CN108452310A - 一种治疗肿瘤的联合用药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗肿瘤的联合用药物，具体地，本发明公开了RAS抑制剂在制备增强MEK抑制剂抑制KRAS突变肿瘤的作用的药物中的用途。本发明还公开了一种治疗KRAS突变肿瘤的联合用药物，它含有不同规格的单位制剂，用于同时或者分别给RAS抑制剂和MEK抑制剂，以及药学上可接受的载体。本发明联合用药物可以有效治疗KRAS突变肿瘤，效果明显优于MEK抑制剂和RAS抑制剂单独使用，临床应用前景良好。

Description

一种治疗肿瘤的联合用药物
技术领域
本发明涉及一种治疗肿瘤的联合用药物。
背景技术
随着生活节奏的加快，肿瘤的病发率越来越高，严重威胁着人类的生命健康。KRAS突变是人类肿瘤中最常发生的突变类型，突变的KRAS可以通过激活RAF-MEK-ERK通路来促进肿瘤的发生发展。由于直接靶向KRAS的药物至今仍未研发成功，而靶向KRAS下游重要效应分子的药物也被证实不如最初设想的那样有效，因此KRAS突变的病人的预后非常差，急需找到新的治疗策略。
曲美替尼(GSK1120212)是一种新型的MEK抑制剂，该药可以通过抑制MEK-ERK级联反应来抑制RAS下游信号通路。但是其使用一段时间后，易产生耐药的问题，后期的疗效不佳。
发明内容
本发明的目的在于提供RAS抑制剂作为增强MEK抑制剂抑制KRAS突变肿瘤的作用的新用途，以及二者的联合用药物。
本发明提供了RAS抑制剂在制备增强MEK抑制剂抑制KRAS突变肿瘤的作用的药物中的用途。
优选地，所述RAS抑制剂为他汀类药物、双磷酸盐类药物、RAS基因沉默剂或者Rigosertib。
优选地，所述的双磷酸盐类药物为唑来膦酸；所述RAS基因沉默剂为KRAS siRNAs，其序列如SEQ ID NO.1所示：5′-GCCUUGACGAUACAGCUAATT-3′。
优选地，所述MEK抑制剂为曲美替尼或者selumetinib。
本发明还提供了一种治疗KRAS突变肿瘤的联合用药物，它含有不同规格的单位制剂，用于同时或者分别给RAS抑制剂和MEK抑制剂，以及药学上可接受的载体。
优选地，所述MEK抑制剂为曲美替尼或者selumetinib。
优选地，所述RAS抑制剂为他汀类药物、双磷酸盐药物、RAS基因沉默剂或者Rigosertib。
进一步优选地，所述的RAS抑制剂为Rigosertib时，RAS抑制剂与MEK抑制剂的摩尔比为50：(10～50)。
优选地，所述的双磷酸盐类药物为唑来膦酸。进一步优选地，所述RAS抑制剂与MEK抑制剂的摩尔比为(4～80)μM：(6～1000)nM；优选为(4～15)μM唑来膦酸与(6～30)nM；或者，所述RAS抑制剂与MEK抑制剂重量比为3:7。
优选地，所述RAS基因沉默剂为KRAS siRNAs，其序列如SEQ ID NO.1所示：5′-GCCUUGACGAUACAGCUAATT-3′。
优选地，唑来膦酸为注射制剂，曲美替尼为口服制剂。
本发明还提供了RAS抑制剂和MEK抑制剂在制备治疗KRAS突变肿瘤的联合用药物中的用途。
优选地，所述MEK抑制剂为曲美替尼或者selumetinib。
优选地，所述RAS抑制剂为他汀类药物、双磷酸盐药物、RAS基因沉默剂或者Rigosertib。进一步优选地，所述的RAS抑制剂为Rigosertib时，RAS抑制剂与MEK抑制剂的摩尔比为50：(10～50)。
优选地，所述的双磷酸盐类药物为唑来膦酸。进一步优选地，所述RAS抑制剂与MEK抑制剂的摩尔比为(4～80)μM：(6～1000)nM；优选为(4～15)μM唑来膦酸与(6～30)nM；或者，所述RAS抑制剂与MEK抑制剂重量比为3:7。
优选地，所述RAS基因沉默剂为KRAS siRNAs，其序列如SEQ ID NO.1所示：5′-GCCUUGACGAUACAGCUAATT-3′。
本发明发现了KRAS突变肿瘤细胞对MEK抑制剂耐药是因为RAS的活化引起，而且抑制RAS的活性可以增强MEK抑制剂对肿瘤细胞的细胞毒性，将RAS抑制剂与MEK抑制剂联合使用对KRAS突变肿瘤细胞的杀伤作用强，并且显著优于二者单独使用，说明二者联合使用可以发挥协同增效的作用，而且体内实验也证明，RAS抑制剂联合MEK抑制剂在治疗KRAS突变肿瘤的效果优良，同样显著优于二者单独使用。本发明为临床治疗KRAS突变肿瘤提供一种新的、有效的治疗方案，临床应用前景良好。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1敲除BRAF或CRAF后MEK/ERK通路相关蛋白和细胞增殖相关蛋白的表达情况
图2 HCT 116和SW480细胞系中采用pull-down检测曲美替尼诱导后pan-RAS和KRAS的活性
图3 A549细胞系中采用pull-down检测曲美替尼诱导后pan-RAS的活性
图4联合KRAS敲减和曲美替尼对肿瘤细胞MEK/ERK通路和细胞增殖在蛋白水平上的影响
图5联合KRAS敲减和曲美替尼对肿瘤细胞增殖的影响
图6 rigosertib与曲美替尼联合使用对HCT 116和SW480细胞的杀伤作用
图7不同基因型肿瘤细胞对唑来膦酸的敏感性
图8唑来膦酸联合曲美替尼对KRAS突变肿瘤细胞的杀伤作用
图9唑来膦酸联合曲美替尼对BARF突变和KRAS野生型细胞的杀伤作用
图10单用曲美替尼和唑来膦酸组以及两药联合组的集落形成抑制情况
图11单用曲美替尼和唑来膦酸组以及两药联合组的细胞凋亡情况
图12单用曲美替尼和唑来膦酸组以及两药联合组的细胞凋亡情况
图13单用曲美替尼和唑来膦酸组以及两药联合组的细胞增殖、凋亡相关蛋白的表达情况
图14单用曲美替尼和唑来膦酸组以及两药联合组对MEK/ERK通路和pan-RAS活性的影响
图15单用曲美替尼和唑来膦酸组以及两药联合组对pan-RAS和KRAS活性的影响
图16 FTI-277联合曲美替尼对KRAS突变细胞的细胞毒性作用
图17 GGTI-298联合曲美替尼对KRAS突变细胞的细胞毒性作用
图18 GGPP逆转单用唑来膦酸、唑来膦酸联合曲美替尼对KRAS突变细胞的杀伤作用
图19 GGPP逆转单用唑来膦酸、唑来膦酸联合曲美替尼对KRAS突变细胞的杀伤作用的相关蛋白质表达
图20瘤体大小图
图21曲美替尼联合唑来膦酸在重量和体积上对瘤体的协同抑制作用
图22体内实验的蛋白印迹分析
具体实施方式
本发明各种材料和试剂：HCT 116(KRAS G13D),SW480(KRAS G12V),A549(KRASG12S),MDA-MB-231(KRAS G13D,BRAF G464V),HT-29(BRAF V600E),A375(BRAF V600E),COLO320(KRAS WT)，以上细胞用Dulbecco’s modified Eagle medium和10％胎牛血清(Gibco,USA)在5％CO2，37℃条件下培养。曲美替尼(GSK1120212),GGTI-298,FTI-277(全部来自于Selleckchem,USA),GGPP(Cayman chemical,USA)和rigosertib(MedChem Express,USA)溶于DMSO。唑来膦酸(Selleckchem,USA)溶于0.1M NaOH(aq)。
其中，HCT 116细胞、SW480细胞、A549细胞和MDA-MB-231细胞均是KRAS突变肿瘤细胞。
本发明的各种实验的操作步骤：
转染
CRAF siRNAs(5′-GGAUGUUGAUGGUAGUACATT-3′),BRAF siRNAs(5′-GCAUAAUCCACCAUCAAUATT-3′),KRAS siRNAs(5′-GCCUUGACGAUACAGCUAATT-3′)和阴性对照siRNAs由GenePharma,China设计并合成。用lipofectamine 2000 RNAiMAX transfectionreagents(Invitrogen,USA)进行siRNA转染。
蛋白质印迹分析
用加入了蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(Calbiochem,Darmstadt,Germany)的RIPA buffer(150mM NaCl,1％NP-40,50mM Tris-HCl PH 7.4,1mM phenylmethylsulfonylfluoride,1μg/ml leupeptin,1mM deoxycholic acid and 1mM EDTA)裂解处理后的细胞。将相同质量的蛋白样品(30-50μg)进行SDS-PAGE电泳，然后用Bio-Rad semidry transfersystem将蛋白转到PVDF膜(Millipore,Bedford,MA,USA)上。使用的抗体包括：MEK,ERK1/2,ERK1,pERK(T202/Y204),c-Myc,CyclinD1(Abcam,UK),pMEK1(S221),pMEK2(T394)(SangonBiotech,China),PARP1,Bcl-xL(CST,USA),CRAF,BRAF(Zen BioScience,China),GAPDH(Santa Cruz,USA),KRAS(Proteintech,USA),pan-RAS(HuaAn Biotechnology,China)。
Pull-down分析
0.6mM IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(Transgene,FRA)，30℃，6小时诱导大肠杆菌表达GST-RAF-RAS-binding domain融合蛋白。然后将细菌裂解，用glutathione agarose beads(Thermo Scientific,USA)纯化融合蛋白。将相同质量的全细胞蛋白样品与等量的融合蛋白在4℃下共孵育2小时。然后离心收集珠子，用PBS洗三遍后加入等量的SDS buffer沸水煮沸15分钟。离心后，收集上清用于蛋白质印迹分析。用KRAS抗体(Proteintech,USA),RAS抗体(HuaAn Biotechnology,China)检测相关蛋白。将另一部分全细胞蛋白样品用于蛋白质印记分析后孵育以上两种抗体作为内参。
细胞增殖和集落形成实验
将细胞以3000–7000个/孔的密度种于96孔板中，37℃过夜。相应药物处理或转染48小时后，用Cell Counting Kit-8(Dojingdo Molecular Technologies,Japan)检测细胞增殖。在集落形成实验中，将8×103–80×103个细胞接种于35mm培养皿中，培养过夜使细胞贴壁，加入相应药物后再培养5-7天。待集落形成后，用4％多聚甲醛固定15分钟,然后用0.5％结晶紫染色15分钟。我们采用Annexin V,FITC Apoptosis Detection Kit(DojindoMolecular Technologies,Japan)检测细胞凋亡。细胞以每孔60％的密度接种于六孔板中，培养过夜使细胞贴壁，然后加入相应药物处理24小时。用胰酶将细胞消化下来后，收集细胞并用PBS洗三遍。用propidium iodide和annexin V-FITC染色细胞后，用Navios flowcytometer(Beckman Coulter)分析细胞凋亡情况。
本发明的统计分析方法：两组间统计学差异由GraphPad Prism version 5.01进行T检验计算。差异显著性设置为*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。所有统计检验均为双侧检验。方差不齐时，行Welch’s correction。
实验例1抑制KRAS可以克服KRAS突变肿瘤对曲美替尼的耐药
1、实验方法
(1)在A549和SW480细胞中干扰RAF，研究其对曲美替尼诱导的pERK和pMEK表达的影响：用CRAF或BRAF的siRNA干扰A549和SW480细胞，再用60和80nM的曲美替尼分别处理A549和SW480细胞48小时。然后裂解细胞行蛋白质印迹分析。
(2)RAF-MEK-ERK是RAS下游重要的级联反应通路，我们设想曲美替尼诱导pMEK和pERK的反弹是否是因RAS的活化引起。我们在HCT 116、SW480和A549细胞系中采用pull-down检测pan-RAS和KRAS的活性：用60或80nM的曲美替尼分别处理HCT 116、A549和SW480细胞12、24、48小时，然后行pull-down(步骤同前述Pull-down分析)，用抗RAS抗体和抗KRAS抗体检测对应的蛋白质表达。
(3)为进一步探究KRAS过度活化对曲美替尼耐药的影响，我们联合KRAS敲减和曲美替尼，检测肿瘤细胞的增殖情况和对MEK/ERK信号通路的影响：
(A)用KRASsiRNA(6孔板：25pmol/well；96孔板:1pmol/well)干扰HCT 116和SW480细胞，再用不同浓度曲美替尼处理细胞48小时后，CCK8检测细胞增殖情况。
(B)用KRASsiRNA干扰A549和SW480细胞，再分别用60或80nM的曲美替尼处理48小时，然后将细胞裂解行蛋白质印迹分析，用相关的蛋白质抗体检测与细胞增殖相关的蛋白质表达和MEK/ERK信号通路的变化。
(4)Rigosertib是近期研究报道的一种RAS抑制剂,在HCT 116和SW480细胞中，我们将其与曲美替尼联合，检测对肿瘤细胞的杀伤作用：用50nM的rigosertib分别与浓度梯度的曲美替尼(0,10,50nM)联合处理HCT 116和SW480细胞48小时，用CCK8检测细胞增殖。
2、实验结果
(1)我们在A549和SW480细胞中敲减RAF，研究其对曲美替尼诱导的pERK和pMEK表达的影响。我们发现，当敲除BRAF或CRAF后，反弹的pERK都有所降低，pMEK水平略有降低。敲除BRAF或CRAF都可以抑制与细胞增殖相关的cycling D1和c-Myc蛋白的表达(图1)。
(2)我们在HCT 116、A549和SW480细胞系中采用pull-down检测pan-RAS和KRAS的活性。
如图2所示,曲美替尼处理后，RAS-GTP水平随时间延长明显增高，说明RAS的活性随时间增强。我们在A549中也检测了pan-RAS的活性，虽然RAS-GTP没有明显升高,但总RAS水平显著降低，也反映RAS的活性增强(图3)。因为KRAS是RAS家族中的主要同源异构体，我们进一步确认了曲美替尼处理后KRAS活性的变化，发现KRAS-GTP也是升高的(图2)。
(3)为进一步探究KRAS过度活化对曲美替尼耐药的影响，我们联合KRAS敲减和曲美替尼，发现可以有效抑制肿瘤细胞增殖，并抑制与细胞增殖有关的蛋白表达(图4和5)。并且，抑制KRAS可以逆转曲美替尼诱导的MEK/ERK信号的再活化(图4)。
(4)Rigosertib是近期研究报道的一种RAS抑制剂，在HCT 116和SW480细胞中，我们将其与曲美替尼联合，发现可以增强对肿瘤细胞的杀伤作用，具体地，用50nM的rigosertib分别与10nM、50nM的曲美替尼联合使用对HCT 116和SW480细胞的杀伤作用强(图6)。实验结果说明，rigosertib与曲美替尼联合使用(二者的摩尔用量为50nM：(10～50)nM)抑制KRAS突变肿瘤细胞的作用优良。
以上结果显示，本发明发现了MEK抑制剂的耐药是因为RAS的过度活化引起，而且抑制RAS的活性可以增强MEK抑制剂对肿瘤细胞的抑制活性，将RAS抑制剂与MEK抑制剂联合使用对KRAS突变肿瘤细胞的杀伤作用优良。
实施例2唑来膦酸与曲美替尼联合使用
根据以上结果，我们想寻找一种可以抑制RAS活性的FDA批准的药物。通过查阅文献，我们找到两类药物，他汀类和双磷酸盐类。唑来膦酸是研究最为广泛的一种双磷酸盐，考虑到唑来膦酸用于临床上恶性肿瘤的骨转移，而他汀类主要用于心血管疾病，我们将研究主要集中于唑来膦酸。
1、实验方法
(1)唑来膦酸与曲美替尼联合使用的功效
(A)用唑来膦酸(HCT 116 40μM，SW480 80μM，MDA-MB-231 12.5μM，A549 12.5μM)分别联合浓度梯度的曲美替尼(HCT 116和SW480浓度梯度为100nM、200nM、400nM；MDA-MB-231和A549浓度梯度为40nM、200nM、1000nM)处理四种KRAS突变的肿瘤细胞，用CCK8检测细胞增殖。
(B)用集落形成实验检测联合用药对细胞长期生存的影响，唑来膦酸联合曲美替尼处理四种细胞5-7天后，多聚甲醛固定15分钟后，结晶紫染色15分钟。(HCT 116唑来膦酸4μM，曲美替尼6nM；SW480唑来膦酸15μM，曲美替尼25nM；MDA-MB-231唑来膦酸8μM，曲美替尼30nM；A549唑来膦酸2μM，曲美替尼10nM)。
(C)用曲美替尼50nM联合唑来膦酸30μM处理HCT 116细胞24小时后，用流式细胞术检测细胞凋亡。SW480(曲美替尼100nM,唑来膦酸80μM),A549(曲美替尼60nM,唑来膦酸45μM)按HCT 116的处理方法检测细胞凋亡。
(D)曲美替尼50nM联合唑来膦酸20μM处理HCT 116细胞24或48小时，然后裂解细胞，行蛋白质印迹分析检测相应蛋白表达。SW480(曲美替尼100nM,唑来膦酸80μM),MDA-MB-231(曲美替尼40nM,唑来膦酸12.5μM),A549(曲美替尼60nM,唑来膦酸45μM)按HCT 116的处理方法检测相应蛋白表达。
(2)唑来膦酸减弱曲美替尼诱导的pERK的反弹
(A)曲美替尼50nM联合唑来膦酸20μM处理HCT 116细胞24或48小时，然后裂解细胞，行蛋白质印迹分析检测pMEK和pERK表达。SW480(曲美替尼100nM,唑来膦酸80μM),MDA-MB-231(曲美替尼40nM,唑来膦酸12.5μM),A549(曲美替尼60nM,唑来膦酸45μM)按HCT 116的处理方法检测pMEK和pERK表达。
(B)曲美替尼联合唑来膦酸处理HCT 116和SW480细胞48小时后，行pull-down检测RAS活性。
(3)唑来膦酸主要通过甲羟戊酸途径协同曲美替尼
(A)FTI-277 10μM联合浓度梯度的曲美替尼(0,10,50nM)处理HCT 116和SW480细胞48小时，用CCK8检测细胞增殖。
(B)GGTI-298 4μM联合浓度梯度的曲美替尼(0,100,200nM)处理HCT 116细胞48小时，GGTI-298 4μM联合浓度梯度的曲美替尼(0,80,160nM)处理MDA-MB-231细胞48小时，然后用CCK8检测细胞增殖。
(C)唑来膦酸40μM单独或联合曲美替尼100nM处理HCT 116，然后加入GGPP 4μM处理48小时，MDA-MB-231(唑来膦酸30μM,曲美替尼80nM)按HCT 116处理方法处理，CCK8检测细胞增殖。
(D)唑来膦酸30μM单独或联合曲美替尼50nM处理HCT 116，然后加入GGPP 4μM处理24小时，MDA-MB-231(唑来膦酸12.5μM,曲美替尼40nM)按HCT 116处理方法处理，然后裂解细胞行蛋白质印迹法检测与细胞增殖相关的蛋白表达。
(4)曲美替尼联合唑来膦酸在体内实验中抑制肿瘤生长
在5周龄雌性裸鼠(Beijing HFK BioScience,China)的右侧皮下接种5×106个HCT 116细胞(悬于100μL PBS中)。当瘤体体积达到100mm3左右时,将裸鼠随机分配至4组(每组n＝6):曲美替尼(2mg/kg,i.g.)隔天一次，唑来膦酸(2mg/kg,i.p.)每五天一次，曲美替尼(2mg/kg,i.g.)隔天一次+唑来膦酸(2mg/kg,i.p.)每五天一次,阴性对照组。每三天测量一次肿瘤大小。14天后处死裸鼠(总共给药14天，曲美替尼的总给药量为14mg/kg，唑来膦酸的总给药量为6mg/kg)，分离肿瘤组织并测量瘤体重量。用RIPA buffer裂解肿瘤组织，然后行蛋白质印迹法，检测不同处理方法对MEK/ERK信号通路和细胞增殖凋亡的影响。动物实验由四川大学华西医院动物伦理委员会批准(项目编号：2016017A)
2、实验结果
(1)唑来膦酸与曲美替尼联合使用的细胞毒性
首先，我们探究了不同基因型肿瘤细胞对唑来膦酸的敏感性，发现KRAS和BRAF突变细胞之间没有明显差异，野生型COLO320是检测细胞系中对唑来膦酸最敏感的细胞系(图7)。
CCK8结果显示，在KRAS突变肿瘤细胞HCT 116,SW480,A549和MDA-MB-231中，唑来膦酸可以明显增强曲美替尼的细胞毒性(图8)。相反，在BARF突变和KRAS野生型细胞中，唑来膦酸反而减弱了曲美替尼的细胞杀伤作用(图9)。
集落形成试验进一步验证了曲美替尼联合唑来膦酸对细胞生存的长期作用。结果显示，联合处理5-7后，相较于单用曲美替尼和唑来膦酸组，两药联合组的集落形成受到明显抑制(图10)。此外，FACS分析发现对比单药组，两药联合可以明显增强细胞凋亡(图11、表1和图12)。
表1曲美替尼联合唑来膦酸对KRAS突变肿瘤细胞HCT 116,SW480,A549的抑制作用
蛋白质印迹分析进一步在蛋白水平上证实，在KRAS突变肿瘤细胞中，曲美替尼联合唑来膦酸可以协同抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。联合处理组中，促进增殖的蛋白c-Myc和cyclin D1表达显著减少，而在单药组中只是略有降低。联合处理组中，抗凋亡蛋白Bcl-xL和总PARP1的下调，裂解的PARP1表达增加都提示肿瘤细胞的凋亡增强(图13)。以上结果显示唑来膦酸可以增强曲美替尼在KRAS突变肿瘤中的细胞毒性。
实验结果说明，本发明将(4～80)μM唑来膦酸与(6～1000)nM曲美替尼联合使用，抑制KRAS突变肿瘤的功效优良，其中，特别是(4～15)μM唑来膦酸与(6～30)nM曲美替尼联合使用可以发挥协同增效作用。
(2)唑来膦酸减弱曲美替尼诱导的pERK的反弹
我们进一步研究联合用药发挥协同作用的机制。曲美替尼处理24和48小时后，唑来膦酸减少了pERK的反弹，而pMEK在4种细胞系中减少程度的不一。Pull-down结果显示，两药联合减少了曲美替尼诱导的RAS-GTP，单用唑来膦酸则能明显抑制RAS的活性(图14和图15A)。HCT 116细胞中，KRAS也出现类似的现象(图15B)。以上数据证明，在KRAS突变肿瘤细胞中，唑来膦酸可以通过抑制RAS活性，增强曲美替尼的效果，延长对ERK通路的抑制作用。
(3)唑来膦酸主要通过甲羟戊酸途径协同曲美替尼
RAS生物活性的获得需要蛋白质的异戊二烯化，包括法尼基化和牻牛儿牻牛儿基化。考虑到唑来膦酸通过甲羟戊酸途径抑制RAS的异戊二烯化，我们设想唑来膦酸是否也是通过相同途径来增强曲美替尼的效果。
法尼基转移酶抑制剂(FTIs)和牻牛儿基牻牛儿基转移酶抑制剂(GGTIs)分别抑制法尼基化和牻牛儿牻牛儿基化。单独的FTIs或GGTIs都不能完全抑制KRAS和NRAS的异戊二烯化。我们研究了FTI-277和GGTI-298在HCT 116,SW480和MDA-MB-231细胞中，对曲美替尼作用的影响。结果发现，两种抑制剂都可以略微增强曲美替尼的细胞毒性(图16和图17)。牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)是牻牛儿牻牛儿基化的中间产物，可以恢复RAS的牻牛儿牻牛儿基化。进一步研究发现，在单用唑来膦酸和两药联合中加入GGPP可以部分逆转唑来膦酸的作用(图18)。蛋白质印迹分析结果也同上述结果一致(图19)。此外，实验室正在进行的对FDA批准药物库的筛查进一步证实了，辛伐他汀可以增强对曲美替尼耐药的SW1116细胞系的细胞毒性，而辛伐他汀也是通过甲羟戊酸途径发挥生物活性的。以上数据提示我们唑来膦酸是通过抑制RAS的异戊二烯化来协同曲美替尼。
(4)曲美替尼联合唑来膦酸在体内实验中抑制肿瘤生长
我们建立HCT 116肿瘤细胞的异种移植模型来验证两药联合在体内的效果。结果显示，单用曲美替尼组肿瘤生长受到明显抑制，单用唑来膦酸组和阴性对照组之间没有显著差异。相较于单药组和阴性对照组，联合组肿瘤在重量和体积上都明显减少(图20、图21和表2)。
表2曲美替尼联合唑来膦酸在体内实验中抑制肿瘤生长(重量)
如图21和表2所示，本发明联合使用组(唑来膦酸与曲美替尼的重量比为3:7)对HCT 116肿瘤细胞的异种移植模型的抑制作用均强于曲美替尼和唑来膦酸单独使用，且差异显著。
为了进一步验证之前体外试验的结果，我们将切除下来的肿瘤组织裂解后进行蛋白质印迹分析，对比单药组，联合组中，c-Myc,cyclin D1,Bcl-xL和总PARP1的表达明显降低(图22)。虽然曲美替尼诱导的pERK反弹被抑制，pMEK的表达却没有明显变化(图22)，这与之前的体外试验结果一致，体外试验显示，相比于其他被测试的细胞系，HCT 116中pMEK的表达弱且变化不明显。以上结果证明了在异种移植物模型中，同时抑制RAS和MEK可以协同抑制肿瘤的生长。这一作用可能是由于对ERK信号通路抑制作用的延长和抑制促增殖、抗凋亡相关蛋白表达而产生。
由上述结果，唑来膦酸联合曲美替尼抑制KRAS突变肿瘤的效果优良，其中，在细胞实验中，将(4～80)μM唑来膦酸与(6～1000)nM曲美替尼联合使用，抑制KRAS突变肿瘤的功效优良，其中，特别是(4～15)μM唑来膦酸与(6～30)nM曲美替尼联合使用可以发挥协同增效作用；在动物实验中，联合使用组(唑来膦酸与曲美替尼的重量比为3:7)对HCT 116肿瘤细胞的异种移植模型的抑制作用均强于曲美替尼和唑来膦酸单独使用，且差异显著。
综上，抑制RAS的活性可以增强KRAS突变肿瘤细胞对MEK抑制剂的敏感性，将RAS抑制剂与MEK抑制剂联合使用可以增强对KRAS突变肿瘤细胞的杀伤作用。而且体内实验也证明，RAS抑制剂联合MEK抑制剂在治疗KRAS突变肿瘤时可以发挥协同增效作用，临床应用前景良好。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种治疗肿瘤的联合用药物
<130> GY026-17P1075
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> KRAS siRNAs
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gccuugacga uacagcuaat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> CRAF siRNAs
<400> 2
ggauguugau gguaguacat t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> BRAF siRNAs
<400> 3
gcauaaucca ccaucaauat t 21

Claims (17)

1.RAS抑制剂在制备增强MEK抑制剂抑制KRAS突变肿瘤的作用的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述RAS抑制剂为他汀类药物、双磷酸盐类药物、RAS基因沉默剂或者Rigosertib。
3.根据权利要求1所述的所述的用途，其特征在于：所述的双磷酸盐类药物为唑来膦酸；所述RAS基因沉默剂为KRAS siRNAs，其序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述MEK抑制剂为曲美替尼或者selumetinib。
5.一种治疗KRAS突变肿瘤的联合用药物，其特征在于：它含有不同规格的单位制剂，用于同时或者分别给RAS抑制剂和MEK抑制剂，以及药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的联合用药物，其特征在于：所述MEK抑制剂为曲美替尼或者selumetinib。
7.根据权利要求要求5或6所述的联合用药物，其特征在于：所述RAS抑制剂为他汀类药物、双磷酸盐药物、RAS基因沉默剂或者Rigosertib。
8.根据权利要求7所述的联合用药物，其特征在于：所述的RAS抑制剂为Rigosertib时，RAS抑制剂与MEK抑制剂的摩尔比为50：(10～50)。
9.根据权利要求7所述的联合用药物，其特征在于：所述的双磷酸盐类药物为唑来膦酸；所述RAS基因沉默剂为KRAS siRNAs，其序列如SEQ ID NO.1所示。
10.根据权利要求9所述的联合用药物，其特征在于：所述RAS抑制剂与MEK抑制剂的摩尔比为(4～80)μM：(6～1000)nM；优选为(4～15)μM唑来膦酸与(6～30)nM；或者，所述RAS抑制剂与MEK抑制剂重量比为3:7。
11.根据权利要求5～10任意一项所述的联合用药物，其特征在于：唑来膦酸为注射制剂，曲美替尼为口服制剂。
12.RAS抑制剂和MEK抑制剂在制备治疗KRAS突变肿瘤的联合用药物中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：所述MEK抑制剂为曲美替尼或者selumetinib。
14.根据权利要求要求12或13所述的用途，其特征在于：所述RAS抑制剂为他汀类药物、双磷酸盐药物、RAS基因沉默剂或者Rigosertib。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于：所述的RAS抑制剂为Rigosertib时，RAS抑制剂与MEK抑制剂的摩尔比为50：(10～50)。
16.根据权利要求14所述的用途，其特征在于：所述的双磷酸盐类药物为唑来膦酸；所述RAS基因沉默剂为KRAS siRNAs，其序列如SEQ ID NO.1所示。
17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于：所述RAS抑制剂与MEK抑制剂的摩尔比为(4～80)μM：(6～1000)nM；优选为(4～15)μM唑来膦酸与(6～30)nM；或者，所述RAS抑制剂与MEK抑制剂重量比为3:7。
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