CN103937801A - 多靶向siRNA分子及其抗肿瘤的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多靶向siRNA分子及其抗肿瘤的应用。所述的多靶向siRNA分子其特征在于，由正义链、反义链1、反义链2和反义链3组成，其序列为：正义链：5’-CCACAAUGGCUGAGCACUUGGAACAAGACCGAAUGGAUACGGAUGACUGAGUACCUGAANn-3’，反义链1：5’-AAGUGCUCAGCCAUUGUGGNn-3’；反义链2：5’-UAUCCAUUCGGUCUUGUUCNn-3’；反义链3：5’-UUCAGGUACUCAGUCAUCCNn-3’。其中，N是胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT；n代表N的个数，n是6～2的整数。本发明可以用于制备同时调节细胞中NET-1、EMS1和Bcl2基因基因功能的药物，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移和侵袭，达到治疗肿瘤的目的。
Description
技术领域
本发明涉及多靶向siRNA分子，尤其是同时靶向肿瘤相关基因NET-1、EMS1和Bcl2基因的siRNA分子及其抗肿瘤应用。
背景技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-strand RNA，dsRNA)引发其同源信使RNA(messenger RNA，mRNA)酶解的一种转录后基因沉默形式(Nature.1998，391：806-811)。长双链RNA进入细胞后，被Dicer酶结合并切割。Dicer酶的切割产物长度通常为20～25bp，且在每条链的3’末端有2个核苷酸悬垂的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)。siRNA的一条链掺入到RNA-诱导的沉默复合物中(RNA-induced silencing complex，RISC)，与互补RNA的序列配对。RISC首先介导siRNA双链解旋，与RISC耦合的单链的siRNA以序列特异的方式与靶mRNA结合，之后由RISC的催化组分切割靶mRNA。切割靶mRNA可以抑制其翻译，最终抑制该基因的表达。现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。
RNAi在医药领域有广阔的应用前景，如抗病毒、抗肿瘤和抗炎症等。双链干扰核酸可设计成能被Dicer酶剪切的称做Dicer底物的长双链形式，或者是短的、不需Dicer酶剪切直接作为RISC底物的形式。合成的双链RNA与目的基因序列互补，导入细胞或生物体后，被内源的遗传物质识别，激活RNAi途径。利用这种机制，RNAi使靶基因的表达水平急剧下降。
RNAi技术开辟了一个全新的治疗领域，目前国际上已有数十种siRNA药物进入临床阶段。其中有应用siRNA治疗老年性黄斑变性、糖尿病黄斑水肿、呼吸道合胞病毒病、实体肿瘤、肝癌、以及急性肾损伤等疾病。
在最近的研究中，陈莉等人报道了NET-1和Cortactin的蛋白在HCC组织中相对癌旁组织显著过表达。前期研究表明NET-1的表达与细胞增殖有关，显著上调癌症的形成(Chen L等.Tumori.2010，96：744-750)。该结果显示，NET-1的表达和功能可能会成为癌症发生发展的潜在靶标。Bcl-2基因是广泛存在于恶性肿瘤细胞中的一种癌基因，定位于18q21上，因其具有抑制细胞凋亡和延长细胞存活的功能而被称为“存活基因”。Bcl-2基因编码的蛋白主要分布于线粒体内膜、核膜和内质网上，目前认为，Bcl-2蛋白能够稳定线粒体膜电压、阻止线粒体释放Cyt C、AIF等细胞因子，抑制或阻断多种因素诱发的细胞凋亡，在线粒体凋亡途径的调控中起中心调控因子的作用(Nature.1999，399：483-487)。正常机体组织中，Bcl-2分布比较局限，主要在胚胎早期组织、成熟淋巴细胞、增生活跃的上皮细胞和神经元等组织表达，但在膀胱癌、鼻咽癌、结-直肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌和肺癌等许多肿瘤中异常高表达，且其表达水平常与肿瘤细胞对多种化疗药物及γ射线的耐受相关(J Cell Biochem，1996.60：23-32)。因此，抑制肿瘤细胞中过度表达的Bcl-2，恢复其正常的凋亡通路及增加其对化疗药物和放疗的敏感性是治疗肿瘤的新策略。
最新报道的由EMSl(细胞骨架重组相关基因)编码的Cortactin(皮层肌动蛋白结合蛋白)，与癌症转移相关的(Kellye C.Cell Adhesion&Migration5：2，187-198；March/April2011)。Cortactin可以结合到Arp2/3复合物上，激活Arp2/3复合物介导的肌动蛋白聚合，促进细胞迁移(Kowalaki JR.J Cell Sci，2005，118(Pt1)：79-87)。以往的研究表明，Cortactin表达与门静脉癌栓和肝外转移显着相关，说明Cortactin的高表达可能是肝癌侵袭性增加的因素之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供同时靶向NET-1、EMS1及Bcl2基因的siRNA分子及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是提供了一种同时靶向NET-1、EMS1及Bcl2基因的siRNA分子，其特征在于，由正义链、反义链1、反义链2和反义链3组成，其序列为：
正义链：
5’-CCACAAUGGCUGAGCACUUGGAACAAGACCGAAUGGAUACGGAUGACUGAGUACCUGAANn-3’(SEQ ID NO：1)，
反义链1：5’-AAGUGCUCAGCCAUUGUGGNn-3’(SEQ ID NO：2)；
反义链2：5’-UAUCCAUUCGGUCUUGUUCNn-3’(SEQ ID NO：3)；
反义链3：5’-UUCAGGUACUCAGUCAUCCNn-3’(SEQ ID NO：4)。
其中，N是胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT；n代表N的个数，n是0～2的整数。
换言之，上述双链siRNA分子的主干序列为：
正义链：
5’-CCACAAUGGCUGAGCACUUGGAACAAGACCGAAUGGAUACGGAUGACUGAGUACCUGAA-3’(SEQ ID NO：5)，
反义链1：5’-AAGUGCUCAGCCAUUGUGG-3’(SEQ ID NO：6)；
反义链2：5’-UAUCCAUUCGGUCUUGUUC-3’(SEQ ID NO：7)；
反义链3：5’-UUCAGGUACUCAGUCAUCC-3’(SEQ ID NO：8)。
对于上述双链siRNA分子而言，
优选地，所述N为dT，且n为2。
优选地，所述的n为0。
本发明提供了上述的同时靶向NET-1、EMS1及Bcl2基因的siRNA分子在制备同时抑制细胞中NET-1、EMS1和Bcl2基因功能的药物中的用途。
本发明还提供了上述的同时靶向NET-1、EMS1及Bcl2基因的siRNA分子在制备治疗肝癌药物中的用途。
体外实验证明，本发明的siRNA分子的反义链可特异性地与NET-1、EMS1和Bcl2基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移和侵袭，达到治疗肿瘤的目的。
本发明的siRNA分子可以应用于制备同时调节细胞中NET-1、EMS1和Bcl2基因功能的药物中发挥RNA干扰的作用，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移和侵袭，达到治疗肿瘤的目的。
附图说明
图1是实时定量PCR检测不同实验组NET-1、EMS1和Bcl2基因的mRNA表达水平结果图。其中，A为不同实验组NET-1基因mRNA相对表达水平；B为不同实验组EMS1基因mRNA相对表达水平，C为不同实验组Bcl2基因mRNA相对表达水平。
图2是MTT法检测不同实验组的SMMC-7721细胞生长结果图。其中，A为不同实验组在不同时间点的生长曲线图；B为不同实验组在不同时间点的OD值柱形图。
图3是流式细胞术检测不同实验组SMMC-7721细胞凋亡结果图。其中，A为不同实验组的FCM分析结果图；B为Annexin V和PI双染阳性细胞的定量柱形图。
图4是细胞划痕实验检测不同实验组SMMC-7721细胞迁移结果图。其中，A为不同实验组在0h、24h、48h和72h的细胞迁移照片；B为72h细胞相对迁移距离的柱形图。
图5是Transwell细胞侵袭实验检测不同实验组SMMC-7721细胞侵袭结果图。其中，A为不同实验组在0h、24h、48h和72h的细胞侵袭照片；B为72h不同实验组侵袭细胞数的柱形图。
具体实施方式
为方便起见，在下文中，术语“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”可以互换，它们表示的意思和范围相同。
其中，siRNA是正义链和反义链退火形成的双链结构。
本发明的siRNA分子来源于针对NET-1、EMS1及Bcl2基因开放阅读框的功能保守区而设计。
siRNA的制备可采用多种方法，比如：化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好地获得基因沉默效率。
本发明的siRNA分子可以作为制备调节细胞中NET-1、EMS1及Bcl2基因功能药物的有效成分，尤其是抗肿瘤药物的有效成分。
出于应用目的，可将siRNA分子作为药物直接给药于受药者身上特定部位，比如肿瘤组织。
本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持siRNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。
任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学上可接受的载体及佐剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持siRNA分子的活性。
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。
实施例1
步骤1、细胞培养：
肝癌细胞株SMMC-7721购于上海中科院细胞研究所，用含10％FBS(Gibco公司)的DMEM培养基(Gibco公司)培养，所述培养基中加入青霉素和链霉素(Invitrogen公司)，青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL和100μg/mL，培养于37℃二氧化碳培养箱。
步骤2、siRNA体外转染：
设计同时靶向NET-1、EMS1及Bcl2基因的一链多靶siRNA序列：Triple-siRNA(Tri_siR)，设计阴性对照序列(NC)作为对照。同时单靶siRNA(NET-1_siR、EMS1_siR、Bcl2_siR)作为对照，序列见表1。
取步骤1中培养得到的处于对数生长期的细胞，96孔板的接种密度为5×104/孔、24孔板按1.5×105/孔、6孔板为1×106/孔接种细胞，将其分为实验组和不转染siRNA的未处理组，所述的实验组包括NET-1_siR转染组、EMS1_siR转染组、Bcl2_siR转染组、Tri_siR转染组和NC转染组。各实验组采用相应的siRNA按操作说明用脂质体(Invitrogen公司)转染到细胞内，使siRNA终浓度为50nM，37℃培养4h后，培养液换成含10％FBS(Gibco公司)的DMEM培养基(Gibco公司)。
所有的实验均重复3次，结果均用平均值±SD表示，用SPSS17.0进行统计学分析。统计学差异用单因素方差分析和双侧t检验。P<0.05表明差异显著。在所有的图表中，*、#表明与未处理组和Tri_siR组相比差异显著。
表1：siRNA序列及对照序列
实施例2
实时定量PCR(RT-QPCR)检测mRNA表达水平：
用实施例1的方法进行细胞培养和siRNA体外转染。所述的体外转染采用96孔板。
转染48h后，细胞总RNA用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取，并按操作说明用RT-QPCR试剂盒(Biomics公司)进行检测。引物序列见表2，PCR反应条件为：95℃预变性5min，40个循环为95℃变性20s、58℃退火30s、72℃延伸30s。
表2：RT-QPCR检测用引物
如图1所示，Tri_siR抑制SMMC-7721细胞中相应靶基因的mRNA表达。如图1A所示，与未处理组及NC_siR组相比，NET-1_siR、EMS1_siR、Bcl2_siR及Tri_siR处理组中的NET-1的mRNA水平分别下降至27％、57％、67％和35％，差异均有统计学意义(P<0.05)。如图1B所示，与未处理组及NC_siR组相比，NET-1_siR、EMS1_siR、Bcl2_siR及Tri_siR处理组中的EMS1的mRNA水平分别下降至66％、28％、65％和21％，差异均有统计学意义(P<0.05)。如图1C所示，与未处理组相比，与未处理组及NC_siR组相比，NET-1_siR、EMS1_siR、Bcl2_siR及Tri_siR处理组中的Bcl2的mRNA水平分别下降至60％、69％、32％和27％，差异均有统计学意义(P<0.05)。Tri_siR处理组优于单靶siRNA处理组(P<0.05)，且各单靶siRNA之间有协同抑制作用(P＜0.05)，NC_siR处理组中各靶基因mRNA表达水平与相应未处理组相比，差异无显著统计学意义(P>0.05)。
实施例3
MTT法检测细胞增殖：
用实施例1的方法进行细胞培养和siRNA体外转染，所述的体外转染采用96孔板。转染前待细胞汇合度达到60-80％时，将对数生长期的细胞铺到96孔细胞培养板中，接种密度为5×104/孔，重复3个孔，作为未转染的样本(即转染0时的样本)。
分别测定转染24h、48h、72h时的NET-1_siR转染组、EMS1_siR转染组、Bcl2_siR转染组、Tri_siR转染组、NC_siR转染组和未处理组样本，以及上述的未转染的样本的OD值，所述测定方法为：分别在24h、48h、72h染色，每孔加入10μLMTT(南京生兴生物)，37℃避光放置4h；每孔加150μLDMSO，37℃放置10min；吹打混匀后取120μL于另一干净96孔板中，并取120μL DMSO作为空白对照调零，酶标仪(Bio-Rad公司)上测OD，波长为490nm。记录结果，绘制细胞生长曲线。
如图2所示，与未处理组及NC_siR组相比，NET-1_siR、EMS1_siR、Bcl2_siR及Tri_siR具有显著的细胞生长速度在48h及72h时明显减慢(P<0.05)，且Tri_siR组的细胞生长速度明显低于单靶siRNA组，差异均有统计学意义(P<0.05)，各单靶siRNA组之间相比差异无统计学意义(P>0.05)，NC_siR组与未处理组相比差异无统计学意义(P>0.05)。
实施例4
流式细胞术(FCM)测定细胞凋亡：
用实施例1的方法进行细胞培养和siRNA体外转染。所述的体外转染采用6孔板。
用Annexin V-FITC凋亡测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)进行Annexin-V/propidium iodide(PI)双重分析。SMMC-7721细胞转染48h后，用0.25％胰酶消化和pH为7.4的PBS缓冲液洗两遍。1×106细胞用500μL结合缓冲液重悬，并按操作说明用5μLFITC标记的Annexin-V染色，加5μLPI并室温避光孵育10min。不同实验组细胞用BD FACS Calibur(BD Bioscience公司)进行流式细胞测试，数据用CellQuest data acquisition分析软件分析(BDBioscience公司)。
如图3所示，用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡，并用流式细胞仪检测。如图2所示，Tri_siR处理组凋亡率为30.88±1.47％，对照组NET-1_siR、EMS1_siR和Bcl2_siR凋亡率分别为15.46±1.47％、10.64±2.91％、13.17±2.83％，未处理组和NC_siR的凋亡率分别为2.40±0.54％和3.08±0.97％。与未处理组相比，siRNA处理组凋亡率明显增高(P<0.05)，且单靶siRNA组的细胞凋亡率显著低于Tri_siR组，差异均有统计学意义(P<0.01)，各单靶siRNA组之间相比差异无统计学意义(P>0.05)，NC_siR组与未处理组相比差异无统计学意义(P>0.05)。
实施例5
细胞划痕实验检测细胞迁移：
用实施例1的方法进行细胞培养和siRNA体外转染。
用密度为1.5×105/孔的SMMC-7721细胞铺到24孔板里并转染。48h后，用移液器吸头在汇合的细胞中划痕，然后用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤，加入无血清的DMEM培养基(Gibco公司)。划痕后24h、48h、72h后拍照观察细胞迁移，实验做3组平行，每板拍4个视野。
用细胞划痕实验检测Tri_siR对SMMC-7721细胞的迁移抑制作用。siRNA处理SMMC-7721细胞后，分别在0h、24h、48h和72h，显微镜下观察细胞迁移情况，如图4所示，并计算各处理组相对于0h时的细胞划痕间距的迁移距离(表3)。
表3：各处理组细胞不同时间相对迁移距离
| 组别 | 24h | 48h | 72h |
| 未处理组 | 0.23±0.015 | 0.57±0.006 | 0.76±0.012 |
| NC_siR | 0.24±0.025 | 0.58±0.015 | 0.77±0.015 |
| Tri_siR | 0.17±0.012 | 0.24±0.006 | 0.38±0.036 |
如图4所示，与未处理组及NC_siR组相比，Tri_siR处理组迁移距离均较小(P<0.05)，NC_siR组与未处理组相比差异无统计学意义(P>0.05)。
实施例6
Transwell细胞侵袭实验：
用实施例1的方法进行细胞培养和siRNA体外转染。所述的体外转染采用24孔板。
转染后72h用24-well membrane filters(美国Corning Bioscience公司)检测细胞迁移。1.5×105个细胞铺到上室中以向含血清的DMEM培养基(Gibco公司)中迁移24h。留在上室中的细胞用棉签去除，迁移到下室中的细胞用10％甲醛固定30s。最后，细胞用0.1％结晶紫染色4min，随后用pH为7.4的PBS缓冲液洗3遍。细胞在200倍放大视野中计数，每个条件下计数5个视野。
如图5所示，用Transwell细胞侵袭实验检测Tri_siR对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响，Tri_siR及对照siRNA转染48h后，用条件培养基刺激细胞，观察细胞侵袭效果，与未处理组(163.67±3.79)相比，Tri_siR(120.33±2.08)显著减少(P<0.05)，未处理组和NC_siR组侵袭细胞均数差异无统计学意义(P>0.05)。
Claims (5)
1.一种同时靶向NET-1、EMS1及Bcl2基因的siRNA分子，其特征在于，由正义链、反义链1、反义链2和反义链3组成，其序列为：
正义链：
5’-CCACAAUGGCUGAGCACUUGGAACAAGACCGAAUGGAUACGGAUGACUGAGUACCUGAANn-3’，
反义链1：5’-AAGUGCUCAGCCAUUGUGGNn-3’；
反义链2：5’-UAUCCAUUCGGUCUUGUUCNn-3’；
反义链3：5’-UUCAGGUACUCAGUCAUCCNn-3’。
其中，N是胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT；n代表N的个数，n是0～2的整数。
2.如权利要求1所述的同时靶向NET-1、EMS1及Bcl2基因的siRNA分子，其特征在于，所述N为dT，且n为2。
3.如权利要求1所述的同时靶向NET-1、EMS1及Bcl2基因的siRNA分子，其特征在于，所述的n为0。
4.权利要求1-3中任一项所述的同时靶向NET-1、EMS1及Bcl2基因的siRNA分子在制备同时抑制细胞中NET-1、EMS1和Bcl2基因功能的药物中的用途。
5.权利要求1-3中任一项所述的同时靶向NET-1、EMS1及Bcl2基因的siRNA分子在制备治疗肝癌药物中的用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140723 |