WO2016018116A1 - 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 Download PDF

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WO2016018116A1
WO2016018116A1 PCT/KR2015/008026 KR2015008026W WO2016018116A1 WO 2016018116 A1 WO2016018116 A1 WO 2016018116A1 KR 2015008026 W KR2015008026 W KR 2015008026W WO 2016018116 A1 WO2016018116 A1 WO 2016018116A1
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seq
kit
primer
probe
egfr
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PCT/KR2015/008026
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Inventor
신영기
오명렬
최준석
조상래
정경숙
변보현
김진주
김성수
Original Assignee
서울대학교 산학협력단
주식회사 젠큐릭스
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • Epidermal growth factor receptor gene mutation detection composition and kit comprising the same
  • the present invention relates to a composition for detecting epidermal growth factor receptor gene mutation and a kit comprising the same, and more particularly, to a primer and probe set composition for detecting epidermal growth factor receptor gene mutation, comprising the composition doing
  • a RUFR kit for detecting an EGFR gene mutation comprising a kit for detecting an EGFR gene mutation and a set of primers / probes in the composition of the present invention.
  • Cancer is a group of abnormal cells caused by continuous division and proliferation due to the disruption of the balance between cell division and death by various causes, also called tumors or neoplasms. It usually affects more than 100 different parts of the body, including organs, white blood cells, bones, lymph nodes, etc., and develops into severe symptoms through infiltration into surrounding tissues and metastasis to other organs.
  • the second difficulty is the presence of a large number of patients who do not show treatment response to the treatment.
  • lapatinib a breast cancer drug
  • HER2 protein HER2-positive
  • EGRF protein high levels of EGRF protein
  • metastatic HER2-negative breast cancers do not respond to lapatinib, indicating that lapatinib is ineffective.
  • the drug suitable for the patient can be selected in advance to reduce the dropout rate and increase the compliance of the medication.
  • the drug suitable for the patient can be selected in advance to reduce the dropout rate and increase the compliance of the medication.
  • the conventional method may cause an error in the diagnosis result depending on the place, time, and experimenter. Therefore, in order to obtain a stable result, a method or an automated process that requires the involvement of the experimenter is preferably excluded.
  • EGFR is a type of protein tyrosine kinase of the erbB receptor family.
  • growth factor ligands such as epidermal growth factor (EGF)
  • the receptor may form a homodimer with another EGFR molecule, or another class member such as erbB2 (HER2), erbB3 (HER3), or heterologous with erbB4 (HER4) Can form a sieve.
  • HER2 erbB2
  • HER3 erbB3
  • HER4 heterologous with erbB4
  • erbB receptor Formation of homo and / or heterodimers of the erbB receptor results in phosphorylation of important tyrosine residues in the intracellular domain and induces stimulation of many intracellular signal transduction pathways involved in cell proliferation and survival.
  • Deregulation of erbB family signal transduction promotes proliferation, infiltration, metastasis, angiogenesis and tumor cell survival, and has been described in many human cancers including lung cancer, head and neck cancer and breast cancer.
  • the erbB class represents a reasonable target for anticancer drug development, and a number of agents targeting EGFR, including gefitinib (IRESSA TM) and erlotinib (TARCEVA TM), are currently available for clinical use.
  • IRESSA TM gefitinib
  • TARCEVA TM erlotinib
  • NSCLC non-smal l-cel l lung cancer
  • L858R and delE746_A750 are known to be associated with reactivity against small molecule tyrosine kinase inhibitors such as zephytinib and erlotinib compared to wild type (WT: wild type) EGFR.
  • WT wild type
  • acquired resistance to therapy with zephytinib or erlotinib is caused by, for example, mutations in the gatekeeper residue T790M, which mutations are detected in 503 ⁇ 4 of clinically resistant patients. It has been reported.
  • the present inventors have made extensive efforts to develop a system for detecting mutations in the EGFR gene, in particular, a system capable of automatization.
  • the present inventors have identified a primer / probe set suitable for application in FFPE samples of cancer tissue,
  • the present invention has been accomplished by developing a method, in particular a kit suitable for automation.
  • an object of the present invention is to provide a primer and probe set composition for detecting an epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutation.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • Another object of the present invention is to provide a kit for detecting EGFR gene mutation comprising the composition of the present invention and a RU0 kit for detecting EGFR gene mutation comprising a set of primers / probes in the composition of the present invention.
  • the present invention provides a primer and probe set composition for detecting an epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutation.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • the present invention provides a EGFR gene mutation detection kit comprising the composition of the present invention and RUFR for EGFR gene mutation detection comprising a primer / probe set of some of the composition of the present invention. Provide the kit.
  • the present invention relates to a primer and probe set composition for detecting an epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutation, wherein the composition comprises a forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NOs: 9 to 13.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • composition of the present invention is preferably therapeutically responsive to EGFR inhibitors.
  • the EGFR inhibitor may preferably be er lotinib (er lot inib) or gefitinib (gef i t inib).
  • primer refers to an oligonucleotide, a nucleic acid chain
  • the primer can serve as a starting point for the synthesis under conditions in which the synthesis of primer extension products complementary to the (template) is induced, i.e. the presence of polymerizers such as nucleotides and DNA polymerases, and conditions of suitable temperature and pH.
  • the primer is deoxyribonucleotide and single chain.
  • Primers used in the present invention may include natural ly occur ing dNMP (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides.
  • the primer may also include ribonucleotides.
  • the primer should be long enough to prime the synthesis of the extension product in the presence of the polymerizer. Suitable lengths of the primers depend on a number of factors, such as temperature, application and source of the primer, but are typically 15-30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower temperatures to form a more complex stable complex with the template.
  • annealing or “priming” refers to juxtaposition of template deoxynucleotides or nucleic acids to template nucleic acids, wherein the juxtaposition polymerase nucleotides complementary to template nucleic acids or portions thereof. To form nucleic acid molecules.
  • probe is a type of taqman probe used for quantitative PCR. It is self-designed.
  • fluorescent materials HEX, VIC, F ⁇ dye
  • TAMRA may be used as a quencher on all 3 'sides of the probe.
  • TaqMan probes are generally ol igonuc leotides tagged with 5 'ends as fluorescent materials and 3' ends as quencher materials. TaqMan probes specifically hybr idi zat ion to template DNA in the annealing step.
  • the quencher at the 3 'end does not fluoresce even when light is applied, but the TaqMan probe decomposed in the template is decomposed by 5' ⁇ 3 'exonuclease activity in the next step, Taq DNA polymerase? ⁇ .
  • the quencher releases the fluorescence and fluoresces quantitatively.
  • primers and probes specific for genomic DNA gene mutations are used in the same sequence for PCR reaction solution and standard PCR reaction solution, each independently a forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 9 Polynucleotide set of probes selected from the group consisting of 13 to 13, forward primer of SEQ ID NO: 3, reverse primer of SEQ ID NO: 4 and polynucleotide set of probes selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 14 to 42, forward primer of SEQ ID NO: 5 , A polynucleotide set of probes selected from the group consisting of reverse primers of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NOs: 43-50, a forward primer of SEQ ID NO: 7, reverse primers of SEQ ID NO: 8, and a probe selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 51-54 Robe's Polynucleo From the group
  • Measurement of PCR reaction can be performed according to methods known in the art, but can be measured by an optical quantitative analysis system using a probe labeled with a reporter fluorescent dye and / or a quencher fluorescent dye. And preferably, by measuring the fluorescence value for the PCR reaction of each micronized droplet.
  • the FAM, HEX, VIC fluorescent dye (fluorescent material) or EvaGreen photo dye is used in combination with the probe, it may be performed by measuring the fluorescence thereof.
  • Such a process can be used for commercially available detection devices (eg biorad Droplet Reader) can be used to detect droplet fluorescence signals of each sample in the device and automatically complete the analysis by counting the number of positives and negative drop let.
  • the probe added to the PCR reaction solution and the probe added to the standard PCR reaction solution may be associated with different fluorescent materials.
  • the present invention provides a kit for detecting an EGFR gene mutation comprising the primer / probe set of the present invention.
  • Kits of the invention preferably utilize the primer / probe set of the invention.
  • Kits of the present invention may further comprise tools and / or reagents known in the art for use in PCR or detection thereof.
  • the kit of the present invention may further include a tube, a well plate, an instruction sheet describing a method of use, etc., which will be used to mix each component as necessary.
  • kit of the present invention may be used for research use only (RUO) or IVD.
  • the IVD Kit also includes the IVD—CDx Kit.
  • the present invention detects the EGFR gene mutation comprising a polynucleotide set of the probe selected from the group consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 1, the reverse primer of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 10 to 13 RU0 kit is provided.
  • the present invention is selected from the group consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 3, the reverse primer of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 14, 15, 20, 21, 26, 27, 28, 31, 33, 34
  • a RU0 kit for detecting an EGFR gene mutation comprising a polynucleotide set of a probe as an active ingredient.
  • the present invention is a forward primer of SEQ ID NO: 3, the reverse primer of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 14, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 24, 25, 29, 30, 32, 35,
  • a RU0 kit for detecting an EGFR gene mutation comprising a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of 36, 37, 38, 39, 40, 41, and 42 as an active ingredient.
  • the present invention is a forward primer of SEQ ID NO: 5, the reverse primer of SEQ ID NO: 6
  • an RU0 kit for detecting EGFR gene mutations comprising as an active ingredient a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of Emer and SEQ ID NOs: 43 to 50.
  • the present invention is an EGFR gene mutation comprising a polynucleotide set of the probe selected from the group consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 7, the reverse primer of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 51 to 54 Provides a RU0 kit for detection.
  • the kit of the present invention is used for qPCR (quant i tat PCR) or dital tal PCR method.
  • the template applicable to the kit of the present invention requires mutation detection of EGFR, and may be used without limitation as long as PCR reaction is possible.
  • the kit of the present invention is a FFPE (formal in f ixed paraf in embedded) sample. DNA isolated from tissue or cDNA (complementary DNA) can be used as a template.
  • Tissues obtained from patients after biopsy are usually immobilized with formalin (formaldehyde) or the like.
  • the immobilized biological sample is generally dehydrated and embedded in a solid support such as paraffin.
  • the sample thus prepared is called an FFPE sample. Since nucleic acids, especially DNA, on FFPE samples are present in fixed cells, fragmented or crosslinked by formalin, it is necessary to remove paraffins and lyse the fixed cells to elute nucleic acids, including DNA, in the cells. .
  • the term "paraffin” refers to the embedding medium of a biological sample used in all interpretations including morphological, immunohistochemical and enzymatic histochemical interpretation. That is, the paraffin in the present invention may be a petroleum paraffin wax step K ⁇ , and all other additives which can be added for the purpose of improving the quality of the embedding medium, etc. based on the petroleum paraffin wax.
  • a petroleum paraffin wax refers to a mixture of hydrocarbons which are solid at room temperature derived from petroleum.
  • kits / devices for separating nucleic acids from FFPE include, for example, the Ti ssue Preparat ion System from Siemens and related reagents (VERSANT ti ssue preparat ion reagents).
  • the kit of the present invention may be a DNA or cDNA separated from the CTC (ci rculating tumor cel l) isolated from the blood as a template.
  • CTCs are tumor cells found in the peripheral blood of malignant tumor patients.
  • CTC is considered to be very important in cancer research and diagnosis because CTC plays an important role in cancer metastasis process, but the number of circulating tumor cells in peripheral blood is very rare, and dozens or less mixed with millions of normal blood cells There is a need for a detection system that requires a sensitivity that is capable of detecting tumor cells.
  • the therapeutic responsiveness in the present invention can be defined as "responsive" to the therapeutic agent if the growth rate is inhibited as a result of contact with the therapeutic agent as compared to its growth not in contact with the therapeutic agent.
  • Cancer growth can be measured in a variety of ways, eg, the expression of tumor markers appropriate to the size of the tumor or its tumor type can be measured.
  • the "reactive" ' may indicate a significant increase in survival time on the survival curve.
  • Cancer is “non-ungular” for a therapeutic agent if the growth rate is inhibited or not inhibited to a very low degree as a result of contact with the therapeutic agent as compared to its growth not in contact with the therapeutic agent.
  • Growth can be measured in a variety of ways, eg, the expression of tumor markers appropriate to the size of the tumor or its tumor type can be measured. It can be assessed using additional criteria beyond the growth size of.
  • Therapeutic treatment for cancer treatment agents may be response treatment for inhibitors of epidermal growth factor receptor (EGFR).
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • the cancer of the present invention may be lung cancer, breast cancer, bladder cancer, and stomach cancer.
  • EGFR is a protein product of erbB or ErbBl, an oncogene.
  • erbB or ErbBl is part of the ERBB family of protooncogenes known to be important factors in numerous cancer developments. Including lung cancer, breast cancer, bladder cancer, stomach cancer Increased expression of EGFR in the back was observed.
  • epithelial cell carcinoma such as lung cancer, breast cancer, bladder cancer, stomach cancer
  • EGFR targeting drugs have been developed, in particular Gefitinib (Gef it inibKAstraZeneca UK Ltd., trade name “IRESSA”) and Erlotinib (Er lot inibXGenentech, Inc. & OSI Pharmaceuticals, Inc., trade name "TARCEVA”).
  • IRESSA Gefitinib
  • Erlotinib Er lot inibXGenentech, Inc. & OSI Pharmaceuticals, Inc., trade name "TARCEVA”
  • Zephytinib and erlotinib are quinazoline compounds that block cellular intestines by inhibiting tyrosine kinase activity of EGFR to inhibit phosphorylation.
  • the nucleic acid to be isolated from the sample of the present invention is preferably genomic DNA, more preferably genomic DNA assumed to carry mutations.
  • composition or kit of the invention is preferably a method of automated or semi-automated
  • compositions or kits of the present invention showed excellent mutation detection for each sample in the detection of mutations in the EGFR gene, which was superior to conventional comparative products.
  • the system of the present invention is an automated process for predicting and diagnosing responsiveness to a therapeutic agent for a cancer patient's prognosis. It can be useful.
  • 1 shows a vector map of a pIDTSmart Amp vector.
  • Figure 2 shows the separation process in the FFPE sample of the method of the present invention in a flow chart.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram of a CTC separation method of the method of the present invention.
  • Figure 4 is an example of the results of PCR reaction in CTC cells in accordance with the method of the present invention.
  • Magnetic beads (VERSANT tissue preparation reagents, Box 1, Siemens) were mixed and incubated at 65 ° C for 15 minutes to allow cell debris to adhere and magnetically attached to the bottom of the labe to bond with magnetic beads The separated material was separated, and the upper solution was removed from the magnetic beads and lysis buffer (VERSANT tissue preparation reagents, Box 1, Siemens) was transferred to a new tube pre-loaded. At this time, the paraffin layer formed on the upper part of the tube should not be transferred to the new tube.
  • a standard vector (named mini-clone) was constructed to validate the designed primers and probes, and to make the standards needed to perform ddPCR.
  • approximately 300bp was synthesized by mutating the exon of each EGFR, namely the probe position.
  • the synthesized DNA fragment was inserted between the universal link sequence of the pIDTSmart Amp vector (see FIG. 1), and the produced clone was transformed into E. coli DH5a cells.
  • the standard vector is for this purpose
  • 100-350 bp of polynucleotides covering DNA gene mutations can be used transformed into a conventional vector.
  • the standard vector of the present invention may be used by inserting about 300bp into the pIDTSmart Amp vector by mutating the exon of the EGFR, that is, the probe position in the center.
  • the standard vector of the present invention may be a vector containing a DNA fragment of about 300 bp with each mutation in the exon of the EGFR, i.e., the probe position in the center, which may be transformed into a host cell such as Escherichia coli. Can be converted to amplified and used after extraction. More preferably, the standard vector of the present invention comprises 1597 of the EGFR gene (genbank accession no.
  • polynucleotide at 100 to 350 bp at the 160900th base, for axon 20 the polynucleotide at 100 to 350 bp to the 167500th base of the EGFR gene at 167101 of the EGFR gene, and the 177551 to 177930th of the EGFR gene at exon 21.
  • Polynucleotide H DNA fragment of 100 to 350 bp in the base may be inserted into the pIDTSmart Amp vector.
  • the probe was designed as a taqman probe by selecting those that met the conditions.
  • HEX / VIC reporter f luorescence was attached to the 5 'wild type probe, and FAM dye was attached to the 5' mutant probe to detect amplification afterwards.
  • TAMRA was used as the quencher on the 3 'side of all probes.
  • probe 21 4, 31, 8, and 4 probes were designed and synthesized, respectively.
  • the probe designed by the inventors had al lele speci fic and almost all probes had a cosmic number.
  • Samples adjusted by dilution in 7 steps up to 0.02% and 0.01% were simultaneously measured by the method according to the Covas EGFR gene mutation test kit and the method in the present invention. Covas EGFR gene mutation testing was performed according to the manufacturer's instructions.
  • the minimum measurement result of the Cobas EGFR mutation test was 0.5% to 53 ⁇ 4, whereas the method of the present invention In this case, it was confirmed that the test can be carried out from 0.02% to 0.13 ⁇ 4.
  • the result of noting that the mutation position of 2239_2257> GT cannot be determined by the COVAS EGFR gene mutation test is 0.05 according to the present invention. Sensitivity of% was confirmed to have greater than or equal results compared to the approved method of COVAS EGFR gene mutation test.
  • the sensitivity analysis for the correlation test using DNA extracted from Hor izon's FFPE tissue and Horizon's mutant genomic DNA showed 0.5% to 5% of the results measured by COVA's EGFR gene mutation test.
  • the minimum measurement value was determined to be 0.023 ⁇ 4 to 0.5% according to the mutation position. This indicates that at least 10 times the sensitivity is shown in the licensed product comparison analysis.
  • CTCs were obtained from blood samples obtained from cancer patients by CTC separation apparatus based on the magnetophoresis method.
  • the conceptual diagram of the CTC separation method by magnetophoresis is shown in FIG. 3.
  • the separation method of the CTC will be described in more detail as follows.
  • Microfucidics chips prepared for CTC separation were installed in a CTC separation device capable of injecting blood and buffer. Blood was passed through the inlets at both ends while flowing the buffer into the center channel. Antibodies (EpCam ant ibody) with magnetic substances attached to the blood to bind specifically to CTC were added to the CTC to show specific magnetism. The ferromagnetic material pre-installed on the microfluidics chip is magnetized by the permanent magnet installed in the CTC separation device, and the CTC cells are moved to the CTC separation channel in the center by the magnetic force generated from the magnetized ferromagnetic material. After the flow of blood, CTC collected on the side of the CTC separation channel was used for subsequent experiments. Mutations in the EGFR gene were measured in DNA isolated from human CTC cells. And separating the DNA from the separation CTC, it utilizes a primer / probe of the present invention, the mutant was confirmed by the process of the present invention.
  • the system of the present invention is capable of predicting and diagnosing the treatment of cancer patients' prognosis through an automated process. It can be useful for the purpose of presentation.

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Abstract

본 발명은 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물， 상기 조성물을 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 RUO 키트에 관한 것이다. 본 발명의 시스템은 자동화된 과정으로 암 환자 예후의 치료제에 대한 반응성 예측， 진단이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트
【기술분야】
<ι> 본 출원은 2014년 8월 1일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0099189 호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
<2>
<3> 본 발명은 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이 를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상피세포 성장인자 수용체 유전 자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물, 상기 조성물을 포함하는
EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머 /프로브 세트를 포함하는 EGFR유전자 돌연변이 검출용 RU0 키트에 관한 것이다.
<4>
【배경기술】
<5> 암이란 다양한 원인에 의해 세포의 분열과 사멸 간의 균형이 파괴됨으로써 계속적인 분열과 증식에 의해 발생한 비정상적인 세포의 집단을 의미하며， 종양 또 는 신생물이라고도 한다. 일반적으로 장기， 백혈구， 뼈， 림프절 등을 포함한 100 가지 이상의 신체의 여러 부분에 발병하며， 주변조직으로 침윤하는 현상 및 다른 기관으로 이동하는 전이를 통해 심각한 증상으로 발전한다.
<6>
<7> 암의 치료제는 지속적으로 개발되고 있어， 현재 임상에서 사용되는 각종 암 에 대한 치료제는 수십 가지에 이르고 있다. 하지만 현재까지도 임상의들은 두 가 지의 어려움을 겪고 있는데， 첫째는 치료제가 치료 효과를 나타내기까지는 몇 주 정도의 시간이 소요되고 개개 환자들에게 효과가 있는 치료제를 미리 알 수가 없다 는 것이다. 즉, 항암제의 치료 효과는 며칠 내에 판정할 수 있는 것이 아니라 수주 에 걸쳐서 서서히 나타나기 때문에 처방된 약물이 효과가 없다고 판단하기까지는 오랜 시간이 걸린다는 것이다. 그 후 치료 효과가 부적절하다면 다른 종류의 치료 제로 변경을 고려하는데， 결국 치료 개시 시기에 임상의가 환자에게 적절한 치료제 를 선택하지 못하였다면， 그만큼 효과적인 치료에 이르는데， 시간이 그만큼 지체하 게 되며， 병의 진행， 재발 및 예후에 치명적인 영향을 미치게 된다.
<8> <9> 두 번째 어려움은 치료제에 치료 반웅을 보이지 않는 환자가 다수 존재하는 점이다. 예를 들어， 유방암 치료제인 라파티닙 ( lapat inib)은 HER2 단백질의 수치가 높고 (HER2 양성 ) EGRF 단백질의 수치가 낮은 경우에 치료효과가 있는 것으로 밝혀 진 바 있다. 그러나 전이성의 HER2 음성 유방암은 라파티닙에 반응을 하지 않아 라 파티닙이 효과가 없는 것으로 드러났다. 이러한 연구결과를 참고하면， 일단 유방암 환자들은 치료를 받기 전에 정확한 검사를 통하여 HER2 음성인지 흑은 양성인지를 확실히 밝혀야 적절한 치료를 선택할 수 있음을 알 수 있다.
<10>
<1 1> 따라서， 치료제에 대한 치료반웅과 그 부작용을 미리 예측할 수 있다면， 환 자에게 맞는 약물을 미리 선별하여 약물을 잘못 선택함으로 인하여 생기는 치료 탈 락 (dropout )률을 낮추고 약물의 순응도를 높일 수 있을 것이다. 또한 약물의 효과 가 나타나기까지 걸리는 시간과 환자가 겪을지도 모르는 부작용의 위험을 피해 갈 수 있을 것이다.
<12>
<13> 이러한 개념하에 여러 약물 반응성과 관련된 마커의 탐색이나 이를 활용한 상용의 체외진단 또는 동반진단 키트가 개발되고 있고, 그 중 몇 가지는 이미 상용 화되어 임상에서 활용되고 있다. 하지만， 이러한 방법들은 일반적으로 고도로 숙련 된 실험자에 의하지 않으면 결과의 신뢰성이 떨어지는 경우가 많다. 이에 따라 일 부의 경우 central lab 방식으로 환자의 시료를 정해진 과정에 따라서 서비스 제공 회사에 제공하여야 비교적 의미있는 결과를 얻을 수 있는 경우도 있고, 실험실간 오차 (inter-laboratory variat ion) , 실험자간 오차 ( inter-observer variat ion) , 실험시기간 오차 (day-to-day variat ion)로 인해 전체적인 시스템의 신뢰성에 의문 이 제기될 수 있기도 하다.
<14>
<15> 이와 같이 종래의 방법은 장소， 시간， 실험자에 따라서 진단 결과에 오류가 생길 우려가 있어 안정적인 결과를 얻기 위하여 실험자의 관여가 가급적 배제된 방 법이나 자동화 과정이 필요한 실정이다.
<16>
<17> 한편， EGFR은 erbB 수용체 부류의 단백질 티로신 인산화효소의 일종이다. 성 장 인자 리간드， 예컨대 표피 성장 인자 (EGF: epidermal growth factor) 결합시， 상기 수용체는 또 다른 EGFR 분자와 동종 이량체를 형성할 수 있거나, 또는 또 다 른 부류 구성원， 예컨대 erbB2(HER2)， erbB3(HER3) , 또는 erbB4(HER4)와 이종 이량 체를 형성할 수 있다.
<18>
<i9> erbB 수용체의 동종 및 /또는 이종 이량체의 형성은 세포내 도메인에서 중요 티로신 잔기의 인산화를 결과로 생성하고， 세포 증식 및 생존에 관여하는 많은 세 포내 신호 전달 경로의 자극을 유도한다. erbB 부류 신호 전달의 탈조절은 증식， 침윤， 전이， 혈관형성 및 종양 세포 생존을 조장하며， 그리고 폐암， 두경부암 및 유방암을 비롯한 많은 인간 암에서 기술되어 있다.
<20>
<21> 그러므로， erbB 부류가 항암 약물 개발을 위한 합리적인 표적올 대표하고， 제피티닙 ( IRESSA™) , 엘로티닙 (TARCEVA™)을 비롯한， EGFR을 표적하는 다수의 제제 가 현재 임상적으로 이용될 수 있다. 2004년에는 EGFR에서 활성화 돌연변이가 비소 세포 폐암 (NSCLC: non-smal l -cel l lung cancer)에서 제피티닙 요법에 대한 반웅과 상관관계가 있다는 것이 보고되었다 (Science [2004] Vol .304, 1497-500 및 New England Journal of Medicine [2004] Vol . 350, 2129-39) . 가장 일반적인 EGFR 활 성화 돌연변이인 L858R 및 delE746_A750은 야생형 (WT: wi ld type) EGFR에 비하여 소분자 티로신 키나제 억제제， 예컨대 제피티닙 및 엘로티닙에 대한 반옹성과 관련 이 있는 점이 알려져 있다. 궁극적으로， 제피티닙 또는 엘로티닙을 사용하는 요법 에 대한 획득 내성이 예를 들면 게이트키퍼 잔기 T790M의 돌연변이에 의해 발생하 는데， 상기 돌연변이는 임상적으로 내성을 띠는 환자 중 50¾>에서 검출되는 것으로 보고된 바 있다.
<22>
<23> 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시 되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조 로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하 게 설명된다.
<24>
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
<25> 이에 본 발명자들은 EGFR 유전자의 돌연변이를 검출하는 시스템， 특히 자동 화가 가능한 시스템을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과， 암 조직의 FFPE 시 료에서 적용시키기 적합한 프라이머 /프로브 세트를 발굴하고， 이에 적합한 방법， 특히 자동화에 적합한 키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다. <26>
<27> 따라서， 본 발명의 목적은 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공하는 것이다.
<28> 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머 /프로브 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 RU0 키트를 제공하는 것이다.
<29>
【기술적 해결방법】
<30> 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공 한다.
<31> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 본 발명의 조성물을 포 함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머 / 프로브 세트를 포함하는 EGFR유전자 돌연변이 검출용 RU0 키트를 제공한다.
<32>
<33> 다른 정의가 없는 한， 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당 업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술 ( Ski l l )의 하나 를 제공한다: Singleton et al . , DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BI0L0TY (2th ed. 1994)； THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walkered. , 1988)； 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.
<34>
<35> 이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다 .
<36>
<37> 본 발명은 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출 용 프라이머 및 프로브 세트 조성물에 관한 것이며， 상기 조성물은 서열번호 1의 정방향 프라이머， 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 9 내지 13으로 이루 어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트， 서열번호 3의 정방향 프라이 머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 14 내지 42으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트， 서열번호 5의 정방향 프라이머， 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 43 내지 50으로 이루어진 군에서 선택된 프로브 의 폴리뉴클레오티드 세트， 서열번호 7의 정방향 프라이머， 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 51 내지 54으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클 레오티드 세트로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드를 유효성분 으로 포함한다.
<38>
<39> 본 발명의 조성물은 바람직하게는 EGFR 저해제에 대한 치료 반응성
(responsiveness) 예측을 위한 것일 수 있다. 2004년, EGFR에서의 돌연변이가 비소 세포 폐암 (NSCLC: non-smal l -cel l lung cancer )에서 제피티닙 요법에 대한 반웅과 상관관계가 있다는 것이 보고 (Science [2004] Vol .304 , 1497—500 및 New England Journal of Medi cine [2004] Vol . 350 , 2129-39)된 이래로 많은 관련 EGFR 돌연변 이가 확인되었다. EGFR 저해제는 바람직하게는 엘로티닙 (er lot inib) 또는 제피티 닙 (gef i t inib)일 수 있다.
<40>
<41> 본 발명에서 "프라이머"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로， 핵산쇄
(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉， 뉴클레오타이 드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재， 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합 성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는， 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타 이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연 (natural ly occurr ing) dNMP (즉， dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP) , 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자 연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한， 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포 함할 수 있다.
<42>
<43> 프라이머는， 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있 을 정도로 층분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소， 예컨대， 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스 (source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 층분히 안정된 흔성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 "어닐링" 또는 "프 라이밍 "은 주형 핵산에 을리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치 (apposi t ion) 되는 것을 의미하며， 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵 산또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
<44>
<45> 본 발명에서 "프로브' '는 정량적 PCR에 이용되는 taqman probe의 일종으로 디 자인된 것이다. 바람직하게는 프로브에는 형광 물질 (HEX, VIC, F崖 dye)를 부착하 였으며, 모든 프로브의 3 '쪽에는 퀀쳐 (quencher )로 TAMRA가 이용될 수 있다. TaqMan probe는 일반적으로 5 '말단을 형광 물질로， 3 '말단을 quencher 물질로 tagging한 ol igonuc leot ide이며， TaqMan probe는 anneal ing step에서 templ ate DNA 에 특이적으로 hybr idi zat ion하지만， probe의 3 '말단에 quencher가 있기 때문에 빛 을 주어도 형광을 발하지 못하지만， 다음 과정인 extension step에서 Taq DNA polymerase?} 지고 있는 5 '→3 ' exonuclease 활성에 의해, 주형에 hybr idi zat ion 한 TaqMan probe가 분해되면 형광물질이 probe로부터 분리되어 quencher에 의한 억 제가 해제되고 형광을 발하게 되는 원리에 의해서 PCR 반응에 따른 형광이 정량적 으로 발하게 된다.
<46>
<47> 본 발명에서의 게놈 DNA 유전자 변이에 특이적인 프라이머 및 프로브는 EGFR
(epidermal growth factor receptor ) 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는 게놈 DNA 유전자 변이에 특이적인 프라이머 및 프로브는 PCR 반웅 용액 및 표준 PCR 반응 용액에 대해서 동일한 서열로 사용되며， 각각 독립적 으로 서열번호 1의 정방향 프라이머， 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 9 내지 13으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 3 의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 14 내지 42으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 5의 정방향 프 라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 43 내지 50으로 이루어진 군에 서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 7의 정방향 프라이머， 서열 번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 51 내지 54으로 이루어진 군에서 선택된 프 로브의 폴리뉴클레오티드 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
<48>
<49> PCR 반응 여부의 측정은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으나, 리 포터 형광 염료 및 /또는 퀀쳐 (Quencher ) 형광 염료로 표지된 프로브를 사용한 광 학적 정량 분석 시스템에 의해서 측정될 수 있으며， 바람직하게는 각 미분화된 작 은 방울 각각의 PCR 반응에 대한 형광값을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다.
<50>
<5i> 구체적으로 프로브에 FAM, HEX, VIC 형광염료 (형광물질) 또는 EvaGreen 형 광염료가 결합된 형태를 사용하였으므로 이들에 대한 형광을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다. 이와 같은 과정은 상용의 검출장치 (예를 들어, biorad사의 Droplet Reader)에 의해서 수행될 수 있으며， 해당 장치내에서 각각의 샘플의 droplet 형광 신호를 각각 감지 및 posi t ive와 negat ive drop let의 수를 세어 자동 으로 분석까지 완료될 수 있다.
<52> 이 때 검출을 위해서 PCR 반웅 용액에 첨가되는 프로브 및 표준 PCR 반웅 용 액에 첨가되는프로브는각각상이한 형광물질과 결합되어 있을 수 있다.
<53>
<54> 한편， 본 발명은 본 발명의 프라이머 /프로브 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
<55>
<56> 본 발명의 키트는 바람직하게는 본 발명의 프라이머 /프로브 세트를 이용한
PCR 반응에 의한 EGFR 유전자의 돌연변이의 검출에 이용될 수 있다. 본 발명의 키 트는 PCR 이나 이의 검출에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및 /또는 시약을 추가 로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 흔합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트， 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.
<57>
<58> 아울러, 본 발명의 키트는 RUO (research use only) 또는 IVD
( invest igat ion use only) 키트일 수 있다. IVD 키트에는 IVD—CDx 키트도 포함된 다.
<59>
<60> 한편， 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머， 서열번호 2의 역방향 프라 이머 및 서열번호 10 내지 13으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오 티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 RU0 키트를 제공 한다.
<6i> 또한， 본 발명은 서열번호 3의 정방향 프라이머， 서열번호 4의 역방향 프라 이머 및 서열번호 14， 15， 20, 21 , 26, 27, 28， 31， 33, 34로 이루어진 군에서 선 택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연 변이 검출용 RU0 키트를 제공한다.
<62> 또한 본 발명은 서열번호 3의 정방향 프라이머， 서열번호 4의 역방향 프라이 머 및 서열번호 14, 16， 17, 18， 19， 22， 23， 24， 25， 29, 30, 32， 35， 36, 37， 38， 39， 40, 41， 42로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR유전자 돌연변이 검출용 RU0 키트를 제공한다.
<63> 또한, 본 발명은 서열번호 5의 정방향 프라이머， 서열번호 6의 역방향 프라 이머 및 서열번호 43 내지 50으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오 티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 RU0 키트를 제공 한다.
<64> 또한， 본 발명은 서열번호 7의 정방향 프라이머， 서열번호 8의 역방향 프라 이머 및 서열번호 51 내지 54로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티 드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 RU0 키트를 제공한 다.
<65>
<66> 본 발명의 키트는 qPCR (quant i tat ive PCR) 또는 digi tal PCR 방법에 사용되 는 것이다.
<67>
<68> 본 발명의 키트에 적용가능한 주형은 EGFR의 돌연변이 검출이 필요하며， PCR 반웅이 가능한 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으나， 바람직하게는 본 발명의 키 트는 FFPE (formal in f ixed paraf in embedded) 시료 조직에서 분리된 DNA 또는 cDNA (complementary DNA)를 주형으로 할 수 있다.
<69>
<70> 생검 후 환자에게서 얻은 조직은 통상적으로 포르말린 (포름알데히드) 등에 의해서 고정화한다. 고정화한 생물학적 샘플은 일반적으로 탈수시키고， 파라핀 등 의 고체 지지체에 포매하며， 이렇게 제조된 시료를 FFPE 시료라고 한다. FFPE 시료 상의 핵산， 특히 DNA는 고정된 세포에 존재하고， 단편화되어 있거나 포르말린에 의 해 교차 결합되어 있으므로 파라핀을 제거하고 고정된 세포를 용해하여 DNA를 비롯 한 핵산을 세포 내에서 용출시킬 필요가 있다.
<71>
<72> 본 발명에 있어서 용어 "파라핀"은 형태학적， 면역조직화학적 및 효소조직화 학적인 해석을 포함하는 모든 해석에 있어서 사용되는 생체시료의 포매 매체를 포 괄적으로 말하는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서의 파라핀은 석유계 파라핀 왁스 단 처 K單體)여도 되고， 당해 석유계 파라핀 왁스를 기제 (基齊 로 하여， 포매 매체의 품질향상 등의 목적으로 첨가될 수 있는 모든 다른 성분을 포함한 것이어도 된다. 여기서， 석유계 파라핀 왁스는 석유에 유래하는 상온에서 고형인 탄화수소류의 흔 합물을 말한다.
<73> 일반적으로 FFPE 처리된 암 환자의 검체 시료를 회전식 미세톱 (rotary microtome)으로 5~10 μ πι 의 두께로 절단한 다음 상용의 FFPE 용 핵산 분리 키트 또 는 이를 활용하는 장치를 통해 DNA를 포함하는 핵산을 분리할 수 있다. FFPE에서 핵산을 분리하는 키트 /장치는 예를 들어 지멘스 사의 Ti ssue Preparat ion System 및 이와 관련된 시약 (VERSANT t i ssue preparat ion reagents)을 들 수 있다.
<74>
<75> 아울러， 본 발명의 키트는 혈액에서 분리된 CTC (ci rculat ing tumor cel l )에 서 분리된 DNA 또는 cDNA를 주형으로 할 수 있다. CTC는 악성 종양 환자의 말초혈 액에서 발견되는 종양세포이다. CTC가 암전이 과정에서 중요한 역할을 하기 때문에 CTC는 암의 연구， 진단 등에 있어서 매우 중요하게 여겨지고 있으나， 말초혈액 내 순환종양세포 존재 수가 매우 드물어, 수백만 개 이상의 정상 혈구세포에 섞여 있 는 수십 개 이하의 종양세포를 검출할 수 있는 정도의 민감도가 요구되는 검출 시 스템이 필요하다.
<76>
<77> 본 발명에서 치료 반응성은 암은 성장률이 치료제와 접촉하지 않은 그의 성 장과 비교해서 치료제와 접촉한 결과로서 억제된다면 치료제에 대해서 "반응성 "이 라고 정꾀할 수 있다. 암의 성장은 다양한 방식으로 측정될 수 있고， 예를 들어， 종양의 크기 또는 그 종양 유형에 적합한 종양 마커의 발현이 측정될 수 있다. 아 울러， 상기 "반응성' '에는 유의미한 생존곡 상의 생존시기의 증가를 나타낼 수도 있다.
<78> 암은 성장률이 치료제와 접촉하지 않은 그의 성장과 비교해서 치료제와 접촉 한 결과로서 매우 낮은 정도로 억제되거나 억제되지 않는다면 치료제에 대해서 "비 반웅성''이다. 위에서 언급된 바와 같이, 암의 성장은 다양한 방식으로 측정될 수 있고， 예를 들어， 종양의 크기 또는 그 종양 유형에 적합한 종양 마커의 발현이 측 정될 수 있다. 비반웅성의 척도는 환자의 삶의 질, 전이도 등을 비롯하여 종양의 성장 크기를 넘는 추가의 기준을 이용해서 평가될 수 있다.
<79>
<80> 암 치료제에 대한 치료 반웅성으로 EGFR (epidermal growth factor receptor )의 저해제에 대한 치료 반웅성일 수 있으며， 이에 따라 본 발명의 암은 폐암, 유방암， 방광암， 위암일 수 있다.
<81>
<82> EGFR은, 종양유전자 (oncogene)인 erbB 또는 ErbBl의 단백질 산물이다. erbB 또는 ErbBl은 수많은 암 발생에 있어 중요 인자로 알려진 원발암유전자 (protooncogenes)인 ERBB 군의 하나이다. 폐암을 포함하여, 유방암， 방광암， 위암 등에서 EGFR의 발현이 증가되는 것이 관찰되었다.
<83>
<84> 폐암， 유방암， 방광암， 위암 등의 상피세포암을 치료하기 위하여 다양한
EGFR 표적 약물이 개발되었으며, 특히 제피티닙 (Gef it inibKAstraZeneca UK Ltd. , 상표명 " IRESSA" )와 엘로티닙 (Er lot inibXGenentech, Inc . & OSI Pharmaceut icals , Inc . , 상표명 "TARCEVA" )이 대표적인 약물이다. 제피티닙과 엘로티닙은 퀴나졸린계 화합물로서， EGFR의 티로신 키나제 활성을 저해하여 인산화를 억제함으로써 세포성 장을 막는다.
<85>
<86> 본 발명의 시료에서 분리되는 핵산은 바람직하게는 게놈 DNA이며， 더 바람직 하게는 돌연변이를 보유하고 있올 것으로 추정되는 게놈 DNA이다.
<87>
<88> 본 발명의 조성물 또는 키트는 바람직하게는 자동화 또는 반자동화된 방법의
EGFR 돌연변이 검출에 이용될 수 있다. 상기에서 자동화는 샘플 (시료)의 투입; 추 출， 분리， 반웅이 완료된 기재 (예를 들어， 튜브， 플레이트)의 재배치 또는 이동; 시약， 버퍼의 스록 (stock)에의 투입， 보층; 장비의 유지관리를 제외한 전부 또는 대부분 과정이 인간 이외의 수단 (예를 들어， 로봇)을 통해서 이루어지는 것을 의 미한다.
<89>
<90> 본 발명의 조성물 또는 키트는 EGFR 유전자의 돌연변이의 검출에 있어서 각 시료에 대해서 우수한 돌연변이 검출능을 보였으며, 이는 종래의 비교 제품에 비해 서도 더 우수한 것이었다.
<91>
<92> 참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다 (Maniat i s et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor , N.Y. (1982)； Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)； Deutscher , M. , Guide to Protein Puri f icat ion Methods Enzymology, vol . 182. Academic Press . Inc . , San Diego, CA(1990)； Ausubel et al . , Current Protocols of Molecular Biology, John Wi ley and Sons (1997)； Rupp and Locker , Lab Invest . 56： A67 (1987)； De Andres et al . , BioTechniques 18： 42044 (1995)； Held et al . , Genome Research 6:986-994 (1996)； T.E. Godfrey et al . J . Molec . Diagnostics 2： 84—91 (2000)； K. Specht et al . , Am. J. Pathol. 158： 419-29 (2001)).
<93>
【유리한 효과】
<94> 따라서， 본 발명의 시스템은 자동화된 과정으로 암 환자 예후의 치료제에 대 한 반응성 예측， 진단이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향 후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.
<95>
【도면의 간단한 설명】
<96> 도 1은 pIDTSmart Amp 백터의 백터맵을 나타낸 것이다.
<97> 도 2는 본 발명의 방법 중 FFPE 시료에서의 분리과정을 플로우 차트로 나타 낸 것이다.
<98> 도 3은 본 발명의 방법 중 CTC분리 방법의 개념도이다.
<99> 도 4는 본 발명의 방법에 따라 CTC세포에서의 PCR반웅 결과의 일례이다.
<100>
【발명의 실시를 위한 형태】
<101> 이하, 본 발명올 실시예에 의해 상세히 설명한다.
<102> 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<103>
<104> <실시예 1>
<i05> FFPE 시료에서의 DNA의 분리
<i06> FFPE 처리된 폐암 환자의 검체 (크기 600mm2)를 시료로 이용하였다. FFPE 시 료를 회전식 미세롭 (rotary microtome)으로 5~10μπι의 두께로 절단한 다음 FFPE용 버퍼 (FFPE buffer, VERSANT tissue preparation reagents, Box 1， Siemens)를 흔합 하고, 80°C에서 30분간 인큐베이션 (incubation)하였다. 온도를 65°C로 낮추고, 단 백질분해'효소 K (proteinase K, VERSANT tissue preparation reagents, Box 2, Siemens)를 흔합한 다음 30분간 인큐베이션 하였다. 마그네틱 비드 (magnetic beads , VERSANT tissue preparation reagents, Box 1, Siemens)를 흔합한 다음 65 °C에서 15분간 인큐베이션 하여 세포 잔해물 (cell debris)가 부착되도록 하고, 류 브 하부에 자기력을 걸어 마그네틱 비드와 결합된 물질을 분리하고， 상부의 용액을 마그네틱 비드와 용해 버퍼 (lysis buffer, VERSANT tissue preparation reagents, Box 1, Siemens)가 미리 담겨 있는 새 튜브로 옮겼다. 이 때， 튜브 상부에 형성되 어 있는 파라핀 층은 새 튜브로 옮겨지지 않도록 한다.
<107>
<108> 마그네틱 비드에 핵산 분자가 결합되도록 실온에서 10분간 인큐베이션 하였 다. 튜브 하부에 자기력을 걸어 마그네틱 비드를 분리하고， 상등액을 제거한 다음 세척 버퍼 1, 2， 3(washing buffer 1， 2， 3， VERSANT tissue preparation reagents, Box 1， Siemens)로 세척하였다. 여기에 용출 버퍼 (elution buffer, VERSANT tissue preparation reagents, Box 1， Siemens)를 넣고, 70°C에서 10분간 인큐베이션 하여 핵산 분자가 용출되도록 하였다. 핵산 분자가 용출된 상등액을 따 로 새 튜브로 옮겨 마그네틱 비드를 제거한 다음 RNase (VERSANT tissue preparation reagents, Siemens)을 넣고 37°C에서 10분간 반웅시켜 RNA를 제거하 여, DNA 만을 분리하였다. 분리된 DNA를 정량한 결과는 다음 표 1과 같다.
<109>
<ιιο> 【표 1】
Figure imgf000014_0001
<111>
<112> <실시예 2>
<113> 표준 물질 백터의 제작
<114>
<ιΐ5> 디자인된 프라이머와 프로브를 검증하기 위해， 그리고 ddPCR 수행에 필요한 표준물질을 만들기 위해 표준 물질 백터 (mini-clone으로 명명)을 제작하였다. mini— clone의 제작과정은 먼저 EGFR의 각각 exon에서 돌연변이가 일어난 구간， 즉 probe 위치를 가운데로 하여 약 300bp을 합성하였다. 합성된 DNA 단편은 pIDTSmart Amp 백터의 universal link sequence 사이에 삽입하고 (도 1 참조)， 제작된 clone 은 대장균 DH5a 세포에 형질전환 (transformation) 시켰다.
<116>
<ii7> circular form 또는 super— coiled form으로 존재하는 표준물질 백터를 선형 화시켜 ddPCR (droplet digital PCR) 시 효율을 극대화시키기 위하여 표준물질 백 터에 제한효소를 처리하였다. 표준물질 백터 (Miniclone DNA) Clal 제한효소를 37 도씨에서 30분간 반웅 후， 반응산물을 정량 후 -20도씨에서 사용 전까지 보관하였 다. <118>
<Π9> 본 발명에서의 검출 대상의 PCR 증폭 후의 수준은 대상 시료에 따라 전체적 으로 차이가 있을 수 있으므로 돌연변이에 특이적인 프라이머 /프로브에 의한 증폭 여부의 판별을 위한 기준이 필요하다. 표준 물질 백터는 이를 위한 것으로 게놈
DNA 유전자 변이를 포괄하는 100 내지 350 bp의 폴리뉴클레오티드가 통상의 백터에 형질전환된 것을 이용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 표준 물질 백터는 EGFR 의 각각 exon에서 돌연변이가 일어난 구간， 즉 probe 위치를 가운데로 하여 약 300bp을 합성하여 pIDTSmart Amp 백터에 삽입하여 사용할 수 있다.
<120>
<i2i> 바람직하게는 본 발명의 표준 물질 백터는 EGFR의 각각 exon에서 돌연변이가 일어난 구간 즉 probe 위치를 가운데로 하여 약 300bp의 DNA 단편을 포함하는 백 터일 수 있으며， 이는 대장균 등의 숙주세포에 형질전환하여 증폭， 추출 후 사용될 수 있다. 더 바람직하게는 본 발명의 표준 물질 백터는 엑손 18의 경우, EGFR 유전 자 (genbank accession no . NG_007726) 의 1597이에서 160100번째 염기에서 100 내 지 350 bp의 폴리뉴클레오티드， 액손 19의 경우， EGFR 유전자의 1605이에서 160900 번째 염기에서 100 내지 350 bp의 폴리뉴클레오티드， 액손 20의 경우， EGFR 유전자 의 167101에서 167500번째 염기에서 100 내지 350 bp의 폴리뉴클레오티드, 엑손 21 의 경우， EGFR 유전자의 177551에서 177930번째 염기에서 100 내지 350 bp의 폴리 뉴클레오티 H DNA 단편을 pIDTSmart Amp 백터에 삽입한 것일 수 있다.
<122>
<123> <실시예 3>
<124> 프라이머 /프로브 디자인 및 선발
<125>
<126> 폐암 관련 유전자인 EGFR의 바이오 마커를 개발하기 위해 cosmic번호
(http : //cancer . sanger . ac .uk)를 기반으로 하여 돌연변이 위치를 확인하였다. 유전 자의 exon별 프라이머를 pr imer 3 프로그램을 사용하여 EGFR-21을 제외한 나머지는 forward가 intron부분과 over lapping될 수 있도록 디자인하였다. 이 때 , 프라이머 의 Tm값은 58~60°C로 하였으며 (^:%는 40~60%로 디자인하였다.
<127>
<128> 프로브는 조건을 층족하는 것들을 선별하여 taqman probe로 디자인하였다.
5 ' wi ld type 프로로브에는 HEX/VIC reporter f luorescence를 부착하였으며, 5' mutant probe에는 FAM dye를 부착하여 이후에 증폭 여부를 검출가능하도톡 하였다. 모든 프로브의 3 ' 쪽에는 quencher로 TAMRA를 사용하였다. EGFR exon 18， 19， 20，
21번에 각각 4, 31 , 8, 4개의 프로브들을 디자인하여 합성하였다. 본 발명자들에 의해 디자인된 프로브는 al lele speci f ic을 갖고있으며 거의 모든 프로브들이 cosmic 번호를 가지고 있었다.
<129>
<130> 디자인된 프라이머 (표 2)와프로브 (표 3 및 표 4)의 정보는 다음과 같다.
<131>
<132> 【표 2】
Figure imgf000016_0001
<133>
<134> 【표 3】
Figure imgf000017_0001
<136> * WT: wildtype; mt： mutant (이하표 4도 같음)
<137> <138> 【표 4】
Figure imgf000018_0001
<실시예 4> 기허가 제품과의 비교실험
<143> <i44> 식약처에서 기허가된 코바스 EGFR 유전자 변이 검사 (cobas EGFR mutat ion test ) 키트에 의한 방법과 본 발명에서의 방법과의 상관성 시험을 위해 민감도에 비해서 비교 분석 시험을 하였다.
<145>
<146> 돌연변이 빈도 (mutat ion frequency)를 각각 5 )， 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%,
0.02%, 0.01% 까지 7단계로 회석하여 조절된 샘플을 대상으로 코바스 EGFR 유전자 변이 검사 키트에 의한 방법과 본 발명에서의 방법에 의해서 동시에 측정하였다. 코바스 EGFR유전자 변이 검사는 제조사의 지침에 따라서 수행하였다.
<147>
<148> 대상 시료는 3가지 경우로 나누어 각각 시험하였다. 첫째로, Hor i zon사의
FFPE 조직에서 추출한 DNA(exon 19 , delE746— A750( l) )과 Hor i zon사의 mutant genomi c DNA올 이용하였다.
<149>
<150> 첫 번째로 Miniclone에 gDNA를 spiking한 temp late를 이용하여 최소 돌연변 이 빈도를 측정한 결과， 코바스 EGFR 유전자 변이 검사의 최소 측정 결과는 0.5%에 서 5¾인 반면 본 발명의 방법에 의하는 경우 0.02%에서 0. 1¾에서도 검사가 가능함 을 확인하였으며, 특히 주목할 결과는 2239_2257>GT의 돌연변이 위치를 코바스 EGFR 유전자 변이 검사로는 측정할 수 없는 것이 본 발명의 방법에 의하는 경우 0.05%의 민감도를 보여 기허가된 코바스 EGFR 유전자 변이 검사의 방법과 대비해서 동등성 이상의 결과를 가짐을 확인하였다.
<151>
<152> 【표 5】
Figure imgf000020_0002
<153> ·
Figure imgf000020_0001
<i54> * ddPCR은 33ng gDNA(104 copies)를 template 로 사용함
4
<155> ** Cobas EGFR mutat ion k i t는 50ng( 1.5x10 (x>p i es )를 template 로 사용함
<156>
<i57> 두 번째로 Hor izon사의 FFPE 조직에서 추출한 DNA와 Horizon사의 mutant genomic DNA로 상관성 시험을 위해 민감도를 비교 분석한 결과， 코바스 EGFR 유전 자 변이 검사로 측정한 결과는 0.5%~5%값으로 측정되었으나 본 발명의 방법에 의하 는 경우 돌연변이 위치에 따라 최소 측정치가 0.02¾~0.5%값으로 측정되었다. 이는 기허가 제품비교분석에서 최소 10배 이상의 민감도를 나타냄을 보여주는 것이다.
<158>
【표 6】 ddPCR- ased UO lot J - Cobas C£ f Μ{Ά ' 석
Figure imgf000021_0001
* ddPCR은 33ng gDNA(10 copies)를 template 로 사용함
4 _
** Cobas EGFR mutat ion ki t는 50ng( 1.5x10 copies)-!- template 로 사용함 <실시예 5>
CTC분리 및 EGFR돌연변이의 측정
CTC는 암 환자로부터 수득한 혈액 샘플을 자기영동 (magnetophoresis) 방법 에 기반한 CTC 분리 장치에 의해서 수득하였다. 자기영동에 의한 CTC 분리방법에 대한 개념도는 도 3과 같다. CTC의 분리방법을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
CTC 분리를 위하여 제조한 마이크로플루이딕스 칩 (microf luidics chip)을 혈액과 버퍼가 주입가능한 CTC 분리 장치에 설치하였다. 버퍼를 가운데 채널로 흘 려주면서 혈액을 양쪽 끝의 주입구를 통해 홀려주었다. 혈액에는 미리 CTC에 특이 적으로 결합하도록 자성물질이 부착된 항체 (EpCam ant ibody)를 첨가하여 CTC에만 특이적으로 자성을 나타내도톡 하였습니다. 마이크로플루이딕스 칩에 미리 설치된 강자성체는 CTC 분리 장치에 설치된 영구자석에 의해서 자화되고, 자화된 강자성체 에서 형성된 자기력에 의해서 CTC 세포가 중앙부의 CTC 분리 채널쪽으로 이동하게 된다. 혈액의 흐름이 끝나면 CTC 분리 채널 쪽에 모여진 CTC를 이후의 실험을 위하 여 사용하였다. 인간 CTC 세포에서 분리된 DNA에서 EGFR 유전자의 돌연변이를 측정하였다. 분리한 CTC에서 DNA를 분리하고， 이를 본 발명의 프라이머 /프로브를 이용하며' 본 발명의 방법에 따라 돌연변이를 확인하였다.
<172>
<173> 그 결과， 도 4에서 보듯이 P5 , P44 프로브의 경우와 같이 돌연변이가 존재하 여 PCR 산물이 증폭된 작은 방울 들이 검출되었고， 이를 통해 CTC에서도 EGFR 돌연 변이 검출을 통해서 치료반웅성의 예측이 가능함을 알 수 있었다.
<174>
【산업상 이용가능성】
<175> 이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 시스템은 자동화된 과정으로 암 환자 예후의 치 료제에 대한 반웅성 예측， 진단이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비 롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적으로 유용하게 사용할 수 있 다.

Claims

<Π6> 【청구의 범위】
【청구항 1】
서열번호 1의 정방향 프라이머， 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 9 내지 13으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트， 서열번호 3의 정방향 프라이머， 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 14 내지 42으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트， 서열번호 5의 정방향 프 라이머， 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 43 내지 50으로 이루어진 군에 서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트， 서열번호 7의 정방향 프라이머， 서열 번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 51 내지 54으로 이루어진 군에서 선택된 프 로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 상기 EGFR 유전자 돌연변이 검출은 EGFR 저해제에 대한 치 료 반웅성 (responsiveness) 예측올 위한 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로 브 세트 조성물.
【청구항 3】
제 2항에 있어서， 상기 EGFR 저해제는 엘로티닙 (er lot inib) 또는 제피티닙 (gef it inib)인 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
【청구항 4】
제 1항에 있어서， 상가프로브는 형광물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 하 는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
【청구항 5】
제 4항에 있어서， 상기 형광물질은 VIX, HEX, FAM, EverGreen dye로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성 물
【청구항 6】
제 1항의 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 유효성분으로 포함하는 EGFR 유 전자 돌연변이 검출용 키트.
【청구항 7]
제 6항에 있어서, 상기 키트는 RUO (research use only) 또는 IVD ( invest igat ion use only) 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 8】
서열번호 1의 정방향 프라이머， 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 10 내지 13으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성 분으로 포함하는 EGFR유전자 돌연변이 검출용 RU0 키트.
【청구항 9】
서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호
14， 15, 20， 21 , 26, 27, 28， 31， 33, 34로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리 뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 RU0 키 트ᅳ
【청구항 10】
서열번호 3의 정방향 프라이머， 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 14， 16， 17, 18， 19， 22， 23， 24, 25， 29, 30, 32, 35, 36, 37， 38, 39， 40' 41 , 42로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포 함하는 EGFR유전자 돌연변이 검출용 RU0 키트.
【청구항 11】
서열번호 5의 정방향 프라이머， 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 43 내지 50으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성 분으로 포함하는 EGFR유전자 돌연변이 검출용 RU0 키트.
【청구항 12】
서열번호 7의 정방향 프라이머， 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 51 내지 54로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분 으로 포함하는 EGFR유전자 돌연변이 검출용 RU0 키트.
【청구항 13]
제 6항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 키트는 qPCR
(quantitative PCR) 또는 digital PCR 방법에 사용되는 것임을 특징으로 하는 키 트
【청구항 14]
제 6항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 키트는 FFPE (formalin fixed parafin embedded) 조직에서 분리된 DNA 또는 cDNA를 주형으로 하는 것을 특 징으로ᅳ하는 키트.
【청구항 15】
제 6항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 혈액에서 분리된 CTC (circulating tumor cell)에서 분리된 DNA또는 cDNA를 주형으로 하는 것을 특 징으로 하는 키트.
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