CN116536419A - 检测alk基因融合的引物、探针及其试剂盒 - Google Patents
检测alk基因融合的引物、探针及其试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116536419A CN116536419A CN202211359611.6A CN202211359611A CN116536419A CN 116536419 A CN116536419 A CN 116536419A CN 202211359611 A CN202211359611 A CN 202211359611A CN 116536419 A CN116536419 A CN 116536419A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alk
- alk gene
- primer
- seq
- detection probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 150
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 96
- 101150023956 ALK gene Proteins 0.000 title claims abstract description 87
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 120
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 claims abstract description 66
- 101000779641 Homo sapiens ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 54
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 29
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 19
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 19
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 18
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 claims description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 10
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 208000007276 esophageal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 5
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 4
- 201000003803 Inflammatory myofibroblastic tumor Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 claims description 4
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000036765 Squamous cell carcinoma of the esophagus Diseases 0.000 claims description 4
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 claims description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 4
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GLYMPHUVMRFTFV-QLFBSQMISA-N 6-amino-5-[(1r)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl)ethoxy]-n-[4-[(3r,5s)-3,5-dimethylpiperazine-1-carbonyl]phenyl]pyridazine-3-carboxamide Chemical compound O([C@H](C)C=1C(=C(F)C=CC=1Cl)Cl)C(C(=NN=1)N)=CC=1C(=O)NC(C=C1)=CC=C1C(=O)N1C[C@H](C)N[C@H](C)C1 GLYMPHUVMRFTFV-QLFBSQMISA-N 0.000 claims description 3
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims description 3
- 206010067917 Inflammatory myofibroblastic tumour Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002146 L01XE16 - Crizotinib Substances 0.000 claims description 3
- 206010061534 Oesophageal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 3
- 229960001602 ceritinib Drugs 0.000 claims description 3
- VERWOWGGCGHDQE-UHFFFAOYSA-N ceritinib Chemical compound CC=1C=C(NC=2N=C(NC=3C(=CC=CC=3)S(=O)(=O)C(C)C)C(Cl)=CN=2)C(OC(C)C)=CC=1C1CCNCC1 VERWOWGGCGHDQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960005061 crizotinib Drugs 0.000 claims description 3
- KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N crizotinib Chemical compound O([C@H](C)C=1C(=C(F)C=CC=1Cl)Cl)C(C(=NC=1)N)=CC=1C(=C1)C=NN1C1CCNCC1 KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N 0.000 claims description 3
- 229950004126 ensartinib Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims description 2
- 208000005228 Pericardial Effusion Diseases 0.000 claims description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003088 loratadine Drugs 0.000 claims description 2
- JCCNYMKQOSZNPW-UHFFFAOYSA-N loratadine Chemical compound C1CN(C(=O)OCC)CCC1=C1C2=NC=CC=C2CCC2=CC(Cl)=CC=C21 JCCNYMKQOSZNPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 abstract description 26
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 102100021699 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Human genes 0.000 description 9
- 101000896557 Homo sapiens Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Proteins 0.000 description 9
- 101000988834 Homo sapiens Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 9
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 9
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 7
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 7
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 241000270617 Cheloniidae Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 3
- 101710168331 ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 2
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 208000000058 Anaplasia Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101000605496 Homo sapiens Kinesin light chain 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001050559 Homo sapiens Kinesin-1 heavy chain Proteins 0.000 description 1
- 101000800847 Homo sapiens Protein TFG Proteins 0.000 description 1
- 101000648196 Homo sapiens Striatin Proteins 0.000 description 1
- 101001135565 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102100038306 Kinesin light chain 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100023422 Kinesin-1 heavy chain Human genes 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 101150104466 NOCT gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000012515 Protein kinase domains Human genes 0.000 description 1
- 108050002122 Protein kinase domains Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100028898 Striatin Human genes 0.000 description 1
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 241000270666 Testudines Species 0.000 description 1
- 102100033131 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 3 Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 108091023290 ctRNA Proteins 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000005861 gene abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本公开涉及一种检测ALK基因融合的引物、探针及其试剂盒,具体涉及利用数字PCR仪单管检测待测样本中ALK基因5’端和3’端的表达量差异评估ALK基因融合情况。采用本公开的方法,可以检测所有的ALK融合亚型,一步完成逆转录PCR反应,减少操作过程中的样本损耗与污染风险,对微量样本的检测具有优势,且具有较高的特异性和灵敏性。
Description
技术领域
本公开属于生物基因检测领域,具体涉及一种检测样本中ALK基因融合的方法,特别是通过检测待测样本ALK基因5’端和3’端的表达量差异,评估ALK基因融合情况。
背景技术
间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic Lymphoma Kinase,ALK)基因位于2号染色体p23.2-p23.1的位置,编码1620个氨基酸,在机体内经过翻译后修饰生成200~220kDa的成熟ALK蛋白。ALK蛋白为一种受体酪氨酸激酶,是受体酪氨酸激酶胰岛素家族的成员。该蛋白在细胞内可以激活多个信号通路,包括PLCγ,JAK-STAT、PI3K-AKT、mTOR及MAPK等,从而广泛参与调节细胞生长、转化及抑制细胞凋亡等的生物过程。正常的ALK主要表达于神经系统中,在神经系统的发育和功能中扮演重要角色,此外,在小肠、睾丸、前列腺及结肠中也有少量表达,但在正常淋巴组织、肺组织及其他组织中不表达。ALK是重要的肿瘤相关基因,在许多恶性肿瘤中发现ALK基因的异常表达,其中ALK基因异常引起的细胞过度增殖和凋亡下调是其主要的致瘤原因,特别是ALK基因融合被认为是非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)中第二常见的驱动基因,中国非小细胞肺腺癌中ALK融合突变阳性的比例为5.3%。
ALK基因融合是指ALK发生断裂并与其他基因融合,翻译后ALK融合蛋白构象改变,影响自身磷酸化,过度激活下游通路,细胞增殖水平提高,从而导致肿瘤的发生。ALK融合后的致瘤活性是由其融合伴侣决定的,ALK融合伴侣介导的ALK融合可不依赖其配体形成二聚体并使蛋白激酶域活化。首个ALK融合蛋白NPM1-ALK于1994年在间变性大细胞淋巴瘤(anaplasticlarge-celllymphoma,ALCL)细胞系中发现。此后,在多种恶性肿瘤中发现了多种类型的ALK融合蛋白。目前已报道的ALK基因融合相关的实体肿瘤主要有炎性成肌纤维母细胞瘤(inflammatory myofibroblastic tumors,IMT)、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌(breastcancer,BC)、直结肠癌(colorectal cancer,CRC)、食管鳞状上皮细胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)、肾细胞癌(renalcell cancer,RCC)、卵巢癌(ovarian cancer,OC)等。目前已发现21种EML4-ALK的融合形式,另外ALK还可能与TFG、KIF5B、KLC1、PTPN3、STRN等基因发生融合。
目前国内已上市了针对ALK基因融合突变的靶向药ALK-TKI,包括克唑替尼、塞瑞替尼、阿来替尼、布加替尼、恩沙替尼、劳拉替尼等在内的多种ALK抑制剂。因此,针对靶向药用药前的伴随检测,需要提供一种灵敏度高、准确性高、步骤简单、成本较低的ALK基因融合的检测体系,在相关癌症的诊疗应用中具有重要意义。
目前临床常用的四种方ALK检测方法包括荧光原位杂交(fluorescencein situhybridization,FISH)、免疫组化(immunohistochemistry,IHC)、RT-PCR以及高通量测序。
IHC是指通过抗原和抗体的结合反应,配合信号级联放大来检测。罗氏公司的Ventana IHC试剂盒可达到FISH检测结果94%-100%的一致率。欧盟和中国都已批准Ventana IHC用于检测ALK重排。此项检测目标为ALK蛋白表达,由于肿瘤异质性,靶蛋白表达强度不一。同时,ALK蛋白表达量增高原因除了ALK融合,还可能来自肿瘤细胞的异常表达,因此可能出现假阳性。IHC的判读也存在一定主观性,弱阳性结果需要使用其他方法进行验证。
FISH是指通过设计两个探针,分别标记在ALK基因两端。当ALK基因出现重排或者倒转,两个探针信号出现分离。此类方法技术成本高,检测周期长,不宜判读。对于特定融合类型,当配体基因与ALK在染色体上位置距离较近时,可能会导致假阴性结果。
高通量测序法使用二代测序技术检测基因重排,有利于发现ALK新的突变融合形式,仅需少量样本即可检测多种基因的突变情况,但存在检测价格高的缺点。
现有的RT-PCR法针对已报道的ALK融合类型设计引物探针检测,简便可行,检测周期短。但只能覆盖已知的ALK融合亚型,无法囊括所有的融合类型。
此外,目前还有将FISH的设计思路应用于RT-PCR法的数字PCR检测体系,但操作流程中可能存在样本损耗,不适用于低拷贝样本(如循环肿瘤细胞、ctRNA)的检测。同时该检测体系采用双通道探针分两管检测的设计,仅适用于样本量高的组织样本,当检测目标为血液样本时,往往会出现样本量不足以满足分管检测要求的情况。
因此,需要提供一种步骤简单、不损耗样本、成本较低、准确性高、适用于低拷贝样本的检测ALK基因融合的反应体系,在癌症的诊疗应用中具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本公开的目的在于提供一种新的检测ALK基因融合变异的试剂盒,一步完成逆转录与检测反应,减少操作过程中的样本损耗与污染风险,对微量样本的检测具有优势。
为了实现上述目的,本公开采用以下具体方案:
在一方面,本公开提供了一种检测ALK基因融合的试剂盒,其包括引物和探针,其中,所述引物包括5’端扩增引物和3’端扩增引物,所述5’端扩增引物包括SEQ ID NO.1所示的ALK基因5’端上游引物和SEQ ID NO.2所示的ALK基因5’端下游引物;所述3’端扩增引物包括SEQ ID NO.7所示的ALK基因3’端上游引物和SEQ ID NO.8所示的ALK基因3’端下游引物;所述探针包括5’端检测探针和3’端检测探针,所述5’端检测探针包括SEQ ID NO.13所示的ALK基因5’端检测探针,所述3’端检测探针包括SEQ ID NO.14所示的ALK基因3’端检测探针。
在另一方面,本公开提供了一种利用前述试剂盒检测样本中ALK基因融合的方法,其包括如下特征:
(1)从待测样本中获取RNA;
(2)将待测样本步骤(1)获取的RNA、上述用于检测ALK基因融合的引物、探针以及任选的内参混合;
(3)进行逆转录PCR反应;
(4)读取PCR扩增产物的荧光信号,根据荧光信号判定检测样本中ALK基因融合的情况。
在另一方面,本公开提供了一种利用前述试剂盒或方法在针对ALK融合基因突变的靶向药用药前的伴随基因检测中的应用。
本公开所取得的有益效果至少如下:
本公开以ALK基因mRNA的5’端和3’端序列为靶标,设计并筛选相应的引物和探针序列来检测待测样本中ALK 5’端和3’端表达量差异,有效评估ALK基因融合情况,得到了一种检测样本中ALK基因融合的方法及其试剂盒。主要具有以下优势:
(1)本公开提供ALK基因融合变异的数字PCR扩增引物与检测探针,具有较高的特异性和灵敏性;
(2)本公开通过定量检测细胞中ALK基因5’和3’表达量差异,对样本的ALK融合情况进行评估,检测可以覆盖所有ALK融合亚型;
(3)本公开提供ALK基因融合变异的数字PCR检测体系,可以单管内一步完成逆转录与检测反应,减少操作中的样本损耗与污染风险,提高样本利用率,同时采用两阶段扩增程序,对微量模板的检测具有优势;
(4)本公开提供的扩增体系操作简单,检测所需时间短,方便操作,结果直观,便于分析。
附图说明
图1:5’端引物E1E3-1-FP/RP的扩增和熔解曲线。
图2:5’端引物E1E3-2-FP/RP的扩增和熔解曲线。
图3:5’端引物E5E7-FP/RP的扩增和熔解曲线。
图4:3’端引物E25E27-FP/RP的扩增和熔解曲线。
图5:3’端引物E26E28-FP/RP的扩增和熔解曲线。
图6:3’端引物E24E26-FP/RP的扩增和熔解曲线。
图7:内参引物的扩增曲线。
图8:阴性样本ALK融合基因检测的数字PCR结果图谱。
图9:阳性样本ALK融合基因检测的数字PCR结果图谱。
图10:微量肿瘤细胞悬液阴性样本ALK融合基因检测的数字PCR结果图谱。
图11:微量肿瘤细胞悬液阳性样本ALK融合基因检测的数字PCR结果图谱。
图12:ALK阳性病人CTC样本的数字PCR结果图谱。
具体实施方式
本公开下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学生物试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本公开所使用的所有的技术和科学术语与属于本公开的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本公开的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不用于限制本公开。
本公开的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形,意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块,而是可选地还包括没有列出的步骤,或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本公开中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”,描述关联对象的关联关系,表示可以存在三种关系,例如,A和/或B,可以表示:单独存在A,同时存在A和B,单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。同时,为了更好地理解本公开,下面提供相关术语地定义和解释。
在本公开中使用的术语“基因融合”是指两个或两个以上基因的部分或全部的序列构成一个新的杂合基因的过程。
在本公开中使用的术语“逆转录PCR反应”即逆转录聚合酶链式反应,是指先将RNA通过逆转录酶的作用合成cDNA,再以该cDNA作模板进行聚合酶链反应扩增特定DNA序列的方法。
在本公开中使用的术语“锁核酸”是Locked nucleic acid(LNA),指一种人工合成的反义寡核苷酸,其中核苷酸残基的核糖环的2’-氧和4’-碳通过亚甲基连接,与靶核酸分子具有强的杂交能力,不易被酶降解。
在本公开中使用的术语“ALK-TIK”是指间变淋巴瘤激酶/酪氨酸激酶抑制剂(anaplasticlymphomakinase/tyrosinekinaseinhibitor,ALK-TKI),为针对ALK基因融合突变的一类靶向药。
在一方面,本公开提供了一种单管检测样本中ALK基因融合的试剂盒,其包括引物和探针,其中,所述引物包括5’端扩增引物和3’端扩增引物,所述5’端扩增引物包括SEQ IDNO.1所示的ALK基因5’端上游引物和SEQ ID NO.2所示的ALK基因5’端下游引物;所述3’端扩增引物包括SEQ ID NO.7所示的ALK基因3’端上游引物和SEQ ID NO.8所示的ALK基因3’端下游引物;所述探针
包括5’端检测探针和3’端检测探针,所述5’端检测探针包括SEQ ID NO.13所示的ALK基因5’端检测探针,所述3’端检测探针包括SEQ ID NO.14所示的ALK基因3’端检测探针。
在本公开的一些实施方案中,所述试剂盒还包括内参,包括内参检测探针、内参上游引物和内参下游引物。
在本公开的一些实施方案中,所述内参检测探针包括SEQ ID NO.15所示的内参检测探针。
在本公开的一些实施方案中,所述内参上游引物包括SEQ ID NO.16所示的内参上游引物。
在本公开的一些实施方案中,所述内参下游引物包括SEQ ID NO.17所示的内参下游引物。
在本公开的一些实施方案中,所述5’端检测探针、3’端检测探针和内参检测探针具有修饰。
在本公开的一些实施方案中,所述修饰选自锁核酸修饰、肽核酸修饰或MGB修饰的一种或多种;优选地,所述修饰为锁核酸修饰。
在本公开的一些实施方案中,SEQ ID NO.13所示的ALK基因5’端检测探针的第9位和第10位核苷酸带有锁核酸修饰。
在本公开的一些实施方案中,SEQ ID NO.14所示的ALK基因3’端检测探针的第12位和第13位核苷酸带有锁核酸修饰。
在本公开的一些实施方案中,SEQ ID NO.15所示的内参检测探针的第11位核苷酸带有锁核酸修饰。
在本公开的一些实施方案中,所述的ALK基因5’端和3’端的上、下游引物和/或探针的部分序列分别位于待扩增靶标区域的两端,其中ALK基因5’端的上、下游引物和/或探针序列位于ALK基因1-3号外显子的两端、ALK基因3’端的上、下游引物和/或探针序列位于24-26号外显子的两端。
在本公开的一些实施方案中,所述ALK基因5’和3’端检测探针的5’端修饰有荧光基团和/或3’端修饰有淬灭基团。
在本公开的一些实施方案中,所述荧光基团选自以下中的一种:FITC、TET、JOE、R110、FAM、CY-5、HEX或CY-3。
在本公开的一些实施方案中,所述荧光基团为FAM、HEX或CY-5。
在本公开的一些实施方案中,所述淬灭基团选自以下的一种:TAMRA、BHQ-2、Dabcyl或MGB。
在本公开的一些实施方案中,所述淬灭基团为MGB或BHQ-2。
在另一方面,本公开提供了一种利用前述试剂盒检测样本中ALK基因融合的方法,其包括如下特征:
(1)从待测样本中获取RNA;
(2)将待测样本步骤(1)获取的RNA、上述用于检测ALK基因融合的引物、探针以及任选的内参混合;
(3)进行逆转录PCR反应;
(4)读取PCR扩增产物的荧光信号,根据荧光信号判定检测样本中ALK基因融合的情况。
在本公开的一些实施方案中,所述待测样本选自循环肿瘤细胞、血液、血浆、外泌体溶液、胸腔积液、腹腔积液、唾液、尿液、组织中的一种或多种。在一个优选的实施方案中,所述血液是外周血。
在本公开的一些实施方案中,所述循环肿瘤细胞获取自血液、胸腔积液、腹腔积液、唾液、尿液、脑脊液和/或心包积液中的一种或多种。
在本公开的一些实施方案中,所述循环肿瘤细胞为炎性成肌纤维母细胞瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、直结肠癌、食管鳞状上皮细胞癌、、肾细胞癌和/或卵巢癌中的一种或多种;优选地,所述循环肿瘤细胞为非小细胞肺癌细胞。
在本公开的一些实施方案中,所述循环肿瘤细胞为人的肿瘤细胞。
在本公开的一些实施方案中,所述PCR反应的条件为:50℃逆转录,15分钟;95℃热启动,5分钟;95℃变性,20秒;57℃退火,30秒;72℃延伸,30秒;扩增15个循环;95℃变性,20秒;60℃延伸,60秒;扩增40个循环,反应结束;
在另一方面,本公开提供了一种利用前述试剂盒或方法在针对ALK融合基因突变的靶向药用药前的伴随基因检测中的应用。
在本公开的一些实施方案中,所述的靶向药为ALK-TKI。
在本公开的一些实施方案中,所述的靶向药选自以下的一种或多种:克唑替尼、塞瑞替尼、阿来替尼、布加替尼、恩沙替尼和/或劳拉替尼。
采用本公开的检测试剂盒和方法,可以检测所有的ALK融合亚型,一步完成逆转录PCR反应,减少操作过程中的样本损耗与污染风险,对微量样本的检测具有优势,且具有较高的特异性和灵敏性。
为了达到清楚和简洁描述的目的,本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征,然而,将要理解的是,本公开的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。
实施例
下面通过具体实施的方式来进一步说明本公开的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本公开,不应视为对本公开的具体限制。
实施例1:单管检测ALK基因融合的反应体系的筛选与建立
1.引物的设计与筛选
本实施例中,用于检测ALK基因融合的引物由NCBI Blast设计完成,具体引物信息见表1,引物长度在18-25个核苷酸之间,引物的GC含量在40%-60%之间,引物的Tm值在55℃~65℃范围内。各引物的Tm值大致接近,以确保引物对能在同一退火温度下高效扩增。设计完成后将各引物用NCBI Blast软件进行比对,确保各引物特异性。引物的扩增产物大小在100-200bp范围内。使用荧光PCR(染料法),利用ALK融合阳性RNA片段筛选适合用于ALK基因融合检测的3’、5’端的扩增引物,针对目的基因片段进行PCR反应,选取扩增效率高且无特异性扩增的引物。
表1引物信息表
1.1实验步骤
(1)提取人非小细胞肺癌细胞系NCI-H2228和人肺癌细胞系Calu-1(的RNA,分别作为ALK基因融合阳性和ALK基因融合阴性的模板基因。
(2)将步骤(1)获得的RNA和无酶水分别按照下述体系及反应条件进行加样反应,扩增引物E1E3-1-FP、E1E3-1-RP、E1E3-2-FP、E1E3-2-RP、E5E7-FP、E5E7-RP在ALK融合阳性模板基因、ALK融合阴性模板基因以及无模板对照(无酶水)5’端的扩增表达情况并记录Ct值;扩增引物E24E26-FP、E24E26-RP、E25E27-FP、E25E27-RP、E26E28-FP、E26E28-RP在ALK融合阳性模板基因、ALK融合阴性模板基因以及无模板对照(无酶水)3’端的扩增表达情况并记录Ct值。
加样体系见表2。
表2加样体系
试剂 | 体积(μL) | 浓度 |
2x Fast Direct RT Premix Buffer II(dUTP) | 25 | 1× |
10X Fast Direct Rtase/UNG mix II | 5 | 1× |
FP | 1 | 200nM |
RP | 1 | 200nM |
Evagreen | 0.5 | 100nM |
无酶水 | 补足 | 补足 |
模板 | 5~14 | -- |
共计 | 50 | -- |
反应条件见表3。
表3反应条件
1.2实验结果
引物表达情况及平均Ct值结果见表4,具体扩增和熔解曲线结果见图1-6。
表4引物表达情况及平均Ct值
注:“NoCt”表示样本未扩增
由表4和图1-6可见,5’端的三对引物中,E5E7-FP/RP在Calu-1 RNA的反应体系中无扩增,故不可用。E1E3-1-FP/RP相较于E1E3-2-FP/RP的Ct值更小,扩增效率更高,因此选择E1E3-1-FP/RP作为5’扩增引物。E1E3-1-FP的序列为CAGATCTTCGGGACTGGTCAT(SEQ IDNO.1),E1E3-1-RP的序列为GAATACTCCAGCTCACAGGGG(SEQ ID NO.2)。
3’端点的三对引物均能正常扩增目的产物,无模板对照无非特异扩增及二聚体,其中E24E26-FP/RP相较于其他两组来说,Ct值更小,扩增效率更高,因此选择E24E26-FP/RP作为3’端的扩增引物,其中,E24E26-FP的序列为GCCTGTGGCTGTCAGTATTTG(SEQ ID NO.7),E24E26-RP的序列为ATAGTAGCTCGCCCTGTAGA(SEQ ID NO.8)。
2.探针的设计
用于检测ALK基因融合的特异性探针,在3’末端均经过修饰以阻断探针在扩增过程中延伸,同时3’末端修饰MGB非荧光淬灭基团;探针5’端修饰有FAM,HEX,CY-5荧光基团中的一种,用于检测不同扩增子的扩增情况。
各探针序列见表5,其中“+”表示左侧碱基带有锁核酸修饰。
表5探针信息
3.内参的设计与筛选
使用荧光PCR(染料法),筛选适合用于ALK基因融合检测的能够稳定扩增无非特异性产物及二聚体、在白细胞内表达水平相对较低的内参引物。具体待筛选内参信息见表6。
表6待筛选内参信息
内参引物 | 序列 | SEQ ID NO |
HPRT1 FP | CAAAGATGGTCAAGGTCGCA | SEQ ID NO.16 |
HPRT1 RP | TCAAATCCAACAAAGTCTGGC | SEQ ID NO.17 |
ACTB FP | CCTCGCCTTTGCCGATCC | SEQ ID NO.18 |
ACTB RP | CGCGGCGATATCATCATCC | SEQ ID NO.19 |
GAPDH FP | TCGGAGTCAACGGATTTGGT | SEQ ID NO.20 |
GAPDH RP | TGAAGGGGTCATTGATGGCA | SEQ ID NO.21 |
3.1实验步骤
(1)采集新鲜全血,使用红细胞裂解液消化红细胞后离心,分离出全血中的白细胞。对采集到的白细胞,使用PBS清洗稀释并计数,取5000个白细胞/份作为内参筛选的样本。
(2)将步骤(1)获得的白细胞样本按照下述体系及反应条件进行加样反应,扩增引物HPRT1 FP,HPRT1 RP,ACTB FP,ACTB RP,GAPDH FP,GAPDH RP在白细胞中表达情况并记录Ct值。
加样体系见表7。
表7加样体系
试剂 | 体积(μL) | 浓度 |
2x Fast Direct RT Premix Buffer II(dUTP) | 12.5 | 1× |
10X Fast Direct Rtase/UNG mix II | 2.5 | 1× |
FP | 1 | 10μM |
RP | 1 | 10μM |
Evagreen | 2.5 | 2× |
无酶水 | 补足 | 补足 |
模板 | 4 | -- |
共计 | 25 | -- |
反应条件如下:50℃逆转录,15分钟;95℃热启动,5分钟;95℃变性,20秒;60℃延伸,60秒;扩增50个循环,反应结束。
3.2实验结果
内参引物在白细胞内的具体扩增曲线结果见图7。由图7可见,HPRT1的Ct值远高于ACTB与GAPDH,说明HPRT1的表达量远低于其他两种内参,考虑到单管qPCR反应中内参表达量太高会使底物与酶耗尽,因此选择HPRT1作为内参使用,其中HPRT1 FP的序列为CAAAGATGGTCAAGGTCGCA(SEQ ID NO.16),HPRT1 RP的序列为TCAAATCCAACAAAGTCTGGC(SEQID NO.17)。
4.检测系统建立
将上述设计的引物探针稀释到10μM,并根据表9的比例配置PCR反应体系,混匀在一个管内。
表8反应条件
使用上海小海龟科技有限公司数字PCR系统biodigital·青进行单管qPCR反应,系统为4~5路荧光通道,可并行处理96个样本,芯片有效液滴数为2万~20万个。将混成单管的PCR反应体系置于数字PCR系统中进行全自动微液滴制备,待微液滴体系完成则可进行下一步PCR反应。将微液滴体系置于PCR仪上进行扩增反应,扩增条件参数如表9。
表9扩增反应条件
将扩增产物置于数字PCR仪器内进行荧光信号读取,分析检测样本中ALK基因融合的情况,根据样本FAM通道和HEX通道拷贝数比值来给出判定结果,当样本HEX通道拷贝数为0时,FAM拷贝数大于5copies/μL时为定义为ALK基因融合阳性;当样本HEX通道拷贝数>0,FAM/HEX通道拷贝数比值大于10定义为ALK基因融合阳性,低于10定义为ALK基因融合阴性。
在ALK基因融合的检测体系的测试中,本公开使用了阳性病人CTC模拟样本进行测试,选取ALK融合变异阳性细胞系NCI-H2228和健康人全血白细胞制备得到阳性病人CTC模拟样本,选取人全血白细胞制备得到阴性样本,对其中的游离细胞进行ALK融合变异的检测,具体操作步骤如下:
1)新鲜分离人全血白细胞,用细胞计数器进行细胞计数,使用ddH2O稀释至1000个/μl,其中阴性样本选取5000个人全血白细胞待用,阳性样本选取10个NCI-H2228细胞,以1:500的比例加入阴性样本中待用。
2)不对样本进行前处理,直接按照数字PCR反应体系配制扩增体系,其中样本选取5μL的体积,阴性、阳性样本分别混匀在两个管内,具体的反应体系内容物参见表8。
3)使用上海小海龟科技有限公司数字PCR系统biodigital·青进行qPCR反应,将反应体系置于数字PCR系统中进行全自动微液滴制备,待微液滴体系完成则可进行下一步PCR反应。将微液滴体系置于PCR仪上进行扩增反应,扩增条件参数如下:50℃逆转录,15分钟;95℃热启动,5分钟;95℃变性,20秒;57℃退火,30秒;72℃延伸,30秒;扩增15个循环;95℃变性,20秒;60℃延伸,60秒;扩增40个循环,反应结束。
4)将扩增产物置于数字PCR仪器内进行荧光信号读取,分析得到检测样本中ALK基因融合的情况,具体的样本检测结果见表10,数字PCR结果图谱见图8和图9。
图8示出了健康人全血白细胞样本的检测结果为ALK无基因融合变异,其中FAM检测信号copies为0copies/μL,FAM/HEX通道阳性点数为0/0(参见表10),判定为ALK融合阴性。
图9示出了阳性病人CTC模拟样本的检测结果为ALK发生基因融合变异,其中FAM检测信号copies为23.764copies/μL,FAM/HEX通道拷贝数为23.764/0,判定为ALK融合阳性。
表10样本检测结果
5.灵敏度测试
对检测体系的灵敏度进行测试分析,细胞样本的具体实验过程如下:
将阳性样本细胞分别按1:62.5、1:125、1:250、1:500、1:1000的梯度比例加入阴性样本中。制备好的灵敏度测试细胞样品浓度为1000细胞/μL,样本体积为5μL,加入反应体系的阳性细胞/背景细胞分别为80/5000,40/5000,20/5000,10/5000,5/5000。使用上述检测体系进行实验,分析结果如表11所示,可以看到,本检测体系的灵敏度可以在5000个背景细胞下检测到10个阳性细胞。
表11细胞样本灵敏度测试分析结果
此外,对RNA样本的检测灵敏度同样进行测试,具体实验过程如下:
准备阴性样本:HEK-293细胞系提取RNA,稀释至6ng/μL;阳性样本:NCI-H2228细胞系提取RNA,稀释至6ng/μL。将阳性RNA与阴性RNA分别按1:25、1:50、1:100、1:250、1:500的比例混合。制备好的灵敏度测试RNA样本浓度为6ng/μL,样本体积为5μL,共30ng。使用上述检测体系进行实验,分析结果如表12所示,可以看到,本检测体系的灵敏度可以在15μgtotal RNA中检出30ng的阳性样本。
表12RNA样本灵敏度测试分析结果
综上所述,本公开使用的ALK基因融合检测体系,可以在5000个白细胞背景下的检测出10个融合阳性细胞,可以在15μg total RNA中检出30ng的阳性样本,具有较高的特异性和灵敏性,同时检测可以覆盖所有的ALK融合亚型。此外,发明人发现对于血浆RNA样本,本检测体系可以在1mL血浆中检出30阳性拷贝,组织样本经提取后,可在30ngtotalRNA中检出30阳性拷贝。该检测体系操作简单,检测时间短,相较于FISH最短需要1天,IHC约4~5小时,二代测序建库到上机2~3天的检测周期,本公开的检测体系只需2~3小时。
实施例2:微量肿瘤细胞悬液样本的检测
选取ALK融合变异阳性细胞系NCI-H2228和ALK融合变异阴性细胞系NCI-H1975制备细胞悬液,采用本公开的检测体系,对其中的游离细胞进行ALK融合变异的检测,具体操作步骤如下:
1.消化细胞并制成细胞悬液,用细胞计数器进行细胞计数,使用ddH2O分别将两种细胞稀释至1000个/μL,其中阴性样本选取5000个NCI-H1975待用,阳性样本选取10个NCI-H2228细胞,以1:500的比例加入阴性样本中待用。
2.不对样本进行前处理,直接按照数字PCR反应体系配制扩增体系,其中样本选取5μL的体积,阴性、阳性样本分别混匀在两个管内,具体的反应体系内容物参见表8。
3.使用上海小海龟科技有限公司数字PCR系统biodigital·青进行qPCR反应,将反应体系置于数字PCR系统中进行全自动微液滴制备,待微液滴体系完成则可进行下一步PCR反应。将微液滴体系置于PCR仪上进行扩增反应,扩增条件参数如下:50℃逆转录,15分钟;95℃热启动,5分钟;95℃变性,20秒;57℃退火,30秒;72℃延伸,30秒;扩增15个循环;95℃变性,20秒;60℃延伸,60秒;扩增40个循环,反应结束。
4.将扩增产物置于数字PCR仪器内进行荧光信号读取,分析得到检测样本中ALK基因融合的情况,具体的样本检测结果见表13,数字PCR结果图谱见图10和图11。
图10示出了微量NCI-H1975肿瘤细胞悬液样本的检测结果为ALK无基因融合变异,其中FAM检测信号copies为0copies/μL,FAM/HEX通道阳性点数为0/0(参见表11),判定为ALK融合阴性。
图11示出了微量NCI-H2228肿瘤细胞和NCI-H1975肿瘤细胞混合悬液样本的检测结果为ALK发生基因融合变异,其中FAM检测信号copies为9.684copies/μL,FAM/HEX通道拷贝数比值为9.684/0,判定为ALK融合阳性。
表13样本检测结果
实施例3:ALK阳性病人CTC样本的检测
采集ALK阳性病人全血样本,富集分离得到CTC,采用本公开的检测体系,对其中的游离细胞进行ALK融合变异的检测,具体操作步骤如下:
1.采集ALK阳性病人全血样本,使用循环肿瘤细胞分离富集系统(Liquid Biopsy)对样本进行富集,洗脱芯片中捕获的细胞,加水至8μL溶解后待用。
2.按照数字PCR反应体系配制扩增体系,其中样本选取8μL的体积,选择单管反应,具体的反应体系内容物参见表8。
3.使用上海小海龟科技有限公司数字PCR系统biodigital·青进行qPCR反应,将反应体系置于数字PCR系统中进行全自动微液滴制备,待微液滴体系完成则可进行下一步PCR反应。将微液滴体系置于PCR仪上进行扩增反应,扩增条件参数如下:50℃逆转录,15分钟;95℃热启动,5分钟;95℃变性,20秒;57℃退火,30秒;72℃延伸,30秒;扩增15个循环;95℃变性,20秒;60℃延伸,60秒;扩增40个循环,反应结束。
4.将扩增产物置于数字PCR仪器内进行荧光信号读取,分析得到检测样本中ALK基因融合的情况,具体的样本检测结果见表14。
表14样本检测结果
实验结果见图12,ALK阳性病人全血样本的检测结果为ALK发生基因融合变异,其中FAM检测信号copies为24.438copies/μL,FAM/HEX通道拷贝数为24.438/0,判定为ALK融合阳性,结果与实际相符。
对比例1:与FISH检测的对比
选取经NGS确认ALK基因融合突变的临床肺癌石蜡包埋组织样本和同源血液样本,其中包括20例ALK融合阴性样本,编号为N1-N20(同源的血液和组织样本为同一编号)。以及3例阳性样本,编号为P1-P3(同源的血液和组织样本为同一编号)。使用本公开的ALK融合检测体系,对病人血液样本进行检测,步骤参考本公开实施例3;同时使用武汉康录生物人类ALK基因融合检测探针(荧光原位杂交法)试剂盒(货号:FP-002)对其血液样本同源的组织样本进行ALK融合基因的对比检测。
检测结果如表15所示,本公开检测体系与荧光原位杂交法的检测阳性符合率为100%,阴性符合率为100%,验证了本公开单管检测ALK基因融合的反应体系的准确性,并且在检测耗时上仅需2~3小时,提高了检测效率。
表15检测结果
以上所述实施例仅表达了本公开的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本公开构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本公开的保护范围。因此,本公开专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种检测ALK基因融合的试剂盒,其包括引物和探针,其中,所述引物包括5’端扩增引物和3’端扩增引物,所述5’端扩增引物包括SEQ ID NO.1所示的ALK基因5’端上游引物和SEQ ID NO.2所示的ALK基因5’端下游引物;所述3’端扩增引物包括SEQ ID NO.7所示的ALK基因3’端上游引物和SEQ ID NO.8所示的ALK基因3’端下游引物;所述探针包括5’端检测探针和3’端检测探针,所述5’端检测探针包括SEQ ID NO.13所示的ALK基因5’端检测探针,所述3’端检测探针包括SEQ ID NO.14所示的ALK基因3’端检测探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还包括内参,所述内参包括内参检测探针、内参上游引物和内参下游引物;
优选地,所述内参检测探针包括SEQ ID NO.15所示的内参检测探针;
优选地,所述内参上游引物包括SEQ ID NO.16所示的内参上游引物;
优选地,所述内参下游引物包括SEQ ID NO.17所示的内参下游引物。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其中,所述5’端检测探针、3’端检测探针和内参检测探针具有修饰;
优选地,所述修饰选自锁核酸修饰、肽核酸或MGB修饰的一种或多种;更优选地,所述修饰为锁核酸修饰;
优选地,SEQ ID NO.13所示的ALK基因5’端检测探针的第9位和第10位核苷酸带有锁核酸修饰;
优选地,SEQ ID NO.14所示的ALK基因3’端检测探针的第12位和第13位核苷酸带有锁核酸修饰;
优选地,SEQ ID NO.15所示的内参检测探针的第11位核苷酸带有锁核酸修饰。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒,其中,所述的ALK基因5’端和3’端的上、下游引物和/或探针的部分序列分别位于待扩增靶标区域的两端,其中ALK基因5’端的上、下游引物和/或探针序列位于ALK基因1-3号外显子的两端、ALK基因3’端的上、下游引物和/或探针序列位于24-26号外显子的两端。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒,其中,所述的ALK基因5’和3’端检测探针的5’端修饰有荧光基团和/或3’端修饰有淬灭基团;
优选地,所述荧光基团选自以下中的一种:FITC、TET、JOE、R110、FAM、CY-5、HEX或CY-3;
优选地,所述淬灭基团选自以下的一种:TAMRA、BHQ-2、Dabcyl或MGB。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒检测样本中ALK基因融合的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)从待测样本中获取RNA;
(2)将步骤(1)获取的RNA、权利要求1-5所述的用于检测ALK基因融合的引物、探针以及任选的内参混合;
(3)进行逆转录PCR反应;
(4)读取PCR扩增产物的荧光信号,根据荧光信号判定检测样本中ALK基因融合的情况。
7.根据权利要求6所述的方法,其中,所述待测样本选自循环肿瘤细胞、血液、血浆、外泌体溶液、胸腔积液、腹腔积液、唾液、尿液、组织中的一种或多种;优选地,所述血液是外周血。
8.根据权利要求7所述的方法,其中,所述循环肿瘤细胞获取自血液、胸腔积液、腹腔积液、唾液、尿液、脑脊液和/或心包积液中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的方法,其中,所述循环肿瘤细胞为炎性成肌纤维母细胞瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、直结肠癌、食管鳞状上皮细胞癌、肾细胞癌和/或卵巢癌中的一种或多种;优选为非小细胞肺癌细胞;
优选地,所述循环肿瘤细胞为人的肿瘤细胞。
10.根据权利要求1-5任一项所述试剂盒或权利要求6-9任一项所述方法在针对ALK融合基因突变的靶向药用药前的伴随基因检测中的应用;
优选地,所述的靶向药为ALK-TKI;
优选地,所述的靶向药选自以下的一种或多种:克唑替尼、塞瑞替尼、阿来替尼、布加替尼、恩沙替尼和/或劳拉替尼。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211359611.6A CN116536419A (zh) | 2022-10-31 | 2022-10-31 | 检测alk基因融合的引物、探针及其试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211359611.6A CN116536419A (zh) | 2022-10-31 | 2022-10-31 | 检测alk基因融合的引物、探针及其试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116536419A true CN116536419A (zh) | 2023-08-04 |
Family
ID=87453034
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211359611.6A Pending CN116536419A (zh) | 2022-10-31 | 2022-10-31 | 检测alk基因融合的引物、探针及其试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116536419A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN118086512A (zh) * | 2024-04-25 | 2024-05-28 | 新羿制造科技(北京)有限公司 | 通过数字pcr方法检测alk融合基因的方法及其试剂盒 |
-
2022
- 2022-10-31 CN CN202211359611.6A patent/CN116536419A/zh active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN118086512A (zh) * | 2024-04-25 | 2024-05-28 | 新羿制造科技(北京)有限公司 | 通过数字pcr方法检测alk融合基因的方法及其试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105624309B (zh) | 检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒 | |
WO2018086263A1 (zh) | 一种实时荧光定量pcr检测方法及其标准品和检测试剂盒 | |
Yung et al. | Single-molecule detection of epidermal growth factor receptor mutations in plasma by microfluidics digital PCR in non–small cell lung cancer patients | |
Han et al. | Detection of EGFR mutation status in lung adenocarcinoma specimens with different proportions of tumor cells using two methods of differential sensitivity | |
US20150218652A1 (en) | Methods for diagnosis and treatment of cancer | |
CN108949990B (zh) | 一种检测egfr基因突变的试剂盒及方法 | |
CN107447013B (zh) | 检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒 | |
CN111394457B (zh) | 生物标志物的应用、检测肾透明细胞癌的试剂及其试剂盒 | |
WO2006008526A2 (en) | Method of predicting the responsiveness oa a tumor to erbb receptor drugs | |
CN102533958A (zh) | 一种检测人pik3ca基因突变的方法和试剂盒 | |
CN109971861A (zh) | Ccdc6-ret融合基因检测试剂盒 | |
CN101875971A (zh) | Braf基因突变的快速检测 | |
CN116536419A (zh) | 检测alk基因融合的引物、探针及其试剂盒 | |
CN110863053A (zh) | 一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法 | |
CN110592217A (zh) | 一种检测外周血游离dna中kras基因突变的试剂盒及其应用 | |
CN107208148B (zh) | 用于乳腺肿瘤的病理分级的方法和试剂盒 | |
CN102912018B (zh) | 一种检测WT1基因mRNA表达量的试剂盒 | |
CN108531598B (zh) | Ros1基因融合检测引物、方法及试剂盒 | |
CN108728538B (zh) | Alk基因融合检测引物、方法及试剂盒 | |
CN115851935A (zh) | 一种用于met基因外显子14跳跃突变检测的引物探针组和试剂盒 | |
CN110964830A (zh) | 多重检测ros1基因突变的试剂盒及方法 | |
WO2017031230A1 (en) | High-sensitivity sequencing to detect btk inhibitor resistance | |
CN110904237A (zh) | 用于检测egfr基因突变的引物探针组合及试剂盒 | |
CN111676285A (zh) | 结直肠癌靶向用药相关热点突变在结直肠癌辅助治疗中的用途 | |
KR102353064B1 (ko) | Her2 복제수 변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |