CN103937800A - 靶向多基因的siRNA分子及其抑制肿瘤的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向多基因的siRNA分子及其抑制肿瘤的应用。所述的靶向多基因的siRNA分子由正义链、反义链1、反义链2和反义链3组成，其中正义链为 ：5’-CCACAAUGGCUGAGCACUUGGAACAAGACCGAAUGGAUACGGAGUACCCUGAUGAGAUCNn-3’，反义链1：5’-AAGUGCUCAGCCAUUGUGGNn-3’；反义链2：5’-UAUCCAUUCGGUCUUGUUCNn-3’；反义链3：5’-GAUCUCAUCAGGGUACUCCNn-3’，其中，N是胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT；n代表N的个数，n是0～2的整数。本发明可以用于制备同时调节细胞中NET-1、EMS1和VEGF基因基因功能的药物，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移和侵袭，达到治疗肿瘤的目的。
Description
技术领域
本发明涉及靶向多基因的siRNA分子，尤其是同时靶向肿瘤相关基因NET-1、EMS1和VEGF基因的siRNA分子及其抑制肿瘤应用。
背景技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-strand RNA，dsRNA)引发其同源信使RNA(messenger RNA，mRNA)酶解的一种转录后基因沉默形式(Nature.1998，391：806-811)。长双链RNA进入细胞后，被Dicer酶结合并切割。Dicer酶的切割产物长度通常为20～25bp，且在每条链的3’末端有2个核苷酸悬垂的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)。siRNA的一条链掺入到RNA-诱导的沉默复合物中(RNA-induced silencing complex，RISC)，与互补RNA的序列配对。RISC首先介导siRNA双链解旋，与RISC耦合的单链的siRNA以序列特异的方式与靶mRNA结合，之后由RISC的催化组分切割靶mRNA。切割靶mRNA可以抑制其翻译，最终抑制该基因的表达。现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。
RNAi在医药领域有广阔的应用前景，如抗病毒、抗肿瘤和抗炎症等。双链干扰核酸可设计成能被Dicer酶剪切的称做Dicer底物的长双链形式，或者是短的、不需Dicer酶剪切直接作为RISC底物的形式。合成的双链RNA与目的基因序列互补，导入细胞或生物体后，被内源的遗传物质识别，激活RNAi途径。利用这种机制，RNAi使靶基因的表达水平急剧下降。
RNAi技术开辟了一个全新的治疗领域，目前国际上已有数十种siRNA药物进入临床阶段。其中有应用siRNA治疗老年性黄斑变性、糖尿病黄斑水肿、呼吸道合胞病毒病、实体肿瘤、肝癌、以及急性肾损伤等疾病。
在最近的研究中，陈莉等人报道了NET-1和Cortactin的蛋白在HCC组织中相对癌旁组织显著过表达。前期研究表明NET-1的表达与细胞增殖有关，显著上调癌症的形成(Chen L等.Tumori.2010，96：744-750)。该结果显示，NET-1的表达和功能可能会成为癌症发生发展的潜在靶标。
最新报道的由EMS1(细胞骨架重组相关基因)编码的Cortactin(皮层肌动蛋白结合蛋白)，与癌症转移相关的(Kellye C.CellAdhesion&Migration5：2，187-198；March/April2011)。Cortactin可以结合到Arp2/3复合物上，激活Arp2/3复合物介导的肌动蛋白聚合，促进细胞迁移(Kowalaki JR.J Cell Sci，2005，118(Pt1)：79-87)。以往的研究表明，Cortactin表达与门静脉癌栓和肝外转移显着相关，说明Cortactin的高表达可能是肝癌侵袭性增加的因素之一。
血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)是诱导血管生成的促进因子，可促进内皮细胞分裂与增殖、促进血管生成以及增加微、小静脉的通透性，诱导丝氨酸蛋白酶与间质胶原酶的表达，使细胞质钙聚集，诱导血管生成，在创伤愈合、胚胎发育、肿瘤生长和转移过程中起着重要的作用。VEGF在成熟器官中表达较低，在一些代谢旺盛、血供丰富的组织细胞中表达较高，尤其是在肿瘤组织中。随着研究的深入，VEGF促进肿瘤血管生成的作用和与人类癌症的发病机制的关系是确定的，因此，抑制VEGF途径被确认为是一种重要的有效的抗癌治疗方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种靶向多基因的siRNA分子，尤其是指同时靶向NET-1、EMSl及VEGF基因的siRNA分子及其抑制肿瘤应用。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是提供了一种同时靶向NET-1、EMS1和VEGF基因的siRNA分子，其特征在于，由正义链、反义链1、反义链2和反义链3组成，其序列为：
正义链：
5’-CCACAAUGGCUGAGCACUUGGAACAAGACCGAAUGGAUACGGAGUACCCUGAUGAGAUCNn-3’(SEQ ID NO：1)，
反义链1：5’-AAGUGCUCAGCCAUUGUGGNn-3’(SEQ ID NO：2)；
反义链2：5’-UAUCCAUUCGGUCUUGUUCNn-3’(SEQ ID NO：3)；
反义链3：5’-GAUCUCAUCAGGGUACUCCNn-3’(SEQ ID NO：4)。
其中，N是胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT；n代表N的个数，n是0～2的整数。
换言之，上述双链siRNA分子的主干序列为：
正义链：
5’-CCACAAUGGCUGAGCACUUGGAACAAGACCGAAUGGAUACGGAGUACCCUGAUGAGAUC-3’(SEQ ID NO：5)，
反义链1：5’-AAGUGCUCAGCCAUUGUGG-3’(SEQ ID NO：6)；
反义链2：5’-UAUCCAUUCGGUCUUGUUC-3’(SEQ ID NO：7)；
反义链3：5’-GAUCUCAUCAGGGUACUCC-3’(SEQ ID NO：8)。
对于上述双链siRNA分子而言，
优选地，所述N为dT，且n为2。
优选地，所述的n为0。
本发明提供了上述的同时靶向NET-1、EMS1和VEGF基因的siRNA分子在制备同时抑制细胞中NET-1、EMS1和VEGF基因功能的药物中的用途。
本发明还提供了上述的同时靶向NET-1、EMS1及VEGF基因的siRNA分子在制备治疗肝癌药物中的用途。
体外实验证明，本发明的siRNA分子的反义链可特异性地与NET-1、EMS1和VEGF基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移和侵袭，达到治疗肿瘤的目的。
本发明的siRNA分子可以应用于制备同时调节细胞中NET-1、EMS1和VEGF基因功能的药物中发挥RNA干扰的作用，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移和侵袭，达到治疗肿瘤的目的。
附图说明
图1是实时定量PCR检测不同实验组NET-1、EMS1和VEGF基因的mRNA表达水平结果图。其中，A为不同实验组NET-1基因mRNA相对表达水平；B为不同实验组EMS1基因mRNA相对表达水平，C为不同实验组VEGF基因mRNA相对表达水平。
图2是MTT法检测不同实验组的SMMC-7721细胞生长结果图。其中，A为不同实验组在不同时间点的生长曲线图；B为不同实验组在不同时间点的OD值柱形图。
图3是流式细胞术检测不同实验组SMMC-7721细胞凋亡结果图。其中，A为不同实验组的FCM分析结果图；B为Annexin V和PI双染阳性细胞的定量柱形图。图4是细胞划痕实验检测不同实验组SMMC-7721细胞迁移结果图。其中，A为不同实验组在0h、24h、48h和72h的细胞迁移照片；B为72h细胞相对迁移距离的柱形图。
图5是Transwell细胞侵袭实验检测不同实验组SMMC-7721细胞侵袭结果图。其中，A为不同实验组在0h、24h、48h和72h的细胞侵袭照片；B为72h不同实验组侵袭细胞数的柱形图。
具体实施方式
为方便起见，在下文中，术语“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”可以互换，它们表示的意思和范围相同。
其中，siRNA是正义链和反义链退火形成的双链结构。
本发明的siRNA分子来源于针对NET-1、EMS1及VEGF基因开放阅读框的功能保守区而设计。
siRNA的制备可采用多种方法，比如：化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好地获得基因沉默效率。
本发明的siRNA分子可以作为制备调节细胞中NET-1、EMS1及VEGF基因功能药物的有效成分，尤其是抗肿瘤药物的有效成分。
出于应用目的，可将siRNA分子作为药物直接给药于受药者身上特定部位，比如肿瘤组织。
本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持siRNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。
任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学上可接受的载体及佐剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持siRNA分子的活性。
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。
实施例1
步骤1、细胞培养：
肝癌细胞株SMMC-7721购于上海中科院细胞研究所，用含10％FBS(Gibco公司)的DMEM培养基(Gibco公司)培养，所述培养基中加入青霉素和链霉素(Invitrogen公司)，青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL和100μg/mL，培养于37℃二氧化碳培养箱。
步骤2、siRNA体外转染
设计同时靶向NET-1、EMS1及VEGF基因的多靶siRNA序列：Multi-targetsiRNA(Mtg_siR)，设计阴性对照序列(NC)作为对照(NC_siR)。同时单靶siRNA(NET-1_siR、EMS1_siR、VEGF_siR)作为对照，序列见表1。
取步骤1中培养得到的处于对数生长期的细胞，96孔板的接种密度为5×104/孔、24孔板按1.5×105/孔、6孔板为1×106/孔接种细胞，将其分为实验组和不转染siRNA的未处理组，所述的实验组包括NC_siR组、Mtg_siR组、NET-1_siR组、EMS1_siR组和VEGF_siR组。各实验组采用相应的siRNA按操作说明用脂质体2000(Invitrogen公司)转染到细胞内，使siRNA终浓度为50nM，37℃培养4h后，培养液换成含10％FBS(Gibco公司)的DMEM培养基(Gibco公司)。
所有的实验均重复3次，结果均用平均值±SD表示，用SPSS17.0进行统计学分析。统计学差异用单因素方差分析和双侧t检验。P＜0.05表明差异显著。
表1：siRNA序列及对照序列
实施例2
实时定量PCR(RT-qPCR)检测mRNA表达水平：
用实施例1的方法进行细胞培养和siRNA体外转染。所述的体外转染采用96孔板。
转染48h后，细胞总RNA用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取，并按操作说明用RT-QPCR试剂盒(Biomics公司)进行检测。引物序列见表2，PCR反应条件为：95℃预变性5min，40个循环为95℃变性20s、58℃退火30s、72℃延伸30s。
表2：RT-QPCR检测用引物
如图1所示，Mtg_siR抑制SMMC-7721细胞中相应靶基因的mRNA表达。如图1A所示，与未处理组及NC_siR组相比，NET-1_siR、EMS1_siR、VEGF_siR及Mtg_siR处理组中的NET-1的mRNA水平分别下降至27％、57％、72％和31％，差异均有统计学意义(P＜0.05)。如图1B所示，与未处理组及NC_siR组相比，NET-1_siR、EMS1_siR、VEGF_siR及Mtg_siR处理组中的EMS1的mRNA水平分别下降至66％、28％、68％和14％，差异均有统计学意义(P＜0.05)。如图1C所示，与未处理组相比，与未处理组及NC_siR组相比，NET-1_siR、EMS1siR、VEGF_siR及Mtg_siR处理组中的VEGF的mRNA水平分别下降至60％、62％、29％和18％，差异均有统计学意义(P＜0.05)。Mtg_siR处理组由于单靶siRNA处理组(P＜0.05)，且各单靶siRNA之间有协同抑制作用(P＜0.05)，NC_siR处理组中各靶基因mRNA表达水平与相应未处理组相比，差异无显著统计学意义(P＞0.05)。
实施例3
MTT法检测细胞增殖：
用实施例1的方法进行细胞培养和siRNA体外转染，所述的体外转染采用96孔板。转染前待细胞汇合度达到60-80％时，将对数生长期的细胞铺到96孔细胞培养板中，接种密度为5×104/孔，重复3个孔，作为未转染的样本(即转染0时的样本)。
分别测定转染24h、48h、72h时的NET-1_siR转染组、EMS1_siR转染组、VEGF_siR转染组、Mtg_siR转染组、NC_siR转染组和未处理组样本，以及上述的未转染的样本的OD值，所述测定方法为：分别在24h、48h、72h染色，每孔加入10μL MTT(南京生兴生物)，37℃避光放置4h；每孔加150μL DMSO，37℃放置10min；吹打混匀后取120μL于另一干净96孔板中，并取120μL DMSO作为空白对照调零，酶标仪(Bio-Rad公司)上测OD，波长为490nm。记录结果，绘制细胞生长曲线。
如图2所示，与未处理组及NC_siR组相比，NET-1_siR、EMS1_siR、VEGF_siR及Mtg_siR具有显著的细胞生长速度在48h及72h时明显减慢(P＜0.05)，且Mtg_siR组的细胞生长速度明显低于单靶siRNA组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，各单靶siRNA组之间相比差异无统计学意义(P＞0.05)，NC_siR组与未处理组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。
实施例4
流式细胞术(FCM)测定细胞凋亡：
用实施例1的方法进行细胞培养和siRNA体外转染。所述的体外转染采用6孔板。
用Annexin V-FITC凋亡测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)进行Annexin-V/propidium iodide(PI)双重分析。SMMC-7721细胞转染48h后，用0.25％胰酶消化和pH为7.4的PBS缓冲液洗两遍。1×106细胞用500μL结合缓冲液重悬，并按操作说明用5μL FITC标记的Annexin-V染色，加5μLPI并室温避光孵育10min。不同实验组细胞用BD FACS Calibur(BD Bioscience公司)进行流式细胞测试，数据用CellQuest data acquisition分析软件分析(BDBioscience公司)。
如图3所示，用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡，并用流式细胞仪检测。如图3B所示，Mtg_siR处理组凋亡率为28.93±1.93，对照组NET-1_siR、EMS1_siR和VEGF_siR凋亡率分别为15.46±1.47％、10.64±2.91％、15.82±1.40，未处理组和NC_siR的凋亡率分别为2.40±0.54％和3.08±0.97％。与未处理组相比，siRNA处理组凋亡率明显增高(P＜0.05)，且单靶siRNA组的细胞凋亡率显著低于Mtg_siR组，差异均有统计学意义(P＜0.01)，各单靶siRNA组之间相比差异无统计学意义(P＞0.05)，NC_siR组与未处理组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。
实施例5
细胞划痕实验检测细胞迁移：
用实施例1的方法进行细胞培养和siRNA体外转染。
用密度为1.5×105/孔的SMMC-7721细胞铺到24孔板里并转染。48h后，用移液器吸头在汇合的细胞中划痕，然后用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤，加入无血清的DMEM培养基(Gibco公司)。划痕后24h、48h、72h后拍照观察细胞迁移，实验做3组平行，每板拍4个视野。
用细胞划痕实验检测Mtg_siR对SMMC-7721细胞的迁移抑制作用。siRNA处理SMMC-7721细胞后，分别在0h、24h、48h和72h，显微镜下观察细胞迁移情况，如图4所示，并计算各处理组相对于0h时的细胞划痕间距的迁移距离(表3)。
表3：各处理组细胞不同时间相对迁移距离
| 组别 | 24h | 48h | 72h |
| 未处理组 | 0.23±0.015 | 0.57±0.006 | 0.76±0.012 |
| NC_siR | 0.24±0.025 | 0.58±0.015 | 0.77±0.015 |
| Mtg_siR | 0.15±0.020 | 0.29±0.015 | 0.33±0.015 |
如图4所示，与未处理组及NC_siR组相比，Mtg_siR处理组迁移距离均较小(P＜0.05)，NC_siR组与未处理组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。
实施例6
Transwell细胞侵袭实验：
用实施例1的方法进行细胞培养和siRNA体外转染。所述的体外转染采用24孔板。
转染后72h用24-well membrane filters(美国Coming Bioscience公司)检测细胞迁移。1.5×105个细胞铺到上室中以向含血清的DMEM培养基(Gibco公司)中迁移24h。留在上室中的细胞用棉签去除，迁移到下室中的细胞用10％甲醛固定30s。最后，细胞用0.1％结晶紫染色4min，随后用pH为7.4的PBS缓冲液洗3遍。细胞在200倍放大视野中计数，每个条件下计数5个视野。
如图5所示，用Transwell细胞侵袭实验检测Mtg_siR对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响，Mtg_siR及对照siRNA转染48h后，用条件培养基刺激细胞，观察细胞侵袭效果，与未处理组(163.67±3.79)相比，Mtg_siR(123.00±4.58)显著减少(P＜0.05)，未处理组和NC_siR组侵袭细胞均数差异无统计学意义(P＞0.05)。
Claims (5)
1.一种同时靶向NET-1、EMS1和VEGF基因的siRNA分子，其特征在于，由正义链、反义链1、反义链2和反义链3组成，其序列为：正义链：
5’-CCACAAUGGCUGAGCACUUGGAACAAGACCGAAUGGAUACGGAGUACCCUGAUGAGAUCNn-3’，
反义链1：5’-AAGUGCUCAGCCAUUGUGGNn-3’；
反义链2：5’-UAUCCAUUCGGUCUUGUUCNn-3’；
反义链3：5’-GAUCUCAUCAGGGUACUCCNn-3’，
其中，N是胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT；n代表N的个数，n是0～2的整数。
2.如权利要求1所述的同时靶向NET-1、EMS1和VEGF基因的siRNA分子，其特征在于，所述N为dT，且n为2。
3.如权利要求1所述的同时靶向NET-1、EMS1和VEGF基因的siRNA分子，其特征在于，所述的n为0。
4.权利要求1-3中任一项所述的同时靶向NET-1、EMS1和VEGF基因的siRNA分子在制备同时抑制细胞中NET-1、EMS1和VEGF基因功能的药物中的用途。
5.权利要求1-3中任一项所述的同时靶向NET-1、EMS1和VEGF基因的siRNA分子在制备治疗肝癌药物中的用途。
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