을 평가하였다. 선행 보고에 따르면 EGFR 프로모터에 다수의 전사 개시 부위가 존재하는 반면(참조: Johnson et al., 1988; Kageyama et al., 1988), 생체내 전사용 주요 부위는 -260번 위치에 존재하였다(참조: Kageyama et al., 1988). 즉, -216 및 -191번 위치는 대부분 EGFR mRNA 서열내에 존재할 수 있다. 2개의 다형성에 대한 이배체형 G-C/T-C를 지닌 10개의 세포주를 선택함으로써 동일한 세포내에 T-C 일배체형 및 G-C 일배체형을 지닌 mRNA 사이의 발현 수준의 차이를 검출하기 위한 가능성이 있도록 하였다. 그 결과, 가설적 비 1 : 1로부터 평균 상대 비의 현저한 편차가 관측되었으며(평균 R = 1.39±12, 95% CI 1.11-1.67, p<0.02), 이는 T-C 일배체형으로부터 기원한 EGFR mRNA가 G-C 일배체형으로부터의 것보다 약 40% 더욱 높음을 입증하였다. 이러한 발견은, -216G/T 변이체가 또한 생체내에서 EGFR 전사시 강력한 영향을 미침을 나타낸다.

대립형질 유전자 불균형외에, 상기 3개의 사람 세포주중 EGFR의 상대적 발현은 실시간 PCR로 평가하였다. 흥미롭게도, 이들 세포에서 EGFR 수준은 이들의 이배체형과 일치하였는데, MDA-MBA-231 세포에서는 EGFR이 현저히 높은 수준이었고, HEK293 세포에서는 약 6배 적었으며, MCF-7 세포에서는 최저였다(참조: 도 6B).

본원에 기술되고 청구된 조성물 및 방법 모두는 본 기술의 측면에서 과도한 시험없이 이루어지고 실행될 수 있다. 비록, 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태의 측면에서 기술되었지만, 당해 분야의 숙련가에게는, 본원에 기술된 조성물 및 방법, 및 방법의 단계들 또는 단계들의 순서에 대해 변형이 본 발명의 개념, 취지 및 영역에 벗어남이 없이 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 더욱 상세하게는, 둘다 화학적으로 및 물리학적으로 관련된 특정 제제가 본원에 기술된 제제로 치환될 수 있으면서 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있음이 명백할 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 명백한 이러한 유사한 치환 및 변형 모두는 첨부된 청구의 범위에 정의된 본 발명의 취지, 영역 및 개념내에 있다.

참조문헌

본원에 설정된 것들에 대한 기타 세부 보충사항 또는 예시적 과정을 제시하는 정도의 하기 참조문헌들이 본원에 참조로 특정하게 인용되어 있다.

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aaagggggaa ggggaccctg gcacagattt ggctcgacct 1800 ggacataggc tgggcctgca agtccgcggg gaccgggtcc agaggggcag tgctgggaac 1860 gcccctctcg gaaattaact cctcagggca cccgctcccc tcccatgcgc cgccccactc 1920 ccgccggaga ctaggtcccg cgggggccac cgctgtccac cgcctccggc ggccgctggc 1980 cttgggtccc cgctgctggt tctcctccct cctcctcgca ttctcctcct cctctgctcc 2040 tcccgatccc tcctccgccg cctggtccct cctcctcccg ccctgcctcc ccgcgcctcg 2100 gcccgcgcga gctagacgtc cgggcagccc ccggcgcagc gcggccgcag cagcctccgc 2160 cccccgcacg gtgtgagcgc ccgacgcggc cgaggcggcc ggagtcccga gctagccccg 2220 gcggccgccg ccgcccagac cggacgacag gccacctcgt cggcgtccgc ccgagtcccc 2280 gcctcgccgc caacgccaca accaccgcgc acggccccct gactccgtcc agtattgatc 2340 gggagagccg gagcgagctc ttcggggagc agcgatgcga ccctccggga cggccggggc 2400 agcgctcctg gcgctgctgg ctgcgctctg cccggcgagt cgggctctgg aggaaaagaa 2460 aggtaagggc gtgtctcgcc ggctcccgcg ccgcccccgg atcgcgcccc ggaccccgca 2520 gcccgcccaa ccgcgcaccg gcgcaccggc tcggcgcccg cgcccccgcc cgtcctttcc 2580 tgtttccttg agatcagctg cgccgccgac cgggaccgcg ggaggaacgg gacgtttcgt 2640 tcttcggccg ggagagtctg gggcgggcgg aggaggagac gcgtgggaca ccgggctgca 2700 ggccaggcgg ggaacggccg ccgggacctc cggcgccccg aaccgctccc aactttcttc 2760 cctcactttc cccgcccagc tgcgcaggat cggcgtcagt gggcgaaagc cgggtgctgg 2820 tgggcgcctg gggccggggt cccgcacgtg cgccccgcgc tgtcttccca gggcgcgacg 2880 gggtcctggc gcgcacccga ggggcgggcg ctgcccaccc gccgagactg cactgtttag 2940 ggaagctgag gaaggaaccc aaaaatacag cctcccctcg gaccccgcgg gacaggcggc 3000 tttctgagag gacctccccg cctccgccct ccgcgcaggt ctcaaactga agccggcgcc 3060 cgccagcctg gccccggccc ctctccaggt ccccgcgatc ctcgttcccc agtgtggagt 3120 cgcagcctcg acctgggagc tgggagaact cgtctaccac cacctgcggc tcccggggag 3180 gggtggtgct ggcggcggtt agtttcctcg ttggcaaaag gcaggtgggg tccgacccgc 3240 cccttgggcg cagaccccgg ccgctcgcct cgcccggtgc gccctcgtct tgcctatcca 3300 agagtgcccc ccacctcccg gggaccccag ctccctcctg ggcgcccgcg ccgaaagccc 3360 caggctctcc ttcgatggcc gcctcgcgga gacgtccggg tctgctccac ctgcagccct 3420 tcggtcgcgc ctgggcttcg cggtggagcg ggacgcggct gtccggccac tgcagggggg 3480 gatcgcggga ctcttgagcg gaagccccgg aagcagagct catcctggcc aacaccatgg 3540 tgtttcaaaa tggggctcac agcaaacttc tcctcaaaac ccggagactt tctttcttgg 3600 atgtctcttt ttgctgtttg aagaatttga gccaaccaaa atattaaacc tgtcttacac 3660 acacacacac acacacacac acacacacac cggattgctg tccctggttc aagtgtgcca 3720 agtgtgcaga cagaacatga gcgagtctgg cttcgtgact accgaccata aacccacttg 3780 acaggggaaa catgccttgg aaggtttaat tgcacaattc caaccttgag ctgcgcgggt 3840 tccaagagcc aggcccgtac ttgctgttga tgtcattggc ttggggagtt ggggtttggt 3900 gcccagcgcg gtcgttgggg gaggggcaag gcatagaaca gtggttccca gaccttgctg 3960 cacattggaa ttacctggga ttaaaaaaaa aaaaatcaaa acaaaaacca gtgtctggct 4020 cccgccccca gacattctga tttaattggc atggggcaag acctggactt gggatttttt 4080 ttaatgctct tcatgtgatc tgttgggcag ccagatttgg ggatcactag acggaagaag 4140 gattgttaaa gtctccggag atgttacttg ccaatgctaa gagctctttg aggacatctg 4200 gaattgttac aatattgcca aatataggaa agagggaaaa ggtagagtgt gattccaata 4260 ataaaggatt ccgcttttca ttgaaggaac tggtggaaag gtttcttctc tgctgagcct 4320 gcaggcccgt cctgcctgcc tggggtgccc gggagacgcg ggcctgctcc ggagactgct 4380 gactgccggt cctgttagtc aggtgtcagc cctgtctctg ccgaagagac tcttctcttt 4440 attttaaatt aaaccctcag agcaccacca aagcatcact tttctccctc cattggtgtt 4500 ctcattcttt gatgttactt gtttgaacac cactattagt agttggagat ttgttcctga 4560 gaaaaatata aataccactt aatttgcctg tttgtcccgc attcactcaa aacagaatgc 4620 tcctgaagac aagagagaga gtaggagaac agacgctatt ccattacagt aacataaaag 4680 actggatttt caggggcaaa ttattaaaat aggagatgag ctcttttaac agaaatttgt 4740 ttaaggcctg tgtctatcaa attcagtgga ttttattcaa gatgcacttt gtttagtggg 4800 agttttgttt ggttctggga catgctaact tctagacttg ctgctcttag aggtaatgac 4860 tgccagacac catttcatga gtcctaatcc ccacattaag cataagaggt gcacactctc 4920 ctcctatggg ggaaactgag gtacgaagaa ctaaagtgac tttcccacag ctggtgggag 4980 gcagacggga 4990 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 3 gttccactgt tgtgcttccc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 4 aagaaagttg ggagcggttc 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 5 gggtggactt gccaaagga 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 6 cttagagcca gcgtcggata 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 7 gcatgacttc aacgcacagt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 8 gaggctaagt gtcccactgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 9 tcggacttta gagcaccacc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 10 gaggaggaga atgcgaggag 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 11 aaattaactc ctcagggcac c 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 12 cgcccttacc tttcttttcc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 13 ccctgactcc gtccagtatt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 14 cgtcctttcc tgtttccttg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 15 accagctgtg ggaaagtcac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 16 agacgagttc tcccagctcc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 17 gcgcaggtct caaactgaag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 18 ggagaagttt gctgtgagcc 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 19 ccctcgtctt gcctatcca 19 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 20 agtgatcccc aaatctggct 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 21 ggcatagaac agtggttccc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 22 gaacaccaat ggagggagaa 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 23 tgaaggaact ggtggaaagg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 24 catgtcccag aaccaaacaa 20 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 25 ccaccggtac cggcggccgc tggccttg 28 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 26 cggcgagaca cgcccttacc ttt 23 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 27 gcagcctccg ccccccgcac ggtgt 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 28 acaccgtgcg gggggcggag gctgc 25 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 29 gcagcctccg ccccccgcac ggtgt 25 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 30 acaccgtgcg gggggcggag gctgc 25 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 31 gcagcctcct ccccccgcac ggtgt 25 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 32 acaccgtgcg gggggaggag gctgc 25 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 33 gcagcctcct ccccccgcac ggtgt 25 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 34 acaccgtgcg gggggaggag gctgc 25 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 35 attcgatcgg ggcggggcga gc 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 36 gctcgccccg ccccgatcga at 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 37 attcgatcgg ggcggggcga gc 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 38 gctcgccccg ccccgatcga at 22

Claims

환자에서 하나 또는 둘다의 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 유전자내 다형성의 서열을 측정함을 포함하여, 환자에서 암을 치료하기 위한 EGFR-표적화 치료제의 잠재 효능을 평가하는 방법.
제1항에 있어서, 다형성이 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169, 및 2034번으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 위치에 있거나, 또는 이와 연결 불균형 상태인 방법.
제2항에 있어서, 다형성이 -1435 C>T, -1300 G>A, -1249 G>A, -1227 G>A, -761 C>A, -650 G>A, -544 G>A, -486 C>A, -216 G>T, -191 C>A, 169 G>T, 및 2034 G>A로 이루어진 그룹 중에서 선택된 다형성이거나, 또는 이와 연결 불균형 상태인 방법.
제1항에 있어서, 환자내 하나 또는 둘다의 EGFR 유전자내 2개 이상의 다형성의 서열을 측정함을 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, EGFR-표적화 치료제가 EGFR-타이로신 키나제 억제제인 방 법.
제5항에 있어서, EGFR-타이로신 키나제 억제제가 게피티니브(gefitinib) 또는 에를로티니브(erlotinib)인 방법.
제1항에 있어서, EGFR-표적화 치료제가 모노클로날 항체인 방법.
제7항에 있어서, 모노클로날 항체가 세툭시마브(cetuximab)인 방법.
제3항에 있어서, 다형성이 -216 G>T인 방법.
제9항에 있어서, 대립형질 유전자상의 -216 위치에서 T가 EGFR 단백질의 보다 높은 발현의 지시인자이고, 여기서, EGFR 단백질의 보다 높은 발현이 EGFR-표적화 치료제의 감소된 효능의 지시인자인 방법.
제1항에 있어서, 환자에서 둘다의 EGFR 유전자내 다형성의 서열을 측정함을 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 다형성 서열 측정이 하이브리드화 검정에 의해 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 다형성 서열 측정이 대립형질 유전자 특이적인 증폭 검정에 의해 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 다형성 서열 측정이 서열분석 또는 미세서열분석 검정(microsequencing assay)에 의해 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 다형성 서열 측정이 제한 효소를 사용한 분해에 의해 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 샘플이 협측 세포, 단핵 세포 또는 암 세포를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, EGFR-표적화 치료제를 환자에게 투여함을 추가로 포함하는 방법.
환자에서 하나 또는 둘다의 EGFR 유전자내 다형성의 서열을 측정함을 포함하여, 암 환자에 대한 임상적 예후를 예측하는 방법.
제19항에 있어서, 환자내 둘다의 EGFR 유전자내 다형성의 서열을 측정함을 추가로 포함하는 방법.
제19항에 있어서, 다형성이 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169, 또는 2034로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 위치에 존재하거나, 또는 이와 연결 불균형 상태인 방법.
제21항에 있어서, 다형성이 -1435 C>T, -1300 G>A, -1249 G>A, -1227 G>A, -761 C>A, -650 G>A, -544 G>A, -486 C>A, -216 G>T, -191 C>A, 169 G>T, 및 2034 G>A로 이루어진 그룹 중에서 선택된 다형성이거나, 또는 이와 연결 불균형 상태인 방법.
제22항에 있어서, 다형성이 -216 G>T인 방법.
제23항에 있어서, 대립형질 유전자상의 -216 위치에서 T가 EGFR 단백질의 증가된 발현의 지시인자인 방법.
제24항에 있어서, EGFR 단백질의 증가된 발현이 불량한 예후의 예측인 방법.
제25항에 있어서, 불량한 예후가 화학치료요법, 호르몬 치료요법 또는 방사선치료요법에 대한 증가된 내성을 나타내는 방법.
제25항에 있어서, 불량한 예후가 전이의 증가된 위험을 나타내는 방법.
환자에서 하나 또는 둘다의 EGFR 유전자내 다형성의 서열을 측정함을 포함하여, EGFR-표적화 치료제에 대한 환자의 독성 위험성을 평가하는 방법.
제28항에 있어서, 뉴클레오타이드 위치 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169, 또는 2034로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 위치에 존재하거나, 또는 이와 연결 불균형 상태인 방법.
제29항에 있어서, 다형성이 -1435 C>T, -1300 G>A, -1249 G>A, -1227 G>A, -761 C>A, -650 G>A, -544 G>A, -486 C>A, -216 G>T, -191 C>A, 169 G>T, 및 2034 G>A로 이루어진 그룹 중에서 선택된 다형성이거나, 또는 이와 연결 불균형 상태인 방법.
제30항에 있어서, 다형성이 -216 G>T인 방법.
제31항에 있어서, 하나 또는 둘다의 대립형질 유전자상의 -216 위치에서 T가 EGFR-표적화 치료제의 감소된 독성의 지시인자인 방법.
제28항에 있어서, 환자의 둘다의 EGFR 유전자내 다형성의 서열을 측정함을 추가로 포함하는 방법.
세포내 EGFR 유전자의 하나 또는 둘다의 대립형질 유전자내 -216 위치에서 서열을 측정함을 포함하며, 여기서, 하나 또는 둘다의 대립형질 유전자내 -216 위치에서의 T가 보다 높은 발현 수준의 지시인자인, 세포내 EGFR의 발현 수준을 예측하는 방법.
환자에서 하나 또는 둘다의 EGFR 유전자내 다형성의 서열을 측정함을 포함하여, 환자에서 EGFR의 조절곤란과 관련된 질병을 치료하기 위한 EGFR-표적화 치료제의 잠재 효능을 평가하는 방법.
EGFR 유전자 좌에서 다형성의 서열을 측정하기 위한 핵산을 포함하는, 환자에서 EGFR-표적화 치료제의 잠재 효능을 평가하기 위한 키트.
제36항에 있어서, 핵산이 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169, 및 2034로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 위치에서 다형성을 증폭시키기 위한 프라이머인 키트.
제36항에 있어서, 핵산이 -1435, -1300, -1249, -1227, -761, -650, -544, -486, -216, -191, 169, 및 2034로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 위치에서 다형성을 검출하기 위해 설계된 특정의 하이브리드화 프로브인 키트.
제38항에 있어서, 특정의 하이브리드화 프로브가 올리고뉴클레오타이드 배열 또는 미세배열(microarray)내에 포함되는 키트.
EGFR 유전자 좌에서 다형성의 서열을 측정하기 위한 제한 효소를 포함하는, 환자내 EGFR-표적화 치료제의 잠재 효능을 평가하기 위한 키트.