CN106755344B - 用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物，所述分子标记物选自以下LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P中的一个或多个基因。本发明进一步公开了所述的分子标记物在制备胰腺癌预后诊断试剂或试剂盒中的应用，所述试剂或试剂盒包括特异性扩增LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P中的一组或多组的引物序列。本发明公开的一个或多个基因作为标记物检测胰腺癌，精确度大大提高，能够快速有效的做到早期检测、预后评估，对胰腺癌的诊断和治疗具有重要意义。

Description

用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物及其应用。

背景技术

胰腺癌是一种消化道常见肿瘤，是预后最差的恶性肿瘤之一。根据最新流行病学调查，胰腺癌位居欧美等发达国家恶性肿瘤死亡率第四位，全球每年约250万人死于胰腺癌。近20年来我国胰腺癌的发病率持续增高，目前胰腺癌位居恶性肿瘤死亡率第五位。在胰腺癌的治疗中，早期诊断困难，其起病隐匿，缺乏典型临床症状，且预后极差，胰腺癌侵袭性强，恶性度高，外科手术、化疗及放疗等手段的疗效均不尽人意，其术后1年生存率不到20％，5年生存率仅为4％，早期确诊率低和术后转移是胰腺癌死亡率高的主要原因。因此，胰腺癌的早期诊断和早期治疗是提高和改善胰腺癌预后的关键，尤其是发现一种特有的、可用于早期诊断和预后的标记物和靶向分子，对于战胜胰腺癌具有重要意义，成为目前国内外肿瘤专家的研究热点。

近年来，随着分子生物学技术的发展，在癌症疾病的相关研究中，越来越多的非编码基因或非编码RNA被报道，如lncRNA、miRNA、假基因等。

非编码RNA(ncRNAs)是一类具有重要生物学功能的RNA，参与基因组印记、染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，在细胞分化和发育、基因转录和翻译、遗传和表观遗传等生命活动中均发挥重要的调控作用。越来越多的权威研究表明lncRNA在肿瘤的发生发展中起着抑制或促进肿瘤的作用。目前己有较多lncRNAs被证实在包括乳腺癌、前列腺、黑色素瘤、肝癌、结肠癌、膀胱癌等在内的人类多种肿瘤中存在差异表达并执行重要的调控功能。

假基因则是一段具有与正常功能基因相似的序列，但是与正常的基因存在结构上的差异。这些差异包括在不同部位上程度不等的核苷酸缺失或插入，在基因内含子和外显子连接区发生序列变化，在编码序列当中含有终止密码子，或在转录启动区出现缺陷等。这些变化使此类基因不能转录翻译，或者产生有缺陷的蛋白质从而失去原有的生物学功能。长期以来，人们认为假基因是貌似正常、却没有功能的“死亡基因”，是基因组进化的“化石记录”。但是近年来，关于假基因的讨论日益增多，越来越多的试验证实假基因能够转录并且表达。假基因在基因表达调控、基因组进化等方面发挥着重要作用。

对于胰腺癌这类发病隐匿、进展快且预后极差的疾病，更需要使用准确、灵敏、特异性强的标记物来辅助胰腺癌的诊断或预后，lncRNAs或者假基因表达分析研究或许可以帮助我们发现一些新的生物标记物。

发明内容

为了实现胰腺癌的早期发现，早期干预，本发明的目的在于提供用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物。

本发明的还一目的是提供所述的胰腺癌临床预后诊断分子标记物在制备胰腺癌预后诊断试剂或试剂盒中的应用。

为实现上述目的，本发明首先提供用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物，所述分子标记物选自以下LOC127841(NR_027022.1,lncRNA)、LOC402377(NR_027442.1,pseudogene)、GEMIN8P4(NR_002830.1,pseudogene)和SLC6A10P(NR_003083.2,pseudogene)中的一个或多个基因。

优选的，所述基因在胰腺癌生物学样本中均为高表达。更优选的，所述样本选自组织、血液、血浆、血清、胰腺分泌物和胰腺细胞。

进一步地，本发明提供了所述的分子标记物在制备胰腺癌预后诊断试剂或试剂盒中的应用。

优选的，所述预后为监测、疗效评估或转移复发监控。

优选的，当所述胰腺癌临床预后诊断分子标记物在受试者样本中呈现高表达时，指示所述受试者预后不良。更优选的，将受试者样本中所述分子标记物的相对表达量与试剂盒中正常标准品的相对表达量的比值定义为P，当P大于或等于2时判定所述分子标记物在受试者样本中高表达，此时受试者被判断为胰腺癌转移复发。

进一步地，本发明提供了一种用于胰腺癌诊断或预后的试剂，其特征在于，所述试剂包括检测所述LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P的一个或多个基因的表达水平的寡聚核苷酸片段。

进一步地，本发明提供了一种用于胰腺癌诊断或预后的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是指包含检测所述LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P的一个或多个基因的表达水平的寡聚核苷酸片段。

优选的，所述试剂盒包括特异性扩增LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P中的一组或多组的引物序列。

优选的，所述引物序列包括：

LOC127841的引物对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

LOC402377的引物对：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4

GEMIN8P4的引物对：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；

和/或SLC6A10P的引物对：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。

优选的，所述试剂盒的组分包括：

(1)组织样本或血液中总RNA提取试剂：Trizol、氯仿、异丙醇和75％乙醇等。

(2)反转录试剂：逆转录缓冲液、M-MLV逆转录酶、热稳定DNA聚合酶活性的酶、RNA酶抑制剂和T重复寡核苷酸Oligo dT。

(3)定量PCR试剂：PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs组成的SYBR Green聚合酶链式反应体系，引物和RNase Free H₂O。

(4)正常标准品：所述的正常标准品采用正常人群中相应基因表达水平位于中位值的人群，以其相应基因通过特异性反转录引物扩增反转录成的cDNA作为标准品。

本发明的有益效果如下：

本发明公开了一组与胰腺癌相关的基因，并进一步证实这些基因在胰腺癌生物学样品中为高表达。利用一个或多个基因联合作为标记物检测胰腺癌，精确度大大提高，不仅能够快速有效的做到早期检测、预后评估，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

附图说明

图1分别为LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P在癌旁组织和癌组织中的表达比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

本发明的发明人基于TCGA数据库信息进行胰腺癌的生存分析，筛选4个候选基因：LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P，现有研究中并没有关于上述基因和胰腺癌相关的报道。进一步，发明人对于从确诊的胰腺癌患者采集的癌组织及对应的癌旁组织作为待测样品进行研究，通过使用RNA提取和定量PCR对胰腺癌组织中的上述基因的表达水平进行检测，与对应的癌旁组织相比，采用统计学分析，显示上述基因在胰腺癌组织与对应的癌旁组织中存在显著的表达差异，上述基因在胰腺癌组织中的总体表达水平高于癌旁组织，提示上述基因可能具有很好的辅助诊断价值，可成为胰腺癌标志物。

LOC127841(long intergenic non-protein coding RNA 628，长链非编码蛋白RNA 628，lncRNA,又名LINC00628)，位于第1号染色体上，与EZH2互动调节H3K27Me3基因表达的水平，影响细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭。

LOC402377(betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase5pseudogene，betaGalβ-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶5，假基因)，位于第9号染色体上。

GEMIN8P4(gem nuclear organelle associated protein 8pseudogene 4，pseudogene，宝石核细胞相关蛋白8基因4，假基因)，位于第1号染色体上。

SLC6A10P(solute carrier family 6member 10,pseudogene，溶质载体家族6成员10，假基因)，位于第16号染色体上。

本发明的所述的基因是在本发明之前的已知基因，其基本信息可以在Genbank中查到，来源于人类基因组。

本发明采用RT-PCR方法检测上述基因在胰腺癌组织或血液中高表达。

荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。

在本发明中，“预后”是指癌症患者在通过手术、化疗、药物治疗或其组合处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。预后可以是通过手术、化疗、药物治疗或其组合处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查标志物来评估，所述的标记物选自以下LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P中的一个或多个基因。预后评估可以这样进行：根据标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。

实施例1基于TCGA数据库信息进行胰腺癌的生存分析筛选相关基因

1、临床信息筛选

检索TCGA数据库中的胰腺癌患者临床信息，截至2015年12月10日，TCGA数据库中总共记载了185例胰腺癌临床病例。对这些数据进行筛选，共有160例患者纳入研究。筛选时排除具有其他恶性肿瘤病史、曾接受过放疗或化疗的患者，同时纳入研究的患者需含临床信息和mRNA数据。

2、生存期研究样本统计

160例胰腺癌患者生存时间的统计结果如下表所示:

表1 160例胰腺癌患者生存时间统计

生存期时间t(年)	期初进入研究人数	期内死亡人数	期内失访人数
				t<1	160	27	74
1≤t<2	59	22	15
				2≤t<3	22	10	2
3≤t<4	10	2	2
				4≤t<5	6	0.	1
5≤t	5	4	1

3、mRNA表达数据生存分析研究方案

(1)对胰腺癌高通量mRNA转录组数据检索、数据下载及样本挑选和归类。由下载的转录组数据通过生物信息学分析筛选得出与胰腺癌生存时间相关的mRNA。

(2)用Cytoscape软件构建由mRNAs组成的生物信息网络，通过DAVID对生物信息网络中与胰腺癌生存时间相关的mRNA进行GO分析和Pathway分析。

4、胰腺癌mRNA表达数据的生存分析结果

将胰腺癌组织的转录组数据下载后，去除read count＝0小于20％的mRNA后用做下一步分析，包括17100个mRNA。提取mRNA基因表达量和胰腺癌TCGA数据库生存时间数据，采用survival包的coxph函数完成，经单因素Cox回归分析，筛选得到单因素Cox回归中p值<0.05的mRNA有580个，包括328个风险性mRNA和252个保护性mRNA。

为了更好的研究与生存时间相关的mRNA的功能，我们通过GORILLA和GeneCodis软件对胰腺癌生存时间相关的mRNA进行GO功能富集合KEGG通路富集，筛选标准皆为FDR<0.05。筛选出4个基因LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P，均为风险性mRNA(HR>1)，如表2所示。

表2与胰腺癌生存时间相关的mRNA

基因	P值	coef	HR	95％CI_lower	95％CI_upper
						LOC127841	0.007765	0.307438	1.359936	1.084467	1.705378
LOC402377	0.04609	0.222461	1.249147	1.003867	1.554357
						GEMIN8P4	0.029401	0.370283	1.448144	1.037774	2.020788
SLC6A10P	0.028602	0.223731	1.250734	1.023678	1.528153

实施例2RT-PCR检测胰腺癌和癌旁组织中基因的表达情况

1、材料

1.1组织病理标本

收集经外科手术切除、并经病理学检查确诊的60例胰腺癌患者组织及对应癌旁组织标本，癌旁组织定义为距肿瘤边缘3cm以外的胰腺组织。取样来源于北京协和医院2012年10月到2015年12月期间确诊为胰腺癌并接受外科术切除的病人。手术切除胰腺癌组织后在病理科医生的指导下立即取胰腺癌及癌旁组织放入液氮，编号后置-80℃低温冰箱保存。

1.2纳入标准如下：

(1)接受外科手术切除的病例；

(2)术后病理确诊为胰腺癌并有相应的癌旁组织，癌旁组织定义为距肿瘤边缘3cm以外的胰腺组织。

(3)病人均未接受过术前新辅助治疗。

2、试验方法

2.1对组织样本进行RNA提取

依据编号分别对胰腺癌组织及对应的癌旁组织进行RNA提取，每例病人的胰腺癌组织和对应癌旁组织编为一组，胰腺癌组织作为实验样本，对应的癌旁组织作为对照样本，60例病人编为60组。

采用

Reagent(invitrogen，货号15596-018)对60组样本进行RNA提取，实验操作按产品说明书进行，每组实验的具体操作如下：

收集样本后冻存于液氮，取出后把组织样本放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：

(1)加入1mLTrizol，室温保存5分钟；

(2)加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温放置5-10分钟；

(3)12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；

(4)12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；

(5)弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；

(6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

2.2RNA样品的质量分析

RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

2.3逆转录合成cDNA

采用

III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。

2.4Real-Time PCR

2.4.1仪器及分析方法

用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2^-△△Ct法进行数据相对定量分析。

2.4.2引物设计

采用在线引物设计软件，基因序列参照LOC127841(NR_027022.1,lncRNA)、LOC402377(NR_027442.1,pseudogene)、GEMIN8P4(NR_002830.1,pseudogene)和SLC6A10P(NR_003083.2,pseudogene)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如表3所示：

表3引物序列

2.4.3具体操作过程

(一)反应体系：用Power

Green PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃预变性5min，(95℃变性15sec，Tm退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，具体Tm参照表3。

表4 RealTime反应体系

组分	加入量
		2×mix	10μL
上游引物(10μM)	0.5μL
		下游引物(10μM)	0.5μL
模板	2μL
		加入灭菌蒸馏水	至25μL

(二)引物筛选

将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。

(三)样品RealTime-PCR检测

将各样品cDNA 10倍稀释后取2μL作模板，分别对目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

3、数据处理

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2^-ΔΔCt×100％，比较基因在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达水平。

4、统计学分析

采用统计学软件SPSS 17.0，统计学显著性差异定义为P＜0.05。应用Mann–Whitney U检验比较基因在胰腺癌组织与癌旁正常胰腺组织中表达的差异。LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P在胰腺癌组织中的总体表达水平均高于癌旁组织(如图1所示)，p＜0.001，提示LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4、SLC6A10P可能具有很好的辅助诊断价值。

实施例3试剂盒的制备

基于实施例2得到的引物组，组装本发明所述用于胰腺癌预后诊断的试剂盒，所述试剂盒包括特异扩增LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P中一个或多个基因的引物组如表3所示，具体为：

1、试剂盒1包括特异性扩增LOC127841的引物对；

2、试剂盒2包括特异性扩增LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P的引物对。

和特异扩增管家基因(GAPDH)的引物对如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mM KCl，2.5mM MgCl₂，200mM(NH₄)₂SO₄；还包括正常标准品：作为阴性对照与检测样本cDNA共同定量PCR检测，每个反应体系使用与检测样本cDNA相同量。

通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定反应体系如表5所示：

表5 PCR反应体系

组分	加入量
		SYBR Green聚合酶链式反应体系	12.5μL
上游引物(10μM)	0.5μL
		下游引物(10μM)	0.5μL
模板cDNA	2.0μL
		加入灭菌蒸馏水	至25μL

最佳反应条件为：

95℃预变性5min，(95℃变性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。

实施例4试剂盒监控胰腺癌转移复发

1、病例样本

选取10例疗程结束的胰腺癌患者进行跟踪随访，取样来源于北京协和医院2012年10月到2015年12月期间治疗的病人。治疗后六周首次采集患者血液，检测血液中相应基因的相对表达量，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。

2、方法

利用实施例3所述的两种试剂盒检测10例胰腺癌患者血液中相应基因的相对表达量。具体实施方法同实施例2。

3、结果

检测结果的处理方法也同实施例2，通过溶解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCt法进行相对定量，并根据相应基因在胰腺癌组织或血液中的相对表达量来判断胰腺癌患者是否发生转移复发(相对表达量定义为P，P值为胰腺癌组织或血液中基因的相对表达量与试剂盒中正常标准品的相对表达量的比值)。判断标准定为：当P大于或等于2时判定基因在胰腺癌患者血液中呈现高表达，此时患者判为胰腺癌转移复发。

10例患者通过实施例3所述的两种试剂盒的判断结果以及9个月后医生根据临床症状判断这10例患者胰腺癌是否转移复发的结果如下表所示：试剂盒1为包括特异性扩增LOC127841的试剂盒；试剂盒2为包括特异性扩增LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P的试剂盒。试剂盒2中P值为LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P相对表达量的平均值。

表6试剂盒1监控胰腺癌转移复发结果

患者编号	6周	3个月	6个月	9个月	临床评价
						1	0.89	0.95	1.09	1.074	无进展生存
2	0.93	0.99	2.68	2.74	转移复发
						3	1.06	0.97	1.08	1.073	无进展生存
4	1.23	2.24	2.78	3.49	转移复发
						5	1.10	1.12	1.11	1.10	无进展生存
6	1.05	1.05	1.11	1.12	无进展生存
						7	0.99	1.07	1.97	1.94	转移复发
8	0.99	1.01	1.03	1.01	无进展生存
						9	1.02	1.59	2.74	2.83	转移复发
10	0.92	1.7	3.3	3.43	转移复发

表7试剂盒2监控胰腺癌转移复发结果

患者编号	6周	3个月	6个月	9个月	临床评价
						1	0.99	0.98	1.06	1.043	无进展生存
2	0.97	1.03	2.78	2.89	转移复发
						3	1.015	0.99	1.02	1.033	无进展生存
4	1.03	2.233	3.44	3.58	转移复发
						5	1.02	1.027	1.107	1.098	无进展生存
6	1.04	1.07	1.10	1.098	无进展生存
						7	0.96	0.98	2.27	2.34	转移复发
8	0.97	1.02	1.01	0.985	无进展生存
						9	1.01	1.78	2.88	2.92	转移复发
10	0.95	1.77	3.12	3.35	转移复发

如表6所示，试剂盒1检测的结果显示10例胰腺癌患者中有4例治疗后出现转移复发，其余6例无进展生存，其中编号为7的患者试剂盒检测结果与临床结果有误；如表7所示，试剂盒2检测结果显示10例胰腺癌患者中有5例治疗后出现转移复发，其余5例无进展生存，试剂盒检测结果与临床诊断一致。据此推断，试剂盒2比试剂盒1检测更精确。使用本发明的试剂盒监控胰腺癌，可早于临床症状和体征发现，为医生提前进行干预提供参考。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京致成生物医学科技有限公司

<120> 用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物及其应用

<130> P16yxa68

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acccacgccc tcctgaat 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgccgataac agatgaggaa ac 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggaggttcc tttcgtaccg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctctaagcc acagctccct 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatgcgaccc gtctggaa 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcgcaggaag gaagaacca 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctccagccct cctctaggta t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agctggtccc actgttgatg 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

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Claims (4)

1.检测胰腺癌相关的基因水平的试剂在制备胰腺癌诊断或预后的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒是指包含检测LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P基因表达水平的寡聚核苷酸片段；

所述基因在胰腺癌生物学样本中均为高表达。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增LOC127841、LOC402377、GEMIN8P4和SLC6A10P的引物序列。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物序列包括：

LOC127841的引物对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

LOC402377的引物对：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4 ；

GEMIN8P4的引物对：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；

和SLC6A10P的引物对：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录试剂、定量PCR试剂和正常标准品。

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