CN105435228B - 三氧化二砷的抗肿瘤新用途及抗肿瘤制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及三氧化二砷的抗肿瘤新用途及抗肿瘤制剂。本发明首次揭示了三氧化二砷的抗肿瘤新机制，在此基础上提供了对于抗肿瘤有用的药物或药盒，以及三氧化二砷或相关制剂的新用途。

Description

三氧化二砷的抗肿瘤新用途及抗肿瘤制剂

技术领域

本发明属于生物制药领域；更具体地，本发明涉及三氧化二砷的抗肿瘤新用途及抗肿瘤制剂。

背景技术

几个世纪以前，砷剂(主要成分为三氧化二砷)就被人们用来治疗牛皮癣、风湿症、白血病、梅毒、痔疮等。哈尔滨医科大学首先报道了静脉滴注三氧化二砷治疗复发的急性早幼粒细胞白血病(APL)达到很高的完全缓解效率。随后上海血液研究所发现三氧化二砷诱导APL细胞凋亡和分化的作用机制。近年来，三氧化二砷与肿瘤的研究发展很快，虽然有结果显示，在其他类型的白血病甚至实体瘤中，三氧化二砷也有一定的治疗效果，但都没有达到三氧化二砷在治疗APL白血病的治疗效率。因此，三氧化二砷在治疗其他类型肿瘤中是如何起作用的，以及如何能增加三氧化二砷的治疗效果是一个非常重要的研究课题。

侵袭和转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，也是肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤的转移包括局部侵袭、内渗进入邻近的血管或淋巴管、在循环系统内的生存及运输、从循环系统的管腔外渗到远端组织、在远端组织克隆形成可见的肿瘤。肿瘤的转移是肿瘤细胞、宿主细胞和肿瘤微环境之间一系列复杂的相互作用，相互影响的连续过程，多个基因，多条通路，多种细胞因子参与了整个的侵袭和转移的过程，这些基因组成了调控肿瘤转移的signature(Nguyen DX，Massague J.Nat Rev Genet.2007；8:341-352)。乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤，其主要转移到病人的骨组织，肺，以及脑。乳腺癌骨转移，肺转移(Minn AJ，Gupta GP，Siegel PM，et al.Nature.2005；436:518-524)，脑转移的Signature相继被鉴定出来，使人们对乳腺癌转移的机制有了更深的了解，也为乳腺癌转移病人的治疗提供了一系列的靶点。

p53是一个抑癌基因，在肿瘤的发生过程中起着非常重要的作用。当细胞受到外界刺激，DNA损伤时，p53可被诱导表达，进而诱导p53下游一系列靶基因，促进细胞进入细胞周期的停滞阶段，或者诱导受损细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的发生(Horn HF，VousdenKH.2007；26:1306-1316)。虽然p53蛋白能抑制肿瘤的发生，但在大约50％的肿瘤患者中都会发现p53基因突变的情况，突变的p53可以促进肿瘤的转移，抑制化疗药物的作用，增加肿瘤的恶性化进程。鉴于p53在癌症发生中的重要作用，医药企业开发出了众多以p53为基础的抗癌药物和疗法。不过这些药物和疗法都是基于重建p53蛋白的活性(Brown CJ等，NatRev Cancer.2009；9:862-873)。

鉴于现有的抗肿瘤疗法存在各种缺陷，本领域还有必要开发进一步的新的肿瘤治疗制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供三氧化二砷的抗肿瘤新用途及抗肿瘤制剂。

在本发明的第一方面，提供一种用于治疗肿瘤的药盒，所述药盒包括：三氧化二砷；和p53抑制剂。

在一个优选例中，所述药盒中还包括：芬维A胺。

在另一个优选例中，所述药盒中还包括：雷帕霉素。

在另一优选例中，所述的p53抑制剂包括：PFTα；PFTμ；以p53作为沉默靶标的干扰分子。

在另一优选例中，所述的以p53作为沉默靶标的干扰分子是p53为靶点的小干扰RNA；较佳地，所述的小干扰RNA是序列如SEQ ID NO:1的核酸(或是以P53基因或mRNA序列中SEQ ID NO:1序列位置为靶点的干扰核酸)；更佳地，所述的小干扰RNA藉由病毒介导进入细胞内发挥干扰作用。

在另一优选例中，所述的肿瘤是表达p53蛋白的肿瘤(较佳地为表达野生型或突变型p53蛋白的肿瘤)，以及缺失p53蛋白的肿瘤。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括(但不限于)：乳腺癌，肺癌，肠癌，前列腺癌，淋巴瘤，黑色素瘤，肾癌，胰腺癌，卵巢癌，骨髓瘤。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合在制备治疗肿瘤的药盒中的用途；所述的药物组合包括三氧化二砷和p53抑制剂。

在一个优选例中，所述的药物组合还包括：芬维A胺。

在另一个优选例中，所述药盒中还包括：雷帕霉素。

在另一优选例中，所述的p53抑制剂包括：PFTα；PFTμ；以p53作为沉默靶标的干扰分子。

在另一优选例中，所述的治疗肿瘤包括：抑制肿瘤的转移以及抑制肿瘤的生长。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括(但不限于)：乳腺癌，肺癌，肠癌，前列腺癌，淋巴瘤，黑色素瘤，肾癌，胰腺癌，卵巢癌，骨髓瘤。

在本发明的另一方面，提供三氧化二砷在制备抑制肿瘤转移的药物中的用途(较佳地，所述的三氧化二砷通过抑制TGFβ和TNFα或它们的下游基因、从而抑制肿瘤的转移)。

在一个优选例中，所述的肿瘤转移是乳腺癌转移(较佳地为乳腺癌肺转移)。

在本发明的另一方面，提供三氧化二砷在制备TGFβ或TNFα信号通路的抑制剂中的用途；较佳地，所述的TGFβ和TNFα信号通路抑制剂抑制肿瘤转移。

在本发明的另一方面，提供三氧化二砷在制备治疗p53功能缺失型肿瘤的药物中的用途。

在一个优选例中，所述的p53功能缺失型肿瘤包括：乳腺癌、结肠癌或肺癌。

在本发明的另一方面，提供p53抑制剂在制备抑制肿瘤转移的药物中的用途；较佳地，所述的肿瘤包括：乳腺癌。

在一个优选例中，所述的p53抑制剂包括：PFTα；PFTμ；以p53作为沉默靶标的干扰分子。

在本发明的另一方面，提供C/EBPβ以及C/EBPβ调控的靶基因在制备诊断乳腺癌转移的诊断试剂中的用途(C/EBPβ特异性地在肺转移的细胞中高表达，并且参与肿瘤的肺转移过程，缺失C/EBPβ促进乳腺癌细胞向肺部的转移；因此，可以通过确定C/EBPβ以及C/EBPβ调控的靶基因的表达情况来进行乳腺癌的预后，如确定发生乳腺癌转移的可能性)。

在本发明的另一方面，提供芬维A胺在制备抑制肿瘤干细胞的药物中的用途；较佳地，所述的肿瘤干细胞是卵巢癌，乳腺癌和结肠癌的肿瘤干细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、三氧化二砷作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231后的整体表达谱特征。

(A)通过CPP-SOM展示三氧化二砷作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231后的调变趋势。其中红色的代表在三氧化二砷处理过程中上调的基因，蓝色表示在三氧化二砷处理过程中下调的基因，而黄色和绿色代表在三氧化二砷处理后调变较低的基因。(B)根据CPP-SOM展示的基因的表达模式，将每个SOM图分为27个bases。(C)Heatmap图的聚类分析展示在任一时间点大于2倍调变的基因。其中绿色的cluster代表三氧化二砷处理后下调的基因，而红色的cluster代表三氧化二砷处理后上调的基因。蓝色的cluster代表中三氧化二砷处理后动态变化的基因。图下面的bar代表基因的表达量。(D)图展示富集到的生物学功能类GO。(E-G)通过heatmap展示在GO富集中与细胞周期，DNA复制和细胞的应急反应相关的调变基因在三氧化二砷处理过程中的变化趋势。

图2、三氧化二砷特异性抑制TGFβ和TNFα信号通路。

(A)三氧化二砷作用于MDA-MB-231细胞后，调变基因相关的pathway分析。(B)三氧化二砷能特异性抑制TGFβ诱导的SMAD2/3的磷酸化。Western blot检测在TGFβ以及三氧化二砷预处理之后MDA-MB-231细胞中SMAD2/3和磷酸化SMAD2/3的表达量。以actin的表达量作为对照。(C)三氧化二砷能特异性抑制TNFα诱导的NF-κB的磷酸化。Western blot检测在TNFα以及三氧化二砷预处理之后MDA-MB-231细胞中NF-κB和磷酸化NF-κB的表达量。(D)荧光实时定量PCR检测TGFβ信号通路下游的靶基因在三氧化二砷(ATO)，TGFβ以及三氧化二砷和TGFβ联合处理之后mRNA的表达量。以GAPDH的表达量作为对照。(E)荧光实时定量PCR检测TNFα信号通路下游的靶基因在三氧化二砷，TNFα以及三氧化二砷和TNFα联合处理之后mRNA的表达量。以GAPDH的表达量作为对照。

图3、三氧化二砷重编程乳腺癌肺转移的signature。

荧光实时定量PCR检测乳腺癌MDA-MB-231和LM2-4175细胞中乳腺癌肺转移signature基因的表达量，以及三氧化二砷5μM处理36小时后MDA-MB-231和LM2-4175细胞中乳腺癌肺转移signature基因的表达量。基因的表达量以GAPDH作为内参。

图4、三氧化二砷对体外肿瘤转移模型和小鼠体内尾静脉肺转移模型的影响。

(A)三氧化二砷对MDA-MB-231和LM2-4175细胞迁移能力的影响。左图展示在MDA-MB-231中的结果。在划痕之后，分别在0小时和40小时拍照。同样的，右图展示在LM2-4175中的结果。(B)三氧化二砷对MDA-MB-231和LM2-4175细胞侵袭能力的影响。图片展示MDA-MB-231和LM2-4175迁移到小室下层的细胞，用结晶紫进行细胞的染色。(C)对B图中转移的细胞进行计数分析。(D)在小鼠尾静脉注射LM2-4175细胞后，小鼠每天腹腔注射三氧化二砷5mg/kg作为治疗组，并以PBS处理作为阴性对照组。两个月后检测转移到小鼠肺部的肿瘤细胞克隆。左图，对每组小鼠中代表性的肺组织进行拍照，并进行H&E的染色。右图展示代表性的H&E的染色结果。(E)对PBS处理组小鼠和AT O治疗组小鼠转移到小鼠肺部肿瘤克隆计数分析。(F)小鼠皮下注射LM2-4175细胞后，小鼠每天腹腔注射三氧化二砷5mg/kg作为治疗组，并以PBS处理作为阴性对照组。三氧化二砷治疗36天，处死小鼠，取出肿瘤并拍照。(G)每隔6天测量肿瘤的大小。实验结果展示每组小鼠肿瘤的平均体积。

图5、三氧化二砷的表达谱特征与临床肿瘤病人样本的相关性。

(A)三氧化二砷处理后发生两倍调变的基因与病人临床数据的聚类分析。(B)两组病人在发生肺转移和发生骨转移的可能性发分析。(C)HER2，ER，PR以及TGFβ信号通路的三个靶基因ANGPTL4，VEGFA和C/EBPβ在这两组病人中的表达量。

图6、转录因子C/EBPβ参与乳腺癌肺转移相关signature的调控。

(A)motif分析乳腺癌肺转移signature基因的promoter区域，筛选可能结合到这些promoter区域的转录因子。取Z-score大于5作为有意义的富集转录因子。(B和C)荧光实时定量RT-PCR检测乳腺癌MDA-MB-231(B)和LM2-4175(C)细胞在三氧化二砷5μM处理0小时，6小时，12小时，24小时和36小时后C/EBPβ和C/EBPγ的表达量。以细胞内GAPDH的表达量作为内参。(D)通过Joan Massagué已经发表的GSE2603这套芯片数据分析在LM2细胞和MDA-MB-231中C/EBPβ表达。其中LM2细胞包括LM2-4180，LM2-4175，LM2-4173和LM2-4142。同时与骨转移的BoM-1834和BoM-1833细胞比较C/EBPβ表达量。(E)通过Joan Massagué已经发表的GSE2603这套芯片数据分析在LM2细胞和MDA-MB-231中C/EBPγ表达。(F)荧光实时定量RT-PCR检测乳腺癌MDA-MB-231和LM2-4175细胞在三氧化二砷5μM处理36小时后C/EBPβ和C/EBPγ的表达量。以细胞内GAPDH的表达量作为内参。(G)经5μM三氧化二砷处理0小时，6小时，12小时，24小时和36小时后，MDA-MB-231和LM2-4175细胞中C/EBPβ蛋白含量变化的western结果。以针对C/EBPβC端的抗体，可以同时检测三种C/EBPβ的蛋白形式。

图7、缺失C/EBPβ促进乳腺癌细胞肺部的转移但不影响肿瘤的生长。

(A)在MDA-MB-231和LM2-5175细胞中表达慢病毒介导的特异性针对C/EBPβ序列的两个小干扰RNA(siRNA1和siRNA2)，荧光实时定量RT-PCR检测敲除质粒的干扰效率。以无特异性的NC序列作为阴性对照。(B)western blot检测敲除质粒的干扰效率。(C)实验用小鼠模型，注射肿瘤细胞的数目，实验用小鼠的数目，以及发生肺转移小鼠的数目统计。NC，siRNA1和siRNA2代表MDA-MB-231中稳定表达的针对C/EBPβ的序列。下图是代表性肺转移小鼠的肺部组织拍照。(D)在裸鼠模型中，NC，siRNA1和siRNA2注射的MDA-MB-231细胞转移至小鼠的肺部的，形成的转移灶的个数进行统计。(E)在NOD-SCID小鼠模型中，NC，siRNA1和siRNA2注射的MDA-MB-231细胞转移至小鼠的肺部的，形成的转移灶的个数进行统计。(F)将转染NC，siRNA1和siRNA2的MDA-MB-231注射到小鼠的皮下组织，测量肿瘤的大小。图片展示每组小鼠平均的肿瘤生长。实验结束时将肿瘤取出拍照，图片在C图的最下方。

图8、MDA-MB-231细胞缺失C/EBPβ后的转录组水平的变化

(A)通过聚类分析展示在MDA-MB-231细胞中C/EBPβ缺失之后的表达谱的变化。下面的bar图代表基因的表达量。(B)展示通过GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)在C/EBPβ缺失的MDA-MB-231芯片数据中富集到的转录因子。取Statistical significance(nominal P value)小于0.05和FDR(false discovery rate)q小于0.25。(C)展示通过GSEA在C/EBPβ缺失的MDA-MB-231芯片数据中富集到的细胞信号通路。nominal P value代表富集的程度。(D)MDA-MB-231中富集到cytokine and cytokine receptor信号通路中的基因。

图9、C/EBPβ靶基因与临床肿瘤病人样本的相关性。

(A)C/EBPβ缺失后发生两倍调变的基因与临床数据的聚类分析。(B)两组病人在发生肺转移和发生骨转移的可能性发分析。(C)HER2，ER，PR以及C/EBPβ的靶基因ANGPTL4，VEGFA以及和C/EBPβ本身在这两组病人中的表达量。

图10、C/EBPβ通过直接结合到基因的启动子区发挥调节作用。

(A)luciferase实验检测C/EBPβ激活型LAP，抑制型的LIP和三氧化二砷对转移signature基因如：ANGPTL4，VCAM1，TNC，ISG20,以及TNFα信号通路相关的基因IL1A，IL1B，CCL20，以及两个在缺失C/EBPβ之后明显上升的基因BMP4，IFIT1的启动子的影响。C/EBPβ的表达载体pcDNA3.0与PGL3.0basic启动子载体共同转染MDA-MB-231细胞，检测luciferase活性的活性。以空载的pcDNA3.0转染细胞为对照。用三氧化二砷处理转染这些基因启动子的MDA-MB-231细胞，然后检测luciferase活性的活性。以三氧化二砷未处理细胞为对照。(B)染色质免疫沉淀(ChIP)与荧光实时定量PCR技术验证在MDA-MB-231和LM2-4175中C/EBPβ与乳腺癌肺转移signature基因的promoter区域的结合。以IgG作为对照。

图11、三氧化二砷和p53抑制剂PFTα在体外的协同抑制肿瘤细胞生长。

(A)实验所用细胞的名称，组织来源以及细胞中p53的状态。(B)p53野生型细胞HCT116，A549，MCF7，p53突变型SKBR3，SUM159，MDA-MB-231，HT29，p53缺失型H1299以及HCT116p53敲除的细胞，在三氧化二砷2.5和5μM处理48小时之后，用MTT方法检测细胞的活性。(C)P53野生型细胞MCF7，HCT116和A549用5μM三氧化二砷单用，20μM PFTα单用，或三氧化二砷和PFTα联合处理48小时。通过MTT的方法检测细胞活性。P53突变型细胞SKBR3作为阴性对照。(D)流式细胞仪检测MCF7和HCT116细胞在5μM三氧化二砷单用，20μM PFTα单用,或三氧化二砷和PFTα联合处理48小时的细胞凋亡情况。通过Annexin V-FITC和propidiumiodide(PI)双染，确定细胞早期和晚期的凋亡。数据展示细胞早期和晚期的凋亡的比例之和。(E)通过western blot检测凋亡过程中的marker PRAP和BCL2来确定三氧化二砷单用，PFTα单用，或三氧化二砷和PFTα联合处理之后细胞的凋亡情况。以actin的表达量作为对照。(F)通过propidium iodide(PI)染色，利用流式细胞仪检测三氧化二砷单用，PFTα单用，或三氧化二砷和PFTα联合处理之后细胞的DNA的含量。柱形图展示处于S期的细胞的比例。(G)通过Western Blot检测在三氧化二砷单用，PFTα单用，或三氧化二砷和PFTα联合处理之后细胞的p53以及p53磷酸化形式的表达量。

图12、三氧化二砷和p53抑制剂PFTα在体内的协同抑制肿瘤细胞生长的作用。

(A)将处于对数生长期的HCT116细胞注射于裸鼠的皮下。待长出可见的肿瘤时，将小鼠随机分成四组，每组6只。一组小鼠注射PBS作为对照，一组注射腹腔注射5mg/kg/day三氧化二砷，一组腹腔注射2.5mg/kg/day PFTα，最后一组联合三氧化二砷和PFTα用药。每隔5天测量小鼠肿瘤的大小。曲线图展示小鼠平均肿瘤的大小变化趋势。(B)各组所剥出的瘤体的照片。(C)实验结束时，每组小鼠的平均的体重。(小鼠的总体重减去负荷肿瘤的重量)。(D)将处于对数生长期的SKBR3细胞注射于裸鼠的皮下。待长出可见的肿瘤时，将小鼠随机分成两组。一组小鼠注射PBS作为对照，一组注射腹腔注射5mg/kg/d三氧化二砷。每隔6天测量小鼠肿瘤的大小。曲线图展示小鼠平均肿瘤的大小变化趋势。

图13、在转录组水平上三氧化二砷和三氧化二砷联合PFTα的作用模式与临床肿瘤病人样本的相关性。

(A)通过CPP-SOM展示三氧化二砷(上)以及三氧化二砷和PFTα联合作用(下)于HCT116后的调变基因。其中红色的代表在三氧化二砷处理过程中上调的基因，蓝色表示在三氧化二砷处理过程中上调的基因，而黄色和绿色代表在三氧化二砷处理后调变较低的基因。(B)根据CPP-SOM展示的基因的表达模式，将每个SOM图分为27个bases。(C)通过Heatmap图展示三氧化二砷单独作用之后发生调变的的基因的基因分析。(D)通过Heatmap图展示三氧化二砷和PFTα合用之后发生调变的的基因。(E)Venn diagram展示三氧化二砷单独作用之后调变的基因与三氧化二砷与PFTα合用之后调变的基因之间的关系。以2倍调变为标准，三氧化二砷单独作用之后有178个基因发生变化，而与PFTα合用之后调变的基因增加到1071个。其中153个基因是其共同调变的。(F)三氧化二砷与PFTα合用后发生两倍调变的基因与临床结肠癌病人数据的聚类分析。(G)两组病人无病生存率的可能性发分析。

图14、4HPR通过调节活性氧水平选择性的杀伤肿瘤干细胞。

(A)sphere细胞对顺铂的耐药性。流式细胞仪检测A2780parental细胞和sphere细胞在20μM顺铂处理48小时的细胞凋亡情况。通过Annexin V-FITC和propidium iodide(PI)双染，确定细胞早期和晚期的凋亡。数据展示细胞早期和晚期的凋亡的比例之和。(B)检测sphere细胞在小鼠体内的成瘤能力。将同样数目的A2780parental细胞和sphere细胞注射到NOD-SCID小鼠的皮下组织，检测肿瘤的大小。数据代表每组中4只小鼠皮下肿瘤生长的速度。(C)4HPR对A2780，MCF7，SUM159来源的sphere细胞的生长抑制作用。在显微镜下对4HPR处理组和非处理的sphere细胞进行拍照。(D)流式细胞仪检测A2780parental细胞和sphere细胞在3μM4HPR处理48小时的细胞凋亡情况。(E)流式细胞仪检测A2780parental细胞和sphere细胞在3μM4HPR处理6小时后的细胞内的活性氧水平。以DCF-DA的荧光强度代表细胞内的活性氧水平。并以维生素C的预处理组作为阴性的对照组。(F)流式细胞仪检测A2780parental细胞和sphere细胞在3μM4HPR以及4HPR在维生素C的预处理组24小时的细胞凋亡情况。

图15、三氧化二砷与p53抑制剂PFTα与4HPR的联合作用。

(A)在HT29以及HT29来源的4HPR耐药株细胞，检测4HPR，三氧化二砷，5FU，EPB处理48小时后细胞的活性。(B)p53野生型细胞HCT116，A549，MCF7，p53突变型SKBR3，SUM159，MDA-MB-231，HT29，以及p53缺失型H1299细胞，在4HPR6μM和9μM处理48小时之后，用MTT方法检测细胞的活性。(C)通过PI染色，利用流式细胞仪检测4HPR单用，4HPR和PFTα联合处理之后细胞的DNA的含量。柱形图展示处于S期的细胞的比例。(D)在MCF7和HCT116中检测三氧化二砷联合PFTα以及4HPR诱导的细胞凋亡的作用。(E)三氧化二砷与p53抑制剂PFTα与雷帕霉素rapamycin与芬维A胺4HPR的组合对细胞活性的影响。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示了三氧化二砷的抗肿瘤新机制，在此基础上提供了对于抗肿瘤有用的药物或药盒，以及三氧化二砷或相关制剂的新用途。

本发明人在研究中发现，三氧化二砷特异性的诱导乳腺癌肺转移signature的重编程，从而在体内和体外抑制乳腺癌肺转移过程。并且通过表达谱—转录因子的筛选及验证，确定C/EBPβ在乳腺癌肺转移和三氧化二砷抑制肿瘤转移中所发挥的作用。同时发现，三氧化二砷能很好的诱导p53功能缺失的细胞的凋亡，但对p53野生型的细胞没有影响。基于这个发现，本发明人提出在肿瘤疾病治疗过程中联合三氧化二砷与p53抑制剂PFTα以及以三氧化二砷与p53抑制剂PFTα为基础联合已有临床肿瘤治疗药物如雷帕霉素rapamycin和芬维A胺4HPR的肿瘤治疗方案。同时本发明人还发现p53抑制剂PFTα可以抑制肿瘤的侵袭转移。

三氧化二砷的新用途

在三氧化二砷抑制肿瘤细胞生长方面，本发明人发现，在相同浓度下三氧化二砷能特异性地抑制p53功能缺失型肿瘤细胞的生长，但对于p53野生型肿瘤细胞无明显影响。具体对于乳腺癌，结肠癌和肺癌细胞，本发明人发现三氧化二砷特异性地抑制来自乳腺癌，结肠癌和肺癌细胞系中的p53功能缺失型肿瘤细胞的生长如SKBR3，SUM159，MDA-MAB-231，HT29和H1299，而对p53野生型肿瘤细胞MCF7，HCT116和A549无明显影响。通过在动物体内的实验，本发明人发现三氧化二砷在小鼠皮下植瘤模型中能明显抑制p53缺失SKBR3细胞的生长，但对p53野生型HCT116细胞的生长抑制不明显。而当联合三氧化二砷和p53抑制剂共同处理时，p53野生型HCT116细胞的皮下成瘤能力就受到明显的抑制。

为了预测三氧化二砷与p53抑制剂合用在结肠癌病人中的治疗效果，本发明人选择在三氧化二砷与p53抑制剂合用后发生两倍调变的基因作为靶基因，并用这些基因与临床病人的生存年限进行基因量和病人肿瘤无病生存时间的双向聚类分析。根据三氧化二砷与p53抑制剂合用的靶基因在病人样本中的表达量，可以将所有的病人分成两组，看到一组病人有很高的死亡率，另一组病人的死亡率发生的可能性比较低。这些数据说明，三氧化二砷与p53抑制剂合用确实能很好的与病人的临床数据结合起来，比单独应用三氧化二砷可能具有很好的临床治疗的效果。

在三氧化二砷抑制肿瘤细胞转移方面，本发明人对三氧化二砷作用后的MDA-MAB-231细胞的表达谱研究发现，三氧化二砷能特异性的抑制乳腺癌肺转移相关的signature基因的表达。在具有高转移性的乳腺癌细胞MDA-MB-231，及来源于MDA-MB-231细胞，具有特异性肺转移能力的LM2-4175细胞中，三氧化二砷同样能特异性的抑制乳腺癌肺转移相关signature基因的表达。

本发明人发现，在体外的细胞转移模型中，三氧化二砷能明显的抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭的能力。在体内的小鼠尾静脉肺转移模型中，三氧化二砷可以抑制乳腺癌细胞在肺部形成克隆。需要强调的是三氧化二砷抑制乳腺癌细胞在肺部形成克隆的能力可能与三氧化二砷抑制乳腺癌肺转移signature基因有关，而不是通过调节某个单独的基因来实现的。

以临床肿瘤病人发生转移的数据为基础，本发明人了验证三氧化二砷在临床上抑制肿瘤细胞转移的可能性。选择在三氧化二砷处理后发生两倍调变的基因作为三氧化二砷作用的靶基因，并用这些基因与临床病人发生转移的数据进行基因表达量和病人肿瘤转移时间的双向聚类分析。根据三氧化二砷作用靶基因在病人样本中的表达量，可以将所有的病人分成两组，然后分析这两组病人在发生肺转移和骨转移的可能性。其中一组病人有很高的肺转移发生的可能性，而另一组病人的肺转移发生的可能性低。而在骨转移上，这两组病人没有明显的区别。并且ER，PR在这两组病人中有明显的差异。TGFβ信号通路的三个靶基因ANGPTL4，VEGFA和C/EBPβ在这两组病人中的表达量同样具有明显的差异。

因此，本发明提供了三氧化二砷的新医药用途，用于制备治疗p53功能缺失型乳腺癌、结肠癌或肺癌的药物；或用于制备抑制乳腺癌转移(较佳地为乳腺癌肺转移)的药物。

C/EBPβ的新用途

本发明人在深入研究后发现，转录因子C/EBPβ在调控肿瘤转移的signature中发挥重要作用，并且三氧化二砷可以通过抑制C/EBPβ的作用来抑制肿瘤的转移。

通过signature基因的motif分析，本发明人发现三氧化二砷通过抑制转录因子C/EBPβ的作用来抑制乳腺癌肺转移。在三氧化二砷作用之后，C/EBPβ的mRNA水平和C/EBPβ抑制型蛋白水平有了明显的升高。通过过表达C/EBPβ和siRNA敲除实验，本发明人进一步证实C/EBPβ可以调节乳腺癌肺转移signature基因。进一步通过小鼠的体内实验表明C/EBPβ的缺失可以促进肿瘤细胞的转移。并且通过ChIP实验，发现C/EBPβ与乳腺癌肺转移signature基因的启动子区结合，从而调节这些基因的表达。

进一步，本发明人通过表达谱芯片研究分析C/EBPβ调控的靶基因。选择在C/EBPβ缺失后发生两倍调变的基因作为C/EBPβ的靶基因，并用这些基因与临床病人发生转移的数据进行基因量和病人肿瘤转移时间的双向聚类分析。根据C/EBPβ的靶基因在病人样本中的表达量，我们可以将所有的病人分成两组。然后我们分析这两组病人在发生肺转移和发生骨转移的可能性。我们看到其中一组病人有很高的肺转移发生的可能性，而另一这组病人的肺转移发生的可能性低。而在骨转移上着两组病人没有明显的区别。

鉴于C/EBPβ在乳腺癌肺转移和三氧化二砷抑制肿瘤转移中发挥重要作用，肿瘤转移灶中C/EBPβ的表达量明显提高，其可以作为乳腺癌肺转移病人的分子诊断标记。因此，本发明提供了C/EBPβ在制备诊断乳腺癌转移的诊断试剂中的用途。

p53抑制剂的新用途

本发明人还发现，p53抑制剂PFTα(Pifithrin-α)也能明显的抑制肿瘤(如乳腺癌)的迁移和侵袭。现有技术中，本领域人员的思路一般均基于重建p53蛋白的活性。而本发明人的思路与之相反，提出以抑制p53活性的模式，通过p53抑制剂来抑制肿瘤的侵袭转移，以及恶性程度的进程。

如本文所用，所述的p53抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。

所述的p53抑制剂是指任何可降低p53蛋白的活性、降低p53基因或蛋白的稳定性、下调p53蛋白的表达、减少p53蛋白有效作用时间、或抑制p53基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调p53有用的物质，从而可用于抑制肿瘤转移。例如，所述的抑制剂是：特异性干扰p53基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷酸；或特异性与p53蛋白结合的抗体或配体。

作为本发明的一种方式，所述的P53的抑制剂是一种特异性与p53结合的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用p53蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达p53或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier，N.Y.，1981)。

作为本发明的一种优选方式，所述的p53的抑制剂是一种p53特异性的小干扰RNA分子(siRNA)。如本文所用，所述的“小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果良好的小干扰RNA分子，所述的小干扰RNA分子可特异性的干扰p53基因的表达，与其它的人类核酸序列没有显著的同源性；并且经验证，其具有良好的干扰p53表达的效果。

此外，本发明还提供了p53在肿瘤分型方面的用途，用于区分不同肿瘤的p53基因型，进而确定肿瘤对于三氧化二砷的敏感性。

药盒及其用途

本发明还发现，三氧化二砷与p53抑制剂对于p53野生型肿瘤细胞能够发挥良好的杀伤活性。

在相同浓度下三氧化二砷能特异性地抑制p53功能缺失型肿瘤细胞的生长，但对于p53野生型肿瘤细胞无明显影响。并且，在p53野生型肿瘤细胞中，通过抑制p53的活性来增强三氧化二砷的作用是有用的。在p53野生型肿瘤细胞MCF7，HCT116和A549中单独使用三氧化二砷或p53抑制剂(如PFTα)对肿瘤细胞都无明显影响，但三氧化二砷和p53抑制剂(如PFTα)的合用能明显抑制肿瘤细胞的生长。同时在p53功能缺失型肿瘤细胞MDA-MAB-231和HT29中三氧化二砷和p53抑制剂也有一定联合作用。

三氧化二砷和p53抑制剂的协同作用主要是通过诱导细胞的凋亡和周期的阻滞来实现的。在p53野生型肿瘤细胞MCF7和HCT116中，与单独使用三氧化二砷或p53抑制剂相比，三氧化二砷和p53抑制剂(如PFTα)的合用能明显增加Annexin V-PI阳性细胞的比例，并且可以诱导剪切型PARP的出现和降低BCL2的表达。在调节细胞周期方面，三氧化二砷和p53抑制剂的合用能明显降低HCT116和A549细胞中S期细胞的比例。在小鼠皮下成瘤的实验中，三氧化二砷和p53抑制剂PFTα同样具有明显的联合作用。与单独使用三氧化二砷或p53抑制剂PFTα相比，三氧化二砷和p53抑制剂PFTα的合用能明显抑制小鼠皮下肿瘤的生长速度。并且与单独使用三氧化二砷相比，三氧化二砷和p53抑制剂PFTα的合用并没有导致明显的小鼠毒副作用。

本发明人进一步发现，三氧化二砷与p53抑制剂(如PFTα)与已有临床肿瘤治疗药物如雷帕霉素和芬维A胺有明显的协同作用。本发明人比较了四种药物的16种组合在细胞活性和诱导细胞凋亡方面的不同作用，发现三氧化二砷，p53抑制剂(如PFTα)联合雷帕霉素或者三氧化二砷，p53抑制剂联合芬维A胺比其中任何两者的联合作用都为明显。

因此，作为本发明的优选方式，以三氧化二砷和p53抑制剂(如PFTα)为基础，结合已有临床肿瘤治疗药物如雷帕霉素和/或芬维A胺(Malone W等，2003；12:1829-1842)进行，将实现更为优异的技术效果。

因此，本发明提供了一种用于治疗肿瘤的药盒，所述的药盒中包括三氧化二砷；和p53抑制剂。更优选地，所述药盒中还包括：雷帕霉素；和/或芬维A胺。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、主要试剂和试剂盒

胎牛血清(FBS)和L-15细胞培养液购买自美国invitrogen公司；

RNA抽提TRIZOL试剂购自Gibco公司；

Protein Inhibitor Cocktail购买自Roche公司；

三氧化二砷购自Sigma公司；

细胞因子TNFα和TGFβ购自美国R&D公司。

RPMI1640细胞培养液，DMEM细胞培养液购于购自美国invitrogen公司；

MTT购自碧云天生物技术公司；

DCF-DA购自Sigma公司(St Louis，MO)；

p53抑制剂PFTα购自Sigma公司；

mTOR抑制剂rapamycin购自Sigma公司；

三氧化二砷采用的浓度为2.5μM和5μM。p53抑制剂PFTα采用的浓度为20μM和40μM；

PCR clean up kit购自Axygen公司；

凝胶抽取试剂盒(QIAquick Gel Extraction kit)购自Qiagen公司；

NucleoBond Xtra Midi购自MACHEREY-NAGEL公司；

脂质体转染试剂盒Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；

荧光素酶检测试剂盒(Dual-Luciferase Reporter Assay System)购自美国Promega公司；

反转录试剂盒(SuperScript^TMII Reverse Transcriptase)为Invitrogen公司；

RNase-Free DNase Set试剂盒为Qiagen公司；

Apoptosis kit购自BD公司。

2、实验小鼠

SPF级裸鼠，NOD-SCID小鼠购自中国科学院上海实验动物中心。(SYXK(沪)2003-0026，SCXK(沪)2002-003)。

3、细胞系、培养条件

细胞系为乳腺癌细胞系MDA-MAB-231，以及来源于MDA-MB-231细胞，具有特异性肺转移的LM2-4175细胞。MDA-MB-231细胞购于中国科学院细胞库。LM2-4175由纽约斯隆凯瑟琳癌症纪念医院提供。L15培养基与10％胎牛血清(FBS)混合培养细胞，放置于37℃、含5％CO₂的、饱和湿度的细胞培养箱中。

乳腺癌MCF7，SUM159，结肠癌细胞系HCT116，HT29，肺癌细胞系A549，H1299，卵巢癌细胞A2780均购自中国科学院细胞库。其中HCT116，HT29和A2780采用RPMI1640培养基，MCF7，SUM159，A549和H1299采用DMEM培养基(Invitrogen)，各种培养基与10％胎牛血清混合培养细胞，放置于37℃、含5％CO₂的、饱和湿度的细胞培养箱中。

4、体外细胞迁移的划痕实验和侵袭实验

划痕实验：当肿瘤细胞密度长到90％左右，1％低血清预处理12小时后，用200μl枪头进行划痕，并分别拍照记录0小时和48小时后的划痕区域。

侵袭实验：Trans-well培养板上室用Matrigel预包埋处理3小时。细胞在1％血清培养基预处理12小时后接种于Trans-well培养板上室。Trans-well培养板下室加入500μl10％血清，37℃，5％CO₂培养48小时。用湿棉签轻轻擦去Matrigel凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。用结晶紫染色后拍照计数穿过的细胞。

5、小鼠尾静脉肺转移实验

取对数生长的体外培养的LM2-4175乳腺细胞悬浮液用PBS洗两次，从小鼠尾静脉中注射2×10⁵细胞。将小鼠分为两组，一组注射PBS，一组注射三氧化二砷5mg/kg。两个月后取小鼠肺部组织进行染色，拍照。

6、小鼠肺组织固定以及转移灶计数

脱颈处死小鼠后，开胸取出肺脏，称重后将肺组织于固定液(饱和苦味酸：甲醛：冰醋酸75：25：5)中固定24小时，再用无水酒精浸泡至肺组织颜色恢复，转移灶为白色结节。在解剖显微镜下记数肺转移结节数量。

7、病理切片及H&E染色

石蜡切片制作：1)瘤体组织1×1×0.3cm。2)10％中性甲醛溶液(12～24小时)。3)酒精脱水。4)二甲苯1小时。5)浸蜡3小时。6)包埋，切片，烘干。

H&E染色：1)苏木素15分钟，水洗；2)1％分化液2～3秒；3)水洗(流水冲洗)20分钟；4)伊红3～4分钟；5)无水酒精脱水；6)二甲苯透明，封片。

8、小鼠皮下成瘤实验

取对数生长的体外培养LM2-4175细胞混合于Matrigel中，并注射于小鼠的皮下。肿瘤长到可见大小时注射PBS，或三氧化二砷5mg/kg。每隔6天用游标卡尺测量肿瘤的大小。

实验完成后，处死小鼠，摘除肿瘤，剔除筋膜，用电子天平称重。裸小鼠体重：裸小鼠实际体重为所称总体重减去瘤重。

9、蛋白的抽提和定量

不同时间点收集加药处理后的细胞约1×10⁶个，2000rpm4℃离心5分钟去掉上清，加入一定量预冷的PBS重悬，同样2000rpm4℃离心5分钟，去掉上清后加，入适量含有蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂的细胞裂解液RIPA，重悬，冰上孵育30分钟后，12000rpm4℃离心10分钟，吸取上清置于-80℃低温保存。

10、免疫印迹(Western blot)检测蛋白表达

待检测样本取相同量蛋白加入一定量3×上样缓冲液，混匀后置于100℃沸水中10分钟使其充分变性。将制备好的蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；电泳后转移蛋白质到硝酸纤维素膜。转好后的硝酸纤维素膜用1×TBST(Tris-Buffered Saline Tween-20)配制的5％脱脂奶粉室温封闭1小时；抗体4℃孵育过夜；1×TBST洗5次，每次5分钟；用辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1小时；1×TBST洗5次，每次5分钟；用EnhancedChemiluminescence(ECL)plus Western Blotting Detection Reagents显色并曝光于X光片上以检测蛋白质表达变化。

细胞总蛋白用以下抗体进行Western blot检测：C/EBPβ(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)，NF-κB(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)，磷酸化NF-κB(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)，SMAD2/3(Cell SignalingTechnology，Beverly，MA)和磷酸化SMAD2/3(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)。PARP(BD Pharmingen，San Diego，CA)、BCL2(BD Pharmingen，San Diego，CA)，PML(SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)，P53(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)，磷酸化P53(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)，磷酸化mTOR(Cell SignalingTechnology，Beverly，MA)，磷酸化S6K1(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)和C/EBPβ(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)。蛋白表达量以β-actin(CellSignaling Technology，Beverly，MA)作为标准化对照。

11、RNA提取和纯化

常规方法抽提细胞的RNA，用凝胶电泳的方法检测RNA质量，NanoDrop仪器检测RNA浓度。使用QIAGEN RNeasy mini kit试剂盒进行RNA纯化。

12、基因芯片杂交与数据挖掘

本实验采用的芯片为Affymetrix Human Genome-U133Plus2.0。进行mRNA提取纯化(DNA-free kit；Ambion Applied Biosystems)，之后交由上海伯豪生物技术有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心进行芯片的后一步操作。

芯片进行完成之后，进行芯片结果的分析。采用的基因筛选、基因聚类的分析方法根据Methods and system for analysis and visualization of multidimensionaldata.US，Patent No:6897875。调变基因的生物学功能聚类GO和pathway聚类以及转录因子分析由DAVID网上分析数据库进行分析。

生物学功能聚类和Pathway聚类的基因由Matlab进行分析，并进行Heatmap图的展示。

13、荧光实时定量RT-PCR

mRNA提取纯化后，反转录成cDNA(Promega)。

荧光实时定量RT-PCR使用SYBR Green I染料(Applied Biosystem，Foster City，CA)，在荧光定量RT-PCR仪ABI7900(Applied Biosystems)热循环检测系统上进行。Realtime PCR：反应体系包括1μl水，1μM的正向引物1μl，1μM的反向引物1μl，SYBR Master Mix5μl，模板2μl。以GAPDH的含量作为标准化对照。

实验所检测的基因及其引物如表1。

表1

	正向引物(SEQ ID NO:)	反向引物(SEQ ID NO:)
			ANGPTL4	GTCCACCGACCTCCCGTTA(2)	CCTCATGGTCTAGGTGCTTGT(3)
EREG	ATACTGGTGTCCGATGTGAACA(4)	CCGACGACTGTGATAAGAAACA(5)
			GPR153	ACGACGAGGAGTCAGACGAT(6)	GGGCCACAAAATCACCTCCAT(7)
ISG20	TCTACGACACGTCCACTGACA(8)	CTGTTCTGGATGCTCTTGTGC(9)
			TNC	GCCCCTGATGTTAAGGAGCTG(10)	GGCCTCGAAGGTGACAGTT(11)
MMP2	CTGATGGCACCCATTTACACC(12)	GCCTCGTATACCGCATCAATC(13)
			CSF3	GCTGCTTGAGCCAACTCCATA(14)	GAACGCGGTACGACACCTC(15)
FSCN1	CCAGGGTATGGACCTGTCTG(16)	GTGTGGGTACGGAAGGCAC(17)
			APOBEC3G	GCATCGTGACCAGGAGTATGA(18)	GTCAGGGTAACCTTCGGGT(19)
PTGS2	AAAGGCGCAGTTTACGCTGT(20)	TGCATTCTTTGCCCAGCACT(21)
			LTBP1	CTGACGGCCACGAACTTCC(22)	GCACTGACATTTGTCCCTTGA(23)
VCAM1	GGGAAGATGGTCGTGATCCTT(24)	TCTGGGGTGGTCTCGATTTTA(25)
			MAN1A1	TGGGGTAAAATTGCTACCTGC(26)	GGCTCAAGTGCATAAACTCCA(27)
CXCL1	AATTCACCCCAAGAACATCC(28)	CCCTTCTGGTCAGTTGGATT(29)

ID1	CTGCTCTACGACATGAACGG(30)	GAAGGTCCCTGATGTAGTCGAT(31)
			SPARC	TGAGGTATCTGTGGGAGCTAATC(32)	CCTTGCCGTGTTTGCAGTG(33)
PDGFA	GCAAGACCAGGACGGTCATTT(34)	GGCACTTGACACTGCTCGT(35)
			VEGFA	AGGGCAGAATCATCACGAAGT(36)	AGGGTCTCGATTGGATGGCA(37)
IL6	ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG(38)	CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG(39)
			IL8	AGGACAAGAGCCAGGAAGAA(40)	GGGTGGAAAGGTTTGGAGTA(41)
IL1A	AGATGCCTGAGATACCCAAAACC(42)	CCAAGCACACCCAGTAGTCT(43)
			IL1B	ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA(44)	GTCGGAGATTCGTAGCTGGA(45)
IL24	TTGCCTGGGTTTTACCCTGC(46)	AAGGCTTCCCACAGTTTCTGG(47)
			CXCL2	CACTCAAGAATGGGCAGAAA(48)	CCTCTGCAGCTGTGTCTCTC(49)
CXCL3	CCAAACCGAAGTCATAGCCAC(50)	TGCTCCCCTTGTTCAGTATCT(51)
			CCL20	TGCTGTACCAAGAGTTTGCTC(52)	CGCACACAGACAACTTTTTCTTT(53)
LIF	CCAACGTGACGGACTTCCC(54)	TACACGACTATGCGGTACAGC(55)
			GAPDH	GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(56)	GAAGATGGTGATGGGATTTC(57)

14、C/EBPβ基因的过表达

以LM-4175细胞的cDNA为模板，分别扩增C/EBPβ的长的激活形式LAP1，LAP2和短的抑制形式LIP，通过PCR克隆，并构建到pcDNA3.0表达载体的多克隆位点内，通过lipo-2000转染细胞。

采用的PCR克隆引物如下：

LAP1-正向引物：TTTGAATTCATGCAACGCCTGGTGGCC(SEQ ID NO:58)

LAP2-正向引物：TTTGAATTCATGGAAGTGGCCAACTTC(SEQ ID NO:59)

LIP-正向引物：TTTGAATTCATGGCGGCGGGCTTC(SEQ ID NO:60)

反向引物TTTCTCGAGGCAGTGGCCGGAGGAGGC(SEQ ID NO:61)

15、慢病毒介导的C/EBPβ，p53的敲除

四种慢病毒介导的C/EBPβ敲除质粒(CEBPβ-homo-261、CEBPβ-homo-1730、CEBPβ-homo-1170、CEBPβ-homo-1891)均购于GenePharma公司。购买时由GenePharma将上述质粒构建到慢病毒载体上，并完成病毒的包装。细胞转染慢病毒48后检测C/EBPβ干扰效果。其中，CEBPβ-homo-1170(siRNA1)和CEBPβ-homo-1891(siRNA2)对C/EBPβ敲除效果最为明显。

采用的siRNA的干扰序列如下：

5’→3’

NC TTCTCCGAACGTGTCACGT(SEQ ID NO:62)；

si RNA1 CACCCTGCGGAACTTGTTCAA(SEQ ID NO:63)；

si RNA2 CCCTGAGTAATCGCTTAAAGA(SEQ ID NO:64)。

慢病毒介导的P53敲除质粒购于GenePharma公司，并由GenePharma公司完成病毒的包装。

采用的p53siRNA的干扰序列如下：

5’→3’：GGAAGACTCCAGTGGTAATCT(SEQ ID NO:1)。

16、Luciferase报告基因活性检测

(1)启动子构建

pGL3-Basic报告基因载体、phRL-SV40海肾荧光素酶报告基因载体均购自Promega公司。分别克隆ANGPTL4，ISG20，TNC，VCAM，IL1A，IL1B，CCL20，BMP4，IFIT1基因转录起始位点ATG上游2000bp到下游500bp的启动子片段，构建到pGL3-Basic载体的启动子调控区中。

UCSC获得基因启动子序列，利用primer3设计引物，添加酶切位点。实验所用的启动子克隆引物如下：

采用NEB限制性内切酶酶切，利用AXYgen DNA clean up kit回收。采用NEB T4DNA连接酶将扩增产物与PGL3-basic载体连接。

转化大肠杆菌Top10感受态细胞，获得阳性转化子。

采用MACHEREY-NAGEL公司的NucleoBond Xtra Midi质粒抽提试剂盒进行质粒抽提。

细胞转染前一天接种到24孔板中，保证转染时细胞80％汇合度，质粒转染按Lipofectamine2000使用说明进行。分别由各启动子驱动的pGL3-Basic报告基因质粒转染125ng，目的蛋白C/EBPβ的表达质粒转染的量根据梯度实验而改变，同时转染海肾荧光素酶(renilla)(phRL-SV40)作为内参来矫正细胞数和转染效率等，培养48h后收细胞，进行下游实验。

荧光素酶报告基因分析：按照双荧光素酶报告系统(Dual-Luciferase ReporterAssay System)步骤要求操作。

17、染色质免疫共沉淀(ChIP)

(1)培养1×10⁸的细胞，细胞活力在97％以上后，收集细胞(5×10⁷细胞用于一个实验组)，细胞悬液中加入甲醛溶液至终浓度为1％，室温摇床孵育10min。

(2)加入总体积1/20的2.5M甘氨酸，室温摇床孵育5min后，4℃条件下，500g离心5min，收集细胞，用10ml预冷的1×PBS溶液洗涤细胞两次。

(3)弃除PBS后用预冷的裂解缓冲液15ml洗涤细胞3次，每次4℃，500g离心5min收集细胞。

(4)弃上清，在细胞中加入1ml IP-前缓冲液，然后用其补足体积至1.5ml后，加入以下缓冲体系中(IP-前缓冲液400μl，5M NaCl80μl，10％SDS200μl，三蒸水247μl，75μlPMSF蛋白酶抑制剂，1μl cocktail)用枪头混匀。

(5)用超声仪器超声，使DNA片段在200-1000bp之间。将超声裂解液以4℃，13000rpm离心10min取上清，将其转入5ml离心管，加入5倍体积的IP稀释缓冲液稀释。

(6)DNA超声后片段检测步骤：取适量超声后的裂解液，加入蛋白酶K，65℃孵育4小时以上解交联，用1％的琼脂糖电泳检测超声后DNA片段的大小。

(7)在液体中加入200μl经过IP稀释缓冲液预处理过的Protein A Sepharosebeads，4℃，摇床至少孵育1小时；4℃条件下，2000rpm离心2min，收集上清至新的15ml离心管中，在每个IP反应中分别加入10μg的ChIP级抗体或control IgG抗体，4℃摇床孵育过夜。

(8)将上述液体2000rpm离心2min，弃上清，收集beads。

(9)每个反应内的beads取出放入Spin-X柱子，用700μl ChIP洗脱低盐缓冲液4℃洗涤3次；用ChIP洗脱高盐缓冲液洗涤beads2次；用ChIP洗脱LiCL缓冲液涤beads2次；用TEbuffer洗涤beads3次；分别用200μl的Elution buffer洗涤beads两次(65℃，30分钟每次)，室温5000rpm，离心2min，共得到400ul洗脱液。

(10)在每个IP样本中加入40ul蛋白酶K充分混匀，65℃水浴过夜。应用QiaquickPCR Purification Column纯化DNA，溶解DNA至40ul的水中。

(11)应用Nanodrop微量核酸定量仪对ChIP-DNA的样本定量。

(12)tranfect分析ANGPTL4，ISG20，TNC,VCAM1基因转录起始位点上游2000bp到下游500bp的启动子片段中可能存在的C/EBPβ结合位点，并针对此位点用primer3设计realtime-PCR引物，并进行ChIP-DNA片段的检测。

实验所用的Ch-IP-q-PCR所用的引物如下：

18、病人临床样本分析

病人样本数据是采用斯隆凯瑟琳癌症纪念医院收集的乳腺癌病人的样本数据，可以在NCBI GSE2603下载。去除病人中无临床分析的样本，共采用82例病人转移生存年限的数据。通过matlab的双向聚类分析，将这82例病人分为两组，然后通过病人生存及肿瘤转移的时间进行两组病人的比较分析。

19、Sphere细胞培养条件

来源于HCT116，HT29，MCF7，SUM159以及A2780的单个细胞在悬浮无血清培养条件下都可以形成sphere样细胞。其中sphere培养液sphere formation media(SFM)包括DMEM-F12，2％B-27，20ng/mL表皮生长因子EGF(sigma)，5μg/mL胰岛素(sigma)，和0.4％牛血清白蛋白BSA(bovine serum albumin)(Amresco)。

20、细胞生长曲线的测定

24孔细胞培养板接种密度为4×10⁴的细胞悬液1000μl，培养24小时后换液、加药。在各加药时间点每孔加入100μl5mg/ml MTT溶液，培养箱孵育3小时后，吸尽培养液，加入1000μl DMSO充分溶解紫色结晶，酶标仪下以570nm波长测定吸光值(参考波长为630nm)。以未加药做作为对照，计算细胞的活性。

21、细胞凋亡检测

用FITC标记的Annexin V同时结合使用Propidium Iodide(PI)拒染法进行凋亡细胞检测。具体操作步骤参照BD试剂盒(BD Pharma)说明。在细胞加药一定时间点，胰酶消化收集细胞，并与消化之前吸出的培液和清洗用的PBS混合，以2×10⁵个细胞/管以2000rpm速度离心5分钟后弃上清，加入PBS500μl重悬一次，2000rpm离心5分钟后，加入200μl1×结合缓冲液重悬，2000rpm5分钟离心后，加入200μl1×结合缓冲液，5μl PI和2.5μl Annexin V抗体，混匀后室温避光静置15分钟后流式细胞仪测试。

22、细胞活性氧ROS检测

按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，37℃细胞培养箱内孵育30分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次。流式细胞仪检测DCF-DA的强度。

23、细胞周期的检测

在细胞加药一定时间点，胰酶消化收集细胞，取1×10⁶个细胞每管，2000rpm离心5分钟后弃上清，加入1mlPBS重悬细胞，2000rpm离心5分钟后弃上清，加入4℃预冷PBS250μl重悬，然后震荡缓慢加入750μl无水乙醇，4℃固定12小时以上后，2000rpm离心5分钟弃上清，再加入500μl PBS重悬，2000rpm离心5分钟弃上清，加入250μl PBS重悬后，加入RNase A至终浓度50μg/ml，37℃孵育30min，加入终浓度10μg/ml的PI后流式细胞仪测试。

24、裸鼠皮下结肠癌移植瘤模型的建立

本模型采用6周龄雄性BALB/c裸鼠。HCT116细胞消化后，加入适量PBS洗两遍后，用不含血清的培养基重悬，密度控制在1×10⁶/100ul。将制得的细胞悬液100μl注射到其身体的右侧腋窝下。待肿瘤长到直径约1cm分成四组(PBS对照组，单给ATO组，单给PFTα组，两药合用组)给药，每组6只。裸鼠给药时间为两周，期间每隔三天用游标卡尺检测肿瘤大小变化。给药结束后，裸鼠颈椎脱臼死亡，将肿瘤剥离承重，裸鼠秤体重。

25、sphere细胞皮下卵巢癌移植瘤模型的建立

本模型采用6周龄雌性NOD-SCID小鼠。单个细胞在无血清培养基形成sphere之后，将sphere细胞消化，加入适量PBS洗两遍后，用不含血清的培养基重悬，将制得的细胞悬液100μl注射到其身体的右侧腋窝下。同等数量的母带细胞100μl同样的注射到其身体的左侧腋窝下。用游标卡尺检测肿瘤大小变化。

26、结肠癌病人临床样本分析

病人样本数据是采用已发表结肠癌病人的样本数据，可以在NCBI14333下载。通过matlab的双向聚类分析，将病人分为两组，然后通过病人生存及肿瘤转移的时间进行两组病人的比较分析。

27、统计分析

两组间的差异用双尾的Student’s t test检验。多组间差异分析时，采用多因素方差分析(Two-way analysis of variance)看各组间的统计学显著差异。p-value<0.05视为统计学显著差异。

实施例1、三氧化二砷作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞系的动态表达谱分析

通过表达谱芯片，本发明人研究三氧化二砷在MDA-MB-231中转录组水平上的调控模式。根据基因表达量的变化趋势，选择Variation在Top5000的基因进行CPP-SOM展示分析(图1A)。并且通过对调变的基因进行聚类，把这些基因分为27个Cluster(图1B)。从图中可以看出，MDA-MB-231中基因表达量在三氧化二砷的处理后处于一种非常动态的变化过程。某些基因在三氧化二砷处理早期被激活，但这些基因在随后的时间中又降低；而在早期被抑制的基因在后来又处于激活的状态。而在处理的末期，即36小时的处理时，大部分变化基因都基于一种低表达的状态。这些数据说明MDA-MB-231细胞具有一种自我反馈的机制。当三氧化二砷处理后，细胞具有自我维持的机制，使得三氧化二砷作用后调变的基因都恢复到原始的状态。这种自我反馈机制在部分水平上解释为什么三氧化二砷在实体瘤MDA-MB-231细胞中没有表现出明显的诱导细胞凋亡的作用。

基于三氧化二砷处理之后在转录水平的动态变化，选取在任一时间点大于2倍调变的基因作为三氧化二砷调控的靶基因。这样共得到1500基因。其中942个基因在三氧化二砷处理之后上调，而609个基因的表达在三氧化二砷处理之后被抑制。图1C展示这些基因在Heatmap中的聚类分析。与CPP-SOM展示分析类似，在609个上调的基因中有134个基因表达在36小时有下降的趋势；而在942个下调的基因中，有320个基因在36小时恢复到原来的表达状态。

通过DAVID(Functional Annotations Bioinformatics Microarrays Analysis)分析软件，对三氧化二砷靶基因进行生物学功能(GO)的聚类分析。在生物学功能分析方面，细胞周期(cell cycle)，DNA复制(DNA replication)，细胞的应急反应(cellularresponse to stress)，细胞对未折叠蛋白的反应(response to unfold protein)和细胞凋亡的负调控(negative regulation of apoptosis)等生物学功能类有明显的富集(图1D)。为了进一步研究富集到的GO功能类与三氧化二砷作用的关系，通过heatmap展示GO中跟细胞周期，DNA复制，细胞的应急反应相关的基因(图1E-G)。从图中可以看出，与细胞周期，DNA复制和细胞的应急反应相关的基因在三氧化二砷处理12小时后都有明显的下降，而在36小时，这些基因的表达量基本上又恢复到0小时的状态。因为细胞周期，DNA复制，细胞的应急反应相关的基因都跟三氧化二砷抑制肿瘤细胞的生长有关，因此这种在细胞周期，DNA复制，细胞的应急反应相关过程中的负反馈机制可能导致三氧化二砷在实体瘤中没有明显的抑制肿瘤生长的作用。

实施例2、三氧化二砷抑制TGFβ和TNFα信号通路

通过DAVID分析软件，本发明人还对三氧化二砷靶基因进行信号通路pathway的聚类分析，希望找到与乳腺癌肺转移相关的信号通路。首先，与GO的细胞功能聚类类似，可以富集到与细胞周期和DNA复制相关的通路。除此之外，p53信号通路(p53signalingpathway)，TGFβ信号通路(TGFβsignaling pathway)以及NOD类细胞受体信号通路(NOD-like receptor signaling)有明显的富集(图2A)。

转化生长因子β(TGFβ)是一个多功能的细胞因子，其作用包括抑制肿瘤细胞生长和促进肿瘤的转移。TGFβ的作用跟肿瘤发生的阶段，肿瘤的类型，肿瘤的微环境密切相关。研究发现，肿瘤内细胞因子TGFβ可以启动乳腺癌细胞向肺部转移的过程。大约40％的肿瘤样本带有受TGFβ影响的基因标签。并且ER阴性的乳腺癌肿瘤细胞在接触TGFβ后，会导致这些肿瘤细胞中血管生成素样蛋白(ANGPTL4)细胞因子的增加。这种肿瘤细胞从肿瘤中逸出并储留在肺部后，ANGPTL4会破坏薄壁毛细血管细胞间的连接，当细胞与细胞间的接触被分开之后，即可使肿瘤细胞穿越血管壁进入肺脏。研究成果提示，人们可以将TGFβ作为药物“标靶”，来开发抑制乳腺癌向肺部转移的药物。此外，TGFβ标签还有助于预测可能出现肺部转移的乳腺癌病人，使他们能够受到更为密切的临床监控，并对他们进行更准确的治疗。

肿瘤坏死因子α(TNFα)是一个特别的，并具有多重功能的细胞因子，它在免疫调节，炎症反应，机体防御当中起着关键的作用。根据不同的细胞微环境，肿瘤坏死因子可以诱导多种反应，例如凋亡，坏死，血管生成，免疫细胞激活，细胞分化，细胞迁移。TNFα在肿瘤当中是一把双刃剑。一方面，TNFα是一个内源性的肿瘤促进因素。TNFα可以刺激肿瘤细胞生长，增殖，侵袭，转移，血管生成。另一方面，TNFα具有杀肿瘤细胞的作用。因此，如果可以调控肿瘤坏死因子的功能，将为癌症的治疗提供可能。

那么三氧化二砷能否特异性抑制TGFβ和TNFα信号通路呢？本发明人检测TGFβ处理之后的SMAD2/3基因的表达量。SMAD2/3是TGFβ信号通路下游的作用分子，当细胞受到TGFβ信号通路的激活时，SMAD2/3就会发生磷酸化。磷酸化的SMAD2/3进入细胞核，作用于下游的靶基因，从而诱导肿瘤的转移过程。本发明人发现，先用三氧化二砷预处理MDA-MB-231细胞，再用TGFβ处理时，三氧化二砷预处理组的SMAD2/3的磷酸化激活形式有明显的减少。说明三氧化二砷能特异性抑制TGFβ诱导的SMAD2/3的磷酸化(图2B)。

类似的，NF-κB作为TNFα信号通路下游的作用分子，当细胞受到TNFα信号通路的刺激时，NF-κB会发生特异位点的磷酸化。磷酸化的NF-κB进入细胞核，作用于下游的靶基因，从而诱导肿瘤的转移过程。同样的，先用三氧化二砷预处理MDA-MB-231细胞，再用TNFα处理时，本发明人发现三氧化二砷预处理组的NF-κB的磷酸化激活形式有明显的减少。说明三氧化二砷能特异性抑制TNFα诱导的NF-κB的磷酸化(图2C)。

TGFβ和TNFα信号通路都是通过诱导其下游的靶基因来实现其细胞生物学功能，那么三氧化二砷能否抑制TGFβ和TNFα信号通路下游靶基因的表达呢？ANGPTL4，NEDD9，MMP2，PDGFA和VEGFA都是TGFβ的下游的靶基因，在TGFβ处理的MDA-MB-231细胞中有明显的激活(图2D上)。但在三氧化二砷预处理的MDA-MB-231细胞中，TGFβ对ANGPTL4，NEDD9，MMP2，PDGFA和VEGFA的激活作用有明显的下降(图2D上)。类似的，本发明人采用已知的TGFβ信号通路的抑制剂SB431542(简称SB)，其结果与三氧化二砷的作用相似。在SB431542预处理的MDA-MB-231细胞中，TGFβ对ANGPTL4，NEDD9，MMP2，PDGFA和VEGFA的激活作用也有明显的下降(图2D下)。

同样的，本发明人检测三氧化二砷对TNFα信号通路下游靶基因IL6，IL1A，CSF3，IL1B，VCAM1，CCL20，PTGS2，LIF，CXCL1，CXCL2的影响。在TNFα处理的MDA-MB-231细胞中，IL6，IL1A，CSF3，IL1B，VCAM1，CCL20，PTGS2，LIF，CXCL1和CXCL2基因的表达都有明显的激活。但在三氧化二砷预处理的MDA-MB-231细胞中，TNFα对IL6，IL1A，CSF3，IL1B，VCAM1，CCL20，PTGS2和LIF的激活作用有明显的下降(图2E)。而对CXCL1和CXCL2没有明显的影响。这些数据说明，三氧化二砷能特异性的抑制TGFβ和TNFα诱导的SMAD2/3和NF-κB的磷酸化，从而抑制TGFβ和TNFα信号通路下游靶基因的表达。已知TGFβ和TNFα均能促进肿瘤的转移，因此三氧化二砷作为TGFβ和TNFα的抑制剂，通过抑制其下游基因的表达、进而抑制肿瘤的转移。

实施例3、三氧化二砷重编程乳腺癌肺转移的Signature

肿瘤的转移是肿瘤细胞、宿主细胞和肿瘤微环境之间一系列复杂的相互作用，相互影响的连续过程，多个基因，多条通路参与整个的侵袭和转移的过程。因此在研究肿瘤的转移过程中必然涉及到多层次，多基因。而如何同时对参与转移的多个基因进行研究呢？本发明人认为，三氧化二砷可能对整个乳腺癌肺转移的signature有明显的影响。

为了证实三氧化二砷对肺转移的Signature基因的影响，本发明人采用来源于MDA-MB-231细胞，具有特异性肺转移的LM2-4175细胞。乳腺癌肺转移相关signature基因中与TGFβ信号通路相关的基因如ANGPTL4，EREG，MMP2，ID1，LTBP1；与TNFα信号通路相关的基因如CSF3，PTGS2，CXCL1，VCAM1，IL6，IL1A，IL1B，CXCL2，LIF，CCL20；还有一些基因如APOBEC3G，FSCN1，ISG20，GPR153，MAN1A1，TNC等与TGFβ和TNFα信号通路不相关。与MDA-MB-231细胞相比，这些基因在LM2-4175细胞中的表达有明显的升高。而在三氧化二砷处理之后，这些基因在MDA-MB-231细胞和LM2-4175细胞中又都有明显的下降(图3)。

实施例4、三氧化二砷抑制肿瘤的肺转移过程而对肿瘤生长没有明显影响

本发明人发现三氧化二砷可以抑制乳腺癌肺转移相关signature基因的表达，那么三氧化二砷是否可以抑制肿瘤的转移呢？首先在体外的划痕实验中，本发明人发现三氧化二砷能明显的抑制乳腺癌MDA-MB-231和LM2-4175细胞迁移能力(图4A)。同样在体外的小室侵袭实验中，三氧化二砷能够抑制穿过小室的肿瘤细胞的数目(图4B-C)。

为更好的模拟体内肿瘤侵袭和转移，本发明人建立实验性肺转移模型。将肺转移亚克隆LM-4175细胞注射于裸鼠尾静脉，然后将小鼠分为PBS对照组和三氧化二砷治疗组。其中三氧化二砷治疗组小鼠每天注射5mg/kg三氧化二砷，持续注射一个月，8-9周后观察肺转移情况。与PBS对照组相比，三氧化二砷治疗组小鼠肺转移结点显著减少(图4D)。通过H&E染色分析，同样的，PBS组可以看到明显的乳腺癌细胞的肺转移的结点，而在三氧化二砷处理组中，这些结点明显的减少(图4E)。总而言之，细胞水平和动物水平的实验结果均证实三氧化二砷可以抑制乳腺癌细胞向肺部转移的能力。

同时本发明人还检测三氧化二砷是否能够抑制肿瘤的生长。将LM2-4175细胞注射于小鼠皮下，在肿瘤长到可见的大小时，将小鼠分为两组。PBS对照组和三氧化二砷治疗组。其中三氧化二砷治疗组小鼠每天注射5mg/kg三氧化二砷，并每隔6天测量肿瘤的大小。在30天的处理之后，PBS对照组和三氧化二砷处理组之间，小鼠的肿瘤大小没有明显的差别(图4F和G)。

实施例5、三氧化二砷表达谱特征与临床肿瘤病人样本的相关性分析

为了进一步验证三氧化二砷在临床上抑制肿瘤细胞转移的可能性，本发明人选择在三氧化二砷处理后发生两倍调变的基因作为三氧化二砷作用的靶基因，并用这些基因与临床病人发生转移的数据进行基因表达量和病人肿瘤转移时间的双向聚类分析。本发明人采用的网上的临床数据是Joan Massagué分析肺转移的signature时用的数据。根据三氧化二砷作用靶基因在病人样本中的表达量，本发明人可以将所有的病人分成两组。红色代表一组病人，蓝色代表一组病人(图5A)。然后分析这两组病人在发生肺转移和骨转移的可能性。本发明人看到，红色的这组病人有很高的肺转移发生的可能性，而蓝色的这组病人的肺转移发生的可能性低。而在骨转移上，这两组病人没有明显的区别(图5B)。

随后，本发明人又分析HER2，ER，PR在这两组病人中的表达量。可以看到ER，PR在这两组病人中有明显的差异。而HER2在两组病人中无明显差异(图5C)。并且发现TGFβ信号通路的三个靶基因ANGPTL4，VEGFA和C/EBPβ在这两组病人中的表达量同样具有明显的差异(图5C)。

实施例6、转录因子C/EBPβ参与三氧化二砷对乳腺癌肺转移相关signature的调控

三氧化二砷可以同时影响乳腺癌肺转移相关signature的多个基因，本发明人认为三氧化二砷的作用可能是通过影响乳腺癌肺转移中某个重要的转录因子来实现的。尽管乳腺癌骨转移，肺转移，脑转移的signature相继被鉴定出来，但是什么因素可以特异的调节这些signature基因还不清楚。本发明人通过motif软件分析乳腺癌肺转移signature基因的启动子(promoter)区域，筛选可能结合到这些启动子区域的转录因子。经过分析，本发明人共富集到四个转录因子POU3F2，PAX2，NKX62和CEBP(图6A)。通过三氧化二砷对MDA-MB-231调控的芯片分析，本发明人发现POU3F2，PAX2和NKX62这三个转录因子在三氧化二砷处理之后的MDA-MB-231细胞中都没有明显的变化。

C/EBP(CCAAT增强子结合蛋白，CCAAT enhancer binding protein)家族包括C/EBPα，C/EBPβ，C/EBPγ，C/EBPδ，C/EBPε和C/EBPζ6个成员。这6个成员中C/EBPβ和C/EBPγ在三氧化二砷处理后有明显的上升，而其他的C/EBP家族成员没有明显的变化。通过荧光实时定量PCR，本发明人进一步验证在三氧化二砷处理之后的MDA-MB-231中，C/EBPβ和C/EBPγ的表达量有明显的升高(图6B)。并且在三氧化二砷处理之后的LM2-4175细胞中，C/EBPβ和C/EBPγ的表达量有明显的升高(图6C)。那么C/EBPβ和C/EBPγ中哪一个在影响乳腺癌的肺转移？本发明人通过Joan Massagué已经发表的GSE2603这套芯片数据分析在LM2细胞和MDA-MB-231细胞中C/EBPβ和C/EBPγ的表达。与母代MDA-MB-231相比，在LM2细胞中，包括LM2-4180，LM2-4175，LM2-4173和LM2-4142，C/EBPβ的表达量有明显的升高，而C/EBPγ的表达量没有明显的变化(图6E)。通过荧光实时定量PCR，本发明人进一步发现，跟MDA-MB-231相比，LM2-4175中C/EBPβ大概有两倍的升高，而C/EBPγ基本没有变化(图6F)。值得注意的是，在MDA-MB-231来源的，特异性骨转移的BoM-1834和BoM-1833(根据互联网已发表的芯片数据)细胞中，C/EBPβ和C/EBPγ的表达量都没有明显的变化。这些结果提示，C/EBPβ特异性地在肺转移的细胞中高表达，并且参与肿瘤的肺转移过程。

接下来本发明人检测C/EBPβ在三氧化二砷处理之后的蛋白表达情况。在蛋白水平上，C/EBPβ有长的激活形式(LAP1和LAP2)和截短型的抑制形式(LIP)三种。这三种蛋白是由同一个mRNA，通过不同的翻译起始位点所形成的。其中LAP1和LAP2含有C/EBPβ的DNA结合区域和转录激活区域，属于C/EBPβ的激活形式。而LIP缺少C/EBPβ的DNA结合区域，通过与其他C/EBPβisofrom相互作用，以显性负抑制的方式抑制C/EBPβ的作用，属于C/EBPβ的抑制形式。

通过Western Blot实验，检测MDA-MB-231和LM2-4175细胞在5μM三氧化二砷处理0小时，6小时，12小时，24小时和36小时后C/EBPβ蛋白的含量。在MDA-MB-231细胞中，C/EBPβ蛋白主要以激活的LAP形式存在，并在三氧化二砷处理后，C/EBPβ三种形式都有明显的增加(图6G)。在LM2-4175细胞中，C/EBPβ蛋白的两种形式LAP和LIP均存在，并且比MDA-MB-231细胞中的表达水平高。在三氧化二砷处理之后，LM-4175在蛋白水平上C/EBPβ的表达量也有明显增加(图6G)。

实施例7、缺失C/EBPβ促进乳腺癌细胞向肺部的转移但不影响肿瘤的生长

本发明人采用慢病毒介导的siRNA来敲除MDA-MB-231和LM2-4175中C/EBPβ的表达。利用两对特异性针对C/EBPβ的siRNA(siRNA1和siRNA2)，以及没有特异性的阴性对照序列(NC)，转染MDA-MB-231和LM2-4175细胞，48h后检测C/EBPβ的干扰效果。

结果显示，在MDA-MB-231细胞中C/EBPβ的mRNA的表达量有明显的下降，跟NC相比，C/EBPβ的表达量下降80％。而在LM2-4175细胞中，由于C/EBPβ的本底的表达量比MDA-MB-231高，因此在同样的病毒滴度下只有40％的下降(图7A)。进一步通过Western实验，在MDA-MB-231中，跟NC相比，C/EBPβ三种蛋白的形式都有明显的下降，几乎检测不到C/EBPβ的表达。而在LM2-4175细胞中，虽然跟NC相比，C/EBPβ的表达量有明显的下降，但是仍有部分的C/EBPβ的表达(图7B)。

为了验证C/EBPβ缺失对乳腺癌肺转移的影响，本发明人将分别应用siRNA1和siRNA2敲除C/EBPβ的MDA-MB-231的细胞，以及对应的NC细胞注射到裸鼠的尾静脉，然后观察小鼠肺转移的情况。当注射4×10⁵个细胞时，在8只注射NC细胞的小鼠中都没有发现肺部的转移结点，而在8只注射siRNA1和8只注射siRNA2的小鼠中，分别有四只小鼠发现有肺部的转移灶(图7C)。而当注射1×10⁶个细胞时，在9只注射NC细胞的小鼠中，有4只发现肺部的转移结点，而在6只注射siRNA1和6只注射siRNA2的小鼠中，所有的小鼠都发现在肺部有乳腺癌细胞的转移结点。通过计数统计分析，当注射1×10⁶个细胞时，每只NC的小鼠平均有2个肺转移的结点，而当C/EBPβ缺失后，每只小鼠的肺部转移灶增加到20多个，明显高于NC小鼠的转移灶(图7D)。这说明C/EBPβ的缺失有利于乳腺癌细胞的肺转移过程。

C/EBPβ的作用跟肿瘤的免疫环境密切相关，为了排除小鼠的免疫缺陷对实验的影响，本发明人采用NOD-SCID小鼠重复上述实验。在NOD-SCID小鼠中，本发明人得到类似的实验结果。在每只NC的小鼠平均有2个肺转移的结点，而当C/EBPβ缺失后，每只小鼠的肺部转移灶增加到20多个，明显高于NC小鼠的转移灶(图7E)。

本发明人还进一步研究C/EBPβ的缺失对肿瘤细胞生长的影响。本发明人将分别应用siRNA1和siRNA2敲除C/EBPβ的MDA-MB-231细胞，以及对应的NC细胞注射到裸鼠的皮下，然后观察肿瘤生长的情况。发现在C/EBPβsiRNA和NC细胞之间没有明显的肿瘤大小的差别。因此提示C/EBPβ缺失只影响到肿瘤的肺转移的能力，还没有影响肿瘤皮下生长的能力(图7F)。

实施例8、MDA-MB-231细胞缺失C/EBPβ后转录组水平的变化

为了了解C/EBPβ缺失之后的整个转录组水平的变化，本发明人提取MDA-MB-231NC细胞，siRNA1和siRNA2细胞的RNA，并与Affymetrix(Santa Clara，CA)公司的HumanGenome-U133Plus2.0array芯片杂交。MDA-MB-231的芯片结果有三次重复。通过数据归一化和数据挖掘，选取P<0.01的基因作为C/EBPβ调控的靶基因。在MDA-MB-231中共有3356个基因发生调变。通过heatmap的聚类分析，在MDA-MB-231调变的3356个基因中有1164个基因被激活，而1692个基因被抑制(图8A)。通过GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)分析C/EBPβ缺失后影响的转录因子。采用FDR q<0.25和p value<0.05的标准。首先可以富集到转录因子C/EBPβ，芯片结果证明确实跟C/EBPβ有关(图8B)。

C/EBPβ也称为核因子白细胞介素-6表达式(NF-IL6)，最初被确定为一个IL1诱导反式激活因子的IL6基因。早期研究表明，C/EBPβ和NF-κB可以实现协同激活IL6的表达。在GSEA转录因子分析时，除C/EBPβ，还可以富集到转录因子NF-κB(图8B)。这个结果说明，C/EBPβ和NF-κB协同调控某些基因的表达。也证实本发明人前面的C/EBPβ参与TNFα信号通路的调节作用的结论。但并没有很明显地富集到TGFβ下游的转录因子SMAD2/3。

通过GSEA，本发明人还分析在MDA-MB-231缺失C/EBPβ之后相关的信号通路。本发明人发现大部分的信号通路都与免疫反应有关。其中包括抗原加工以及递呈(the antigenprocessing and presentation)信号通路和IgA表达的调控(immune network for IgAproduction)与B淋巴细胞的功能有关。Toll和NOD样受体通路(Toll，NOD like receptorsignaling pathway)以及T细胞受体通路(T cell receptor signaling pathway)与T淋巴细胞的功能有关。与自然杀伤性NK细胞有关的自然杀伤性细胞介导的细胞毒性反应(Natural killer cell mediated cytotoxicity)同样有富集(图8C)。在这些通路中，本发明人发现细胞因子和细胞因子受体相互作用(cytokine and cytokine receptorinteraction)这条通路有最为明显的富集，因此着重研究参加C/EBPβ调控的细胞因子。这些细胞因子包括TNFα家族如：TNFSF15，TNFRSF9，TNFRSF1B，TNFRSF25，TNFRSF10D，TNFRSF10A，TNFRSF10B在C/EBPβ缺失之后有明显的降低，而TNFRSF21，TNFSF10，RNFRSF14，TNFRSF11B，TNFRSF11A，TNFRSF9在C/EBPβ缺失之后有明显的升高。白介素家族中IL1A，IL1B，IL6，IL24，IL7，IL12A，IL7R等在C/EBPβ缺失之后有明显的降低，而IL17RA，IL13RA1，IL11RA，IL2RB，IL15，IL18在C/EBPβ缺失之后升高。VEGF家族VEGFA，VEGFB，VEGFC和TGFβ家族基因，包括BMP2，TGFBR1，TGFB2，TGFB1，TGFBR2,BMPR1A，BMPR2，BMPRIB；以及CXCL族包括CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL11等(图8D)。

实施例9、C/EBPβ靶基因与临床病人样本的关系分析

为了进一步验证C/EBPβ在肿瘤转移，特别是乳腺癌肺转移过程中的作用，本发明人选择在C/EBPβ缺失后发生两倍调变的基因作为C/EBPβ的靶基因，并用这些基因与临床病人发生转移的数据进行基因量和病人肿瘤转移时间的双向聚类分析。本发明人采用网上的临床数据分析肺转移的signature时用的数据。根据C/EBPβ的靶基因在病人样本中的表达量，可以将所有的病人分成两组。红色代表一组病人，蓝色代表一组病人(图9A)。然后分析这两组病人在发生肺转移和发生骨转移的可能性。本发明人发现红色的这组病人有很高的肺转移发生的可能性，而蓝色的这组病人的肺转移发生的可能性低(图9B)。而在骨转移上着两组病人没有明显的区别(图9B)。

随后，本发明人又分析HER2，ER，PR在这两组病人中的表达量。可以看到ER，PR在这两组病人中有明显的差异。而HER2没有差异(图9C)。并且本发明人发现C/EBPβ的靶基因ANGPTL4，VEGFA以及和C/EBPβ本身在这两组病人中的表达量同样具有明显的差异(图9C)。

实施例10、C/EBPβ通过直接结合到基因的启动子区从而发挥调节作用

C/EBPβ是一个转录因子，那么C/EBPβ是否直接与乳腺癌肺转移相关基因的启动子区域结合，从而调节这些基因的表达。首先通过荧光素酶实验，检测C/EBPβ对转移signature基因如：ANGPTL4，VCAM1，TNC，ISG20，以及TNFα信号通路相关的基因IL1A，IL1B，CCL20，以及两个在缺失C/EBPβ之后明显上升的基因BMP4，IFIT1的启动子的影响。本发明人克隆这些基因的启动子区域，把它们连接到PGL3-basic载体上。并与C/EBPβ的表达载体pcDNA3.0以及作为内参的phRL-SV40共同转染MDA-MB-231细胞

因为C/EBPβ有激活和抑制的两种蛋白亚型，因此，本发明人在pcDNA3.0上分别构建这两种不同的C/EBPβ的形式，包括激活型LAP和抑制型的LIP。本发明人发现，LAP1的表达能明显激活ANGPTL4，VCAM1，TNC，ISG20，IL1A，IL1B，CCL20,以及BMP4，IFIT1的荧光素酶活性(图10A)。而LIP的表达对这些基因荧光素酶的活性的影响相对比较复杂。在ANGPTL4中，本发明人没有发现LIP对其启动子的激活作用，而在VCAM1，IL1A，IL1B以及BMP4，IFIT1的启动子区域，本发明人发现LIP的表达能明显激活这些基因的荧光素酶活性(图10A)。而在TNC，ISG20，CCL20这三个基因中，LIP的表达能明显抑制这些基因的荧光素酶活性(图10A)。

当将激活型LAP和抑制型的LIP共转染时，发现在VCAM1，IL1A，CCL20这三个基因中，LIP的表达能明显抑制LAP1所激活的luciferase活性(图25A)。但与空载质粒相比，其对荧光素酶仍然有明显的激活(图10A)。而在BMP4这个基因上，LAP和LIP在对荧光素酶活性的调节上有协同作用(图10A)。这些结果进一步表明，LAP和LIP在基因调控中的不同的作用，并且暗示C/EBPβ调控下游靶基因的复杂性。

前面的研究表明，三氧化二砷对C/EBPβ有明显的调控作用。在三氧化二砷处理的MDA-MB-231细胞中，C/EBPβ的表达量有明显的升高。因此，本发明人认为三氧化二砷对ANGPTL4，VCAM1，TNC，ISG20，L1A，IL1B，CCL20，BMP4，IFIT1的启动子的荧光素酶活性也有明显的影响。本发明人用三氧化二砷处理转染这些基因启动子的MDA-MB-231细胞，然后检测荧光素酶活性的活性。实验结果显示，与三氧化二砷的未处理组相比，三氧化二砷能明显的激活这些基因的荧光素酶活性(图10A)。

通过染色质免疫共沉淀及荧光定量PCR技术，本发明人进一步发现C/EBPβ对这些基因启动子区域的直接结合作用。首先，通过TRANSFEC软件对这些基因的启动子区域进行分析，并预测C/EBPβ可能结合的DNA片段。之后通过染色质免疫共沉淀，分离出C/EBPβ结合的DNA片段，并用荧光实时定量PCR方法检测。结果显示，在MDA-MB-231和LM2-4175细胞中，与阴性IgG相比，C/EBPβ明显的结合到ANGPTL4，EREG，ISG20，PTGS2，TNC，VCAM1，IL6，TET1，TNFSF15，BPM4的启动子区域(图10B)。

这个结果说明，虽然C/EBPβ作为一个专门的增强子结合蛋白(CCAAT增强子结合蛋白)，但仍可以结合到基因的启动子区域，从而对下游的基因进行调控。进一步说明C/EBPβ调控下游靶基因的复杂性。

实施例11、三氧化二砷和p53抑制剂PFTα协同作用抑制p53野生型肿瘤细胞的生长

为比较p53野生型细胞和p53功能缺失型细胞对三氧化二砷敏感性的不同，本发明人选择8种实体瘤的肿瘤细胞系，其中乳腺癌MCF7细胞系，结肠癌HCT116细胞系和肺癌A549细胞系为p53野生型细胞；乳腺癌SKBR3，SUM159，MDA-MB-231细胞系，结肠癌HT29，SW480细胞系以及肺癌H1299细胞系为p53功能缺失型细胞。图11A展示各个细胞系的来源以及细胞中p53的情况。三氧化二砷2.5μM和5μM处理48小时后，乳腺癌，结肠癌和肺癌细胞系中的p53功能缺失型细胞如SKBR3，SUM159，MDA-MAB-231，HT29和H1299的生长受到明显的抑制。而相对来说，三氧化二砷处理对p53野生型肿瘤细胞MCF7，HCT116和A549的活性无明显影响(图11B)。为了进一步验证p53功能的缺失可能增强三氧化二砷的作用，本发明人通过siRNA(序列为：5’-GGAAGACTCCAGTGGTAATCT-3’)在HCT116中干扰p53蛋白的表达，并筛选p53稳定敲除的HCT116细胞系，HCT116p53-/-。与原来对三氧化二砷不敏感的HCT116细胞相比，在敲除p53之后的HCT116p53-/-中，三氧化二砷处理后细胞生长有明显的抑制(图11B)。

本发明人注意到，在相同浓度下三氧化二砷能特异性地抑制p53功能缺失型肿瘤细胞的生长，但对于p53野生型肿瘤细胞无明显影响。因此本发明人提出，在p53野生型肿瘤细胞中通过抑制p53的活性来增强三氧化二砷的作用。p53是一个抑癌基因，以抑制p53作为肿瘤治疗的方式与传统的肿瘤治疗方法相违背，因此一直都没有引起人们的重视。p53抑制剂PFTα最初用来降低在化疗过程所产生的副反应。但在随后的研究中发现p53抑制剂PFTα能增强某些抗肿瘤药物的作用，并且没有明显的毒副作用。

在p53野生型肿瘤细胞MCF7，HCT116和A549中单独使用三氧化二砷或p53抑制剂PFTα对肿瘤细胞都无明显影响，但三氧化二砷和p53抑制剂PFTα的合用能明显抑制肿瘤细胞的生长(图11C)。而在p53突变的SKBR3细胞中，三氧化二砷和p53抑制剂PFTα没有表现出明显的合用效果(图11C)。

三氧化二砷和p53抑制剂PFTα的合用主要通过诱导细胞的凋亡和调节细胞周期来实现的。在p53野生型肿瘤细胞MCF7，HCT116中，与单独使用三氧化二砷或p53抑制剂PFTα相比，三氧化二砷和p53抑制剂PFTα的合用能明显的增加Annexin V-PI阳性细胞的比例(图11D)，并且可以诱导剪切型PARP的出现和降低BCL2的表达(图11E)。在调节细胞周期方面，三氧化二砷和p53抑制剂PFTα的合用能明显降低HCT116和A549细胞中S期细胞的比例(图11F)。

在三氧化二砷处理之后，p53蛋白水平上没有明显的变化，那么p53的存在是如何抑制三氧化二砷的功能的呢？本发明人发现，三氧化二砷可以激活p53磷酸化形式的表达，并且这种磷酸化的激活形式可以被p53抑制剂PFTα所抑制(图11G)。

实施例12、三氧化二砷和p53抑制剂PFTα协同抑制小鼠皮下肿瘤的生长。

本发明人进一步验证在小鼠皮下成瘤的实验中，三氧化二砷和p53抑制剂PFTα同样具有明显的协同作用。虽然体外实验中，三氧化二砷对HCT116细胞无明显的生长抑制作用，但在体内的实验中，三氧化二砷可以明显的抑制肿瘤细胞的生长(P＝0.0054)(图12A和B)。更重要的是，与单独使用三氧化二砷相比，三氧化二砷和p53抑制剂PFTα的合用更能明显抑制小鼠皮下肿瘤的生长速度(P＝0.0002)(图12A和B)。并且与单独使用三氧化二砷相比，三氧化二砷和p53抑制剂PFTα的合用并没有导致明显的小鼠毒副作用(图12C)。

本发明人采用乳腺癌细胞系SKBR3作为阳性对照。SKBR3细胞为p53突变型的细胞，在体外对三氧化二砷的处理表现出明显的凋亡的作用。同样的，在小鼠体内，三氧化二砷几乎可以完全抑制SKBR3细胞的成瘤作用(图12D)。

实施例13、三氧化二砷及三氧化二砷和p53抑制剂PFTα的合用后的表达谱分析

为了了解三氧化二砷和p53抑制剂PFTα怎样协同作用抑制肿瘤细胞的生长，本发明人进行三氧化二砷单用之后HCT116细胞的转录组水平的变化和三氧化二砷联合p53抑制剂PFTα处理之后的HCT116细胞的转录组变化。图13A通过CPP-SOM分析展示top5000的基因，并且这些基因可以根据其表达量的聚类分为27个cluster(图13B)。可以看出，单用三氧化二砷之后，基因调变的数目很少，并且变化的程度很小。而三氧化二砷与p53抑制剂PFTα联合处理之后，在单独用三氧化二砷中有调变的基因又进一步的变化，并且产生很多单用三氧化二砷没有调变的基因。

通过进一步的数据分析，发现三氧化二砷处理HCT116细胞之后，共178个基因的表达发生两倍的调变(图13E)，而与p53抑制剂PFTα合用之后，其两倍调变的基因达到1071个(图13E)。三氧化二砷处理HCT116细胞之后的178个中，153个基因也在p53抑制剂PFTα合用之后发生调变(图13E)。进一步，通过heatmap图显示这些调变的基因(图13C和D)。

从上面的结果，本发明人可以看出，PFTα通过两方面的机制增强三氧化二砷的作用。首先，PFTα的加入激活很大一部分在三氧化二砷单独作用时所没有激活的基因，而这部分基因可能促进细胞的凋亡。还有一部分基因是在三氧化二砷单独作用和三氧化二砷与PFTα合用时都调变的基因。而这部分基因在三氧化二砷与PFTα合用时的调变的程度要远比三氧化二砷单独作用时调变的程度高。

为了预测三氧化二砷与PFTα合用在结肠癌病人中的治疗效果，本发明人选择三氧化二砷与PFTα合用调变的基因与临床上结肠癌病人的无病生存时间进行分析。选择在三氧化二砷与PFTα合用后发生两倍调变的基因作为靶基因，并用这些基因与临床病人的生存年限进行基因量和病人肿瘤无病生存时间的双向聚类分析。本发明人采用的是网上的结肠癌病人数据GSE14333。根据三氧化二砷与PFTα合用的靶基因在病人样本中的表达量，可以将所有的病人分成两组。红色代表一组病人，蓝色代表一组病人(图13F)。然后分析这两组病人的无病生存期。结果，红色的这组病人有很高的死亡率，而蓝色的这组病人的死亡率发生的可能性比较低(图13G)。

这些数据说明，本发明人提出的三氧化二砷与PFTα合用确实能很好的与病人的临床数据结合起来，比单独应用三氧化二砷可能具有很好的临床治疗的效果。

实施例14、通过sphere体外富集肿瘤干细胞

肿瘤细胞具有异质性，在同一肿瘤中，只有部分细胞具有无限增殖、分化和体外形成克隆的能力，这部分细胞命名为肿瘤干细胞或肿瘤起始细胞(cancer stem cell orcancer initiating cell，CSC)。肿瘤的发生主要是由这群干细胞引起，并且赋予肿瘤侵袭，转移以及肿瘤的高复发性和高抗药性。在肿瘤疾病的靶向治疗中，肿瘤干细胞已经成为备受关注的药物设计与筛选的靶点。

然而，肿瘤干细胞在肿瘤中的数目很少，为了大量的富集肿瘤干细胞，本发明人采用sphere的肿瘤干细胞体外富集的方式。本发明人从耐药性以及成瘤能力两个方面验证富集到的sphere细胞具有肿瘤干细胞的特性。发现，来自卵巢癌A2780的sphere细胞对传统的肿瘤化疗药物顺铂有明显的耐药性(图14A)。并且与母系的A2780细胞相比，sphere来源的A2780细胞在NOD-SCID小鼠体内有明显的强的成瘤能力(图14B)。这些结果说明，本发明人富集到的sphere细胞确实具体肿瘤干细胞的能力。

采用sphere体外肿瘤干细胞的模型，本发明人发现芬维A胺(4HPR)能特异性的抑制卵巢癌，乳腺癌和结肠癌肿瘤干细胞体外模型sphere细胞的形成(图14C)。并且通过流式细胞仪检测，发现4HPR能特异性的诱导sphere细胞的凋亡，而对母系的细胞没有明显的影响(图14D)。在AML和CML中，4HPR诱导的肿瘤干细胞的凋亡都与4HPR诱导的ROS水平的升高有关，那么在实体瘤中4HPR的作用是否也与ROS有关呢？

通过DAF-DA的荧光强度，本发明人检测4HPR作用之后的细胞内的ROS的水平。与未处理组相比，母系细胞和sphere细胞在4HPR处理后，ROS水平都有明显的升高，并且这种ROS的升高可以被还原剂维生素C所抑制(图14E)。并且伴随着ROS被维生素C所抑制，4HPR诱导的sphere细胞的凋亡也可以被维生素C所抑制，进一步说明，4HPR是通过诱导ROS来诱导细胞的凋亡过程(图14F)。

实施例15、三氧化二砷，p53抑制剂PFTα以及4HPR的联合作用

三氧化二砷也可以作为ROS的诱导剂，从而诱导肿瘤细胞的凋亡。那么三氧化二砷和4HPR在诱导肿瘤细胞的凋亡上是否有一定的相似性呢？本发明人从4HPR相对敏感的HT29中选择出4HPR的耐药株HT29/HPR。结果显示，与HT29相比，HT29/HPR对4HPR不敏感(图15A)。有趣的是，HT29/HPR细胞同样对三氧化二砷有类似的耐药性，而对传统的化疗药物5-氟尿嘧啶(5Fu)和表阿霉素(EPB)没有耐药性(图15A)。

进一步，本发明人比较p53野生型细胞和p53功能缺失型细胞对4HPR敏感性的不同。与三氧化二砷的作用类似，p53功能缺失型细胞如SKBR3，MDA-MB-231，HT29和H1299的生长受到明显的抑制。而相对来说，4HPR处理对p53野生型肿瘤细胞MCF7，HCT116和A549无明显影响(图15B)。

为了达到最好的肿瘤治疗的效果，本发明人提出联合三氧化二砷，p53抑制剂PFTα与芬维A胺4HPR的三联肿瘤治疗模式。在HCT116和MCF7细胞中，本发明人发现三氧化二砷，p53抑制剂PFTα联合芬维A胺比两者的合用都有更明显的肿瘤生长抑制作用(图15C)。在诱导细胞凋亡方面，三氧化二砷，p53抑制剂PFTα联合芬维A胺比三氧化二砷与p53抑制剂PFTα两者联合更能诱导AnnexinV-PI凋亡的发生(图15D)。

最终，结合以前的结果，三氧化二砷与p53抑制剂PFTa与芬维A胺4HPR可联合用于抑制肿瘤细胞(图15E)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.药物组合在制备治疗肿瘤的药盒中的用途，所述的肿瘤是表达野生型p53蛋白的肿瘤，选自：乳腺癌，肺癌，肠癌；所述的药物组合包括三氧化二砷和p53抑制剂，所述的p53抑制剂选自：PFTα，以野生型p53作为沉默靶标的siRNA。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合还包括：芬维A胺或雷帕霉素。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的siRNA是序列如SEQ ID NO:1的核酸。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的小干扰RNA藉由病毒介导进入细胞内发挥干扰作用。

Images