CN107208148B - 用于乳腺肿瘤的病理分级的方法和试剂盒 - Google Patents

用于乳腺肿瘤的病理分级的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本公开为一种用于鉴定受试者的乳腺组织中的肿瘤类型的方法。该方法包括下列步骤：执行一种或多种基于核酸的测定，用于依据第一测试模块和第二测试模块鉴定从受试者获得的乳腺组织中存在的突变，各测试模块均与一个或多个基因中的至少一个预定突变的检测相关联，且各测试模块均配置为提供与组织中检测到至少一个预定突变相对应的阳性结果或与样品中不存在可检测的预定突变相对应的阴性结果；以及基于所提供的第一和第二测试模块的结果来鉴定乳腺组织的肿瘤的类型。优选地，第一测试模块与MED12基因突变和/或RARA基因突变的检测相关联，而第二测试模块与FLNA基因突变、SETD2基因突变和/或MLL2基因突变的检测相关联。

Description

用于乳腺肿瘤的病理分级的方法和试剂盒
技术领域
本公开涉及能够对受试者的乳腺组织进行病理分层或鉴定肿瘤类型的方法。更具体地，本公开的方法通过根据与感兴趣的突变相关联的预定测试模块检测或定位同时存在于乳腺组织中的突变来鉴定肿瘤类型、阶段或组。本公开还提供了被配置为能实现本公开的方法的试剂盒。
背景技术
乳腺纤维上皮肿瘤是以上皮和基质成分两相增殖为特征的病种。纤维上皮性乳腺肿瘤包括纤维腺瘤(FAs)和叶状肿瘤(PTs)，其后者可以根据组织学特征1进一步细分为良性、边缘性以及恶性等级。FAs每年在世界范围内影响数百万妇女3，PTs发生的频率约占乳腺肿瘤的1％或更少，以及高达7％的亚洲乳腺癌4。与FAs相比，PTs具有更晚的中位发病年龄(35岁相对于43岁)，以及更高的局部复发倾向，远处转移也发生在一些恶性PTs中5。
以前的研究表明，PTs和FAs可能高度相关4。在PTs组织病理学检查中FA类似区域并不罕见，一些研究提出了从FA到PT的克隆发展6-10。在分子水平上，最近在FAs和PTs中观察到RNA聚合酶II转录中介亚基12(MED12)外显子2的频繁突变2,11-14，而基因表达和DNA甲基化分析已经涉及PT发展中的基因如HOXB13和HMGA215-17。更高的拷贝数变更率(CNA)也与更高级别的PTs相关18,19，最近的一项研究使用靶向癌症基因组分析了少量PTs(n＝15，每等级5个)，揭示肿瘤蛋白p53(TP53)的复发突变和视网膜母细胞瘤蛋白(RB1)以及神经纤维瘤蛋白1(NF1)中单突变仅存在于高等级的PTs中11。然而，与全面突变图谱已被广泛研究的乳腺癌(BCs)不同20-23，对于连接不同类型的乳腺纤维上皮病变的遗传和分子关系，知之甚少。
PTs的诊断和分型经常对病理学家是个挑战，特别是区分良性PT与FA。这种分型在为患有FA、PT或BC的患者提供疾病特异性治疗方面具有临床重要性。
发明内容
本公开旨在提供一种用于对受试者的乳腺组织相关肿瘤的分级、鉴定或分类的方法。通过正确鉴定肿瘤的类型、阶段或组，本公开促进针对受试者的疾病特异性疗法。
本公开的另一个目的是使用一种或多种基于核酸的测定来辅助与受试者的乳腺组织相关的肿瘤类型的分级、鉴定或分类。本公开的方法使用基于核酸的测定，除了用于肿瘤分级的样品的物理检查之外，还提供可靠的结果用作支持性诊断工具。特别地，本公开的方法允许病理学家大体上区分良性PT与FA。
本公开的又一个目的是提供一种试剂盒，该试剂盒至少部分包含必需试剂，以促进上述一种或多种基于核酸的测定在所需的肿瘤分级中的表现。本公开的试剂盒可以以各种实施方案，在基于核酸的测定的不同平台下操作。
通过本公开，前述目的中的至少一个被全部或部分地满足，其中，本公开的实施例之一是用于鉴定受试者乳腺组织中的肿瘤类型的方法，该方法包括执行一个或多个基于核酸的测定的步骤，以通过第一测试模块和第二测试模块鉴定从受试者获得的乳腺组织中存在的突变，第一和第二测试模块均与一个或多个基因中的至少一个预定突变的检测相关联，并配置为提供与组织中检测到至少一个预定突变相对应的阳性结果或与样品中不存在可检测的预定突变相对应的阴性结果，所述第一测试模块与MED12基因突变和/或视黄酸受体α(RARA)基因突变的检测相关联，所述第二测试模块与细丝蛋白Aα(FLNA)基因突变，含有2(SETD2)基因的SET结构域突变和/或混合谱系白血病蛋白2(MLL2)基因突变的检测相关联；并且基于第一和第二测试模块提供的结果识别乳腺组织肿瘤的类型。优选地，当第一测试模块和第二测试模块的结果分别为阳性和阴性时，肿瘤的类型被认为是纤维腺瘤。或者，当第一测试模块和第二测试模块的结果均为阳性时，肿瘤的类型被认为是叶状肿瘤。此外，第一测试模块可以进一步与受试者的端粒酶逆转录酶(TERT)基因突变的检测有关。
根据多个优选实施例，执行一种或多种基于核酸的测定的步骤还包括与检测NF1基因突变、RB1基因突变和/或磷脂酰肌醇4,5-二磷酸-3-激酶催化亚基α(PIK3CA)基因突变相关联的第三测试模块。优选地，当第一测试模块、第二测试模块以及第三测试模块的结果都为阳性时，肿瘤的类型被认为是恶性叶状肿瘤。
根据本公开的方法的多个优选实施例，MED12基因的突变是位于MED12基因的外显子2的位置-8处的剪切位点突变，位于MED12基因cDNA的密码子44处的错义突变或位于MED12基因cDNA的密码子36处的错义突变。
根据更优选的实施例，RARA基因中的突变对应于或导致从受试者的RARA基因翻译的中发现的p.F286del、p.F287L、p.N299H、p.R394Q、p.L409del和/或p.G289R。
对于多个实施例，FLNA基因中的突变对应于从受试者的FLNA基因翻译的多肽中发现的p.A1191T、p.S1199L、p.P1244S、p.1687-1688TV>M和/或p.S1186W。待检测的这些突变特别涉及产生的多肽上的错义突变。
对于多个实施例，SETD2基因中的突变涉及在其可翻译的多肽中发现的p.R1674-1675EA>D、p.K1587fs、p.Q1545*、p.Y1605fs和/或p.F1651fs。在SETD2基因中发现的突变通常与错义或体细胞突变有关。
在多个实施例中，TERT基因中待检测的突变优选位于启动子区域。例如，位于TERT基因的启动子区域的-124和/或-146处的突变导致错义突变。
本公开的另一方面，提供了一种用于鉴定受试者的乳腺组织中的肿瘤类型的试剂盒。优选地，该试剂盒包括至少一个能够进行一种或多种基于核酸的测定的平台，依据第一测试模块和第二测试模块鉴定从受试者获得的乳腺组织中存在的突变，各测试模块均与一个或多个基因中的至少一个预定突变的检测相关联，各测试模块均配置为提供与组织中检测到至少一个预定突变相对应的阳性结果或与样品中不存在可检测的预定突变相对应的阴性结果，所述第一测试模块与MED12基因突变、TERT和/或RARA基因突变的检测相关联，所述第二测试模块与FLNA基因突变，SETD2基因突变和/或MLL2基因突变的检测相关联。优选地，所述测试模块被配置为对应任何阳性结果发射可检测的或可视的信号。当第一测试模块和第二测试模块的结果分别为阳性和阴性时，肿瘤的类型被认为是纤维腺瘤。或者，当第一测试模块和第二测试模块的结果均为阳性时，肿瘤的类型被认为是良性叶状肿瘤。
在本公开的试剂盒的一个或多个实施例中，所述至少一个平台进一步包括与检测NF1基因突变、RB1基因突变和/或PIK3CA基因突变相关联的第三测试模块。通过包含所述第三测试模块，当第一测试模块、第二测试模块和第三测试模块的结果全部为阳性时，本公开的试剂盒可以进一步考虑、分级或鉴定肿瘤类型为恶性叶状肿瘤。
在一些实施方案，所述乳腺组织是与本公开的用于肿瘤分级或鉴定的试剂盒一起使用的基质细胞。
附图说明
图1A为组合图，显示了通过靶向测序鉴定的100个纤维上皮肿瘤中频发突变基因的分布，包括21个FAs和79个PTs，中心图表明频发突变基因的分组，点表示同一患者中第二突变的发生，左侧柱状图显示变异次数及相邻数字，以指示组中的变异频率，右侧栏显示亚型突变的频率，而星号表示样品未匹配正常；
图1B为简单的图表，用于说明基于本公开的发现，与纤维上皮肿瘤谱的每个时期相关联的关键遗传变异和通路的概述；
图2A为MED12中的突变的示意图，在其从左到右标记为MED、转录中介复合亚基Med12、MED12-LCEWAV、真核中介12亚结构域、MED12-PQL、真核中质12链蛋白结合域之后，其每个变异的频率表示在括号中；
图2B为RARA突变的示意图，RARA中的结构域：NR_DBD(视黄酸受体的DNA结合结构域)；NR_LBD(视黄酸受体的配体结合结构域)；
图2C为FLNA突变的示意图，FLNA中的结构域：CH(钙调节蛋白同源结构域)和IG_FLMN(细丝蛋白型免疫球蛋白结构域)；
图2D为SETD2突变的示意图，SETD2中的结构域：AWS(与SET结构域相关)、SET(Su(var)3-9、zeste增强子、trithorax)结构域、WW(WWP结构域)以及SRI(set2Rbp1相互作用域)；
图2E为MLL2突变的示意图，MLL2中的结构域：zf-HC(PHD样锌结合结构域)、指环(真正有趣的新基因)结构域、PHD(PHD锌指)、HMG(高迁移率组-框结构域)FYRN(富含F/Y的N末端)、FYRC(富含FY结构域的C末端区域)SET(Su(var)3-9，zeste增强子、trithorax)结构域；
图3归纳了叶状肿瘤体细胞突变图，图(A)表明FA和PT中的体细胞突变数。*p<0.001(B)显示22个叶状肿瘤中每例突变的频率，表示为覆盖目标序列每兆碱基(Mb)的突变数，(c)22对PT中的突变特征，以及(d)显示100个纤维上皮肿瘤中50个靶基因的变异拷贝数，与低级别肿瘤相比，高级别肿瘤倾向于具有更多的CNA。N.S.，不显著性*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
图4A为显示纤维上皮肿瘤和实体瘤中具有体细胞突变的样品的百分比的图示，所述样品来自TCGA样品，通过从cBioPortal(括号中的每项研究的样品数)得到的公开数据鉴定，其中ACC为肾上腺皮质癌，ccRCC为肾透明细胞癌；
图4B为显示纤维上皮肿瘤中qPCR检测到的RARA的表达水平的图示，其中含RARA野生型(17例)或突变型(13例)；
图4C为表明RARA突变体转录活性低于野生型RARA的图示，其中用RARE Cignal报告基因以及分别含有空载体、野生型和突变型RARA的cDNA的表达质粒转染HEK293细胞，转录活性在缺失和存在RA刺激下测量(误差线＝SD，n＝3)；
图4D为显示HEK293细胞中进行的哺乳动物双杂交测定的结果的图示，以评估在不存在和存在RA的情况下，野生型或突变型RARA与核共抑制子NCoR1的相互作用(误差线＝SD，n＝3)；
图5A显示乳腺癌中体细胞FLNA突变的示意图谱，使用FLNA蛋白的结构域的，乳腺癌中的变异根据cBioPortal(TCGA)获得的公开数据确定，其中CH为Calponin同源性结构域，IG-FLMN为细丝蛋白型免疫球蛋白结构域；
图5B显示3个新鲜冷冻PT中FLNA变体的cDNA Sanger测序结果；
图6A为揭示边界(样品1056)和恶性(样品1076)PT中EGFR扩增模式的图；
图6B为EGFR的IHC染色的代表图，表明边界PT(样品1056)中的蛋白质水平和EGFR位置，图像显示EGFR蛋白仅位于基质细胞中并不存在于上皮细胞中；
图7显示了基于靶向测序分析的FA、PT和BC中突变谱的比较，以及已知在BCs中显着突变的代表性基因(TP53、PIK3CA、MAP3K1、GATA3和CDH1)；
图8A是样品1007的苏木精和曙红(H&E)染色部分的显微照片，通过激光捕获显微切割(LCM)获得，其中S表示基质和E表述上皮；
图8B显示了在图8A中提供的相同染色样品的本体组织、上皮以及基质区域中的MED12、RARA和BRCA1的Sanger测序，测序结果显示突变是基质区独有的；
图9(A)是具有宽阔叶状基质叶状突起到由良性上皮排列的裂缝空间的石蜡化肿瘤部分的低放大倍数显微照片，(B)是由良性双层上皮覆盖的轻度至中度细胞基质的中等放大倍数，(C)是显示渗透到相邻脂肪中的基质细胞的渗透性边界的显微照片，(D)通过有丝分裂显示基质有丝分裂活性，(E)是样品004肿瘤和匹配血液的RB1和EGFR的Sanger测序；
图10A为显示FA和PT并发的H&E染色切片的一个显微照片，选择用于从一个患者中宏观解剖，所述突变中癌症相关基因的获得仅定位在PT中，最下面的显微照片为EGFR的IHC染色，PT区域的蛋白质显著，但不在FA样区域；以及
图10B描绘了基于在上图中报道的每个患者的组织学亚型的并发和纵向FAs/PT的体细胞突变谱，底部图是用于指示所鉴定的突变类型的示意图。
具体实施方式
本发明可以以其他具体形式实施，而不脱离其结构、方法或本文中广泛描述并要求保护的其它基本特征。所描述的实施例在所有方面仅被认为是说明性的，而不是限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是前面的描述来表示。在权利要求的等同的含义和范围内的所有变化将被包括在其范围内。
除非另有说明，本文所用的术语“包括”和“包含”及其语法变体旨在表示“开放”或“包含性”的语言，使得它们包括所引用的元素，但也允许包含附加的未引用的元素。
如本文所使用的，短语“在实施例中”是指在一些实施例中，但不一定在所有实施例中。
如本文所使用的，在组分浓度、条件、其他测量值等的上下文中，术语“约”或“大约”是指所述值的+/-5％，或所述值+/-4％，或所述值的+/-3％，或所述值的+/-2％，或所述值的+/-1％，或所述值的+/-0.5％，或所述值的+/-0％。
本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”指代mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语通常是指长度大于30个核苷酸残基的寡核苷酸。
本说明书中使用的术语“引物”是指当与DNA链配对时，能够在合适的聚合剂存在下引发引物延伸产物的合成的寡核苷酸。为了扩增的最大效率，引物优选为单链的，但也可以是双链的。引物必须足够长，以在聚合剂存在下引发延伸产物的合成。引物可以与其被设计去杂交的模板上的序列“实质上互补”，并且作为合成起始的位点。“实质上互补”是指引物充分互补以与靶多核苷酸杂交。优选地，引物不含与其被设计与之杂交的模板的错配，但这不是必需的。例如，非互补核苷酸残基可以连接到引物的5'末端，引物序列的其余部分与模板互补。或者，非互补核苷酸残基或一段非互补核苷酸残基可以散布到引物中，只要引物序列与模板序列具有足够的互补性以与其杂交，从而形成用于合成引物延伸产物的模板。
本文所用的术语“基因”可以指具有功能意义的DNA序列。其可以是天然核酸序列，或衍生自天然来源或合成构建体的重组核酸序列。术语“基因”也可以用于指，例如但不限于，直接或间接地由基因组DNA序列编码或衍生自其的cDNA和/或mRNA。
本公开的一个主要方面，公开了一种用于鉴定受试者乳腺组织中的肿瘤类型的方法。优选地，本公开的方法包括以下步骤：执行一种或多种基于核酸的测定，从而依据第一测试模块和第二测试模块鉴定从受试者获得的乳腺组织中存在的突变，各测试模块均与一个或多个基因中的至少一个预定突变的检测相关联，各测试模块均配置为提供与组织中检测到至少一个预定突变相对应的阳性结果或与样品中不存在可检测的预定突变相对应的阴性结果，所述第一测试模块与MED12基因突变、TERT基于突变和/或RARA基因突变的检测相关联，所述第二测试模块与FLNA基因突变，SETD2基因突变和/或MLL2基因突变的检测相关联。以及基于第一和第二测试模块所提供的结果，来确定乳腺组织的肿瘤的类型。
一般普通技术人员应理解，本文描述的至少部分基于核酸的测定法还可以包括至少一些公知的完成测定的方法或步骤，尽管在本说明书中可能未完全详细描述。例如，基于核酸的测定的一部分可以涉及使用任何方法或商业化试剂盒提取或分离含有关于受试者或被检体组织样品遗传信息的脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)材料的步骤。如在一些优选实施例中，基于核酸的测定的一部分还可能涉及针对分离的DNA或RNA材料进行聚合酶链式反应(PCR)，连同预定的热循环和条件，以扩增基因或部分基因，在测试模块中进行分析，以完成病理分级。这些预处理或过程可以构成基于核酸的测定的一部分，最终导致肿瘤分级和分类所需基因的等位基因、突变和/或基因分型的鉴定。
根据本公开的方法的一些优选实施例，基于核酸的测定优选进行鉴定、检测和/或基因分型潜在的突变，所述突变存在于引发肿瘤或癌症发展的受试者的一个或多个基因中。本公开的基于核酸的测定包括测序感兴趣的基因。测序可以在自乳腺组织分离出的DNA或RNA材料扩增和/或复制的多核苷酸上进行。更具体地，本公开中采用的用于实现突变鉴定或检测的测序方法可以是Sanger测序和/或标记扩增超深度测序，其有效并且能够高度精确和可靠地得出识别测试模块中设置的感兴趣的突变。Sanger测序和/或标记扩增超深度测序的细节在以下并入的实施例中进一步阐述。对于其他技术人员来说，重要的是意识到可以使用其他已知的等同的测序或非等同程序或方法来检测所分析的多核苷酸中感兴趣的突变的存在，从而实现本公开的方法，并且这种修改不应偏离本公开的范围。可用于鉴定或辅助鉴定这些突变的其它已知方法可以是但不限于温度梯度凝胶电泳、毛细管电泳、扩增受阻突变体系聚合酶链式反应(ARMS-PCR)、动态等位基因特异性杂交(DASH)、用于下一代测序(NGS)的靶捕获、高密度寡核苷酸SNP阵列或限制性片段长度多态性(RFLP)。本公开利用来自测试模块的模式、成果或结果，关于预定的与给定模块相关的基因，对组织样品的肿瘤分期或类型进行分级，而不仅仅是采用特定的引物或单个平台来实现分级或分类。对可实施本发明的肿瘤分级方法的引物或平台的修饰，诸如测序引物长度或杂交位置的不同，均落入本公开的范围。
如上所述，第一测试模块和第二测试模块分别与测试模块特异性相关的一个或多个基因的至少一个突变的检测相关联，并提供适用于后续肿瘤阶段分级或组织样品类型的结果。更具体地，在多个优选实施例中，第一测试模块与MED12基因、TERT基因和/或RARA基因中的突变的检测相关联。更优选地，第一模块与MED12基因、TERT基因和/或RARA基因相关联的多于一个的突变的检测有关。例如，MED12基因可检测到并与第一测试模块相关联的突变可以是位于MED12基因的外显子2的位置-8处，位于MED12基因cDNA密码子44的错义突变或位于MED12基因cDNA密码子36处的错义突变等剪切位点突变中的任何一个。类似地，与第一测试模块相关联的RARA基因的可检测突变可以是在其翻译的多肽中，导致错义突变p.F286del、p.F287L、p.N299H、p.R394Q、p.L409del和/或p.G289R中的任何一种。此外，TERT基因中待检测的突变优选位于启动子区。例如，位于TERT基因的启动子区的-124和/或-146处的突变导致错义突变。
根据所公开的方法的许多实施例，第二测试模块优选与位于FLNA基因、SETD2基因和/或MLL2基因中的可检测的预定突变体相关联。更具体地，与第二测试模块相关联的FLNA基因检测的一个或多个突变通常在其翻译的多肽中产生p.A1191T、p.S1199L、p.P1244S、p.1687-1688TV>M和/或p.S1186W。与SETD2基因相关并与第二测试模块相关联的突变为产生top.R1674-1675EA>D、p.K1587fs、p.Q1545*、p.Y1605fs和/或p.F1651fs的任何单一或联合突变，可从SETD2翻译。类似地，要检测的并与第二测试模块相关联的MLL2基因的突变通常是引起失活突变的任何突变，例如在由MLL2基因编码的多肽中发现的p.V5482fs、p.Q1139*、p.G2668fs、p.Q3814*和/或p.L3457fs。对于少数优选实施例，除了FLNA基因、SETD2基因和/或MLL2基因相关联之外，本公开方法的第二测试模块可以进一步与其他基因的突变相关联。
这些可推断或指示乳腺肿瘤类型或阶段的，具有感兴趣突变的额外的基因，可以与第二测试模块相关，为BCL-6辅抑制因子蛋白(BCOR)基因和有丝分裂原激活蛋白激酶kinasekinase 1(MAP3K1)基因。
在本公开的方法的一些实施例中，第二测试模块可以被配置为检测除了FLNA基因、SETD2基因和/或MLL2基因之外的受试者的基因突变的存在。例如，第二测试模块可安排为发现受试者的B细胞淋巴瘤因子6辅抑制因子(BCOR)基因中的失活突变，如p.K460*、p.W534*和/或p.K175fs，或体细胞突变，如受试者的有丝分裂原激活蛋白激酶kinasekinase 1(MAP3K1)基因中的p.M312fs和/或p.Q409fs。
为了更好地分级或鉴定乳腺组织样品的肿瘤时期，执行一种或多种基于核酸的测定还可以包括与检测NF1基因突变、RB1基因突变和/或PIK3CA基因突变相关联的第三测试模块。借助于第三测试模块，本公开的方法可以进一步分级或鉴定那些已经进入边界恶性或恶性阶段的叶状肿瘤的组织样品。优选地，与第三测试模块相关联的NF1基因的突变是在其可翻译多肽中发现的关于p.K1014*、p.R416*和/或p.D2283fs的突变。第三测试模块中靶向NF1基因的这些突变引起无义突变或移码突变，导致肿瘤的发生。类似地，与第三测试模块相关联的RB1基因的突变是在其可翻译多肽中发现的关于p.Q504*、p.N316fs和/或p.P796fs的突变。这些RB1基因的突变也会引起无义或移码突变。对于PIK3CA基因，与第三测试模块相关联的感兴趣的突变主要涉及p.H1047R/L，其为错义突变。
除NF1基因、RB1基因和/或PIK3CA基因的突变之外，本公开方法的其它实施例可以具有通过第三测试模块发现的其它相关联基因的更多突变。随着覆盖更多突变位点，本公开的方法能够提供更高的准确性，及时检测、诊断、分类、分组或识别受试者肿瘤发展的各个阶段。第三测试模块可以用于检测由表皮生长因子受体(EGFR)基因编码的多肽中与p.L62R相关联的频发突变，磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)基因编码的多肽中发现的p.I33del相关的非移码缺失突变，肿瘤蛋白P53(TP53)基因编码的多肽中发现的p.294fs或p.C229fs相关的失活移码突变，Erb-B2受体酪氨酸激酶4(ERBB4)基因编码的多肽中发现的p.W407R相关的体细胞突变，和/或受试者胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)基因的复制。
根据优选的实施例，所述第一、第二和/或第三模块被制成只要检测到与特定测试模块相关联的基因的至少一个预定突变就产生肯定结果，反之亦然。例如，第一测试模块响应于受试者的乳腺组织的MED12基因、TERT基因和/或RARA基因中检测到的至少一个突变而产生阳性结果。相反，在没有与MED12基因、TERT基因和/或RARA基因相关联的任何可检测的预定突变的情况下，第一测试模块产生阴性结果。类似的原理适用于第二和第三测试模块，以在肿瘤分级鉴定中实现本公开的方法。在许多优选实施例中，在测试模块中考虑的基因的每个突变可以在不同的已知原理或平台下进行单独的基于核酸的测定，以进行检测或鉴定。对于这些实施例，所涉及的基因的各个突变的基于核酸的测定可以不是并行进行的，而是将每个测定产生的结果检索或收集到相关联的测试模块中以计算或产生其结果。根据其他优选实施例，本公开的方法可以同时运行类似的测试，以在相同平台的单个操作中检测分别与不同模块相关联的基因的突变或等位基因，将每个分析的突变的结果与预定模块相关联，用于计算随后肿瘤分级的结果。根据前文，尽管为了成本和/或节省时间，优选通过一个平台鉴定相关基因的感兴趣的突变，本文所述的基于核酸的测定法不受限于单个操作平台或机制。
如在前面的描述中所阐述的，本公开的方法响应所使用的测试模块计算、生成或发出的结果，有效分级肿瘤的类型。根据多个优选的实施方式，当第一测试模块和第二测试模块的结果分别为阳性和阴性时，本公开的方法认为乳腺组织样品的肿瘤类型为纤维腺瘤。本公开的发明人发现，与FA的早期发作相关的生物标记可以与受试者的MED12、TERT基因和/或RARA基因中可检测的突变相关。同时，FA样品通常不含任何与第二测试模块相关联的那些基因中的可检测突变，例如FLNA、SETD2、MLL2、BCOR、MAP3K1。类似地，在第一和第二测试模块分别为阳性和阴性结果之外，当第三模块递送阴性结果时，本公开还将分析的乳腺组织关联为FA，表明在这些与第三模块关联的基因中不能检测到显著的感兴趣的突变。
根据优选实施例，当第一测试模块和第二测试模块的结果都为阳性时，本公开的方法可以将肿瘤的类型视为叶状肿瘤。基于所进行的测试和实验，本公开认识到叶状肿瘤的发生似乎具有与第一和第二测试模块均相关的基因的突变。特别地，除了确定与第一测试模块相关的基因中的感兴趣突变之外，符合FLNA、SETD2、MLL2、BCOR或MAP3K1基因中存在考虑过突变的，乳腺组织样品的肿瘤类型可以方便地被认为是叶状肿瘤。
为了进一步区分或分级经过鉴定的叶状肿瘤，在一些优选实施例中，本公开除了在第一和第二模块中存在的那些外，还引出第三测试模块，以检测受试者的额外基因的突变。特别地，当第一测试模块、第二测试模块和第三测试模块的结果全部为阳性时，所获得的乳腺组织的肿瘤类型被认为是恶性叶状肿瘤，意味着所获取的样品在每个测试模块中至少携带一个突变的基因。具有测试模块阳性结果的样品或测试的受试者，在与特定测试模块相关的一个或多个基因中也可能存在两个或多个突变。另一方面，当第三测试模块的结果为阴性，且第一和第二测试模块的结果为阳性时，本公开的方法优选将乳腺组织样品的肿瘤的类型视为良性叶状肿瘤。
本公开的另一方面涉及一种用于鉴定受试者的乳腺组织中的肿瘤类型的试剂盒。优选地，该试剂盒包括至少一个能够进行一种或多种基于核酸的测定的平台，依据第一测试模块和第二测试模块鉴定从受试者获得的乳腺组织中存在的突变，第一和第二测试模块中的每一个均与一个或多个基因中的至少一个预定突变的检测相关联，并且配置为提供与组织中检测到至少一个预定突变相对应的阳性结果或与样品中不存在可检测的预定突变相对应的阴性结果，所述第一测试模块与MED12基因突变、TERT和/或RARA基因突变的检测相关，所述第二测试模块与FLNA基因突变，SETD2基因突变和/或MLL2基因突变的检测相关。
本公开的试剂盒可用的用于鉴定或辅助鉴定这些突变的至少一个平台可以是但不限于温度梯度凝胶电泳、毛细管电泳、扩增受阻突变体系聚合酶链式反应(ARMS-PCR)、动态等位基因特异性杂交(DASH)、用于下一代测序(NGS)的靶捕获、高密度寡核苷酸SNP阵列或限制性片段长度多态性(RFLP)。根据本公开试剂盒的多个优选实施例，测试模块中考虑的基因的每个突变可以进行单独的基于核酸的测定，所述测定在至少一个上述平台中执行，以检测或鉴定。在一些实施例中，所涉及的基因的各个突变的基于核酸的测定可以不是并行进行的，而是将每个测定产生的结果检索或收集到相关联的测试模块中以计算或产生其结果。在另一些优选的实施例中，本公开的试剂盒可用于，至少一部分，同时运行类似的测试，以在单一平台下检测分别与不同模块相关联的基因的突变或等位基因，将每个分析的突变的结果与预定模块相关联，用于计算随后肿瘤分级的结果。
在更优选的实施例中，本公开试剂盒的基于核酸的测定包括测序感兴趣的基因。测序可以在自乳腺组织分离出的DNA或RNA材料扩增和/或复制的多核苷酸上进行。更具体地，本公开中采用的用于实现突变鉴定或检测的测序方法可以是Sanger测序和/或标记扩增超深度测序，其有效并且能够高度精确和可靠地得出识别测试模块中设置的感兴趣的突变。
根据前面的描述，本公开的试剂盒的第一测试模块和第二测试模块分别与测试模块特异性相关的一个或多个基因的至少一个突变的检测相关，并提供适用于后续肿瘤阶段分级或组织样品类型的结果。更具体地，在本公开试剂盒的多个优选实施例中，第一测试模块与MED12基因、TERT基因和/或RARA基因中的突变的检测相关。更优选地，第一模块与MED12基因、TERT基因和/或RARA基因相关的多于一个的突变的检测有关。例如，MED12基因可检测到并与第一测试模块相关的突变可以是位于MED12基因的外显子2的位置-8处，位于MED12基因cDNA密码子44的错义突变或位于MED12基因cDNA密码子36处的错义突变等剪切位点突变中的任何一个。类似地，与第一测试模块相关的RARA基因的可检测突变可以是在其翻译的多肽中导致p.F286del、p.F287L、p.N299H、p.R394Q、p.L409del和/或p.G289R错义突变中的任何一种。对于TERT基因，待检测的突变优选位于启动子区。例如，导致错义突变的位于TERT基因的启动子区的-124和/或-146处的突变。
根据一些优选的实施例，第二测试模块优选与位于FLNA基因、SETD2基因和/或MLL2基因中的可检测的预定突变体相关联。更具体地，与第二测试模块相关联的FLNA基因检测的一个或多个突变，为与受试者FLNA基因翻译的多肽中p.A1191T、p.S1199L、p.P1244S、p.1687-1688TV>M和/或p.S1186W相应的突变。与SETD2基因相关并与第二测试模块相关联的突变为其产生多肽中发现的导致p.R1674-1675EA>D、p.K1587fs、p.Q1545*、p.Y1605fs和/或p.F1651fs的任何单一或联合突变。类似地，要检测的并与第二测试模块相关联的MLL2基因的突变通常是引起失活突变的任何突变，例如在由MLL2基因编码的多肽中发现的p.V5482fs、p.Q1139*、p.G2668fs、p.Q3814*和/或p.L3457fs。对于少数优选实施例，除了FLNA基因、SETD2基因和/或MLL2基因相关联之外，本公开试剂盒的第二测试模块可以进一步与其他基因的突变相关联。这些可推断或指示乳腺肿瘤类型或阶段的，具有感兴趣突变的额外的基因，可以与第二测试模块相关，为BCL-6辅抑制因子蛋白(BCOR)基因和有丝分裂原激活蛋白激酶kinasekinase 1(MAP3K1)基因。
本公开的试剂盒有助于利用来自测试模块的模式、成果或结果，基于预定和相关基因，对组织样品的肿瘤分期或类型进行分级。优选地，当第一测试模块和第二测试模块的结果分别为阳性和阴性时，乳腺组织样品的肿瘤的类型被认为是纤维腺瘤。相反，当第一测试模块和第二测试模块的结果均为阳性时，被测乳腺组织的肿瘤类型被认为是良性叶状肿瘤。
在更多优选的实施方式中，本公开试剂盒可以进一步包括与检测NF1基因突变、RB1基因突变和/或PIK3CA基因突变相关的第三测试模块。借助于第三测试模块，本公开的试剂盒有助于进一步分级或鉴定那些已经进入边界恶性或恶性阶段的叶状肿瘤的组织样品的肿瘤类型。优选地，与第三测试模块相关的NF1基因的突变是在其可翻译多肽中发现的关于p.K1014*、p.R416*和/或p.D2283fs的突变。类似地，与第三测试模块相关的RB1基因的突变是在其编码多肽中发现的关于p.Q504*、p.N316fs和/或p.P796fs的突变。对于PIK3CA基因，与第三测试模块相关的感兴趣的突变通常涉及导致编码多肽的p.H1047R/L的突变。因此，当第一测试模块、第二测试模块和第三测试模块的结果都是阳性时，通过本公开的试剂盒将获得的乳腺组织的肿瘤类型视为恶性叶状肿瘤，意味着所获取的样品在每个测试模块中至少携带一个突变的基因。另一方面，当第三测试模块的结果为阴性，且第一和第二测试模块的结果为阳性时，本公开的试剂盒优选使得试剂盒的使用者将乳腺组织样品的肿瘤类型视为良性叶状肿瘤。
为了加速本公开试剂盒的结果的产生，优选将测试模块配置为对应任何阳性结果发射可检测的或可视的信号，反之亦然。只要识别与给定模块相关联的一个感兴趣的突变，将产生机器或用户可读信号，以突出所获得的阳性结果。例如，本公开的试剂盒可以采用一种实施例，以DNA芯片的形式，其上锚定多种多核苷酸，以便容易地与靶基因片段杂交，潜在地结合从乳腺组织样品扩增出的感兴趣的突变。测试模块可以是芯片上的一组多核苷酸或专用区域。DNA芯片上属于特定测试模块的离散点，附着专门设计为在严格条件下仅特异性杂交具有感兴趣突变的靶基因片段的多核苷酸，成功的杂交出现时，会产生微阵列机器可读的信号，以通知并将感兴趣突变的检测关联到该特定测试模块以产生阳性结果。
基于乳腺活检的物理性检查，上述方法和/或试剂盒除了可以进行常规肿瘤分级或分类，还可以进行支持性诊断，无论是否进一步染色。如果组织学检查和本公开的方法和/或试剂盒的结果之间存在差异，那么医生可能必须重新检查组织样品。例如，三个测试模块均为阳性结果，被认为是FA或良性PT的样品，应由医生进行重新检查。在本公开的实验中清楚地显示，FA或良性PT样品应不含任与本公开的方法和/或试剂盒的第三模块相关基因中所存在的何突变。物理或组织学检查的结果极有可能是假阴性。由于误诊结果导致的延误治疗，可能危及受检对象的健康状况。本公开的方法和/或试剂盒提供了额外的机制，来防止主观的、主要依赖于执行医生经验的组织学检查所产生的假阴性或假阳性结果。
以下示例旨在进一步说明本发明，而不意图将本发明限于本文所述的具体实施例。
示例1
根据临床特征和手术切除肿瘤的组织病理学检查，对纤维上皮肿瘤进行了诊断和分型。所有病例均由至少2名乳腺病理学专家进行组织学检查。诊断和分级标准基于世卫组织的乳腺肿瘤分类的建议1。简而言之，当纤维上皮肿瘤显示具有伴随基质超细胞性的类叶叶状体的夸张的管内模式时，诊断为叶状肿瘤。当病变显示出轻度的基质细胞性、最小核异型性、边界推进、每10个高倍视野有4个或更少的有丝分裂、无基质过度生长时，诊断为良性的叶状肿瘤。当有明显的基质细胞性和异型性、存在基质过度生长和渗透性边缘、每10个高倍视野的有丝分裂活性为10个或更多时，可以诊断为恶性叶状肿瘤。具有中间特征的肿瘤被认为是边界性。由21FA和79个PT组成的所有100例均为新鲜冷冻的组织。本研究中使用的样品的详细情况见下表1。其中69例为正常组织。研究中还包括另外5例FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)片，其中包括并发(n＝3)和纵向(n＝2)个例，后来被纳入研究。
表1.纤维上皮肿瘤患者的临床特征
Figure BDA0001356160680000151
Figure BDA0001356160680000161
Figure BDA0001356160680000171
肿瘤和全血均获自知情同意手术切除纤维上皮肿瘤的患者。新鲜冷冻组织的基因组DNA(gDNA)采用Qiagen血液和细胞培养DNA试剂盒提取和纯化。基因组DNA产量和质量使用PicogreenTM荧光分析以及琼脂糖凝胶电泳图像的目视检查来测定。对于来自并发或纵向纤维上皮肿瘤的FFPE样品，使用QiagenFFPE组织试剂盒。
示例2
全外显子组测序在22个匹配的肿瘤-正常对的叶状肿瘤中进行。使用推荐设置，使用CovarisTMS2(Covaris)系统将全基因组DNA分段。使用TruSeq配对末端基因组DNA试剂盒(Illumina)进行测序接头连接。为了富集编码序列，我们根据制造商推荐的方案使用了TruSeq外显子组测序试剂盒(Illumina)。随后在IlluminaHiSeq 2000仪器上对富集的外显子组库进行测序，以产生76bp的配对末端读数。如先前的工作46所述，进行生物信息学分析，包括序列比对、变异调用以及候选体细胞变体的鉴定。过滤变体，仅保留被至少15个读数覆盖且具有至少三个变体读取的那些。此外，排除那些具有低于5％的变异等位基因频率(VAFs)的。丢弃插入缺失重叠的简单重复区域。在IGV基因组浏览器47中目视检查所有剩余的候选变体，以排除可能的种系突变和测序的人为假象。在外显子组测序中鉴定的同义突变包括在下表2中。
表2.从22例叶状体的全外显子组测序鉴定的同义突变的列表
Figure BDA0001356160680000181
Figure BDA0001356160680000191
Figure BDA0001356160680000201
使用Platinum Taq聚合酶(Life Technologies)进行PCR扩增。PCR程序包括95℃10分钟的1个循环，95℃30秒的35个循环，58℃30秒，72℃1分钟以及72℃10分钟的1个循环。使用BigDye Terminator v.3.1试剂盒(Applied Biosystems)用于生成的PCR扩增子的双向测序，并使用ABI PRISM 3730遗传分析仪(Applied Biosystems)对产物进行分级。使用Lasergene 10.1(DNASTAR)将测序记录与参考序列比对，并进行肉眼分析。本公开选择了60个推定的体细胞突变，用于Sanger验证(包括肿瘤和正常样品)，其包括频发突变的基因、癌症相关基因以及随机选择的基因中的突变。其中54例突变成功验证，4例被发现为假阳性，2例测序失败，表明真阳性率为90％。经验证的突变在表3中用星号突出显示。
表3.从22例叶状肿瘤的全外显子组测序鉴定的候选体细胞突变的列表
Figure BDA0001356160680000202
Figure BDA0001356160680000211
Figure BDA0001356160680000221
Figure BDA0001356160680000231
Figure BDA0001356160680000241
Figure BDA0001356160680000251
Figure BDA0001356160680000261
Figure BDA0001356160680000271
Figure BDA0001356160680000281
Figure BDA0001356160680000291
Figure BDA0001356160680000301
Figure BDA0001356160680000311
注意：频发基因为粗体并经Sanger测序验证
*由Sanger测序验证的突变
本发明进行了22个匹配的肿瘤-正常成对的PT的全外显子组测序，包括10个良性，8个边界以及4个恶性PT(表1)。测序PT外显子组以及成对的正常样品，平均覆盖面为66倍的，平均78％的碱基被至少20个读数所覆盖(表2)。本公开的发明人在310个基因中总共鉴定了333个非同义或剪切位点体细胞突变。感兴趣的频发突变(在至少两例中突变)和单突变的Sanger测序获得了90％的验证率(表3)。尽管与以前本发明人进行的FA研究相比(66Xvs 124X)，PT中非沉默体细胞突变/病例的中位数高于FA(13vs 5，p<0.001)，如图3A所示。PT中的相对较低的突变计数与其他间质肿瘤如肉瘤和平滑肌瘤24-26的突变计数相当。PT中每兆碱基中平均非同义突变率为0.192(NS/S比＝3.2，图3B)，主要突变特征是NpCpG位点的C>T取代，如图3C所示。
示例3
使用SureDesign工具(Agilent)设计了一组50个选定的基因(包括PT发现群组中的频发突变基因，FA2中突变的基因以及与乳腺癌相关的基因20)。根据制造商的说明书，使用针对Illumina多路测序平台(Illumina)的SureSelect XT2靶向富集系统，从68个成对的肿瘤-正常样品以及32个肿瘤提取的DNA制备测序文库。随后在Illumina HiSeq 2000测序平台上对富集靶标的文库进行测序以产生76bp的配对末端读数。对于成对的肿瘤-正常样品，进行如外显子组测序分析部分中所述的分析。此外，由于更高的测序覆盖度(目标区域样品的平均覆盖度至少为228X)，使用Strelka48(Illumina)体细胞变体呼叫者以鉴定低等位基因频率变体(至少3％)。在IGV中目视检查所有候选变体，以确认它们可能是体细胞。对于只有肿瘤样本的患者，只考虑在成对的肿瘤-正常样品中频发突变的基因变体。本公开还对SNV(至少5％)和indels(至少10％)使用更严格的变体等位基因频率截止。丢弃变体重叠的简单重复区域，以及dbSNP49(版本137)条目的变体。变体还经内部数据库过滤，该内部数据库由包含大约512个东亚外显子组鉴定的种系变异，以进一步除去可能的种系多态性。这些变体也经IGV目视检查，以排除可能的测序假象。
为了验证PT外显子组测序数据，本公开的发明人在100个纤维上皮肿瘤(21个FA，34个良性，35个边界和10个恶性PT，如表1所示)的患病人群中进行靶向深度测序，其中包括来自检测组的22例。本发明总共测序了50个基因，包括在我们检测组中感兴趣基因的频发突变的和单突变，以及先前报道的在FAs2和BCs20-22,27中突变的基因。目标基因的平均覆盖度为524X(最小为228X)。本公开承认在PT的外显子组测序中相对低的平均覆盖深度(66X)是本研究的一个局限，并且可能导致序列变体的不足。这得到进一步观察的支持，通过靶向测序(20％变体频率的截止)鉴定出的59个突变中有11个被外显子组测序所遗漏，导致18.6％的假阴性率，可能是由于覆盖度低。此外，由于PT的稀少性和相对较小的检测组，本研究可能错过了在患者中低频发生的突变，因为这些突变将被排除在目标测序组之外。
示例4
使用OncoCNV28获得靶向测序研究中每个基因的拷贝数估计值。简言之，每个目标区域的覆盖深度信息从BAM文件生成，并针对正常样本池以及GC含量进行标准化。然后汇总探针水平拷贝数估计值，以获得基因水平拷贝数的估计值。拷贝数估计值小于1.5或超过3的基因被认为具有拷贝数增加或损失。我们使用Control-FREEC29识别我们的外显子组测序队列中的拷贝数变更(CNAs)以及具有LOH的区域。
为了研究点突变的潜在功能，我们分别进行了SIFT50，Polyphen251，CHASM52和PROVEAN53等突变预测算法。功能突变在表4中显示为破坏的或可能有破坏的和有害的。癌症特异性突变显示为司机或乘客。中性突变显示为可耐受的或良性。
表4.通过靶向测序检测到的100个纤维上皮肿瘤中的体细胞突变
Figure BDA0001356160680000331
Figure BDA0001356160680000341
Figure BDA0001356160680000351
Figure BDA0001356160680000361
Figure BDA0001356160680000371
Figure BDA0001356160680000381
Figure BDA0001356160680000391
注意：频发基因为粗体
*无成对正常组织的样品
Figure BDA0001356160680000392
使用COSMIC v69版本
***CHASM p值<0.05(司机)>0.05(乘客)
#在外显子组测序中检测，并通过Sanger测序验证cDNA+gDNA。存在于靶向测序中但由于链偏差而不被认为的变体读数。
**由于等位基因频率在肿瘤样本中>45％且<55％而被滤除，但由于该突变已被确认为其他成对样品中的体细胞突变，仍保留(并且也列在COSMIC中)
从如上所述进行的实验中，本公开鉴定了如图1a总结的纤维上皮肿瘤中的20个频发突变基因。另外，本公开使用OncoCNV28检测靶基因的拷贝数变更。获得的结果如图1A、图3D以及表6所揭示，证实了使用Control-FREEC29的具有外显子组测序数据的样品中突变的杂合性缺失(LOH)模式。
表5. 100个纤维上皮肿瘤中50个靶基因的拷贝数变更
样本编号 基因符号 转录物编号 染色体 起始 终止 拷贝数 P-值 Q-值
样品1076 EGFR CCDS5514.1 chr7 55086911 55273341 18 1.56E-15 3.27E-14
样品1056 EGFR CCDS5514.1 chr7 55086911 55273341 11.5 2.23E-15 4.24E-14
样品1076 NF1 CCDS42292.1 chr17 29422297 29701221 1 9.78E-34 2.25E-32
样品1078 NF1 CCDS42292.1 chr17 29422297 29592421 1 1.88E-18 4.52E-17
样品1078 NF1 CCDS42292.1 chr17 29652813 29665892 0 1.89E-08 4.16E-07
样品1074 PTEN CCDS31238.1 chr10 89624175 89725256 1 2.84E-05 5.10E-04
样品1011 SETD2 CCDS2749.2 chr3 47058543 47205468 1 6.35E-17 1.27E-15
样品1078 TP53 CCDS45606.1 chr17 7569531 7579965 1 4.82E-07 9.64E-06
注意：拷贝数估计值小于1.5或超过10的基因被认为具有拷贝数损失或增加。对于拷贝数变更，仅包括肿瘤抑制基因的损失和致癌基因的扩增。P-值和q-值由OncoCNV算法生成。
在纤维上皮肿瘤中的频发性突变的比较揭示了乳腺纤维上皮肿瘤谱中不同阶段相关的突变和通路的不同模式，如图1A和1B所示。首先，在纤维上皮肿瘤的所有阶段都经常发现MED12和RARA(核视黄酸受体α)的突变，分别发生在73％和32％的肿瘤中。确认早期研究，纤维上皮肿瘤中的MED12外显子2突变与子宫平滑肌瘤中报道的相同，但与前列腺和肾上腺皮质癌30,31中发现的MED12突变的模式和位置都是不同的。值得注意的是，本公开还在超过三分之一纤维上皮肿瘤中观察到RARA突变(图2B)。在本研究之前，PML-RARA的体细胞错义突变仅在抗药性急性早幼粒细胞白血病(APL)32有报道，或低频(<5％)地散在于其他实体瘤。纤维上皮性RARA突变在核激素受体配体结合结构域(LBD)内高度聚集，包括错义突变和框内缺失，与这些可能影响RARA与其他结合伴侣之间相互作用的突变一致。有趣的是，MED12和RARA都与雌激素信号转导和雌激素调控转录33,34相关，MED12和RARA突变的共同发生率高于预期的随机机率(置换检验p-值＝0.0046,100000次试验)。这些结果表明，PTs和FAs可能共有共同的起因，其中MED12和RARA突变是可能相互作用或协作导致这种肿瘤类型的激素失调的早期事件。
其次，本公开还观察到PT中(良性，边界和恶性)存在FLNA、SETD2、MLL2、BCOR和MAP3K1的新突变，这在FA中很少存在(图1A，Fisher的确切检验值与FA＝1E-04相比)。这一发现表明PT肿瘤发生可能涉及这些额外突变的基因。其中，FLNA特别新颖。X染色体基因FLNA编码细丝蛋白A、一种F-肌动蛋白交联蛋白，其通过与整合素受体35相互作用，作为支架蛋白调节参与细胞运动和入侵的信号事件。纤维上皮肿瘤中的FLNA突变(28％，28/100)特别的在F-肌动蛋白结合区被观察到，尤其在免疫球蛋白(Ig)样重复9-15结构域(80％，24/30)36中。相反，如图5A和图5B所示，报道发现BC的FLNA突变主要影响其他Ig样重复结构域而不是的F-肌动蛋白结合区。这些结果显示FLNA在PT中的功能作用可能与在BC中不同。使用cDNA Sanger测序，本公开确认了FLNA突变转录物的表达，表明FLNA突变可能在活性X染色体上发生。
除了FLNA外，超过三分之一(35％)的PT还具有两种染色质修饰酶中的至少一种的突变；SETD2(21％)和MLL2(12％)(Fisher测试p-值与FA＝0.0058相比，进一步参见图1A)。SETD2和MLL2突变显示典型的肿瘤抑制因子功能缺失突变模式，包括失活突变和缺失37,38。SETD2和MLL2都是介导表观遗传调控的组蛋白甲基转移酶，并且这些基因的失活可能通过染色质修饰导致异常的转录调节。
再次，与良性PT相比，边界和恶性PT也在NF1、RB1、TP53、PIK3CA、ERBB4和EGFR中表现出额外的突变，这些是已知具有转化能力的癌症-驱动基因。这些基因的拷贝数变更(CNAs)也在边界/恶性PT中发现。这些发现与以前的研究一致，发现TP53和RB1在恶性PTs39 -41中被解除调节。有趣的是，虽然各个癌症相关基因的变异频率很低，但29％(13/45)的边界/恶性PT显示出可能的驱动变异(定义为COSMIC频发性突变和功能丧失突变(无义/移码)或高水平CNAs)，在至少一个癌症相关基因中。相比之下，55个FA和良性PT(0/55,0％)在这些基因中没有一个遗传变异(Fisher的确切检验，p-value＝1.02E-05)。这些结果表明这些癌症相关基因可能参与高等级的PT亚型。值得注意的是，两个肿瘤明显的包含真正的PIK3CA激活突变(H1047R/L)，两个肿瘤具有高水平的EGFR扩增，如图6A和图6B所示的。总而言之，这些发现为纤维上皮肿瘤的各种亚型的肿瘤发生的遗传基础提供了重要的见解。
示例5
如FA，PT是纤维上皮肿瘤，包括上皮和基质隔室的混合物。为了确定在本研究中鉴定的PT相关突变的位置和分布，本公开进一步在发现系列的6个PT上进行激光捕获显微切割(LCM)。分离的上皮和基质组分分别进行MED12、RARA、FLNA、SETD2、BRCA1和PIK3CA中的突变分析，后两个基因在BC中经常突变，但在PT中较少(见下一段)。简言之，将6个叶状肿瘤的新鲜冷冻组织嵌入最佳切割温度(OCT)化合物(Tissue-Tek，Sakura Finetek)中，并在Microtome-cryostat(Leica)中切片(8μm厚)，安装在
Figure BDA0001356160680000411
PEN膜载玻片(LifeTechnologies)，然后在-80℃保存至需要。根据制造商的建议，将载玻片脱水并用
Figure BDA0001356160680000412
Histogene染色。将染色的载玻片装载到激光捕获显微镜载物台(ArcturusXTTM激光捕获显微切割(LCM)系统)上。然后将CapsureTMMacro LCM帽(cap)(LifeTechnologies)自动放置在组织的选定区域上。一旦软件突出显示的感兴趣的细胞被用户验证，机器将使用近红外激光或紫外线脉冲自动将突出显示的细胞解剖，将其转移到CapsureTMMacro LCM帽上。使用Qiagen FFPE DNA组织试剂盒，按照制造商的方案直接从LCM帽中提取DNA，并进行以下改变。将每个样品盖与裂解缓冲液(ATL&蛋白酶K)在500μl微量离心机中在60℃孵育5小时，并在90℃下进行酶失活10分钟。洗脱的DNA直接用于PCR和
Figure BDA0001356160680000421
测序。
本公开内容发现，所有PT相关突变都存在于基质细胞中，而不存在于上皮细胞中。这些观察结果与以前在FAs中的研究一致，其中MED12突变仅在肿瘤基质2中检测到，表明FAs和PTs可能源于基质细胞而不是上皮细胞，尽管它们具有双相上皮-基质形态学外观。然而，需要注意，目前的结果并不排除在纤维上皮肿瘤的上皮细胞间也存在遗传变异的可能性。通过使用OncoCNV分析，本公开中在21％的纤维上皮肿瘤中观察到chr1q中的LOH，与先前的研究一致42。此外，在PT43中经常观察到上皮变异，并且如表6所示，组织病理学评估表明，49％的PT(32/65，具有可评估的上皮隔室)可显示中度至充分发展的导管增生，一种上皮表型4。因此，乳腺纤维上皮肿瘤发展可能涉及这些肿瘤的上皮和基质隔室之间的复杂相互作用，需要进一步的研究。
表6.叶状肿瘤中的上皮增生
Figure BDA0001356160680000422
与BC相比，纤维上皮肿瘤中的突变谱和频率之间的比较显示出如图7中总结的显著差异。MED12、RARA、FLNA、SETD2和MLL2在FA和PT中通常突变，但在BCs中不常突变，而TP53、PIK3CA、GATA3和CDH1突变在纤维上皮肿瘤中是罕见的，但在BCs中普遍存在。这些突变模式以及纤维上皮相关的驱动突变的基质定位表明BC和乳腺纤维上皮肿瘤之间存在明显的分子致病机制，支持现有的指导，认为这两种肿瘤类型是不同的疾病实体，应该被不同地管理。
示例6
将全长RARA cDNA用3×Flag标记克隆到pcDNA3.1中。使用QuikChange II XL定点诱变试剂盒(Agilent)引入患者衍生的突变，如制造商的说明书所述。通过使用RARE(视黄酸反应元件)Cignal报道分析试剂盒(Qiagen)的荧光素酶测定来评估野生型和突变型RARA的转录活性。用来自试剂盒的RARE报告构建体和海肾(Renilla)荧光素酶构建体，以及如上所述的野生型或突变型RARA质粒瞬时转染HEK293细胞。然后将转染的细胞与指定浓度的RA孵育24小时。根据制造商的说明书，使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega)进行荧光酶测定。结果被标准化为共表达海肾。
对于哺乳动物双杂交测定，将RARA配体结合结构域克隆到pACT载体(Promega)中以产生诱饵质粒，将编码NCoR1蛋白CoRNR1肽区(THRLITLADHICQIITQDFARNQV)的cDNA序列插入pBIND中，从而产生猎物质粒。用CheckMate哺乳动物双杂交系统(Promega)，按照制造商的方案进行哺乳动物双杂交筛选。简言之，用指定浓度的RA处理转染的HEK293T细胞24小时，并测定荧光素酶活性。结果被标准化为共表达海肾。
如图4A所示，鉴于纤维上皮肿瘤中特异性的高频率的RARA突变，本研究随后对其功能重要性进行了调查。以前的研究已经确定，RARA是可以与共抑制子和共激活蛋白相互作用以调节基因表达的转录因子。图4B所示的结果显示，携带野生型和突变的RARA基因的纤维上皮肿瘤之间的RARA表达水平没有显著差异。然而，通过计算分析，几乎所有的RARA错义突变都被归类为破坏的或有害的，显示它们具有生物学意义。为了检查RARA突变对RARA介导的转录激活的影响，本公开以具有RARE(视黄酸反应元件)报道构建体和表达野生型RARA或RARA突变(F286del、S287L、N299H和R394Q)的cDNA载体转染HEK293细胞。然后在视黄酸(RA)刺激前、后测量RARA转录活性。在表达野生型RARA的细胞中，用RA刺激引起RARE相关转录的显著增加。相比之下，即使在RA刺激之后，表达RARA突变形式的细胞也显示出明显的转录活性的减弱，如图4C所示。本公开假设，RARA突变体转录活性的减弱，可能至少部分地，来自引起RARA与共抑制蛋白的结合增强的这些突变。为了测试这种可能性，本公开使用哺乳动物双杂交测定来探测野生型和突变型RARA蛋白与NcoR1共抑制因子(已知的RARA相互作用者)44的相互作用。与野生型RARA相比，RARA突变体在RA刺激之前和之后都表现出与NCoR1的更高的结合信号，如图4D所示，这表明突变体RARA是更有效的共抑制因子的招募者。总之，这些结果表明，在乳腺纤维上皮肿瘤中，RARA中的聚集突变可能促进RARA与共抑制因子的相互作用，从而改变RARA靶基因的转录。
示例7
为了证实突变体FLNA的表达，本研究还用可得到的新鲜冷冻组织对三个FLNA突变体样品的cDNA进行了测序。根据制造商推荐的方案，使用来自Invitrogen的SuperScriptIII First-Strand Synthesis SuperMix将一百个RNA转化为cDNA。根据表7中列出的引物进行PCR。如上所述，为了对基因组DNASanger测序，进行PCR扩增、测序和分级。
表7.用于FLNA cDNA测序的引物
引物 正向序列5'-->3' 反向序列5'-->3'
FLNA-A1191+Y1235 CTCTTCGCTGACACCCACATCC TCCACACTGAACTCAGTGGTGG
FLNA-G1578 CCCAGACCGTCAATTATGTGCC GGGATCTCGTCACCACCGTACT
最后，本公开研究了FAs是否以线性方式进展到恶性PT，如以前的研究6-10中提出的。使用相同的50基因目标组，实验测定了从同样患者(N＝3)分离的成对的并发FA和PT样区域。本公开还分析了来自两名起始诊断为FAs，但随后PT样复发患者的成对的纵向肿瘤。已经发现，即使在相同的患者中，较高级别的PTs比成对的FA区域具有的突变更多，特别是在表8和图10B所示的癌症相关基因中。在这些患者中，两名患者，其中一名为并发的，一名为纵向的，具有配对FA和PT共享共同的突变，与线性进展一致。然而，第三名患者(纵向的)显示具有不同MED12突变的FA和PT损伤，支持多病灶起源。剩余的两个并发病例在FA中没有显示突变，因此被认为是非信息性的。总体而言，这些观察结果表明，乳腺纤维上皮肿瘤发展可能并不总是遵循严格的线性进展模型，而是也可能由同一乳房中独立病变产生的多病灶方式引起。
本公开描述的乳腺纤维上皮肿瘤的基因组蓝图可能具有显著的临床意义。如前所述，PT的诊断和组织病理学分类常常对病理学家提出挑战。本公开内容为基于乳腺纤维上皮肿瘤的基因组学分类提供了基础，当与组织病理学标准结合使用时，其可以增加诊断准确性。例如，基于所获得的测序数据，先前在组织学上被分类为良性FA的样品004被发现除了具有MED12、RARA和FLNA突变之外(参见图9)，还具有R1B截断和EGFR激活突变，符合边界/恶性PT特征。该病例随后由2名乳腺病理学专家重新评估，并确认为临界PT。这种情况支持有序突变分析可能提高分类纤维上皮肿瘤的能力的观念，特别是与恶性状态相关的肿瘤。除了诊断之外，本发明还揭示PT的候选治疗靶标。具体来说，PIK3CA中的典型活化突变和EGFR的高水平扩增仅在较高级PT患者中发现，显示EGFR-和PI3K靶向治疗的潜在治疗机会。这对于侵略性恶性PT尤其重要，对于侵略性恶性PT，除了手术之外，目前还没有有效的治疗选择。同样令人感兴趣的是影响MED12和RARA的突变，其在纤维上皮肿瘤中频度很高，并且可能影响核激素受体信号34,45。本实验数据首次确定了实体瘤中错义RARA错义突变的作用，进一步强调了RARA在纤维上皮肿瘤中的重要性。因此，这些基因可能代表潜在的治疗靶点。
虽然所公开的方法和试剂盒已经以其特定程度的优选形式进行了描述，但是应当理解，本公开的优选形式仅作为示例给出，在不脱离本公开的范围的情况下，可以对构造的细节和部件的组合和布置进行诸多变化。
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Claims (11)

1.一种用于鉴定受试者的乳腺组织中的肿瘤类型的试剂盒，包括：
至少一个能够进行一种或多种基于核酸的测定的平台，依据第一测试模块和第二测试模块，鉴定从受试者获得的乳腺组织中存在的突变，所述第一和第二测试模块中的每一个均与一个或多个基因中的至少一个预定突变的检测相关联，并且均配置为提供与组织中检测到至少一个预定突变相对应的阳性结果或与样品中不存在可检测的预定突变相对应的阴性结果，所述第一测试模块与MED12基因突变的检测相关联，所述第二测试模块与FLNA基因突变以及SETD2基因突变的检测相关联；
其中，所述测试模块被配置为对应任何阳性结果发射可检测的或可视的信号；
其中，当第一测试模块和第二测试模块的结果分别为阳性和阴性时，肿瘤的类型被认为是纤维腺瘤，当第一测试模块和第二测试模块的结果均为阳性时，肿瘤的类型被认为是叶状肿瘤；
其中，所述FLNA基因突变对应于已翻译多肽中发现的p.A1191T、p.S1199L、p.P1244S、p.1687-1688TV>M和/或p.S1186W。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一个平台还包括第三测试模块，所述第三测试模块与NF1基因突变、RB1基因突变和/或PIK3CA基因突变的检测相关联。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一测试模块还与RARA基因突变的检测相关联。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一测试模块还与受试者TERT基因突变的检测相关联。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，当所述第一测试模块、所述第二测试模块以及所述第三测试模块的结果都为阳性时，肿瘤的类型被认为是恶性叶状肿瘤。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述MED12基因突变是位于MED12基因的外显子2的位置-8处的剪切位点突变，位于MED12基因cDNA的密码子44处的错义突变或位于MED12基因cDNA的密码子36处的错义突变。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RARA基因突变对应于已翻译多肽中发现的p.F286del、p.F287L、p.N299H、p.R394Q、p.L409del和/或p.G289R。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二测试模块还与受试者的MLL2基因突变的检测相关联。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述SETD2基因突变对应于已翻译多肽中发现的p.R1674-1675EA>D、p.K1587fs、p.Q1545*、p.Y1605fs和/或p.F1651fs。
10.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述TERT基因突变对应于位于TERT基因启动子区域的-124和/或-146处的错义突变。
11.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述MLL2基因突变对应于从其翻译的多肽中发现的p.V5482fs、p.Q1139*、p.G2668fs、p.Q3814*和/或p.L3457fs。
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