JP2007535939A - Erg遺伝子を単独でまたは前立腺癌中で過剰発現もしくは過少発現される他の遺伝子と組み合わせて用いる、前立腺癌を診断または治療する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書中に記載した発明は、その特許権使用料の支払いなしに政府での目的のために製造、認可、および使用し得る。
本出願は、その開示全体が信頼されて参考として組み込まれている、2004年5月7日出願の米国仮出願第60/568,822号および2004年10月27日出願の第60/622,021号の利益を主張する。
本発明は、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、および前立腺癌に関与している他の遺伝子、その発現産物、ならびにその誘導体および類似体に関する。本発明はさらに、治療組成物ならびに前立腺および他の関連する癌を含めた癌を検出、診断、および治療する方法に関する。
前立腺癌(CaP)は米国人男性において最も一般的な悪性疾患であり、癌死亡率の2番目に多い原因である(Landis他(1999)、Cancer J.Clin.、49:8-31;Jemal他(2004)、Cancer J Clin、54:8-29)。この疾患の発生および進行における分子的決定要因の理解は乏しい。近年では、CaPの分子遺伝学が集中的に調査されている。しかし、現在までに、ほとんどのCaPに共通する癌遺伝子、癌抑制遺伝子、または他の遺伝的変化は見つかっていない。p53、PTENおよびp27などの腫瘍抑制因子、またはBCL2、HER2およびC-MYCなどの癌遺伝子の変化は、原発性CaPのわずかな部分集合とのみ関連しており、より高頻度な関連は進行したCaPで観察される。
本発明の目的の1つは、癌、特に前立腺癌を検出するための方法およびキットを提供することである。これらの方法およびキットを用いて、癌マーカーとして役割を果たす核酸またはタンパク質を(定性的もしくは定量的に)検出することができる。例えば、前立腺癌細胞特異的遺伝子ERGの発現は、被験体由来の生体試料で検出された場合には、単独で、または他の前立腺癌細胞特異的遺伝子の発現を含む他の癌マーカーと組み合わせて、被験体において前立腺癌が存在することまたは被験体が前立腺癌を発生する素因がより強いことを示すために用いることができる。したがって、ERGの発現を、単独で、または表1〜6に同定した任意の遺伝子の発現と組み合わせて検出することを利用して、癌、特に前立腺癌の診断または予後診断をすることができる。
(a)生体試料を少なくとも第1および第2のオリゴヌクレオチドプライマーと、ハイブリダイズ条件下で混合するステップであって、第1のオリゴヌクレオチドプライマーはERG(配列番号1)、AMACR(配列番号3)、および/もしくはLTF(配列番号5)などの前立腺癌細胞特異的遺伝子、ならびに/またはDD3(配列番号4)に由来する標的配列中の第1の配列とハイブリダイズする配列を含み、第2のオリゴヌクレオチドプライマーは標的配列に相補的な核酸鎖中の第2の配列とハイブリダイズする配列を含み、第1の配列は第2の配列と重なり合わない、前記ステップと、
(b)生体試料中に標的配列が存在する場合に、複数の増幅産物を産生するために少なくとも1つのポリメラーゼ活性を加えるステップと、
(c)標的配列の少なくとも1つの増幅産物とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを加えるステップと、
(d)オリゴヌクレオチドプローブと少なくとも1つの増幅産物とのハイブリダイゼーションからシグナルが生じるかどうかを検出するステップであって、該シグナルの検出は生体試料中における前立腺癌細胞特異的遺伝子の発現を示す、前記ステップと、
を含む。
生体試料中の過剰発現されたERGおよび/もしくはAMACRなどの前立腺癌細胞特異的遺伝子、ならびに/またはDD3遺伝子の発現レベル(例えばmRNAまたはポリペプチド)を測定すること、および
ERG、AMACR、および/またはDD3遺伝子の発現レベルを、被験体における前立腺癌の存在または前立腺癌を発生する素因がより強いことと相関付けること、
を含む。
生体試料中のLTFなどの過少発現された前立腺癌細胞特異的遺伝子の発現レベル(例えばmRNAまたはポリペプチド)を測定すること、および
LTF遺伝子の発現レベルを、被験体における前立腺癌の存在または前立腺癌を発生する素因がより強いことと相関付けること、
を含む。
用語「CaP細胞特異的遺伝子」、すなわち「前立腺癌細胞特異的遺伝子」とは、表1〜6に特定した遺伝子を指す。この定義には、その発現が前立腺癌細胞中でアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされる、CaP細胞特異的遺伝子の類似体、例えば相同分子種およびホモログ、ならびにCaP細胞特異的遺伝子の機能的に等価な断片またはその類似体がさらに包含される。
本発明は、一貫したCaP上皮細胞特異的遺伝子発現シグネチャの同定および検証に部分的に基づいている。これらの遺伝子発現シグネチャは、強侵襲性および強侵襲性でない癌発生の経過の区別をつける前立腺上皮細胞中の遺伝子ならびに経路を同定することによって、進行した疾患を発生するリスクのあるCaPに罹患している患者を定める。2つの患者群を選択した。それらは、例えばPSAの再発、グリーソンスコア8〜9、T3cステージ、精嚢の侵襲、低分化腫瘍を示す、高リスク(HR)群と、例えばPSAの再発なし、グリーソンスコア6〜7、T2a〜T3bステージ、精嚢の侵襲なし、高または中分化腫瘍を示す、中リスク(MR)群である。2つの患者群を既知の危険因子、すなわち年齢、人種、およびCaPの家族歴に対応させた。2つの患者群の腫瘍および正常な前立腺からのLCM由来上皮細胞を、以下の実施例1に記載のようにGeneChip解析によって比較した。結果は、以下の実施例2に記載のように定量的逆転写酵素PCR(QRT-PCR)を用いて検証した。強侵襲性または強侵襲性でないCaPと最も高い関連性を有すると同定かつ検証された遺伝子群を用いて、CaPの進行の可能性のある経過を信頼性をもって判定することができる。
一実施形態では、本発明は、CaP細胞特異的遺伝子発現シグネチャについて生体試料のスクリーニングを行うことを含む、CaPの診断方法を含む。具体的には、本発明は、表1〜6に記載のCaP細胞特異的遺伝子の少なくとも1つ、特にERG遺伝子、AMACR遺伝子、LTF遺伝子またはERG遺伝子およびAMACR遺伝子の組合せについてスクリーニングを行うことを含む。また、本発明は、ERGおよびDD3遺伝子、またはERG、DD3、およびAMACR遺伝子の組合せの発現について生体試料のスクリーニングを行うことを含む、CaPの診断方法を含む。
本発明は、治療化合物(本明細書中で「治療剤」と呼ぶ)を投与することによる、様々な疾患および障害の治療または予防を提供する。「治療剤」には、それだけには限定されないが、ERGまたはLTFタンパク質ならびにその類似体および誘導体(断片を含む)(例えば本明細書中に上述のもの);ERGもしくはLTFタンパク質、類似体、または誘導体をコードしている核酸;ERGまたはLTFのアンチセンス核酸、ERGまたはLTFのドミナントネガティブ突然変異体、ERGまたはLTFに対するsiRNA、ERGまたはLTFの抗体およびERGまたはLTFのアゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。小分子を含めたERGまたはLTFのアゴニストおよびアンタゴニストは、本出願中に開示した方法、または任意の標準のスクリーニングアッセイを用いて同定することができ、特に前立腺癌細胞においてERGもしくはLTFの発現または機能をモジュレートする薬剤を同定する。例えば、ERGもしくはLTFの発現または機能は、例えば、患者から例えば組織試料(例えば生検組織から)、血液試料、または尿試料などの生体試料を得て、mRNAもしくはタンパク質のレベル、発現されたERGもしくはLTFのmRNAまたはタンパク質の構造および/あるいは活性についてin vitroでアッセイを行うことによって、容易に検出することができる。当分野で標準の多くの方法を用いることができ、それだけには限定されないが、キナーゼアッセイ、ERGもしくはLTFタンパク質を検出および/または可視化するための免疫アッセイ(例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降、次いでSDS-PAGE、免疫細胞化学など)、ならびに/あるいはERGもしくはLTFのmRNAを検出および/または可視化することによるERGもしくはLTFの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、in situハイブリダイゼーション、PCR(RT-PCRを含む)、TMA、NASAB、3SR、LCR、SDA、LAMPなど)が含まれる。
細胞の過剰増殖に関与する障害は、ERGの機能もしくは発現を拮抗する(低減させるまたは阻害する)、またはLTFの機能もしくは発現を増強する治療剤を投与することによって治療あるいは予防する。特定の実施形態では、ERGの機能は、ERGのアンチセンス核酸を用いることによって阻害される。本発明は、本明細書中に記載のERGヌクレオチドのうち任意のものに対するアンチセンス中の少なくとも10個、15個、100個、200個、500個、1000個、1500個、2000個、または2500個の連続したヌクレオチドの核酸の、治療的または予防的使用を提供する。特定の実施形態では、ERGのアンチセンス核酸は、ERGのヌクレオチド配列に対してアンチセンス方向で少なくとも10個、15個、100個、200個、500個、1000個、1500個、2000個、または2500個の連続したヌクレオチドを含む。本明細書中で使用するERG「アンチセンス」核酸とは、ある程度の配列相補性により定義した条件下でERG核酸の一部分とハイブリダイズすることができる核酸をいう。アンチセンス核酸は、ERG核酸のコード領域および/または非コード領域に相補的であり得る。そのようなアンチセンス核酸は、ERGの機能を阻害する治療剤として有用性があり、本明細書中に記載のような障害の治療または予防に用いることができる。
具体的な実施形態では、ERGまたはLTFの機能を促進するために、遺伝子治療によってERGもしくはLTFタンパク質またはその機能的な誘導体をコードしている配列を含む核酸を投与する。あるいは、ERGの発現または機能を拮抗阻害するためにアンチセンスERG配列を含む核酸を投与する。遺伝子治療とは、核酸を被験体に投与することによって行う治療を言う。
本発明はさらに、本発明のERGまたはLTF核酸(センスもしくはアンチセンス)あるいはERGまたはLTFポリペプチドを含めたERGまたはLTF治療剤を有効量で、下に記述するように製薬上許容される担体中に含む、医薬組成物を提供する。
ERG、LTF、および/またはAMACRタンパク質、類似体、誘導体、およびその断片、ならびにそれに対する抗体;ERG、LTF、DD3、および/またはAMACR核酸(ならびにその相補配列および相同配列)ならびに抗ERG、抗DD3、抗LTFおよび/または抗AMACR抗体を含めたそれに対する抗体が、診断において使用される。このような分子は、免疫アッセイなどのアッセイで用いて、ERG、LTF、DD3、および/もしくはAMACRの発現に影響を与える様々な条件、疾患、ならびに障害を検出、予後診断、診断、あるいはモニタリングするか、その治療、詳細には癌、より詳細には前立腺癌をモニタリングすることができる。具体的には、このような免疫アッセイは、特異的結合が起こることができる条件下で、個体に由来する試料を抗ERG、抗LTF、抗DD3、および/または抗AMACR抗体(タンパク質産物もしくは核酸のどちらかに対する)と接触させるステップと、抗体によるすべての特異的結合の量を検出または測定するステップとを含む方法によって実施する。一実施形態では、組織切片中の抗体のこのような結合を用いて、異常なERG、LTF、DD3、および/もしくはAMACRの局在化または異常な(例えば高い、低いもしくは存在しない)レベルのERG、LTF、DD3、および/もしくはAMACRを検出することができる。具体的な実施形態では、ERG、LTF、DD3、および/またはAMACRに対する抗体を用いて、生体試料(例えば、組織、血液、もしくは尿試料)をERG、LTF、DD3、および/またはAMACRの存在についてアッセイを行うことができ、異常なレベルのERG、LTF、DD3、および/またはAMACRは、例えば前立腺癌を含めた癌などの疾患状態の指標である。
患者の選択
検体は、ウォルターリード陸軍医療センター(Walter Reed Army Medical Center(WRAMC))で前立腺全摘除(RP)による治療を行った患者から、IRBが承認したプロトコルの下で入手した。300人を超える患者から、RP後に疾患増悪が中リスク(MR)または高リスク(HR)のいずれかである前立腺腫瘍を有していた2つの群を選択した。HR群は、PSAの再発、グリーソンスコア8〜9、T3cステージ、精嚢の侵襲、および低分化腫瘍細胞を示し、MR群はPSAの再発なし、グリーソンスコア6〜7、T2a〜T3bステージ、精嚢の侵襲なし、および高分化〜中分化腫瘍細胞を示した。LCM適合性の検体は、CaPの家族歴を有さない、年齢および人種が一致するHRまたはMR患者から選択した。
前立腺全摘除検体のOCT包埋かつヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色した凍結前立腺切片から、正常細胞および癌細胞のレーザー捕捉顕微解剖(LCM)を行った(試料1個あたり2000回のレーザーショット)。レーザー捕捉顕微解剖(LCM)は、顕微鏡下で、低エネルギー赤外線レーザーの集束パルスを用いて目的細胞を透明フィルムに選択的に付着させることによって、形態学的に定義された均一な細胞集団を複合組織から単離することを容易にする。Emmert-Buck他、Science(1996);274(5289):921-922;Schutz他、Nat Biotechnol(1998)16(8):737-742。
MicroRNAキット(Stratagene、カリフォルニア州La Jolla)を用いて全RNAをLCM試料から単離し、RiboGreen色素(Molecular Probes、オレゴン州Eugene)およびVersaFluor蛍光計(BioRad、カリフォルニア州Hercules)を用いて定量し、NKX3.1およびGPADHプライマーを用いたRT-PCRによって品質を試験した。RiboAmp RNA増幅キット(Arcturus、カリフォルニア州Mountain View)を用いて直鎖状RNAの増幅を行った。正確には、各患者からの正常組織および腫瘍組織のLCM由来上皮細胞からの2ngの全RNAを第1ラウンドの増幅に用いた。cDNA合成および精製後の第2ラウンドの増幅では、in vitro転写の際にその試料をビオチン標識し、これをGeneChip解析に用いた。
直鎖状に増幅したaRNAを高密度オリゴヌクレオチドヒトゲノムアレイ(HG U133Aアレイ)(Affymetrix、米国カリフォルニア州Santa Clara)とハイブリダイズさせた。このアレイは22,283組のプローブセットを含み、そのうち約18,000組が十分に注釈付けされた遺伝子を示し、残りが様々な発現配列タグ(EST)および仮想遺伝子を表す。MEGAスクリプトT7 in vitro転写キット(Ambion、米国テキサス州Austin)、cDNAならびにビオチン標識したUTPおよびビオチン標識したCTP(ENZO、米国ニューヨーク州Farmingdale)(34)を用いたin vitro転写によって、aRNAを用いてビオチン化を実施した。QIAGEN RNeasyスピンカラム(QIAGEN、カリフォルニア州Valencia)を用いて、製造者のプロトコルに従って、ビオチン標識したcRNAを精製した。40mM トリス-酢酸(pH8.1)、100mM 酢酸カリウム、および30mM 酢酸マグネシウムを含む40μlの反応混合物中でビオチン標識したcRNAの断片化を行い、94℃で35分間インキュベーションを行い、その後、氷上に置いた。
ビオチン標識および断片化したaRNAをHG U133Aアレイとハイブリダイズさせた。手短に述べると、1M NaCl、10mM トリス(pH7.6)、0.005% Triton X-100、50pM 対照オリゴB2(5' bioGTCAAGATGCTACCGTTCAG 3')(配列番号6)(Affymetrix)からなる220μlのハイブリダイゼーション溶液;Bio B(150pM)、Bio C(500pM)、Bio D(2.5nM)およびCre X(10nM)(American Type Tissue Collection、バージニア州ManassasおよびLofstrand Labs、メリーランド州Gaithersburg)の対照cRNAカクテル、0.1mg/mlのニシン精子DNAおよび0.05μg/μlの断片化し標識した試料cRNAを、95℃まで35分間加熱し、40℃まで冷却し、遠心分離によって清澄化した。ハイブリダイゼーションは42℃で、回転架台式ハイブリダイゼーションオーブン(Model 320、Affymetrix)内、60rpmで16時間行った。ハイブリダイゼーションののち、GeneChipアレイを、25℃で、6×SSPE-T緩衝液(1M NaCl、0.006M EDTA、および0.06M Na3PO4、0.005% Triton X-100、pH7.6)で、自動液体工学ステーションのプロトコルを用いて、10回洗浄した。GeneChipアレイは、0.5×SSPE-T、0.005% Triton X-100中、60rpm、回転架台式オーブン内で、50℃で20分間、インキュベーションを行った。GeneChipアレイを、6×SSPE-T緩衝液および1.0mg/mlのアセチル化ウシ血清アルブミン(Sigma)中の最終濃度10μg/mlのストレプトアビジンフィコエリスリン(Molecular Probes,Inc.、オレゴン州Eugene)染色溶液を用いて、室温、60rpmで15分間、染色した。GeneChipアレイを、室温で、6×SSPE-T緩衝液を用いて2回洗浄し、その後、GeneChip3.1ソフトウェア(Affymetrix)によって制御されるHP GeneArrayスキャナー(Hewlett-Packard、カリフォルニア州Santa Clara)を用いてスキャンした。
画像解析およびデータ収集
Affymetrix GeneChipマイクロアレイ解析ソフトウェア、バージョン3.1、およびAffymetrix Micro DBおよびデータマイニングツール バージョン2.0(Affymetrix)、マイクロソフトエクセル2000(Microsoft、ワシントン州Seattle)、ならびにStatisticaバージョン4.1(Stat Soft,Inc.、オクラホマ州Tulsa)を用いた。そのAffymetrixシステムでは、平均蛍光差は、それぞれの完全にマッチするプローブ細胞とその対照のミスマッチプローブ細胞との間の差の平均であり、それは転写物の発現レベルに直接関連している。比較ファイルは、ベースラインと実験試料との間の各転写物の存在量の相対変化(変化倍率)を示す。さらなる詳細かつ高度なバイオインフォマティクス解析のために、本発明者らはNHGRIのマイクロアレイデータ解析ソフトウェアおよびGeneSpringソフトウェア(Silicon Genetics、カリフォルニア州)を用いた。
クラスタリング解析には、米国立ヒトゲノム研究所(National Human Genome Research Institute(NHGRI))のマイクロアレイデータ解析ソフトウェアを用い、これにより、その遺伝子発現の統計的挙動に基づいて高リスク群および中リスク群の試料をよく分離された均一な群へと分配した。群をそれぞれクラスタリングするという目的を達成するため、試料間の全てのペアワイズ類似性を評価し、その後、平均連鎖アルゴリズムによってグループ化した。典型的にはピアソン相関係数またはユークリッド距離を用いて、類似性を定量化した。同じ距離マトリクスを用いて教師なし階層的クラスタリングおよび/または非階層的クラスタリングも行った。
本発明者らは、本発明者らによるいくつかの独立したデータセットの解析から得た遺伝子の識別可能性について試験を行った。AffymetrixオリゴヌクレオチドGeneChip Hum95Av2データをWelsh他(2001)、Singh他から得た。本発明者らの識別リストの遺伝子に対応するこれらのデータベース由来の遺伝子を選択し、その腫瘍特異的な発現強度および/または腫瘍 対 正常比を、データ解析セクションで上述したMDS解析に用いた。独立したデータセットについてその遺伝子の識別能を示すMDSプロットが得られた。
距離に基づいた多次元スケーリング(MDS)を用いたクラス予測解析を用いて、前立腺全摘除を受けた18人の患者における腫瘍および良性の上皮細胞間の発現差異を決定した。最小限の発現レベルを満たすすべての遺伝子を解析に含めた。本発明者らは、18人の患者すべての間での腫瘍および良性組織の特異的遺伝子発現プロフィールの区別を決定するための距離に基づいたMDSによるクラス予測解析に、18個の腫瘍および18個の正常試料すべての正規化した強度を用いた。すべての実験の完全なペアワイズ比較からのピアソン相関係数のマトリクスを用いて、本発明者らは、図2Aに二次元MDSプロットとして示される、腫瘍および良性組織間の遺伝子発現パターンにおける有意な全体的差異を観察した。各腫瘍および良性試料の位置は、MDSプロット中に二次元のユークリッド空間で示し、試料間の距離はそれぞれの個々の群内の試料間の相関(クラスター内距離)を反映しており、また、2つの群間の明確な分離(中心間距離)を反映している(図2A)。4566個の遺伝子の腫瘍および良性の強度の10,000回の並べ替えによって得た上位200個の遺伝子から、MDSプロットを得た。遺伝子発現の腫瘍特異的変化を定めるこれら200個の遺伝子のうち、53個の遺伝子が腫瘍試料中で発現がより高く、残り147個の遺伝子は良性試料中で発現がより高かった。18人の患者すべてからの腫瘍および良性試料を明確に識別する遺伝子の一部リストを表1に示す。本発明者らは、200個の識別遺伝子を用いた階層的クラスタリング解析も行った。階層的クラスタリングアルゴリズムは階層的樹形図をもたらし、これにより、16個の腫瘍試料および17個の良性試料の2つの主要な明確なクラスターが同定された(図2B)。
本発明者らは、18人の患者を2つの患者群に区別することができるかどうかを判定するために、HR群(9人の患者)およびMR群(9人の患者)からの腫瘍対良性の遺伝子発現強度の比(T/B比)(図3A)を、距離に基づいたMDS法を用いるクラス予測解析に用いた。本研究で用いた18個の腫瘍の病理的特徴および臨床的特徴は、HR群およびMR群で明らかに識別可能であった。HR群とMR群とで、発現パターンに有意な全体的差異が観察された。試料間の距離は、それぞれの個々の選択群内の相関の程度(クラスター内距離)、および2つの選択群間の明確な分離(中心間距離)をどちらも反映する(図3A)。T/B比に基づいた4868個の遺伝子の10,000回の並べ替えによって上位200個の遺伝子から得たMDSプロットを、図3Aに示す。MDS解析の上位200個の遺伝子のうち、135個がHR群で過剰発現されており、65個の遺伝子がMR群で過剰発現されていた。HR群とMR群とを識別するT/B比に基づくMDS解析によって同定された最良のp値を有する上位50個の遺伝子を、図3Bに記載する。HR群とMR群との間の識別の解釈に用いた手法は経験的なものであった。変化の分散が腫瘍試料すべてにわたる個々の遺伝子の「加重リスト」(図3B)は、CaPの病理的特徴および臨床的特徴と相関があるクラスを予測するための所与のクラスターの境界を定める。また、MDS解析の結果を検証し、また、別の解析手法を用いてこれら200個の遺伝子がクラス/群(HRおよびまたはMR)を予測する能力を試験するために、階層的クラスタリングも行った。その結果得られたT/B比の階層的樹形図は、HR群の9個の試料は非常にはっきりした密なクラスターを形成し、MR群の9個の試料も同様であったことを実証している(図3B)。
MDS解析を用いて、18人の患者のHR群とMR群とへの区別を決定した。HR群とMR群の間の腫瘍特異的発現における全体的な差異を二次元のMDSプロットとして示す(図3C)。18人の患者の腫瘍試料からの4115個の遺伝子の遺伝子発現強度の10,000回の並べ替えから得たMDSプロットにより、選択された上位200個の遺伝子に基づいてそれらをHR群とMR群とに区別した(図3C)。この200個の遺伝子のうち、94個がHR群で発現がより高く、残り106個の遺伝子はMR群で発現がより高かった。本発明者らは、教師ありMDS解析から得た200個の識別遺伝子を用いて階層的クラスタリング解析を行った。その結果得られた、18個の腫瘍試料の階層的樹形図は、HR群の9個の腫瘍試料およびMR群の9個の腫瘍試料が2つの密なクラスターに分離されたことを実証している。(図3D)。HR群とMR群とを識別するための「遺伝子クラスター」解釈を得るために本発明者らが図3の全体的な遺伝子発現の線形相関に基づいて使用した手法は、経験的なものであった。HR群とMR群とを識別する遺伝子を表7に示す。
本発明者らは、HR群の9個の良性試料およびMR群の9個の良性試料の正規化した強度に対し、腫瘍 対 腫瘍試料の遺伝子発現強度と同様のMDSおよびクラスター解析をクラス予測のために用いた。驚くべきことに、良性試料のMDSプロットで、HR群とMR群との間の明確な分離が示された(図3E)。HR群とMR群とで発現パターンに有意な全体的差異が観察された。MDSプロットは、良性 対 良性強度からの3358個の遺伝子の10,000回の並べ替えによって上位200個の遺伝子から得た(図3E)。この200個の遺伝子のうち、61個がHR群の良性試料中で過剰発現されており、残り139個の遺伝子がMR群中で過剰発現されていた。発現変化の分散が正常試料のすべてにわたる個々の遺伝子の「加重リスト」は、所定のクラスターが分類を予測する能力を示す。階層的クラスタリングアルゴリズムにより、HR群の9個の良性試料の類似の主要なクラスターおよびMR群の9個の良性試料のクラスターが同定された。
2つの独立したデータセットを用いて、予測された分類子のIn Silico解析を実施した。グリーソンスコアがこれらのデータに利用可能な唯一の基準であったので、HR群およびMR群はグリーソンスコアに基づいて選択した。すべてのMDS解析から少なくとも200個の遺伝子を抽出した(詳細な説明の方法を参照)。この200個の分類遺伝子からなる部分集合は、Welsh他2001およびSing他2002のデータ中に見つかった。上述の正確に類似したMDS解析(10,000回の並べ替え試験による測定でp<0.001)を、WelshおよびSinghのデータのこれら200個の遺伝子の発現強度を用いて行った。Welshデータ(図4A)およびSinghデータ(図4B)からの200個の遺伝子からなる部分集合からのわずか50個の遺伝子の腫瘍 対 良性比を用いたMDS解析により、HR群からの試料とMR群からの試料とが明確に分離された。したがって、この観察により、この小さな遺伝子セットの示差的発現プロフィールを用いて、その臨床病理的特徴に基づいて未知の前立腺癌試料が何であるかまたはそのクラスもしくは群を予測することができることが明らかとなった。この解析結果は、この少数の遺伝子の発現プロフィールが独立したデータセットにわたって保存されていることを示している。
前立腺癌との生物学的関連が示されたGeneChip解析によって同定された遺伝子の発現変化をさらに検証するために、AMACRおよびGSTP1を用いたリアルタイムPCR解析用のプライマーならびにプローブを得た。CaPにおいてAMACRは増加しておりGSTP1は低下していることが数グループの研究者によって既に報告されていることから、これらの遺伝子が検証目的に選択された。それぞれの試料が、20個の試料のうち18個でGSTP1遺伝子の独特のパターンのダウンレギュレーションおよびAMACRのアップレギュレーションを示した(図1)。他の2つの試料は有意な変化を示した(1.5倍未満の変化倍率)。
上述の実験で用いたAffymetrix GeneChipプローブセット(213541_s_at)およびTaqManプローブは、ERG1およびERG2アイソフォームの両方に特異的な領域を認識する(図6)が、アイソフォーム3〜9は排除する。他のプライマーおよびプローブを用いることもできるが、例として、ERG1およびERG2をどちらも認識するが、他のERGアイソフォームは認識しないTaqManプライマーおよびプローブは以下のとおりであった:
順方向プライマー:5'-AGAGAAACATTCAGGACCTCATCATTATG-3'(配列番号7)
逆方向プライマー:5'-GCAGCCAAGAAGGCCATCT-3'(配列番号8)
プローブ:5'-TTGTTCTCCACAGGGT-3'(配列番号9)
このプローブは、5'末端に付着させたレポーター色素である6-FAM、および3'末端に付着させたTAMRAを有する。3'-TAMRAはPCRの際に伸長を効率的に阻止する。
順方向プライマー:5'-CAGGTCCTTCTTGCCTCCC-3'(配列番号10)
逆方向プライマー:5'-TATGGAGGCTCCAATTGAAACC-3'(配列番号11)
プローブ:5'-TGTCTTTTATTTCTAGCCCCTTTTGGAACAGGA -3'(配列番号12)。
腫瘍 対 良性のERG1発現比率データは正常な分布を有していなかったので、表8に示すように、ウィルコクソン順位和検定を用いて様々な臨床病理的特徴とのその関係を解析した。
テトラサイクリン調節型哺乳動物発現ベクター内へのERG1のクローニング:
ERG1のcDNAを、テトラサイクリン調節型哺乳動物発現ベクター(pTet-off、EC1214A)内にサブクローニングした。作製された構築体には、pTet-off-ERG1(センス)、pTet-off-ERG1(アンチセンス)、pTet-off-FlagERG1(センス)およびpTet-off-FlagERG1(アンチセンス)が含まれる。リボプローブベクターpGEM中へのERG1構築体は最初にサウスカロライナ医科大学(Medical University of South Carolina)のDr.Dennis K.Watsonから得た。構築体はジデオキシシークエンシングおよびアガロースゲル解析によって確認した。
ERGに対する抗体は、完全長ERG1コード配列から導いたペプチド抗原を用いて作製した。抗原のエピトープは、ERG1/2/3を特異的に認識し、ETSファミリーの他のメンバーを認識しないように、注意深く選択した(図9)。所望の領域に最も高い親水性(-1.26および-0.55)ならびに抗原性を有する以下のペプチドを用いて抗体を作製した:
ペプチドM -50mer:
CKALQNSPRLMHARNTDLPYEPPRRSAWTGHGHPTPQSKAAQPSPSTVPK-[NH2](配列番号13)
ペプチドC -49mer:
CDFHGIAQALQPHPPESSLYKYPSDLPYMGSYHAHPQKMNFVAPHPPAL(配列番号14)
結合のために各ペプチドにシステインを付加した。ペプチドMは内部ペプチドであるので、C末端残基でアミド化されている。
アフィニティー精製した抗体の特徴づけを行うために、本発明者らは、リポフェクタミン試薬(Invitrogen、カリフォルニア州Carlsbad)を用いて、製造者の使用説明書に従って、HEK-293(ヒト胎児腎臓細胞系、ATCC、バージニア州Manassas)にERG1構築体pTet-off-ERG1(センス)およびpTet-off-FlagERG1(センス)を一過的にトランスフェクションした。プラスミドでトランスフェクションしなかったHEK-293は、トランスフェクション対照として役割を果たした。トランスフェクションの48時間後に細胞を収集し、免疫ブロット解析用に処理した。トランスフェクション後のERG1の発現を、上述のユニークなM-およびC-ERGエピトープに対して産生されたアフィニティー精製したポリクローナル抗血清を用いた免疫ブロッティングによって、測定した。内在性のERG1発現は、トランスフェクションしていないHEK-293細胞では検出されなかった。しかし、ERG抗体により、様々なERG1構築体でトランスフェクションしたHEK-293細胞ではERG1の発現が検出された。テトラサイクリン(2μg/ml)により、どちらのテトラサイクリン調節型構築体でも、すなわちpTet-off-ERG1(センス)およびpTet-off-FlagERG1(センス)の両方で、ERG1の発現が消滅した。M2-Flag抗体はFlagをタグづけしたERG1タンパク質のみを特異的に認識した。
CaP細胞中でのERGの過剰発現の頻度が驚くほど高いことから、やはりCaP細胞中で過剰発現される別の2つの遺伝子、すなわちAMACRおよびDD3とERGの発現について比較するに至った。本発明者らは、55人のCaP患者からの、レーザー顕微解剖した対応する腫瘍および良性の前立腺上皮細胞において、AMACRおよびDD3、ならびにERG遺伝子の遺伝子発現の定量的特徴を評価した。
順方向プライマー:5'-CACATTTCCAGCCCCTTTAAATA-3'(配列番号15)
逆方向プライマー:5'-GGGCGAGGCTCATCGAT-3'(配列番号16)
プローブ:5'-GGAAGCACAGAGATCCCTGGGAGAAATG-3'(配列番号17)。
CaP細胞中で最も一貫して過少発現された遺伝子の1つがLTFであった(表1)。LCM由来の腫瘍および良性の前立腺上皮細胞におけるQRT-PCR(TaqMan)による検証から、試験したCaP細胞の100%で、一貫した、腫瘍関連LTF過少発現が確認された(図1D)。品質管理として、最近同定されたCaP組織マーカーであるAMACRの発現、およびCaP中で一般に発現が低減しているかまたは発現が認められない遺伝子であるGSTP1の発現(Nelson他、Ann.N.Y.Acad.Sci.、952:135-44(2001))も測定した(それぞれ図1Bおよび1C)。LTFに類似した頑強な過少発現がGSTP1で観察され、一方でAMACRの発現の増加が、試験した腫瘍細胞の95%で認められ、これにより、腫瘍および良性のLCM検体の高品質ならびにQRT-PCRの信頼性が確認された。さらなる研究では、LTFの発現を、103人のCaP患者の顕微解剖した腫瘍および良性の前立腺上皮細胞において、QRT-PCRによって解析した。結果は最初の結果と一致しており、患者の76%(103人中78人)で腫瘍に関連した過少発現が示された。
Claims (33)
- 被験体における前立腺癌の診断または予後診断を行う方法であって、
(a)被験体由来の生体試料中のERG1遺伝子(配列番号1)の発現レベルを測定すること、および
(b)ERG1遺伝子の発現レベルを、被験体における前立腺癌の存在または被験体が前立腺癌を発生する素因がより強いことと相関付けること、
を含む方法。 - サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、および核酸増幅法から選択される1つまたは複数の方法によって前記発現レベルを測定する、請求項1に記載の方法。
- AMACR遺伝子(配列番号3)もしくはDD3遺伝子(配列番号4)、またはAMACR遺伝子およびDD3遺伝子の両方の、発現レベルを測定すること、ならびにERG1遺伝子とAMACR遺伝子、ERG1遺伝子とDD3遺伝子、またはERG1遺伝子とAMACR遺伝子とDD3遺伝子のその発現レベルを、被験体における前立腺癌の存在または被験体が前立腺癌を発生する素因がより強いことと相関付けることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 高ストリンジェンシー条件下で配列番号1とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを用いてERG1遺伝子の発現レベルを検出する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅法および高ストリンジェンシー条件下で配列番号1とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを用いてERG1遺伝子の発現レベルを検出する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが、6×SSC中65℃で48時間のハイブリダイゼーション、次いで0.1×SSX中50℃で45分間の洗浄を含む高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる、請求項5に記載の方法。
- 生体試料が組織試料、血液試料、または尿試料から選択される、請求項6に記載の方法。
- 生体試料が前立腺組織試料である、請求項7に記載の方法。
- 生体試料が尿試料である、請求項7に記載の方法。
- 生体試料中のERG1遺伝子の発現レベルを対照試料中のERG1遺伝子の発現レベルと比較し、ここで対照試料中のERG1遺伝子の発現と比較した場合の生体試料中での少なくとも2倍のERG1遺伝子発現の増加は、被験体における前立腺癌の存在または被験体が前立腺癌を発生する素因がより強いことを示す、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 対照試料が前記被験体由来の非癌性生体試料である、請求項10に記載の方法。
- 高ストリンジェンシー条件下で配列番号1(ERG1)またはその相補配列とハイブリダイズすることができる第1のオリゴヌクレオチドプローブ、および高ストリンジェンシー条件下で配列番号3(AMACR)またはその相補配列とハイブリダイズすることができる第2のオリゴヌクレオチドプローブを含む、前立腺癌を検出するためのキット。
- 高ストリンジェンシー条件下で配列番号1(ERG1)またはその相補配列とハイブリダイズすることができる第1のオリゴヌクレオチドプローブ、および高ストリンジェンシー条件下で配列番号4(DD3)またはその相補配列とハイブリダイズすることができる第2のオリゴヌクレオチドプローブを含む、前立腺癌を検出するためのキット。
- 高ストリンジェンシー条件下で配列番号4(DD3)またはその相補配列とハイブリダイズすることができる第3のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項12に記載のキット。
- 前記第1、第2、および第3のオリゴヌクレオチドプローブが担体に固定されている、請求項12〜14のいずれか一項に記載のキット。
- 担体が、高ストリンジェンシー条件下で表1〜6において同定した遺伝子とハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第3のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項12または13に記載のキット。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが配列番号1の少なくとも約20個の連続したヌクレオチド、またはその相補配列を含む、請求項12〜16のいずれか一項に記載のキット。
- 第1のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第2のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む請求項17に記載のキットであって、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーは配列番号1中の第1の配列とハイブリダイズする配列を含み、前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーは配列番号1に相補的な核酸鎖中の第2の配列とハイブリダイズする配列を含み、前記第1の配列は前記第2の配列と重なり合わず、前記第1および第2のオリゴヌクレオチドプライマーは配列番号1中の標的配列を増幅することができる、前記キット。
- 高ストリンジェンシー条件が、6×SSC中65℃で48時間のハイブリダイゼーション、次いで0.1×SSX中50℃で45分間の洗浄を含む、請求項18に記載のキット。
- ERG1遺伝子の発現レベルを用いて前立腺癌の病理ステージを示すかまたは予測する、請求項1に記載の方法。
- ERG1遺伝子の発現レベルと、AMACR遺伝子もしくはDD3遺伝子、またはAMACRおよびDD3遺伝子の両方の、発現レベルとを用いて、前立腺癌の病理ステージを示すかまたは予測する、請求項3に記載の方法。
- 生体試料中のERG遺伝子の発現の検出方法であって、
(a)前記生体試料を少なくとも第1および第2のオリゴヌクレオチドプライマーと、ハイブリダイズ条件下で混合するステップであって、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーは標的配列中の第1の配列とハイブリダイズする配列を含み、前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーは前記標的配列に相補的な核酸鎖中の第2の配列とハイブリダイズする配列を含み、前記第1の配列は前記第2の配列と重なり合わず、前記標的配列は配列番号1の断片を含む、前記ステップと、
(b)前記生体試料中に前記標的配列が存在する場合には、複数の増幅産物を産生するために少なくとも1つのポリメラーゼ活性を加えるステップと、
(c)前記標的配列の少なくとも1つの増幅産物とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを加えるステップと、
(d)前記オリゴヌクレオチドプローブと前記少なくとも1つの増幅産物とのハイブリダイゼーションからシグナルが生じるかどうかを検出するステップと、
を含む方法。 - AMACR、DD3、およびLTFから選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を検出することをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- AMACRの発現を検出することをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- DD3の発現を検出することをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- LTFの発現を検出することをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- AMACRおよびDD3の発現を検出することをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- 生体試料が前立腺組織試料、血液試料、または尿試料である、請求項22〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが高ストリンジェンシー条件下で配列番号1またはその相補配列とハイブリダイズすることができる、請求項28に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが、6×SSC中65℃で48時間のハイブリダイゼーション、次いで0.1×SSX中50℃で45分間の洗浄を含む高ストリンジェンシー条件下で、配列番号1とハイブリダイズすることができる、請求項29に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブ、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、または第2のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号1の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを有する配列番号1の断片またはその相補配列を含む、請求項30に記載の方法。
- 前立腺癌を診断または予後診断する方法であって、
(a)被験体由来の生体試料中のLTF遺伝子(配列番号5)の発現レベルを測定すること、および
(b)LTF遺伝子の発現レベルを、被験体における前立腺癌の存在または被験体が前立腺癌を発生する素因がより強いことと相関付けること、
を含む方法。 - 免疫組織化学、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、ELISA、および核酸増幅法から選択される1つまたは複数の方法によって前記発現レベルを測定する、請求項32に記載の方法。
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