CN102657878B - Ints6基因小激活rna在制备抗前列腺癌药物中的应用 - Google Patents
Ints6基因小激活rna在制备抗前列腺癌药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102657878B CN102657878B CN201210130905.1A CN201210130905A CN102657878B CN 102657878 B CN102657878 B CN 102657878B CN 201210130905 A CN201210130905 A CN 201210130905A CN 102657878 B CN102657878 B CN 102657878B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ints6
- gene
- cell
- dsints6
- rna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 101001033788 Homo sapiens Integrator complex subunit 6 Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 102100039133 Integrator complex subunit 6 Human genes 0.000 title abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 12
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 title abstract 5
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 title description 22
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 title description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 16
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 claims description 10
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 7
- 239000003667 hormone antagonist Substances 0.000 claims description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 76
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 abstract description 50
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 abstract description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 abstract description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 abstract description 2
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 abstract 3
- 206010062904 Hormone-refractory prostate cancer Diseases 0.000 abstract 2
- 230000004034 genetic regulation Effects 0.000 abstract 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 abstract 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 abstract 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 12
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 12
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 6
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 238000009261 endocrine therapy Methods 0.000 description 4
- 229940034984 endocrine therapy antineoplastic and immunomodulating agent Drugs 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 3
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 108091029810 SaRNA Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 101150057630 par-4 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000010224 Castration-Resistant Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 101710092889 Integrator complex subunit 6 Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000000819 phase cycle Methods 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 229940078677 sarna Drugs 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供一种靶向上调INTS6基因的小RNA在制备抗激素非依赖性前列腺癌药物中的应用。所述的小RNA的核苷酸序列由4条21个核苷酸的正义链和反义链组成,每条链的3’端均悬挂突出两个核苷酸,通常为dTdT,中间19个核苷酸配对。本发明通过特定序列的小双链RNA诱导激素非依赖性前列腺癌细胞中INTS6基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的增殖和运动能力,达到抑制肿瘤生长和进展的目的。本发明的小RNA操作简单,成本较低;用量较少,20nM的转染浓度即可达到良好的激活效果;激活作用确切,靶基因mRNA和蛋白水平均有升高。另外saRNA诱导基因表达属于表观遗传学调节,不破坏基因组的完整性,因此应用较为安全。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及靶向上调INTS6基因的小激活RNA在制备抗前列腺癌,提别是激素非依赖性前列腺癌药物中的应用。
背景技术
前列腺癌正严重威胁着我国50岁以上男性的健康。内分泌治疗是临床上治疗前列腺癌的常用方法。但是绝大多数前列腺癌患者在内分泌治疗1~2年内病情出现进展,继续应用内分泌治疗药物,并不能控制病情发展。前列腺癌细胞由激素依赖转变为激素非依赖,是前列腺癌内分泌治疗失败、患者死亡最主要的原因。
2006 年Li等报道靶向基因启动子区的dsRNA(双链RNA,double-stranded RNA)能引起序列特异性的基因转录激活。并把此现象命名为RNA引起的基因激活(RNA activation,RNAa),而把这样的dsRNA称为小激活RNAs (small activating RNAS,saRNAs)。该项技术通过改变染色体的结构导致内源性靶基因表达增强。它能激活许多失活的抑癌基因或增加活性较低的基因的表达量,从而起到治疗肿瘤的作用。
INTS6是一种抑癌基因,全称Integrator complex subunit 6 gene,1999年由I Wieland和Zhengnan Yin两个团队同时报道,在《Oncogene》杂志的同一期刊登。INTS6定位于人类染色体13q14.2附近,由于这一区段在许多肿瘤细胞中存在缺失,因此INTS6又被命名Delete In Cancer 1(DICE1)。INTS6调控的信号网络仍未完全阐明,有研究指出INTS6可能参与WNT信号通路的调节,在肿瘤中扮演抑癌基因的角色。INTS6在前列腺癌组织和细胞株中存在表达缺失。文献报道,杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)和表观遗传学改变双重打击造成前列腺癌中INTS6表达下调。INTS6成为RNA激活干预前列腺癌的理想靶标。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向上调INTS6基因的小RNA在制备抗激素非依赖性前列腺癌药物中的应用。本发明通过特定序列的小双链RNA诱导激素非依赖性前列腺癌细胞中INTS6基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的增殖和运动能力,达到抑制肿瘤生长和进展的目的。
所述靶向上调INTS6基因的小RNA的核苷酸序列由2对(4条)21个核苷酸的正义链和反义链组成,其序列分别为:dsINTS6-374 S(SEQ ID NO:1):5’-CCA CUU UAC UCA ACC CUU C [dTdT] -3’, dsINTS6-374 AS (SEQ ID NO:2):5’-GAA GGG UUG AGU AAA GUG G [dTdT] -3’;dsINTS6-390 S (SEQ ID NO:3):5’-CUA ACC AGG UGU UUG UCC A [dTdT] -3’,dsINTS6-390 AS (SEQ ID NO:4):5’-UGG ACA AAC ACC UGG UUA G [dTdT] -3’。每条链的3’端均悬挂突出两个核苷酸(通常为dTdT,中间19个核苷酸配对)。
本发明的有益之处:小RNA操作简单,成本较低;用量较少,20nM的转染浓度即可达到良好的激活效果;激活作用确切,靶基因mRNA和蛋白水平均有升高。另外saRNA诱导基因表达属于表观遗传学调节,不破坏基因组的完整性,因此应用较为安全。
附图说明
图1是不同位点dsRNAs对PC3细胞内INTS6 mRNA表达的影响程度,数据来源于3次独立实验的平均值和标准差。
图2是不同位点dsRNAs对Du145细胞内INTS6 mRNA表达的影响程度,数据来源于3次独立实验的平均值。
图3是dsINTS6-374/-390上调PC3细胞内INTS6蛋白的表达,β-actin表达量作为内参。
图4是dsINTS6-374/-390上调Du145细胞内INTS6蛋白的表达,β-actin表达量作为内参。
图5是MTT法提示dsINTS6-374/-390能明显抑制PC3细胞活性,数据以平均值±标准差表示。
图6是MTT法提示dsINTS6-374/-390能明显抑制Du145细胞活性,数据以平均值±标准差表示。
图7是dsINTS6-374/-390处理后PC3细胞平板克隆形成能力减弱。
图8是流式细胞仪检测提示dsINTS6-374/-390能诱导PC3细胞发生G1期周期阻滞,数据来源于3次独立的实验,结果以平均值和标准差显示。
图9是dsINTS6-374/-390处理组穿至transwell膜下表面的PC3细胞数较少,Migration:细胞迁移实验;invation:细胞侵袭实验。
图10是dsINTS6-374/-390处理组穿至transwell膜下表面的Du145细胞数较少,Migration:细胞迁移实验;invation:细胞侵袭实验。
图11是dsINTS6-374/-390处理后,PC3裸鼠移植瘤生长较对照组明显放缓。
图12是免疫组化显示处理组移植瘤组织中,肿瘤细胞尤其是胞核中INTS6表达增强。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质,本发明结合附图和实施例作进一步的说明。但这些具体实施方案不是要以任何方式限制所要求保护的发明范围。
实施例1 dsRNAs上调前列腺癌细胞中INTS6基因的表达
实验方案:
1.细胞系:人激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3、Du145(上海细胞所)
2.dsRNAs合成:dsRNAs均由上海吉凯生物技术有限公司化学合成。
3.实验分组:
20nM的dsINTS6-374和-390组、无意义dsRNA对照组(dsControl)和空白转染试剂组(mock)。dsControl组dsRNA与已知人基因组序列非同源: 正义链, 5’-ACU ACU GAG UGA CAG UAG A[dTdT]-3’(SEQ ID NO:5);反义链, 5’-UCU ACU GUC ACU CAG UAG U[dTdT]- 3’(SEQ ID NO:6)。
4.细胞培养及转染:
细胞培养在含10%灭活新生牛血清的RPMI1640培养基中,放置于CO2含量为5%的37oC细胞培养箱内。转染前一天细胞传代后种于培养板中,密度大约30~40%。dsRNAs经过脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染入细胞,以6孔板为例(其余培养器皿根据底面积之间的比例调整试剂量),每孔取3μl 20μM dsRNAs储存液和5μl脂质体分别溶于250μl无血清培养基,5min后混合,室温静置20min后加入培养板中,补充含血清培养基使dsRNA终浓度为20nM,作用持续48至144小时。
5.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR):
利用 Trizol Reagent将各实验组的细胞提取总RNA ,紫外分光光度计准确定量。取3μg总RNA进行逆转录。GAPDH上游引物(SEQ ID NO:7):5’-ATGGCACCGTCAAGGCTGAG-3’,下游引物(SEQ ID NO:8):5’-GCAGTGATGGCATGGACTGT-3’,INTS6 上游引物(SEQ ID NO:9):5’- TGCCCATCTTACTGTTCCTG-3’,下游引物(SEQ ID NO:10):5’- TCTTCGAAAGTGACCAGC-3’。采用SYBR Green染料法进行荧光实时定量PCR(real-time PCR)检测,结果按照2-delta法标准化到对照组进行比较。
6.蛋白印迹(Western Blot):
细胞转染72 h后,收集细胞,利用RIPA细胞裂解液提取总蛋白,BCA(二喹啉甲酸)法测定蛋白浓度,并调整待测样本的蛋白质含量。每孔加20ug的蛋白电泳、转膜、封闭,把膜放入稀释的一抗中,温和振荡3h后置4度冰箱中过夜。再温和振荡2 h ,回收一抗后在Tris缓冲液中洗膜30 min,中间更换Tris缓冲液2-3次,分别把膜置于稀释的二抗中温和振荡1h,后在Tris缓冲液中洗膜30 min,中间换液3-4次。曝光、显影及定影,用底片扫描仪扫描X线胶片。
结果如下:
1.两对dsRNAs对激素非依赖前列腺癌细胞内INTS6 mRNA表达的影响
对激素非依赖前列腺癌细胞PC3和Du145分别转染20nM dsRNAs(dsINTS6-374、-390)以及对照dsRNA(dsControl)并设置空白对照组,72小时后利用RT-PCR检测INTS6的mRNA表达情况,与对照组相比,dsINTS6-374、-390作用组细胞内的INTS6 mRNA明显增加,是对照组的2倍以上(参见图1,图2)。
2.dsINTS6-374/-390上调前列腺癌细胞内INTS6蛋白的表达
进一步通过Western Blot检测PC3和Du145细胞转染72小时后各作用组细胞内INTS6蛋白表达情况,与对照组相比,dsINTS6-374/-390作用组细胞内的INTS6蛋白增加(参见图3、4)。
实施例2 dsINTS6-374/-390上调INTS6在体外对激素非依赖前列腺癌细胞的抑制作用
实验方案:
1.细胞系:同实施例1。
2.dsRNAs合成:同实施例1。
3.实验分组:同实施例1。
4.细胞培养及转染:同实施例1。
5.四唑盐(MTT)比色法:
取对数生长期的癌细胞,胰酶消化制成单细胞悬液,以每孔2000~5000个细胞的密度将细胞种于96孔培养板内(为保证结果的准确性,在实验前测定细胞的贴壁率、倍增时间以及不同接种数目细胞的生长曲线,再确定每孔细胞的接种数,以保证培养终止时细胞不至于过满),将培养板置于37oC,5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱内培养过夜后,吸去旧培养液,加入20nM dsINTS6-374/-390,并设立阴性对照(dsControl)和空白对照(Mock)。作用48~144小时后,每孔加入20μl MTT溶液(5 mg/ml),37oC孵育4小时后弃培养基,每孔加入DMSO 150μl,室温放置10分钟,待结晶溶解后用酶标仪在490 nm波长处测定其吸光度(OD)值。按下述公式计算细胞存活率:存活率=治疗组OD值/空白对照组OD值×100%;
6.平板克隆形成
经胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390、dsControl以及Mock组处理72h后的细胞,分别取400个细胞种于六孔板的孔中培养,直至出现肉眼可见的克隆形成,100%甲醛固定细胞,结晶紫染色,观察各处理组细胞克隆形成的数量。
7.流式细胞仪检测细胞周期
经胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390、dsControl以及Mock组处理72h后的细胞,70%酒精固定,用PBS洗涤并细胞计数,取含有1×105个细胞的悬液,RNA酶处理细胞去除RNA,4oC、2000rpm离心5分钟,弃上清液,每个样本加入500μl的PI染料,室温避光保存30分钟, Beckman Coulter FC500流式细胞仪检测,粗数据使用modfit软件判读,计算G0/G1、S和G2/M各期细胞的比例。
8.Transwell穿膜实验检测细胞运动能力
利用孔径8μm(略小于细胞直径)的transwell小室检验细胞的迁移和侵袭能力。小室的上室采用无血清的培养基,小室的下室采用含20%血清的培养基,由此建立趋化梯度。经胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390、dsControl以及Mock组处理72h后的细胞,分别将8×104个不同处理组的细胞置于上室的低血清环境中培养,比较一定时间后趋化至下室的细胞数,从而评价细胞的运动能力。其中,使用无基质胶的transwell小室评价细胞的迁移能力,使用基质胶预先处理的transwell小室评价细胞的侵袭能力。
结果如下:
1. dsINTS6-374/-390抑制激素非依赖前列腺癌细胞的活性
为了明确dsINTS6-374/-390对激素非依赖前列腺癌细胞生长和活性的抑制程度,我们进行了MTT试验。在96孔板中,分别对PC3和Du145细胞转染20nM的dsINTS6-374/-390和dsControl RNA,并设置空白对照组mock,每个组共设置4个复孔,结果均标准化到mock组(以mock组为1)。参见图5、6,dsINTS6-374/-390对两种癌细胞的抑制作用出现在48h时间点,且持续至144h。在转染144h时,dsINTS6-374/-390对两种癌细胞的抑制率均超过50%。
2. dsINTS6-374/-390能抑制激素非依赖性前列腺癌细胞的体外克隆形成能力
利用平板克隆形成,研究dsINTS6-374/-390抑制激素非依赖性前列腺癌细胞活性是否与细胞增殖减弱有关。对前列腺癌细胞PC3分别转染20nM的dsINTS6-374/-390和对照dsRNA(dsControl),观察处理后每400个细胞最终在平板中形成克隆的数量。结果显示,与对照RNA组相比,dsINTS6-374/-390处理的PC3细胞形成克隆的数目更少。(参见图7)
3. dsINTS6-374/-390能诱导激素非依赖性前列腺癌细胞发生G1期阻滞
对前列腺癌细胞PC3和Du145分别转染20nM的dsINTS6-374/-390和对照dsRNA(dsCon),72小时后利用PI染色,通过流式细胞仪检测研究细胞周期分布。如图8所示,dsINTS6-374/-390处理组G0/G1期细胞增加而S期细胞减少。
4. dsINTS6-374/-390能抑制激素非依赖性前列腺癌细胞的体外运动能力
利用transwell穿膜实验,研究dsINTS6-374/-390处理后激素非依赖性前列腺癌细胞PC3和Du145运动能力的变化。结果显示,与对照RNA组相比,dsINTS6-374/-390处理的PC3和Du145穿至transwell膜下表面的细胞数较少。(参见图9、10)
实施例3 dsINTS6-374上调INTS6在体内抑制激素非依赖性前列腺癌的生长
实验方案:
1.细胞系:人激素非依赖前列腺癌细胞株PC3。
2.动物模型:采用4周龄BALB-c裸鼠,皮下荷瘤。成瘤后分non-sense dsRNA对照组和dsINTS6-374/-390 RNA组进行干预,每组4只。
3.给药方案:瘤内注射30μg脂质体包被的RNA,3天一次,共三周。
4.结果观察:同步观察瘤体大小变化情况。最后处死裸鼠,免疫组化染色观察肿瘤组织中INTS6蛋白的表达。
结果如下:
小激活RNA能够激活PC3裸鼠皮下移植瘤中INTS6的表达,同时抑制移植瘤的生长
利用PC3细胞在裸鼠皮下成瘤,移植瘤内重复注射dsINTS6-374/-390小激活RNA,移植瘤生长受到抑制,同时瘤组织内INTS6表达增强。(参见图11、12)。
<110> 浙江大学
<120> INTS6基因小激活RNA在制备抗前列腺癌药物中的应用
<160> 10
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸
<400> 1
cca cuu uac uca acc cuu ctt
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸
<400> 2
gaa ggg uug agu aaa gug gtt
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸
<400> 3
cua acc agg ugu uug ucc att
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸
<400> 4
ugg aca aac acc ugg uua gtt
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸
<400> 5
ACU ACU GAG UGA CAG UAG ATT
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 最后两位为脱氧核糖核苷酸
<400> 6
UCU ACU GUC ACU CAG UAG UTT
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 作为GAPDH PCR扩增的上游引物
<400> 7
ATG GCA CCG TCA AGG CTG AG
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 作为GAPDH PCR扩增的下游引物
<400> 8
GCA GTG ATG GCA TGG ACT GT
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 作为PAR-4基因 PCR扩增的下游引物
<400> 9
TGC CCA TCT TAC TGT TCC TG
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 作为PAR-4基因 PCR扩增的下游引物
<400> 10
TCT TCG AAA GTG ACC AGC
Claims (3)
1.一种靶向上调INTS6基因的小RNA在制备抗激素非依赖性前列腺癌药物中的应用,所述靶向上调INTS6基因的小RNA的核苷酸序列由4条21个核苷酸的正义链和反义链组成,其序列分别为:dsINTS6-374 S:5’-CCA CUU UAC UCA ACC CUU C dTdT -3’,dsINTS6-374 AS:5’-GAA GGG UUG AGU AAA GUG G dTdT -3’;dsINTS6-390 S:5’-CUA ACC AGG UGU UUG UCC A dTdT -3’,dsINTS6-390 AS:5’-UGG ACA AAC ACC UGG UUA G dTdT -3’。
2.根据权利要求1所述的一种靶向上调INTS6基因的小RNA在制备抗激素非依赖性前列腺癌药物中的应用,其特征在于,每条链的3’端均悬挂突出两个核苷酸,为dTdT,中间19个核苷酸配对。
3.根据权利要求1所述的一种靶向上调INTS6基因的小RNA在制备抗激素非依赖性前列腺癌药物中的应用,其特征在于,所述药物还有制剂允许的赋形剂。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210130905.1A CN102657878B (zh) | 2012-05-01 | 2012-05-01 | Ints6基因小激活rna在制备抗前列腺癌药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210130905.1A CN102657878B (zh) | 2012-05-01 | 2012-05-01 | Ints6基因小激活rna在制备抗前列腺癌药物中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102657878A CN102657878A (zh) | 2012-09-12 |
CN102657878B true CN102657878B (zh) | 2014-04-16 |
Family
ID=46767542
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210130905.1A Expired - Fee Related CN102657878B (zh) | 2012-05-01 | 2012-05-01 | Ints6基因小激活rna在制备抗前列腺癌药物中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102657878B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016145608A1 (zh) * | 2015-03-17 | 2016-09-22 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种小激活rna及其制备方法和应用 |
EP3778893A4 (en) * | 2018-04-10 | 2022-04-20 | Ractigen Therapeutics | P21 GENE EXPRESSION ACTIVATION METHOD |
CN111849968A (zh) * | 2019-04-30 | 2020-10-30 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 寡核苷酸分子及其在急性间歇性卟啉症治疗中的应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2005245815B2 (en) * | 2004-05-07 | 2011-06-09 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Methods of diagnosing or treating prostate cancer using the erg gene, alone or in combination with other over or under expressed genes in prostate cancer |
WO2011135396A1 (en) * | 2010-04-30 | 2011-11-03 | Cellectis | Method for modulating double-strand break-induced homologous recombination |
-
2012
- 2012-05-01 CN CN201210130905.1A patent/CN102657878B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (12)
Title |
---|
.2009,1-9. * |
.2012,第41卷(第1期),117-121. * |
.2012,第4卷(第2期),65-68. * |
Cancer Cell International> * |
Stephanie Filleur等.INTS6/DICE1 inhibits growth of human androgen-independent prostate cancer cells by altering the cell cycle profile and Wnt signaling.< * |
Stephanie Filleur等.INTS6/DICE1 inhibits growth of human androgen-independent prostate cancer cells by altering the cell cycle profile and Wnt signaling.<Cancer Cell International>.2009,1-9. |
华中科技大学学报(医学版)> * |
张萍等.RNAa基因表达调控模式.< * |
张萍等.RNAa基因表达调控模式.<华中科技大学学报(医学版)>.2012,第41卷(第1期),117-121. |
现代泌尿生殖肿瘤杂志> * |
陈忠等.RNA激活研究进展.< * |
陈忠等.RNA激活研究进展.<现代泌尿生殖肿瘤杂志>.2012,第4卷(第2期),65-68. |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102657878A (zh) | 2012-09-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11235011B2 (en) | Use of alphavirus in preparation of antitumor drugs | |
CN101951926B (zh) | 包含微小rna-21抑制剂的增强辐射敏感性的组合物 | |
CN102657878B (zh) | Ints6基因小激活rna在制备抗前列腺癌药物中的应用 | |
CN104774929A (zh) | miR-455-3p在食管鳞状细胞癌中的诊断、治疗和预后的应用 | |
CN108245526A (zh) | 一种肝癌细胞生长抑制剂及其在肝癌预后判断中的应用 | |
CN102641508A (zh) | 靶向上调par-4基因小rna在制备抗膀胱癌药物中的应用 | |
CN106591308A (zh) | 一种改善人肺腺癌厄洛替尼的耐药性的shRNA | |
CN102031256B (zh) | 人miR-485-5p反义核酸及其应用 | |
CN104147616B (zh) | 双链rna或其修饰物在制备肿瘤抑制剂中的应用 | |
CN109745335A (zh) | miR-218在制备乳腺癌化疗药物增敏剂中的应用 | |
CN105031611A (zh) | netrin-1蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途 | |
CN101220360B (zh) | 一种抑制caspase-3基因表达的siRNA序列 | |
CN102031254B (zh) | 人miR-150反义核酸及其应用 | |
CN102604946B (zh) | 抑制肿瘤转移的siRNA及其应用 | |
CN107582525A (zh) | Trim31抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制pdac增殖能力药物中的应用 | |
CN111534516B (zh) | 一种snord83a基因的靶向抑制剂及其用途 | |
CN115317625B (zh) | 一种小干扰rna在制备改善鼻咽癌预后的药物中的应用 | |
CN102031255B (zh) | 人miR-223反义核酸及其应用 | |
CN114908160B (zh) | Snord60作为子宫内膜癌诊断的标志物及其应用 | |
CN102140462B (zh) | 人miR-1260反义核酸及其应用 | |
CN102140467B (zh) | 人miR-365反义核酸及其应用 | |
CN101220359B (zh) | 一种抑制bak基因表达的siRNA序列 | |
CN105779452A (zh) | 一种抑制肿瘤生长的寡聚核酸及其应用 | |
CN103937800A (zh) | 靶向多基因的siRNA分子及其抑制肿瘤的应用 | |
CN109971762A (zh) | 日本血吸虫eIF4A基因的siRNA及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140416 Termination date: 20150501 |
|
EXPY | Termination of patent right or utility model |