CN109423517A - 外泌体在肿瘤诊断、治疗和预后评估中的用途 - Google Patents

外泌体在肿瘤诊断、治疗和预后评估中的用途 Download PDF

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Abstract

本文提供外泌体在肿瘤诊断、治疗和预后评估中的用途。具体而言，本文提供外泌体用于诊断和/或治疗肺癌和/或评估肺癌预后的用途。本文还提供一种组合物和/或试剂盒，其包括外泌体分析剂和/或调节剂。本发明对于研究肺癌侵袭、转移及调控的关键分子机制，提高肺癌治疗效果和评估肺癌患者预后有重要的现实意义。

Description

外泌体在肿瘤诊断、治疗和预后评估中的用途
技术领域
本申请涉及肿瘤诊断和治疗领域，具体而言，本申请涉及外泌体调节剂包括抑制剂在肿瘤如肺癌的诊断和治疗中的应用。
背景技术
外泌体(Exosomes)是Trams等在1980年最先发现的直径为40～130nm的纳米级囊泡结构，其中包含有大量的蛋白质、核酸和脂质等，在细胞间物质信息传递过程中发挥重要的作用[11，12]。与正常细胞相比，肿瘤细胞释放更多的外泌体，并且其中所包含的一系列蛋白质和核酸组分在调节肿瘤微环境、促进肿瘤的侵袭和定向转移过程中起到了关键的作用[13，14]。此外有研究表明肿瘤细胞产生的高水平外泌体与肿瘤患者的预后不良具有显著相关性[14]。
肺癌已成为对人类健康威胁最大的恶性肿瘤之一，发病率在多数国家呈明显增高趋势，全球每年有超过100万人死于肺癌，其中约85％为非小细胞肺癌(Non-Small CellLung Cancer，NSCLC)，在我国肺癌的发病率和死亡率均高居所有恶性肿瘤的首位[1，2]。目前NSCLC的治疗包括手术、放疗、化疗等，但手术治疗仍是目前唯一可能治愈肺癌的手段，仅不足一半的患者有机会接受根治性手术治疗，术后5年生存率仅为30-60％。化疗虽然能改善NSCLC病人的生存率，然而5年存活率仅为15％；总的来说，接受术后辅助化疗的中期患者和接受放化疗的晚期患者，临床预后不尽如人意[3，4]。临床数据表明NSCLC的侵袭和转移是影响患者疗效和生存的关键因素，但由于NSCLC的转移调控机制较为复杂，临床上仍缺乏有效的肺癌侵袭转移相关预测标志和可能的靶向抑制手段。
局部浸润和远端转移是恶性肿瘤最重要的特点，并且这也是肺癌致人死亡的主要原因[5]。已有大量研究发现，与正常细胞相比，肿瘤细胞释放更多的活性因子来调节肿瘤微环境[6]，以逃避免疫系统的杀伤[7]，并增强肿瘤细胞侵袭转移能力；同时微环境中调节因子可影响远端转移肿瘤细胞的存活和增殖[8，9]。实体肿瘤的微环境包括不同细胞因子和各种细胞外基质等，发挥的功能不尽相同，且不同的实体肿瘤中其组成成分存在差异[10]。近年研究表明肿瘤细胞主要通过不同大小的囊泡向外主动分泌多种调节因子，并以囊泡形式广泛存在于肿瘤局部微环境和体液中，与肿瘤的微环境建立密切相关[9]。
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发明内容
发明人研究发现正常肺上皮细胞外泌体的分泌显著低于NSCLC肿瘤细胞株(p＜0.001)，且肿瘤细胞分泌的外泌体在体外对肿瘤细胞的侵袭转移具有促进作用；血清水平研究发现NSCLC患者血清中外泌体含量显著高于正常人群(p＜0.001)，且与患者的临床分期具有正相关性。
在一些实施方案中，本发明涉及外泌体在制备用于诊断和/或治疗肺癌和/或评估肺癌预后的组合物和/或试剂盒中的用途。
在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括外泌体分析剂和/或调节剂，包括例如外泌体内容物和/或囊泡表面蛋白的分析剂和/或外泌体分泌调节剂，包括例如用于检测外泌体和/或外泌体内容物如蛋白或核酸存在的试剂，包括例如与肺癌患者中尤其是转移性肺癌患者中与外泌体分泌相关的分子的检测剂和/或分析剂。
在一些实施方案中，本发明的所述肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌。
在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多miRNA的试剂和/或检测和/或调节一种或更多蛋白质的试剂。
在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多miRNA的试剂，所述miRNA包括miR-4485，miR-124，miR-326，miR-6803，miR-4433，miR-4286，miR-199，miR-4306，miR-3120，miR-33和/或miR-1246，miR-144，miR-148a，miR-200b，miR-150，miR-342，miR-29a，miR-1304，miR-10a，miR-7g。
在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多miRNA的试剂，所述miRNA包括miR-33，miR-124，miR-126，miR-203，miR-128b，miR-221，miR-7a，miR-199和/或miR-137，miR-372，miR-182，miR-221，miR-130，miR-15b，miR-145。
在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多miRNA的试剂，所述miRNA包括miR-33，miR-124，miR-199。
在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多蛋白质的试剂，所述蛋白质包括外泌体分泌调节蛋白，包括Rab家族GTP酶，如Rab，尤其是Rab27a和Rab27b、鞘磷脂酶2(SMS2)，可溶性的N-乙基马来酰亚胺敏感因子连接物复合体(SNAREs)，如syntaxin-4和SNAP-23，以及VAMP-2和VAMP-8。
在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节miR-124的试剂和/或检测和/或调节Rab27a的试剂。
在一些实施方案中，本发明涉及一种组合物和/或试剂盒，其包括一种或更多上文描述的试剂。
附图说明
图1：肿瘤细胞中低水平miR-124通过提高Rab27a激酶的表达调控外泌体的释放，最终影响NSCLC的侵袭转移和预后。
图2：
A：正常肺上皮细胞HBEpiC外泌体的分泌水平(0.74×109/mL)显著低于NSCLC肿瘤细胞株SPC-A-1和NCI-H1299(1.62×109/mL、2.11×109/mL；p＜0.001)；
B：血清水平研究发现NSCLC患者血清中外泌体含量(4.04×1011/mL)显著高于正常人群(1.19×1010/mL；p＜0.001)，且与疾病的进展和患者的临床分期具有正相关性；
C：发生转移的NSCLC患者，其血清中的外泌体含量显著高于未转移的患者；
D：细胞划痕实验研究表明不同浓度的NCI-H1299外泌体对肿瘤细胞SPC-A-1的迁移能力具有直接的促进作用，且作用存在剂量效应关系。
图3：正常对照组织、NSCLC未转移患者和转移患者原发肺肿瘤组织中miRNAs的表达差异，聚类分析获得前20种表达差异显著的miRNA分子。
图4：
A：miR-124及对照质粒转染后，NSCLC细胞NCI-H1299的外泌囊泡的大小分布趋势：对照肿瘤细胞中40-130nm的外泌体在细胞分泌囊泡中所占比例较大；miR-124过表达后，细胞分泌囊泡中外泌体的比例显著降低；
B：miR-124过表达，显著抑制了外泌体的释放；
C：荧光共聚焦结果显示NSCLC细胞内miR-124过表达降低外泌体水平。
图5：miR-124水平降低显著提高了外泌体的分泌水平。
图6：miR-124对细胞内外泌体分泌相关调控蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
发明人已经发现肺癌患者尤其是NSCLC患者与外泌体的分泌相关，并且发现外泌体的分泌与肿瘤的侵袭和转移相关。因此，可以通过检测和/或监测和/或调节肿瘤患者中外泌体的分泌来诊断和/或治疗肺癌和/或评估肺癌预后。
如上所述，在一些实施方案中，本发明涉及外泌体在制备用于诊断和/或治疗肺癌和/或评估肺癌预后的用途。在一些实施方案中，可通过检测和/或监测和/或调节肿瘤患者如肺癌患者的肿瘤细胞的外泌体分泌来诊断和/或治疗肺癌和/或评估肺癌预后。
在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括外泌体分析剂和/或调节剂，包括例如外泌体内容物和/或囊泡表面蛋白的分析剂和/或外泌体分泌调节剂，包括例如用于检测外泌体和/或外泌体内容物如蛋白或核酸存在的试剂，包括例如与肺癌患者中尤其是转移性肺癌患者中与外泌体分泌相关的分子的检测剂和/或分析剂。外泌体分析是本领域已知的，例如可以通过离心分离外泌体，还可以通过抗体检测外泌体表面标记。例如在一些实施方案中，本发明所述的外泌体分析剂包括确定外泌体存在的试剂，包括例如检测外泌体表面标记的抗体，尤其是检测肺癌患者外泌体特异性的表面标记的抗体。另外，还已经使用表面等离子共振(SPR)来定量和检测外泌体及其表面标记。所述外泌体分析剂还包括确定检测外泌体和/或外泌体内容物和/或与肿瘤患者中外泌体相关的如蛋白或核酸(包括DNA和/或RNA，例如miRNA)存在的试剂。检测蛋白和/或核酸存在的方法是本领域已知的，包括例如利用特异性抗体和/或互补序列进行检测。本领域还已经提供用于纯化外泌体和分析RNA分子的试剂盒，例如Qiagen exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit(ExosomeDiagnostics，Inc)。在一些实施方案中，本发明的方法和/或产品可以在来自肿瘤患者的样品如肿瘤细胞和/或血液样品如血清上进行。
本文中，所述外泌体分析剂和/或调节剂可用于诊断肺癌和/或评估肺癌患者的预后。在一些实施方案中，所述外泌体分析剂和/或调节剂还可以用于肺癌的治疗。例如，已经发现miRNA包括miR-33，miR-124，miR-199等可以调节肿瘤患者中外泌体的分泌。在一些实施方案中，本发明涉及通过miRNA降低肿瘤患者中外泌体的分泌，从而降低肿瘤侵袭性。在一些实施方案中，本发明涉及通过例如提高miRNA包括miR-33，miR-124，miR-199的表达，抑制外泌体分泌调节蛋白包括Rab27a，抑制肿瘤细胞的外泌体分泌，从而治疗肿瘤。因此，在一些实施方案中，本发明涉及提高miRNA包括miR-33，miR-124，miR-199的表达与抑制外泌体分泌调节蛋白包括Rab27a的试剂的组合。另外，在一些实施方案中，本发明涉及提高miRNA和/或降低miRNA表达的试剂与提高和/或降低不同途径的外泌体分泌调节蛋白表达的试剂的组合。例如本发明可以提供提高miRNA包括miR-124表达的试剂和调节Rab27a以外的外泌体分泌调节剂的组合。本发明还涉及检测上述miRNA和/或蛋白的试剂的组合，用于诊断和/或治疗肺癌和/或评估肺癌预后。在这些方面，可以预见通过不同途径的检测和/或调节方式的组合能够提高肿瘤诊断和/或治疗的灵敏度和/或特异性。
在一些实施方案中，本发明的所述肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌。
在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多miRNA的试剂和/或检测和/或调节一种或更多蛋白质的试剂。检测核酸和/或蛋白质存在的试剂是本领域已知，并能够容易的制备的。
在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多miRNA的试剂，所述miRNA包括miR-4485，miR-124，miR-326，miR-6803，miR-4433，miR-4286，miR-199，miR-4306，miR-3120，miR-33和/或miR-1246，miR-144，miR-148a，miR-200b，miR-150，miR-342，miR-29a，miR-1304，miR-10a，miR-7g。已经令人吃惊的发现在转移性肺癌中，miR-4485，miR-124，miR-326，miR-6803，miR-4433，miR-4286，miR-199，miR-4306，miR-3120，miR-33的表达降低和/或miR-1246，miR-144，miR-148a，miR-200b，miR-150，miR-342，miR-29a，miR-1304，miR-10a，miR-7g的表达增高(与正常对照和未转移肺癌患者相比)。因此，在一些实施方案中，本发明可以通过检测miR-4485，miR-124，miR-326，miR-6803，miR-4433，miR-4286，miR-199，miR-4306，miR-3120，miR-33的表达降低和/或miR-1246，miR-144，miR-148a，miR-200b，miR-150，miR-342，miR-29a，miR-1304，miR-10a，miR-7g的表达增高诊断肺癌和/或评估肺癌的预后情况。在一些实施方案中，miR-4485，miR-124，miR-326，miR-6803，miR-4433，miR-4286，miR-199，miR-4306，miR-3120，miR-33的表达降低和/或miR-1246，miR-144，miR-148a，miR-200b，miR-150，miR-342，miR-29a，miR-1304，miR-10a，miR-7g的表达增高指示转移性肺癌和/或患者的预后较差。
在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多miRNA的试剂，所述miRNA包括miR-33，miR-124，miR-126，miR-203，miR-128b，miR-221，miR-7a，miR-199和/或miR-137，miR-372，miR-182，miR-221，miR-130，miR-15b，miR-145。已经令人吃惊的发现在肺癌患者中，miR-33，miR-124，miR-126，miR-203，miR-128b，miR-221，miR-7a，miR-199的表达降低和/或miR-137，miR-372，miR-182，miR-221，miR-130，miR-15b，miR-145的表达增加(与正常肺上皮细胞的表达相比)。因此，在一些实施方案中，miR-33，miR-124，miR-126，miR-203，miR-128b，miR-221，miR-7a，miR-199的表达降低和/或miR-137，miR-372，miR-182，miR-221，miR-130，miR-15b，miR-145的表达增加可以用于诊断或辅助诊断肺癌。
在一些实施方案中，本发明所述任一种诊断和/或治疗和/或预后评估方式可以作为辅助方式与其它任何诊断和/或治疗和/或预后评估方式进行组合。在一些实施方案中，通过引入本发明的诊断和/或治疗和/或预后评估方式，提高了诊断和/或治疗和/或预后评估的灵敏度和/或特异性和/或效果。
在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多miRNA的试剂，所述miRNA包括miR-33，miR-124，miR-199。已经令人吃惊的发现在肺癌患者中，miRNA包括miR-33，miR-124，miR-199的表达降低。在一些实施方案中，miRNA包括miR-33，miR-124，miR-199的表达改变可以调节外泌体的分泌。
在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多蛋白质的试剂，所述蛋白质包括外泌体分泌调节蛋白，包括Rab家族GTP酶，如Rab，尤其是Rab27a和Rab27b、鞘磷脂酶2(SMS2)，可溶性的N-乙基马来酰亚胺敏感因子连接物复合体(SNAREs)，如syntaxin-4和SNAP-23，以及VAMP-2和VAMP-8。
在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节miR-124的试剂和/或检测和/或调节Rab27a的试剂。在一些实施方案中，本发明的所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节miR-124的试剂和/或检测和/或调节除了调节Rab27a以外的外泌体分泌调节蛋白，包括Rab家族GTP酶如Rab27b、鞘磷脂酶2(SMS2)，可溶性的N-乙基马来酰亚胺敏感因子连接物复合体(SNAREs)，如syntaxin-4和SNAP-23，以及VAMP-2和VAMP-8。可以预见通过组合不同途径的调节方式的检测和/或调节，能够提高肿瘤诊断的灵敏性和/或特异性，还可以提高肿瘤的治疗效果。
在一些实施方案中，本发明涉及一种组合物和/或试剂盒，其包括一种或更多上文描述的试剂。例如，在一些实施方案中，本发明提供检测剂和/或治疗剂和/或诊断剂和/或相关组合物和/或试剂盒，其包括确定肿瘤细胞样品和/或血液样品中外泌体和/或相关分子(如外泌体标记、肿瘤特异性内容物标记、肿瘤细胞中外泌体表达调节分子)存在的试剂。在一些实施方案中，其包括调节肿瘤患者的外泌体表达的试剂，例如降低外泌体表达的试剂，所述试剂可以是例如miRNA分子。
以下结合具体实施例进一步描述本发明的一些实施方案，所述实施例不应视为对本发明的具体限制。
研究方法：
1)外泌体的相关检测分析
外泌体的分离提取：肿瘤细胞体外培养72小时，更换无血清培养基，继续培养48小时，1500g离心收集上清，10000g离心去除细胞碎片后，可直接使用Nanosight进行外泌体分泌量和外泌体大小分布的检测。对于血清标本，直接进行离心步骤，后续步骤同细胞上清标本。
外泌体的定量计数：采用Nanosight对上述提取的外泌体直接进行检测，获得外泌体数量和大小分布的相关资料。
2)肿瘤细胞的培养和转染
实验中使用的NSCLC细胞系为NCI-H1299和SPC-A-1；对照细胞为永生化支气管上皮细胞HBEpiC，均使用含10％胎牛血清的RMPI-1640培养基，在37℃、5％CO2的条件下培养；细胞购买自协和肿瘤库，本室保存，经STR检测验证。
过表达质粒的转染：表达质粒采用本课题组前期保存的荧光素酶报告质粒PcDNA3.1进行构建；细胞接种于6孔板中，细胞数量为3×105个/孔，每孔各加2ml含10％FBS培养基，置于37℃培养箱中培养18-24h，待其融合度达到70％-80％时即可进行转染实验。采用lipo2000进行细胞转染，转染过程根据说明书进行操作。
抑制miRNA的转染：将9ul的Lipofetaamine RNAiMAX和9ul miRNA(10umol/L)分别溶解于150ul的Opi-MEM溶液中，将miRNA稀释液逐滴加入Lipofetaamine RNAiMAX稀释液中，室温孵育5min，取250ul混合液加入6孔板中，放入37℃的细胞培养箱内。
3)miRNA影响肿瘤细胞侵袭转移的研究方案
细胞迁移力检测：细胞转染miR-124模拟物和阴性对照24小时后，用1％FBS的RMPI-1640培养基调整细胞浓度为2×108/L，取200ul加入上室，下室加入600ul含10％FBS的RMPI-1640培养基，37℃孵育18h，取下Transwell小室，PBS清洗小室上层的残余细胞，4％多聚甲醛室温固定15min，0.1％结晶紫染色40min，200倍显微镜下计数迁移细胞数，每张膜计数上中下左右5个不同视野的透过细胞数，计算平均值，每组设3个复孔，以迁移细胞的相对数量表示肿瘤细胞的迁移能力的变化。
细胞侵袭能力的检测：将细胞侵袭试剂盒中包被好Matrigel基底膜小室防置室温平衡，加入300ul无血清RMPI-1640培养基37℃孵育1-2h备用。细胞转染miR-124模拟物和阴性对照24小时后，用1％FBS的RMPI-1640培养基调整细胞浓度为5×108/L，取300ul加入上室，下室加入500ul含10％FBS和5mg/L FN的RMPI-1640培养基，37℃孵育48h，细胞固定和染色步骤同细胞迁移实验，以侵袭细胞的相对数量表示肿瘤细胞的侵袭能力的变化。
在体鸡胚尿囊膜检测肿瘤的侵袭转移能力实验(CAM)：获得受精的鸡蛋并将鸡蛋在MultiQuip培养箱中37℃，60％湿度下孵育。在无菌条件下在小鸡胚胎发育的第3天在壳上造一个小口。用胶带重新密封窗口，并将蛋放回培养箱中直到鸡胚发育的第11天。在第11天，将NCI-H1299细胞悬浮液(9×105)与生长因子减少的基质胶(8.9mg/mL，BDBiosciences)混合，总体积为30μL。对照组为纳米包裹的miR-124(20μmol/mL)与NCI-H1299细胞和基质胶一起混合。将基质胶混合物置于CAM顶部，重新密封并返回培养箱72小时(每个细胞系n＝6只鸡胚)。收获胚胎和周围CAM基质胶，并用4％多聚甲醛固定24小时，包埋在石蜡中。连续切片用苏木精和曙红染色。使用NanoZoomer(Hamamatsu Photonics K.K.)进行数字扫描。
4)miRNA分子靶向调控目标基因的研究方案
利用TargetScan，miRanda和Microcosm Targets等信息学软件分析miRNA与外泌体分泌相关基因及可能的作用位点，重点分析与外泌体分泌直接相关的Rab家族。
首先，采用WB免疫印迹技术直接验证目标蛋白与miR-124表达水平的关系；
其次，采用荧光共定位的方法，证明该miRNA分子对下游分子的直接调控；并利用荧光素酶系统鉴定出与miRNA分子结合的3’-UTR区域；
最后，采用双荧光素酶报告系统对目标分子的鉴定：从健康人血细胞中提取人类基因组DNA，设计含有xho1和Not1双酶切味道的PCR引物，扩增目的基因3’端非编码区域(3’UTR)；构建psi-CHECK2-[Target gene]-3’-UTR-wt野生型重组载体，同时设计miR-124与目的基因结合处突变序列合成psi-CHECK2-[Target gene]-3’-UTR-mut突变型重组载体。应用Lipofectamine 2000向293T细胞中分别转染野生型和突变型重组载体，每个载体设置空白对照组，miR-124抑制组和抑制阴性对照组。按照promega公司双荧光素酶检测试剂盒说明书操作，检测细胞的荧光强度。
5)miR-124上游调控分子的研究方案
基因关联分析：研究采用Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库中已有的信息，找出NSCLC研究中的数据集，探索NSCLC中与miRNA-124表达相一致的基因，挑选其中一致程度最高的五种基因，进行后续分析；
基因富集分析：通过对NSCLC组织样本进行基因探针富集分析(GSEA)，找出上述五个关联基因中最有可能的上游调控蛋白分子；研究采用GSEA 2.2.1版软件进行分析。根据miRNA-124的表达水平分为高表达组和低表达组。本研究利用GSEA网站MsigDB数据库中获得数据集；然后，按缺省加权富集统计的方法进行富集分析，设置随机组合次数为1000次。
6)细胞和组织中蛋白水平和miRNA水平的检测方案
细胞和新鲜组织标本中的蛋白和miRNA采用Western blot和RT-PCR方法；石蜡组织标本切片的蛋白和miRNA检测采用IHC和ISH检测法。具体实验步骤按照说明书操作，WB实验采用ECL发光并通过Bio-rad公司扫描仪分析结果。IHC采用DAB显色并使用病理图像工作站扫描，结果阳性标准为每个视野中25％的细胞显示有弱阳性至强阳性。
7)动物转移实验研究
静脉转移模型实验：将8周龄雄性NOD/SCID小鼠尾静脉注射1×106/200μl荧光素酶基因和miR-124基因共质粒转染NCI-H1299细胞和对照NCI-H1299细胞。注射前和注射之后每周使用IVIS Lumina XRMS系列III成像系统(PerkinElmer)监测荧光素酶表达细胞。小鼠按300mg/kg体重腹膜内注射100mL D-荧光素(Biosynth；Cas#115144-35-9)，然后异氟烷气体麻醉后检测。
肺癌原位转移模型实验：8周龄的雄性NOD/SCID小鼠，采用穿刺针将1.5×105/200μl上述miR-124过表达NCI-H1299和对照NCI-H1299细胞团块接种到小鼠肺部，并按上述检测方法进行成像。动物处死后，取出器官用于离体生物发光成像。
皮下转移模型实验：8周龄的雄性NOD/SCID小鼠，经皮下分别接种5×106个上述miR-124高表达NCI-H1299细胞或对照NCI-H1299肿瘤细胞，待瘤体体积达到0.7-0.9cm3后，按照上述检测方法进行成像。动物处死后，取出器官用于离体生物发光成像。
肿瘤转移抑制实验：靶向给予miR-124影响肺癌侵袭转移的实验中，对上述三组动物实验，分别设置三个治疗组，分别腹腔，尾静脉和瘤内注射纳米包裹的miR-124分子，每周注射两次。每3天测量肿瘤并记录。
8)统计学方法：miR-124浓度以平均值±标准差表示。表达和临床病理资料之间的相关性是由Mann-Whitney U检验；计量资料用t检验或方差分析。其他定性资料使用卡方检验进行分析。实验中所有数据分析均使用SPSS13.0统计软件包完成，并使用Prism 6.0软件作图。统计使用双侧检验，P＜0.05认为具有统计学意义。
(1)NSCLC细胞外泌体与侵袭转移的关系。
发明人研究发现正常肺上皮细胞HBEpiC外泌体的分泌水平(0.74×109/mL)显著低于NSCLC肿瘤细胞株SPC-A-1和NCI-H1299(1.62×109/mL、2.11×109/mL；p＜0.001)(图2A)；血清水平研究发现NSCLC患者血清中外泌体含量(4.04×1011/mL)显著高于正常人群(1.19×1010/mL；p＜0.001)，且与疾病的进展和患者的临床分期具有正相关性(图2B)，尤其引人注意的是，发生转移的NSCLC患者，其血清中的外泌体含量显著高于未转移的患者(图2C)。研究结果表明外泌体与NSCLC的侵袭转移存在显著相关性。为了验证外泌体对肿瘤细胞侵袭转移的直接调控作用，发明人在体外进行了细胞划痕实验，研究表明不同浓度的NCI-H1299外泌体对肿瘤细胞SPC-A-1的迁移能力具有直接的促进作用，且作用存在剂量效应关系(图2D)，研究提示，肿瘤细胞释放的外泌体可能对NSCLC的侵袭转移具有显著的调控作用。
(2)NSCLC肿瘤细胞内影响外泌体释放的miRNA分子差异表达分析。
发明人首先比较了正常对照组织、NSCLC未转移患者和转移患者原发肺肿瘤组织中miRNAs的表达差异，通过聚类分析发明人获得前20种表达差异显著的miRNA分子(图3)。同时发明人比较了肺癌细胞系NCI-H1299、SPC-A-1和正常支气管上皮细胞系HBEpiC，通过miRNA测序的方法，获得表达差异的miRNA分子队列(表1)；结合这两项研究中获得的与NSCLC患者转移和外泌体分泌差异存在关联的miRNA分子，进一步缩小影响肺癌相关的miRNA分子列表；并对表达差异最显著的miRNA进行后续的验证和分析。
图2显示了不同数量NCI-H1299来源外泌体与对SPC-A-1细胞侵袭转移的促进作用。
A.NSCLC细胞系NCI-H1299和SPC-A-1的外泌体分泌量显著高于永生化肺上皮细胞HBEpiC；B.NSCLC患者血清中外泌体含量显著高于无结节正常对照人群，并与疾病的发生发展呈现一致性的关系；C.NSCLC转移患者的血清中外泌体含量显著高于未转移的患者。D.外泌体对肿瘤细胞迁移能力具有显著的促进作用。
图3显示了正常对照与NSCLC未转移及转移患者肺原位肿瘤组织miRNAs分子的测序分析，在转移性肺癌中，miR-4485，miR-124，miR-326，miR-6803，miR-4433，miR-4286，miR-199，miR-4306，miR-3120，miR-33的表达降低和/或miR-1246，miR-144，miR-148a，miR-200b，miR-150，miR-342，miR-29a，miR-1304，miR-10a，miR-7g的表达增高(与正常对照和未转移肺癌患者相比)。
表1.NSCLC细胞NCI-H1299、SPC-A-1与正常肺上皮细胞内miRNA的表达差异
(3)NSCLC细胞内miR-124、miR-199和miR-33过表达显著降低外泌体的水平。
发明人进行了非小细胞肺癌的早期筛查标志物筛选研究，其中miRNAs方向的研究结果表明肿瘤细胞内多种miRNAs与NSCLC临床进展和转移显著相关。发明人收集了两种NSCLC代表性细胞株(NCI-H1299和SPC-A-1)，对NSCLC细胞株和正常永生支气管上皮细胞(HBEpiC)外泌体中总miRNAs进行测序，筛选出15组与外泌体分泌水平显著相关的差异表达miRNAs分子。将前期结果与测序结果合并分析后，发明人初步研究了3种与外泌体分泌和肺癌转移显著相关的miRNA分子(miR-124、miR-199和miR-33)。
构建了pcDNA3.1-miR-124表达质粒，通过基因转染NCI-H1299，在细胞水平验证了高水平miR-124可抑制外泌体的释放，结果如图4所示。对照肿瘤细胞中40-130nm的外泌体在细胞分泌囊泡中所占比例较大；miR-124过表达后，细胞分泌囊泡中外泌体的比例显著降低(图4A)。定量分析结果显示，miR-124过表达后外泌体分泌水平降低75％以上。荧光共聚焦实验佐证了上述结果，细胞内miR-124过表达后，外泌体水平显著降低，提示miR-124可能是NSCLC细胞调控外泌体的关键分子。(图4C)。miR-199和miR-33过表达可获得类似结果。
图4显示了NSCLC细胞miR-124过表达对外泌体水平的影响。
A.miR-124及对照质粒转染后，NSCLC细胞NCI-H1299的外泌囊泡的大小分布趋势；B.miR-124过表达，显著抑制了外泌体的释放。C.荧光共聚焦结果显示NSCLC细胞内miR-124过表达降低外泌体水平肺上皮细胞内miR-124水平降低显著提高了外泌体的分泌水平。
通过向后肺支气管永生化HBEpiC细胞内转染CD63-GFP/miR-124反义核酸共表达质粒后，第四个小时更换培养基，连续监测实验证实，miR-124敲降与细胞内外泌体水平的增高显著相关，且外泌体逐渐分泌到细胞外，结果提示miR-124水平降低可显著提高外泌体的分泌水平。(图5)。
图5显示了miR-124水平降低显著提高了外泌体的分泌水平。
研究通过在NSCLC细胞株NCI-H1299中过表达miR-124，初步探索miR-124调控外泌体分泌相关蛋白表达水平的改变。Western blot结果显示miR-124显著抑制了细胞内Rab27a蛋白表达(图6)，研究结果提示miR-124调控外泌体的作用可能与细胞内Rab27a蛋白分子直接相关。
图6显示了miR-124对细胞内外泌体分泌相关调控蛋白表达水平的影响。
通过TargetScan在线工具分析，初步探索miR-124调控细胞内Rab27a表达的机制。
利用TargetScan在线工具，发明人对miR-124与Rab27a结合的可能位点进行分析，结果发现Rab27a基因3′UTR区域有3个可能的结合位点(表2)。针对这三个位点，发明人分别设计了突变序列，对3′UTR序列进行定点突变，目前基因序列已经设计完毕，准备进行下一步的验证。
表2.miR-124与Rab27a可能的结合位点
研究表明患者肿瘤细胞中低水平miR-124可能通过提高Rab27a激酶的表达调控外泌体的释放，最终影响NSCLC的侵袭转移和预后(图1)。本文研究了肿瘤细胞外泌体分泌改变的分子调控过程，期望阐明NSCLC细胞通过外泌体影响侵袭转移的具体分子机制。上述研究结果将有助于阐明NSCLC肿瘤细胞外泌体释放增多的分子机制，拓展肺癌侵袭转移途径的知识领域，并为开发新的针对肺癌转移靶点和转移预后评估指标提供重要线索和新的视角。

Claims (10)

1.外泌体在制备用于诊断和/或治疗肺癌和/或评估肺癌预后的组合物和/或试剂盒中的用途。
2.权利要求1所述的用途，其中所述组合物和/或试剂盒包括外泌体分析剂和/或调节剂，包括例如外泌体内容物和/或囊泡表面蛋白的分析剂和/或外泌体分泌调节剂，包括例如用于检测外泌体和/或外泌体内容物如蛋白或核酸存在的试剂，包括例如与肺癌患者中尤其是转移性肺癌患者中与外泌体分泌相关的分子的检测剂和/或分析剂。
3.权利要求1或2所述的用途，其中所述肺癌包括非小细胞肺癌。
4.权利要求1-3任一项中的用途，其中所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多miRNA的试剂和/或检测和/或调节一种或更多蛋白质的试剂。
5.权利要求1-4任一项中的用途，其中所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多miRNA的试剂，所述miRNA包括miR-4485，miR-124，miR-326，miR-6803，miR-4433，miR-4286，miR-199，miR-4306，miR-3120，miR-33和/或miR-1246，miR-144，miR-148a，miR-200b，miR-150，miR-342，miR-29a，miR-1304，miR-10a，miR-7g。
6.权利要求1-5任一项中的用途，其中所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多miRNA的试剂，所述miRNA包括miR-33，miR-124，miR-126，miR-203，miR-128b，miR-221，miR-7a，miR-199和/或miR-137，miR-372，miR-182，miR-221，miR-130，miR-15b，miR-145。
7.权利要求1-6任一项中的用途，其中所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多miRNA的试剂，所述miRNA包括miR-33，miR-124，miR-199。
8.权利要求1-6任一项中的用途，其中所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节一种或更多蛋白质的试剂，所述蛋白质包括外泌体分泌调节蛋白，包括Rab家族GTP酶，如Rab，尤其是Rab27a和Rab27b、鞘磷脂酶2(SMS2)，可溶性的N-乙基马来酰亚胺敏感因子连接物复合体(SNAREs)，如syntaxin-4和SNAP-23，以及VAMP-2和VAMP-8。
9.权利要求1-7任一项中的用途，其中所述组合物和/或试剂盒包括检测和/或调节miR-124的试剂和/或检测和/或调节除Rab27a之外的外泌体分泌调节蛋白的试剂。
10.一种组合物和/或试剂盒，其包括权利要求1-9中任一项中定义的试剂。
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