CN111607648A

CN111607648A - 一种非小细胞肺癌诊断试剂盒

Info

Publication number: CN111607648A
Application number: CN202010274247.8A
Authority: CN
Inventors: 马志红; 陈莹蓉; 李栋立
Original assignee: Huzhou Central Hospital
Current assignee: Huzhou Central Hospital
Priority date: 2020-04-09
Filing date: 2020-04-09
Publication date: 2020-09-01

Abstract

本发明涉及一种诊断试剂盒，尤其是一种非小细胞肺癌诊断试剂盒；属于诊断试剂盒技术领域。一种非小细胞肺癌诊断试剂盒，试剂盒含有miR‑4286的实时荧光定量PCR引物，所述引物分别为：SEQ ID NO：1上游引物序列：5'‑GCGTCACCCCACTCCT‑3'；SEQ ID NO：2通用下游引物序列：5'‑CGCTCACCCCACTCCT‑3'。本发明提供的试剂盒通过检测miR‑4286的表达，可以对非小细胞肺癌发生进行早期诊断，通过检测其表达水平与临床分期以及转移的关系，对病人预后作出评价。

Description

一种非小细胞肺癌诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及一种诊断试剂盒，尤其是一种非小细胞肺癌诊断试剂盒；属于诊断试剂盒技术领域。

背景技术

公开号为CN102121047A的中国发明专利，公开了一种中期因子表达量的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该试剂盒是基于对中期因子（MK）的研究，而发展起来的一种诊断手段。多项有关 MK 功能的研究证实其参与肿瘤的生长、分化及肿瘤血管生成等过程，表明MK 在肿瘤演化过程中可能具有直接作用。由于 MK 特异表达于多种肿瘤组织，因而 MK 成为肿瘤治疗的新靶点。

然而，MK因子与多种肿瘤都相关，仅通过该试剂盒不能很好地对肿瘤进行分型。而非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率位于世界之首，侵袭、转移是其致死的主要原因，但其转移的机制一直未能阐明。微小RNA （microRNAs, miRNAs）被认为通过作用于癌基因和抑癌基因的转录后调控在NSCLC 的发生、转移中起着重要的作用。

miR-4286是一个在人胚胎干细胞早期分化进程中筛选出的新发现的miRNA，在黑色素瘤、食管癌及直肠癌的治疗中可观察到miR-4286表达的上调或显著改变。但目前，仍未有基于该发现的非小细胞肺癌诊断试剂盒的报导。

发明内容

本发明要解决上述技术问题，从而提供一种非小细胞肺癌诊断试剂盒。

本发明解决上述问题的技术方案如下：

一种非小细胞肺癌诊断试剂盒，试剂盒含有miR-4286 的实时荧光定量PCR 引物，所述引物分别为：

SEQ ID NO ：1上游引物序列：5'-GCGTCACCCCACTCCT-3'；

SEQ ID NO ：2通用下游引物序列：5'-CGCTCACCCCACTCCT-3'。

作为优选，所述试剂盒还包括PCR 反应常用的酶和试剂；所述试剂包括：组织总RNA 提取试剂、RNA 加polyA 试剂、逆转录试剂和定量PCR 试剂；

其中，逆转录试剂包括miR-4286 的特异逆转录引物，其序列为：

SEQ ID NO ：3引物序列：

5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGTACC-3'；

逆转录试剂还包括内参U6的逆转录引物，其序列为：

SEQ ID NO ：4引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；

定量PCR 试剂中还包括miR-4286相关的内参U6 的特异引物，其序列为：

SEQ ID NO ：5上游引物：

5'-ACACTCCAGCTGGGTGAGATGAAGCACTGTAG-3'；

SEQ ID NO ：4通用下游引物：

5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。

我们的研究中采用miRNA 芯片技术筛选NSCLC组织中特异性表达的miRNA，通过聚类分析发现，miR-4286 在发生淋巴结转移的NSCLC 组织中特异性上调表达，此后Real-Time PCR 技术验证证实，NSCLC 癌组织中miR-4286 的上调表达与淋巴结转移密切相关。

进一步的采用原位杂交方法和荧光定量PCR方法分别检测NSCLC组织芯片和新鲜冻存组织中miR-4286的表达，分析其表达水平与NSCLC临床病理特征的关系。

组织芯片中NSCLC癌组织的miR-4286阳性表达率为62.14%，明显高于癌旁配对正常组织的4.29%（P <0.001)；癌组织中miR-4286的表达与NSCLC的肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期密切相关（P <0.05），而与患者的性别、年龄、肿瘤组织类型、分化程度均无明显的相关性(P >0.05)。荧光定量PCR方法结果显示，NSCLC癌组织中miR-4286的表达水平为0.032(0.024-0.057)，显著高于配对癌旁正常组织的0.027(0.018-0.041)（P <0.05)，miR-4286的高表达水平与NSCLC的TNM分期、淋巴结转移相关(P<0.05)。NSCLC 组织中miR-4286的高表达与NSCLC的疾病进展与转移潜能明显相关。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的试剂盒通过检测miR-4286 的表达，可以对非小细胞肺癌发生进行早期诊断，通过检测其表达水平与临床分期以及转移的关系，对病人预后作出评价。提出了miR-4286 在制备抑制非小细胞肺癌肿瘤生长和转移药物中的作用。本发明在医学和生物制药领域有重大实际意义和巨大的应用价值。

附图说明

图1为NSCLC 不同细胞株中miR-4286的表达水平；

图2为组织芯片NSCLC组织中miR-4286的表达情况；

图3为非小细胞肺癌组织中miR-4286的表达。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的说明。

本具体实施方式仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的任何改变，只要在权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

实施例1

miR-4286 在非小细胞肺癌不同细胞株中的差异性表达

采用Real-Time PCR 方法检测NSCLC 细胞株NCI-H1299（淋巴结转移）、肺鳞癌细胞SK-MES-1，NCI-H520和肺腺癌细胞GLC-82、A549、NCI-H460中miR-4286的表达水平。

结果显示，miR-4286在来源于转移淋巴结细胞株NCI-H1299中的表达水平最高，鳞癌细胞SK-MES-1，NCI-H520次之，在NCI-H460、GLC-82、A549表达水平较低（图1）。

实施例2

采用原位杂交技术检测NSCLC组织芯片（芯片编号：HLugSqu150CS01、HLugA150CS02）中miR-4286的表达量。150例NSCLC患者样本来源于国家人类遗传资源共享服务平台（2005DKA21300），剔除信息不全及脱靶等因素，共入组患者140例，男105例，女35例；年龄35~72岁（60.25±9.22）岁；肿瘤直径≤3cm 102例，＞3cm 38例；腺癌72例，鳞癌68例；TNM分期：Ι期59例，II期45例，III期27例，IV期9例；淋巴结转移59例，未转移81例；远处转移9例，未转移131例；肿瘤分化程度：Ι期19例，II期84例，III期37例。

所有患者均经临床确诊且术前未接受放、化疗，手术切除组织包含癌组织和相匹配的距离癌组织边缘5cm以上的远端正常组织。离体组织经常规4%甲醛固定并石蜡包埋，5μm厚度切片，制成直径1.5mm的组织芯片。采用原位杂交方法检测组织芯片中140例NSCLC癌组织及远端正常组织中miR-4286的表达，分析其表达水平与NSCLC临床病理特征的关系。

按照丹麦 Exiqon 公司的原位杂交试剂盒 miRCURY LNA™ microRNA ISHOptimization Kit（FFPE）（No.90008）的操作说明进行实验。组织芯片脱蜡水化后，蛋白酶K（15μg/ml）37℃孵育15min。将梯度乙醇脱水后的芯片置于55℃预杂交30min，接着加入90℃变性的地高辛标记探针miR-4286（丹麦Exiqon公司，YD00610917-BCG，1:500）杂交工作液于55℃孵育过夜。次日经过梯度洗片和封闭后，加入Anti-DIG-AP（美国Roche公司，No.11093274910，1:800）室温孵育1h。最后采用NBT/BCIP染色，核固红复染后封片镜检。用已知的阳性切片作阳性对照，用PBS替代探针作阴性对照。

原位杂交结果显示，miR-4286阳性染色主要定位于NSCLC癌组织的细胞质或细胞核（图2. a-d），远端正常组织中偶有表达（图2 e）。140例NSCLC癌组织中miR-4286高表达率为62.14%（87/140），高于远端正常组织的4.29%（6/140），差异有统计学意义（P<0.01）。进一步分析miR-4286与NSCLC临床病例特征的关系（表1）发现，miR-4286 高表达与NSCLC 肿瘤直径大小、肿瘤TNM分期和淋巴结转移均有关（均P <0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤组织类型、远处转移和肿瘤分化程度均无关（均P >0.05）。

表1 miR-4286 与临床病理资料间的联系

实施例3

选择2014 年1 月~2015 年12 月本院接受手术治疗的62 例原发性NSCLC 患者手术切除标本。留取肿瘤组织和距肿瘤边缘5cm 以上的配对远端正常组织，手术离体后30 分钟内液氮速冻，保存于-80℃冰箱备用。所有病例经病理学检查确诊，临床资料完整，术前未接受放化疗。该实验研究经本院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

RNA提取和cDNA逆转录

RNA 抽提与逆转录均采用Trizol（Invitrogen，美国）抽提试剂抽提RNA，为避免基因组DNA 污染，采用PrimeScript^TMⅡ 1st StrandcDNA Synthesis Kit 试剂盒（Takara，大连宝生物）逆转录，获得cDNA 第一链，-80℃ 保存备用。

Real-Time PCR 检测PCR 扩增引物由上海基康生物有限公司设计、合成。

其中，miR-4286 的上游引物：5'-GCGTCACCCCACTCCT-3'，如SEQ ID NO ：1 所示；

下游引物序列为：5'-CGCTCACCCCACTCCT-3'，如SEQ ID NO ：2 所示。

特异逆转录引物，其序列为：

5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACggtacc-3'，如SEQ ID NO ：3所示；

内参U6的上游引物：

5'-ACACTCCAGCTGGGTGAGATGAAGCACTGTAG-3'，如SEQ ID NO ：5 所示；

内参U6的下游引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'如SEQ ID NO ：4

内参U6的逆转录引物，其序列为：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'，如SEQ ID NO ：4 所示；

PCR 扩增在ABI7500 PCR 仪上进行。扩增体系为：cDNA 2μL，SYBR Premix Ex Taq^TM（2×） 10μL， ROX II 0.4μL，上下游引物各0.4μL，H₂O 6.8μL，合计20μl 体系。先95℃ 变性10 秒后，40 个循环95℃ 5 秒，60℃ 34 秒，采集荧光数据，并绘制溶解曲线。以水为模板同批扩增，作阴性对照，每个样品均重复2 次扩增。定量结果采用2^-△CT法计算NSCLC癌组织和远端正常组织中miR-4286的相对表达量，采用2-^△△CT法计算NSCLC 患者癌组织中AEG-1 mRNA 的最终相对表达量，其中△CT=CT_{目的基因-}CT_内参基因，△△CT=△CT_癌组织-△CT_正常组织。

如图3所示，miR-4286在NSCLC新鲜冻存的癌组织中表达高于配对的远端正常组织，且其高表达水平与NSCLC的淋巴结转移有关(表1)。

因此miR-4286可以用来制备非小细胞肺癌发生诊断试剂盒。参见表1，miR-4286的表达与非小细胞肺癌的淋巴结转移和临床分期密切相关，因此，miR-4286可以用来制备非小细胞肺癌转移诊断试剂盒。

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<110> OrganizationName : 湖州市中心医院

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Claims

1.一种非小细胞肺癌诊断试剂盒，其特征在于：试剂盒含有miR-4286 的实时荧光定量PCR 引物，所述引物分别为：

SEQ ID NO ：1上游引物序列：5'-GCGTCACCCCACTCCT-3'；

SEQ ID NO ：2通用下游引物序列：5'-CGCTCACCCCACTCCT-3'。

2.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR 反应常用的酶和试剂；所述试剂包括：组织总RNA 提取试剂、RNA 加polyA 试剂、逆转录试剂和定量PCR 试剂；

SEQ ID NO ：3引物序列：

5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGTACC-3'；

逆转录试剂还包括内参U6的逆转录引物，其序列为：

SEQ ID NO ：4引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；

SEQ ID NO ：5上游引物：

5'-ACACTCCAGCTGGGTGAGATGAAGCACTGTAG-3'；

SEQ ID NO ：4通用下游引物: 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。