CN102793930A

CN102793930A - 一种抑制肿瘤细胞增殖的新型双功能3p-siRNA及其应用

Info

Publication number: CN102793930A
Application number: CN2011101347699A
Authority: CN
Inventors: 陈忠斌; 陈晓娟; 邢雅玲
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2011-05-24
Filing date: 2011-05-24
Publication date: 2012-11-28

Abstract

本发明涉及一种高效、特异性抑制肿瘤相关survivin基因表达并抑制肿瘤细胞增殖的双功能siRNA(3p-siRNA)及其应用。该抗肿瘤3p-siRNA一方面通过RNAi机制特异性沉默肿瘤靶基因survivin表达，另一方面还具有RIG-I依赖的激活细胞因子如干扰素(IFN)表达活性，通过细胞抗肿瘤天然免疫反应发挥其抗肿瘤效应，是一种兼备RNAi和激活细胞IFN天然免疫效应的双功能新型抗肿瘤3p-siRNA。该抗肿瘤3p-siRNA毒性小，能高效激活RIG-I介导的宿主IFN表达，同时能显著抑制肿瘤细胞内survivin蛋白的表达以及肿瘤细胞的增殖，并且能够促进肿瘤细胞凋亡。本发明所述的抗肿瘤双功能3p-siRNA采用体外转录方法和人工化学合成方法制备，可以应用于人类肿瘤治疗药物的研究和开发。

Description

一种抑制肿瘤细胞增殖的新型双功能3p-siRNA及其应用

技术领域：

本发明涉及一种抑制肿瘤细胞增殖，同时激活细胞内干扰素天然免疫信号通路的双功能3p-siRNA及其应用。

背景技术：

Survivin于1997年被首次报道，是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族的一个独特成员。人survivin由142个氨基酸组成，分子量是16.5kD，是哺乳动物IAP家族中最小的成员。人survivin基因位于染色体17q25，全长1417kb。Survivin的主要功能是调控细胞有丝分裂和抑制细胞凋亡，在胚胎和胎儿器官中广泛高度表达，在大多数结束分化的正常组织中均未被检测到，但在60余种肿瘤组织或细胞中均过量表达，并为肿瘤细胞生存所必需。对表达survivin的肿瘤，肿瘤病人总体存活率降低，复发率升高，并对化疗等产生抗性。因为survivin在肿瘤组织中过量表达具有高度特异性，并为肿瘤细胞生存所必需，所以它是将抗凋亡与细胞恶变直接联系起来的重要蛋白；survivin也因此被公认为是癌症治疗的一个重要靶点。

RNA干扰技术是基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象，由dsRNA、siRNA或shRNA介导，通过对同源互补靶基因mRNA的降解而实现特异性基因沉默的技术。RNAi是以survivin为靶向的抗肿瘤治疗重要策略之一。2003年，Carvalho团队首先使用RNAi特异性地抑制了HeLa细胞内survivin的表达。另据报道，靶向survivin的siRNA可以增加突变型P53的肺癌细胞对阿霉素的敏感性，且能够促进细胞凋亡。与传统的反义技术相比，RNAi以其高效、高特异性等优点，拥有独特的优势及广泛的应用前景。

3p-siRNA是一类具有21-25个核苷酸的特殊dsRNA分子，其序列与靶mRNA序列具有同源性，其双链均由5’端3个磷酸基团和3’端羟基基团构成，每条单链的3’端均有2个突出的非配对碱基(如图1所示)。3p-siRNA具有的RNAi效应不受影响。对siRNA分子的5’端进行磷酸化修饰，生成5’-ppp-siRNA(3p-siRNA)，可以结合并活化维甲酸诱导基因I(retinoic-acid-inducible gene I，RIG-I)受体，是RIG-I的特异性配体，能够激活RIG-I介导的天然免疫系统，诱导抗病毒和抗肿瘤细胞因子如干扰素(IFN)表达。

3p-siRNA将RNAi机制与天然免疫应答机制相结合，可以有效抑制肿瘤细胞增殖，同时增强肿瘤细胞的免疫原性，这一发现为肿瘤药物治疗提供新的思路。

肿瘤的发生、发展是多基因、多因素的复杂过程。由于肿瘤细胞的可塑性，单靶标治疗方法对其治疗效果常常不理想。本发明设计了一种靶向survivin基因的新型双功能3p-siRNA，不仅能激活RIG-I介导抗肿瘤天然免疫信号通路，同时能通过RNAi特异性沉默survivin基因表达，这两种效应在限制肿瘤增殖和分化过程中具有非常重要的作用，可以开发成新型抗肿瘤药物。

发明内容：

本发明的目的是：利用3p-RNA激活RIG-I信号通路的性质，将这一特性拓展用于siRNA分子，提供一种特异性沉默survivin基因、同时又激活细胞内IFN天然免疫通路的新型抗肿瘤双功能核酸类药物：靶向survivin的5’-ppp-siRNA(3p-siRNA)。

具体来说，本发明针对人survivin基因的特定区域(人survivin cDNA表达启动子下游约40bp处)，设计并通过体外转录方法获得能够特异性沉默survivin基因表达的siRNA(全长21bp)，并对该分子进行5’端磷酸化修饰，最终获得目的3p-siRNA，其双链均由5’端3个磷酸基团和3’端羟基基团构成，每条单链的3’端均有2个突出的非配对碱基。

上述3p-siRNA也可选择survivin基因的其他特定区域作为靶序列，按照碱基互补原则进行设计，并通过体外转录法或者人工化学合成法获得。

本发明所述双功能3p-siRNA分子的突出优点体现在：(1)特异性：基于RNA干扰机制，特异性沉默survivin基因的特定区域，有效抑制survivin蛋白表达，并且克服了基因沉默中的“脱靶”效应。(2)高效性：该分子具有双重功能，既可以特异性沉默survivin基因，又具有RIG-I依赖的激活细胞IFN天然免疫反应功能，共同实现抑制肿瘤细胞增殖的目的。

本发明提供的3p-siRNA可以被制备成包括临床使用的片剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂、胶囊、滴丸、颗粒剂等适宜的剂型，用于治疗各种肿瘤，也可与其他肿瘤治疗药物或肿瘤放疗等方法联合应用，以增强疗效。

附图说明：

图1为抗肿瘤3p-siRNA结构示意图。

图2为体外转录方法生成3p-siRNA的流程。

图3为3p-siRNA激活细胞内RIG-I介导的IFN表达通路(A、B：HEK293T细胞，3p-siRNA转染18小时；C：A549细胞3p-siRNA转染18小时；均采用双荧光素酶报告基因检测法进行检测)。

图4为3p-siRNA抑制A549细胞内survivin蛋白表达(A：100nmol/L 3p-siRNA转染48小时，B：100nmol/L sp-siRNA转染72小时；1：vector，2：Lipo2000，3：NC-siRNA，4：siRNA，5：3p-siRNA)。

图5为3p-siRNA抑制A549细胞增殖(A：100nmol/L 3p-siRNA转染48小时；B：100nmol/L3p-siRNA转染72小时；C：100nmol/L 3p-siRNA转染后24小时对细胞进行总剂量4Gy的⁶⁰Coγ射线辐照，而后继续培养48h；各组均MTT法检测存活的细胞数)。

图6为3p-siRNA促进A549细胞凋亡(100nmol/L 3p-siRNA转染后24小时对细胞进行总剂量4Gy的60Coγ射线辐照，而后继续培养48小时，采用Annexin V-FITC/PI双染色法，经流式细胞仪检测凋亡细胞量)。

具体实施方式：

一、抗肿瘤3p-siRNA的序列设计与体外合成：

首先，选取人survivin基因cDNA启动子下游45-65bp区域作为靶序列，设计并化学合成DNA模板(5’段包含T7启动子)，然后分别用双链RNA的正义链和反义链的DNA模板(5’末端突出的鸟嘌呤)转录生成两条单链3p-siRNA(长约21bp)，然后将这两个反应体系混合并孵育过夜，再退火即形成双链siRNA，并进行纯化：用DNAse-I(Epicenter)消化DNA模板，用酚/氯仿抽提去除额外的盐和NTPs，经醋酸钠和冰乙醇沉淀、70％乙醇漂洗后，最后用TE Buffer溶解沉底。如图2所示。

使用碱性磷酸酶(CIAP，TaKaRa)去除3p-siRNA 5’末端的5’-ppp基团，生成siRNA作为对照，方法如下：2μg体外转录的3p-siRNA用6U CIAP、40U RNase inhibitor在CIAP Buffer中50℃处理60min，接着用苯酚/氯仿抽提、醋酸钠和冷乙醇沉淀、70％乙醇漂洗，最后用TEBuffer溶解沉底。CIAP Buffer成分是：500mmol/LTris-HCl(pH 9.0)和10mmol/L MgCl₂。

二、通过以下实例对本发明所述抗肿瘤3p-siRNA的细胞水平毒性、对RIG-I介导IFN通路的激活作用、对survivin蛋白表达的抑制作用、对肿瘤细胞增殖的抑制作用以及作用特征进行评价，但不限于以下实例。所用生物实验及相关技术主要包括：细胞培养、质粒转染、细胞增殖检测实验、细胞凋亡检测实验、双荧光素酶报告基因分析和Western蛋白印迹分析等，具体实施过程如下：

实施例一：抗肿瘤3p-siRNA激活细胞内RIG-I介导的IFN表达通路

1.HEK293T细胞和A549细胞培养

细胞在含10％胎牛血清及200μg/ml的DMEM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将细胞接种于24孔板(3×10⁶细胞/孔)，继续培养。

2.双荧光素酶报告基因分析法检测抗肿瘤3p-siRNA激活IFN表达

接种至24孔板内的细胞培养24小时，待长至40-60％细胞汇合后，在无血清状态下，使用Lipofectamine 2000试剂将IFN-β荧光素酶报告基因与Flag-hRIG-I共同转染HEK293T或A549细胞，同时转入海肾虫荧光素酶报告基因(TK-PRL)作为内参；转染后24小时，用siRNA、3p-siRNA、CIAP处理的3p-siRNA或作为对照的NC-siRNA、poly(I:C)转染细胞，继续培养18小时，利用双荧光素酶报告基因测定试剂盒检测荧光素酶活性。

3.结果

在HEK293T细胞中，未转染RIG-I时3p-siRNA只能微弱地诱导IFN表达，但是共转RIG-I后3p-siRNA强烈地诱导IFN表达；3p-siRNA(100nmol/L)作用18小时后能够显著激活RIG-I介导的IFN表达，而经CIAP处理后的3p-siRNA(即3p-siRNA+CIAP)以及未进行5’端磷酸化修饰的siRNA则不具有激活RIG-I介导干扰素表达的功能。在A549细胞中也观察到同样的结果。如图3所示。

实施例二：3p-siRNA抑制肿瘤细胞内survivin蛋白表达

1.A549细胞培养

A549细胞在含10％胎牛血清及200μg/ml的DMEM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将细胞接种至96孔板(1×10⁴细胞/孔)，继续培养。

2.转染

接种至96孔板内的细胞培养24小时，待长至40-60％细胞汇合后，在无血清状态下，采用Lipofectamine 2000转染试剂将3p-siRNA或siRNA转入A549细胞，同时转入NC-siRNA或Lipofectamine 2000作为对照。

3.Western印迹法检测细胞内survivin蛋白表达

分别于转染后48、72小时后提取细胞总蛋白，采用Western印迹法检测survivin蛋白的表达。细胞总蛋白采用BCA法进行定量，而后进行SDS-PAGE电泳、转膜至PVDF膜、5％脱脂奶粉封闭、一抗孵育(兔survivin单克隆抗体，1∶1000稀释，室温孵育4小时)、洗膜、二抗孵育(羊抗兔IgG，1∶2000稀释，室温孵育2小时)，最后采用化学发光法显影。

4.结果

转染后48小时，3p-siRNA(100nmol/L)和siRNA(100nmol/L)均可以显著抑制细胞内survivin蛋白表达；转染后72小时，3p-siRNA和siRNA也具有同样的作用。如图4所示。

实施例三：3p-siRNA抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡

1.A549细胞培养

2.MTT法检测A549细胞增殖

接种至96孔板内的细胞培养24小时，待长至40-60％细胞汇合后，在无血清状态下，采用Lipofectamine 2000转染试剂将siRNA、3p-siRNA或CIAP处理的3p-siRNA转入A549细胞，同时转入NC-siRNA或Lipofectamine 2000作为对照。分别于转染后48、72小时结束培养，弃去细胞培养液，参照MTT使用说明书，每孔加入MTT 10μl，避光培养4小时，加入formazan溶解液，37℃孵育4小时，经多标记酶联免疫检测仪测量570nm吸光度值。为了观察3p-siRNA对射线诱导下肿瘤细胞增殖的影响，在转染后24小时对细胞进行总剂量4Gy的⁶⁰Coγ射线辐照，而后继续培养48小时，采用MTT法检测细胞增殖情况。同时，转染后每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化情况。

3.Annexin V-FITC/PI双染色法检测A549细胞凋亡

接种至96孔板内的细胞培养24小时，待长至40-60％细胞汇合后，在无血清状态下，采用Lipofectamine 2000转染试剂将siRNA或3p-siRNA转入A549细胞，同时转入NC-siRNA作为对照。转染后24小时对细胞进行总剂量4Gy的⁶⁰Coγ射线辐照，而后继续培养48小时，采用Annexin V-FITC/PI双染色法，经流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

4.结果

在转染后48小时、72小时，siRNA、3p-siRNA或CIAP处理的3p-siRNA均可以显著抑制肿瘤细胞的增殖，转染后72小时抑制作用更强，3p-siRNA比siRNA或CIAP处理的3p-siRNA的抑制作用更为明显。在⁶⁰Coγ射线诱导下，siRNA、3p-siRNA、或CIAP处理的3p-siRNA作用72小时均可以抑制肿瘤细胞的增殖，但3p-siRNA的抑制作用尤其显著。如图5所示。

在⁶⁰Coγ射线诱导下，约17％的肿瘤细胞发生凋亡，而siRNA或3p-siRNA作用72小时后，肿瘤细胞凋亡率分别为26％、34％，3p-siRNA显著促进肿瘤细胞凋亡。如图6所示。

Claims

1.一种新型高效双功能的抑制肿瘤的核酸类药物，其特征为：该核酸类药物具有通过RNAi机制特异性沉默靶基因表达从而有效抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的特性。同时，该核酸类药物还具有通过RIG-I依赖机制激活细胞干扰素(IFN)表达，通过激活机体天然免疫反应发挥其抗肿瘤效应，是一种兼备RNAi和激活细胞天然免疫效应的双功能抗肿瘤新型核酸类药物。

2.根据权利要求1所述的核酸类药物，其特征为：其有效成分为三磷酸siRNA(3p-siRNA)，是一种双链RNA分子，每条单链的5’端带有3个磷酸基团。

3.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征为：其siRNA序列与survivin基因的特定区域互补，可以是5’ppp-GGACCACCGCAUCUCUACA UU-3’或者其它序列。

4.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征为：可以选择survivin基因或者其它肿瘤基因作位RNAi作用的靶基因，设计并得到的核酸药物。

5.根据权利要求1所述的核酸类药物，其特征为：可以通过体外转录方法和人工化学合成方法进行大量制备。

6.权利1至5所述的3p-siRNA分子在制备抗肿瘤药物中的应用。