KR20190077309A

KR20190077309A - 식도암 진단 및 치료 방법

Info

Publication number: KR20190077309A
Application number: KR1020197006371A
Authority: KR
Inventors: 에이제이 고엘; 진세이 미요시
Original assignee: 베일러 리서치 인스티튜트
Priority date: 2016-08-04
Filing date: 2017-08-04
Publication date: 2019-07-03
Also published as: WO2018025242A3; JP2019529351A; EP3494230A4; EP3494230A2; CN109790585A; CA3032827A1; WO2018025242A2; US11603566B2; US20190185944A1

Abstract

본 개시는 바이오 마커 miRNA의 발현 수준에 기초한 식도암 치료 및 진단 방법에 관한 것이다. 본 개시의 양태는 환자에서 식도암 (EC)을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 다음을 포함한다: 환자가, 대조군 샘플에서의 하나 이상의 miRNA 발현 수준에 비교하여, 환자의 샘플에서 mir-15b, miR-17, mir-18a, mir-21, mir-23a, mir-24-2, mir-25, mir-27a, mir-93, mir-103, mir-106b, mir-129-2, mir-139, mir-146b, mir-148a, mir-151, miR-155, mir-181a-1, mir-181a, mir-181b-1, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-192, mir-194-1, mir-194-2, mir-196a-1, mir-196a-2, mir-196b, mir-205, mir-215, mir-223, mir-224, mir-335, mir-338, mir-375, mir-421, mir-484, mir-505, mir-769, mir-944, mir-1468, mir-3648, 및 let-7i로부터 선택된 하나 이상의 miRNA 발현 수준이 상승하거나 감소된 것으로 판정되었을 때 식도암 환자로 진단하는 단계; 및 상기 진단된 환자에서 유효량의 식도암 치료제를 투여하는 단계.

Description

식도암 진단 및 치료 방법

본원은 2016 년 8 월 4 일자로 출원된 미국 가특허출원 제 62/371,028 호의 우선권의 이익을 주장하며, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

정부 지원 성명

본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 부여된 No. R01 CA184792의 허가 하에 정부의 지원으로 이루어진 것이다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리(certain rights)를 가진다.

본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 종양학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 마이크로 RNA (miRNA) 분자와 암 예후, 진단 및 치료와 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다.

식도암은 암세포가 식도에 생기는 경우에 발생하며, 식도는 목구멍에서 위까지 관을 형성하는 관 모양의 구조이다. 음식은 식도를 통해 위장에서 입으로 이동한다. 암은 식도의 내부 층에서 시작하여 식도의 다른 층과 신체의 다른 부위에 퍼질 수 있다(전이).

식도암에는 두 가지 주요 유형이 있다. 한 유형은 식도 편평 세포 암종 (squamous-cell carcinoma)이다. 편평 세포 (squamous cell)는 내부 식도를 덮고 있으며, 편평 세포로부터 발생하는 암은 전체 식도를 따라 발생할 수 있다. 다른 유형은 식도 선암(esophagus adenocarcinoma)이라고 한다. 이것은 선 세포 (gland cells)에서 발생하는 암이다. 식도의 선암이 발병되기 위해, 식도를 정상으로 덮고 있는 편평 세포가 선 세포로 대체된다. 이것은 일반적으로 위 근처 하부 식도에서 발생하며 하부 식도에 대한 산 노출 (acid exposure)과 크게 관련이 있다고 한다.

식도암 (EC)은 암 관련 사망의 6번째 원인이고, 전 세계적으로 8 번째로 흔한 암이며, 발생 빈도는 지리적 위치와 민족에 따라 크게 다르다. 식도 편평 세포 암종 (ESCC)은 모든 EC 사례의 약 80 %를 차지하며 동부 아시아와, 동부 및 남부 아프리카에서 특히 높다. 모든 ESCC의 평균 5 년 생존율은 약 10-41 %이다. 예후가 좋지 않은 주된 이유 중 하나는 식도에 장액막 (serosa)이 없고 림프계가 광범위하게 분포되어 암의 국소(local) 확산에 대한 저항력을 줄이고 초기 국소 (regional) 종양 진행 및 초기 전이를 허용한다는 것이다. 또한 ESCC의 초기 단계에는 일반적으로 증상이 없으므로 결과적으로 진단이 지연된다. ESCC 환자의 진단에서, 암배아항원 (carcinoembryonic antigen, CEA), 편평 세포 암종 항원 (squamous cell carcinoma antigen, SCC-Ag), 사이토케라틴-19 절편 (cytokeratin-19 fragment, CYFRA21-1) 및 p53 항체를 포함한 다양한 생화학적 혈액-기반의 마커가 조사(investigate)되었지만, 이러한 순환 바이오마커 (circulating biomarkers)는 ESCC의 조기 검출 (early detection)에 있어서 신뢰할 만하지 않다. 따라서 ESCC의 조기 검출을 위한 새로운 순환 바이오마커의 발견은 ESCC 환자의 전반적인 결과를 개선하는데 있어 임상적으로 매우 중요하다.

따라서, 식도암의 조기 발견, 특히 조기 발견을 위한 보다 효과적인 방법이 당 업계에 필요하다. 더욱이, CRC 단계의 보다 정확한 진단은 CRC 치료를 위한 새롭고 보다 효과적인 치료 방법을 이끌어 낼 것이다.

본 개시는 바이오마커 miRNAs의 발현 수준에 기초하여 식도암의 보다 효과적인 치료 및 진단 방법을 제공함으로써 당업계의 필요를 충족시킨다. 본 개시의 일 측면은 환자에서 식도암 (EC)을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음을 포함한다: 환자로부터의 샘플에서 mir-15b, miR-17, mir-18a, mir-21, mir-23a, mir-24-2, mir-25, mir-27a, mir-93, mir-103, mir-106b, mir-129-2, mir-139, mir-146b, mir-148a, mir-151, miR-155, mir-181a-1, mir-181a, mir-181b-1, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-192, mir-194-1, mir-194-2, mir-196a-1, mir-196a-2, mir-196b, mir-205, mir-215, mir-223, mir-224, mir-335, mir-338, mir-375, mir-421, mir-484, mir-505, mir-769, mir-944, mir-1468, mir-3648, 및 let-7i으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 대조군 샘플에서의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준에 비하여 상승 또는 감소된 것으로 판정될 때, 식도암 환자로 진단하는 단계; 및 진단된 환자에게 유효량의 식도 치료제를 투여하는 단계.

다른 측면은 식도암을 갖는 것으로 판정된 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 다음을 포함한다: 환자에게 식도암 치료제를 투여하는 단계로서, 상기 환자는 대조군 샘플에서의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준에 비하여 환자의 샘플에서의 mir-15b, miR-17, mir-18a, mir-21, mir-23a, mir-24-2, mir-25, mir-27a, mir-93, mir-103, mir-106b, mir-129-2, mir-139, mir-146b, mir-148a, mir-151, miR-155, mir-181a-1, mir-181a, mir-181b-1, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-192, mir-194-1, mir-194-2, mir-196a-1, mir-196a-2, mir-196b, mir-205, mir-215, mir-223, mir-224, mir-335, mir-338, mir-375, mir-421, mir-484, mir-505, mir-769, mir-944, mir-1468, mir-3648, 및 let-7i로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 상승 또는 감소된 것으로 판정된 것인 단계.

또 다른 측면은 환자에서 하나 이상의 miRNA를 검출하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음을 포함한다: 인간 환자로부터 샘플을 수득하는 단계; miRNA 검출제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 상기 샘플에서 하나 이상의 miRNA 발현이 증가 또는 감소되었는지 여부를 검출하는 단계; 여기서 하나 이상의 miRNA는 mir-15b, miR-17, mir-18a, mir-21, mir-23a, mir-24-2, mir-25, mir-27a, mir-93, mir-103, mir-106b, mir-129-2, mir-139, mir-146b, mir-148a, mir-151, miR-155, mir-181a-1, mir-181a, mir-181b-1, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-192, mir-194-1, mir-194-2, mir-196a-1, mir-196a-2, mir-196b, mir-205, mir-215, mir-223, mir-224, mir-335, mir-338, mir-375, mir-421, mir-484, mir-505, mir-769, mir-944, mir-1468, mir-3648, 및 let-7i로부터 선택된다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 환자의 샘플에서 하나 이상의 miRNA가 상승될 때 식도암 환자를 치료하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 환자의 샘플에서의 miRNA 발현 수준을 대조군 샘플에서의 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 샘플은 혈청 샘플을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 대조군 샘플은 식도암 (EC)이 없는 인간 환자로부터의 생물학적 샘플을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인간 환자는 식도암을 갖는 것으로 의심된다.

본 개시의 또 다른 측면은 식도암으로 판정된 환자의 치료 방법에 관한 것으로, 다음을 포함한다: 식도암 치료제를 환자에게 투여하는 단계로서, 여기서 상기 환자는 대조군 샘플에서의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준에 비하여 환자 샘플에서의 miR-103, miR-106b, miR-151, miR-17, miR-181a, miR-21, miR-25, 및 miR-93로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 상승된 것으로 판정된 것인 단계. 일부 실시 양태에서, 환자로부터의 샘플은 혈청 샘플을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 식도암은 식도 편평 세포 암종 (ESCC)이다.

또 다른 측면은 식도암 환자를 진단하는 방법에 관한 것으로, 다음을 포함한다: 환자로부터의 샘플에서의 mir-15b, miR-17, mir-18a, mir-21, mir-23a, mir-24-2, mir-25, mir-27a, mir-93, mir-103, mir-106b, mir-129-2, mir-139, mir-146b, mir-148a, mir-151, miR-155, mir-181a-1, mir-181a, mir-181b-1, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-192, mir-194-1, mir-194-2, mir-196a-1, mir-196a-2, mir-196b, mir-205, mir-215, mir-223, mir-224, mir-335, mir-338, mir-375, mir-421, mir-484, mir-505, mir-769, mir-944, mir-1468, mir-3648, 및 let-7i로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 판정하는 단계; 하나 이상의 miRNA의 발현 수준에 기초하여 식도암을 진단하는 단계.

본원에 기술된 임의의 방법 또는 키트는 다음의 miRNA를 포함할 수 있거나, 다음의 miRNA 중 적어도 (at least) 또는 최대 (at most) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 또는 44 개(또는 여기에서 유도할 수 있는 임의의 범위)를 포함할 수 있는 것으로 고려된다: mir-15b, miR-17, mir-18a, mir-21, mir-23a, mir-24-2, mir-25, mir-27a, mir-93, mir-103, mir-106b, mir-129-2, mir-139, mir-146b, mir-148a, mir-151, miR-155, mir-181a-1, mir-181a, mir-181b-1, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-192, mir-194-1, mir-194-2, mir-196a-1, mir-196a-2, mir-196b, mir-205, mir-215, mir-223, mir-224, mir-335, mir-338, mir-375, mir-421, mir-484, mir-505, mir-769, mir-944, mir-1468, mir-3648, 및 let-7i. 일부 실시 양태에서, 이들 miRNA 분자 중 하나 이상의 발현이 검출, 측정, 비교, 기록, 분석, 특성화 및/또는 검정(qualified)될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 환자는 하나 이상의 검출된 miRNA의 발현 수준이 대조군 샘플과 비교하여 현저히 상이할 때 EC로 진단된다.

일부 실시 양태에서, 상기 방법은 환자로부터 샘플을 얻는 단계를 더 포함한다. 일부 실시 양태에에서, 하나 이상의 miRNA의 발현 수준은 대조군과 비교하여 증가된다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA의 발현 수준은 대조군과 비교하여 감소된다.

일 실시 양태는 miRNA의 발현 수준을 결정하는 것에 관한 것이다. 일부 실시 양태에서, 상기 발현 수준은, miRNA의 발현 수준 또는 활성이 비-암성 (non-cancerous) 생물학적 샘플에서의 수준과 비교하여 상승하는지 여부를 판정하기 위해 대조군과 비교된다. 상기 대조군은 비-암성 식도 조직이거나 암성 식도 조직일 수 있다. 대조군이 암성 조직인 경우, 대조군 및 환자 샘플의 수준이 유사, 예를 들어 서로 적어도 또는 최대 1, 2, 3, 또는 4의 표준 편차(또는 그로부터 유도될 수 있는 임의의 범위) 내에 있기 때문에, 샘플은 miRNA의 수준이 상승된 것으로 판정될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 대조군은 비-EC 환자 샘플에서 하나 이상의 miRNA의 수준이다. 일부 실시 양태에서, 대조군 샘플은 비-암성 생물학적 샘플이다. 일부 실시 양태에서, 대조군은 본원에 기술된 특정 코호트(cohort)로부터의 것이다. 하나 이상의 대조군은 시험 샘플과 동시에 측정될 수 있거나 다수의 대조군 샘플로부터 수집된 정규화된 값일 수 있다.

일부 실시 양태에서, 상기 방법은 환자로부터의 샘플에서 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 판정하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 mir-21, mir-93, mir-106b, mir-27a, mir-17 및/또는 mir-181a 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 mir-93을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 mir-93 및 mir-21을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 mir-181a, mir-21 및 mir-17을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 mir-181a, mir-17, mir-21 및 mir-27a를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 mir-21, mir-93 및 mir-27a를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 상승된 수준의 mir-205를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA는, 대조군과 비교하여, miR-21, miR-93, miR-27a, miR-24-2 및 miR-17 중 하나 이상의 상승된 수준(level)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, miR-21, miR-93, miR-27a, miR-24-2 및 miR-17 중 하나 이상의 발현 수준이 대조군, 예를 들어 비(non)-EC 또는 비-암성 대조군의 발현 수준에 비해 상승할 때, 환자는 EC에 대해 치료되거나 EC로 진단된다.

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA는, 대조군과 비교하여, miR-103, miR-106b, miR-151, miR-17, miR-181a, miR-21, miR-25, 및 miR-9 중 하나 이상의 상승된 수준을 포함한다. 일부 실시 양태에서, miR-103, miR-106b, miR-151, miR-17, miR-181a, miR-21, miR-25 및 miR-93 중 하나 이상의 발현 수준이 대조군, 예를 들어 비(non)-EC 또는 비-암성 대조군의 발현 수준에 비해 상승할 때, 환자는 EC에 대해 치료되거나 EC로 진단된다.

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 mir-103, mir-106b, mir-151, mir-17, miR-181a, mir-21, miR-25 및 mir-93 중 적어도 2 종을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 mir-103, mir-106b, mir-151, mir-17, miR-181a, mir-21, miR-25 및 mir-93 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 mir-103, mir-106b, mir-17, miR-181a, mir-21, miR-25 및 mir-93 중 적어도 2 종을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 let-7i, mir-103, mir-106b, mir-17, mir-151, mir-155, mir-181a, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-18a, mir-21, mir-223, mir-23a, mir-25, mir-484, mir-505, 및 mir-93을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 식도암은 식도 편평 세포 암종 (ESCC)이다.

일부 실시 양태에서, 하나 이상의 miRNA는 mir-196a-1, mir-196b 및/또는 mir-21의 상승된 수준을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 식도암은 식도 선암 (EAC)이다.

일부 실시 양태에서, 환자 샘플 및/또는 대조군 샘플은 조직 샘플이다. 일부 실시 양태에서, 환자 샘플 및/또는 대조군 샘플은 혈청 샘플이다. 일부 실시 양태에서, 환자 샘플 및/또는 대조군 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 생물학적 샘플이다.

일부 실시 양태에서, 식도암 치료는 화학 요법 (chemotherapy), 방사선 요법(radiation therapy), 수술 (surgery) 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 화학 요법은 카보플라틴 (carboplatin), 파클리탁셀 (paclitaxel), 시스플라틴 (cisplatin), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 에피루비신 (epirubicin), 도세탁셀 (docetaxel), 세페시타빈 (cepecitabine), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 및 이들의 조합을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 상기 방법은 환자로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 환자로부터의 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 대조군 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 더 포함한다.

일부 실시 양태에서, 상기 환자는 I, IA, IB, II, IIA, IIB, III, IIIA, IIIB, IIIC 또는 IV 단계의 식도암을 가지고 있거나 가지고 있다고 판정된다. 일부 실시 양태에서, 상기 환자는 초기 단계의 EC 또는 단계 I의 EC, 예를 들어 ESCC를 갖고 있거나 가지고 있다고 판정되거나, 상기 방법은 초기 단계의 EC 또는 단계 I의 EC, 예를 들어 ESCC의 진단을 위한 것이다. 일부 실시 양태에서, 환자의 생물학적 샘플은 원발 종양 (primary tumor)으로부터의 샘플이다. 일부 실시 양태에서, 식도암은 카테고리 T1, T2, T3 또는 T4 식도암을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 식도암은 카테고리 N0, N1, N2 또는 N3 식도암을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 식도암은 카테고리 M0 또는 M1 식도암을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 식도암은 림프절 전이를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 식도암은 원격 전이 (distant metastasis)를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 원격 전이는 폐, 간 및/또는 골 (bone) 전이이다. 일부 실시 양태에서, 식도암은 본원에 기재된 EC의 하나 이상의 양태를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 본원에 기술된 EC의 하나 이상의 단계 또는 유형을 구별하는 것이다.

일부 실시 양태에서, 발현 수준의 상승 또는 감소는 컷-오프 (cut-off) 값으로부터 판정된다. 일부 실시 예에서, 컷-오프 값은 ROC 분석에 의해 판정된다.

일부 실시 양태에서, 상기 환자는 이전에 식도암으로 치료를 받았다.

일부 실시 양태에서, 상기 miRNA 마커는 EAC와 ESCC, 또는 EAC와 no EC, 또는 ESCC와 no EC의 구별을 위한 것이다. 일부 실시 양태에서, EAC와 ESCC, 또는 EAC와 no EC를 구별할 수 있는 EAC-특이적 마커는 mir-196a-1, mir-196b, mir-21, mir-181a-1, mir-196a -2, mir-335, mir-181b-1, mir-15b, mir-17 및 mir-106b 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시 양태에서, ESCC와 EAC, 또는 ESCC와 no EC를 구별할 수 있는 ESCC-특이적 마커는 mir-205, mir-944, mir-194-2, mir-192, mir-194-1 mir-23a, mir-215, mir-27a, mir-338 및/또는 mir-21 중 하나 이상을 포함한다.

본 개시의 또 다른 양태는 mir-15b, miR-17, mir-18a, mir-21, mir-23a, mir-24-2, mir-25, mir-27a, mir-93, mir-103, mir-106b, mir-129-2, mir-139, mir-146b, mir-148a, mir-151, miR-155, mir-181a-1, mir-181a, mir-181b-1, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-192, mir-194-1, mir-194-2, mir-196a-1, mir-196a-2, mir-196b, mir-205, mir-215, mir-223, mir-224, mir-335, mir-338, mir-375, mir-421, mir-484, mir-505, mir-769, mir-944, mir-1468, mir-3648, 및 let-7i 로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA를 검출하기 위한 제제 (agent)를 포함하는 키트에 관한 것이다. 일부 실시 양태에서, 상기 제제는 생물학적 샘플로부터의 miRNA를 증폭시키기 위한 하나 이상의 핵산 프로브를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 제제는 표지된다. 일부 실시 양태에서, 키트는 사용 설명서를 추가로 포함한다.

일부 측면에서, 본 개시는 EC-차별 발현(differentially expressed) miRNA를 검출하기 위한 제제를 포함하는 키트에 관한 것으로, 상기 EC-차별 발현 miRNA는 mir-21, mir-93, mir-106b, mir-27a, mir-17 및 mir-miR으로 구성된다. 일부 측면에서, 본 발명은 EC-차별 발현(differentially expressed) miRNA를 검출하기 위한 제제를 포함하는 키트에 관한 것으로, 상기 EC-차별 발현 miRNA는 mir-205로 구성된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명은 EC-차별 발현 miRNA를 검출하기 위한 제제를 포함하는 키트에 관한 것으로, 상기 EC-차별 발현 miRNA는 mir-196a-1로 구성된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명은 EC-차별 발현 miRNA를 검출하기 위한 제제를 포함하는 키트에 관한 것으로, 상기 EC-차별 발현 miRNA는 mir-196b로 구성된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명은 EC-차별 발현 miRNA를 검출하기 위한 제제를 포함하는 키트에 관한 것으로, 상기 EC-차별 발현 miRNA는 mir-21로 구성된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명은 EC-차별 발현 miRNA를 검출하기 위한 제제를 포함하는 키트에 관한 것으로, 상기 EC-차별 발현 miRNA는 mir-103, mir-106b, mir-151, mir-17, mir-181a, mir- 21, mir-25 및 mir-93으로 구성된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명은 EC-차별 발현 miRNA를 검출하기 위한 제제를 포함하는 키트에 관한 것으로, 상기 EC-차별 발현 miRNA는 let-7i, mir-103, mir-106b, mir-17, mir-151, mir-155, mir-181a, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-18a, mir-21, mir-223, mir-23a, mir-25, mir-484, mir-505, 및 mir-93으로 구성된다.

일부 실시 양태에서, 상기 키트는 하나 이상의 대조군(controls)를 검출하기 위한 하나 이상의 제제를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 키트는 생물학적 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 시약을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태예에서, 상기 시약은 혈청 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 것이다. 일부 실시 양태에서, 상기 시약은 본원에 기술된 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 것이다.

대상 (subject) 또는 환자 (patient)라는 용어는 인간, 비인간 영장류, 설치류, 개 또는 돼지를 포함하지만 이에 한정되지 않는 동물(예를 들어, 포유 동물)을 지칭할 수 있다. 본원에서 제공되는 수득 방법은 미세 바늘 흡인, 코어 바늘 생검, 진공 보조 생검, 절개 생검, 절제 생검, 펀치 생검, 면도 생검 또는 피부 생검과 같은 생검 방법을 포함한다.

일 실시 양태에서, 샘플은 식도, 위 또는 근육 조직, 점막 또는 이의 점막하층으로부터의 생검으로부터 수득된다. 다른 실시 양태에서, 상기 샘플은, 담낭, 피부, 심장, 폐, 유방, 췌장, 간, 근육, 신장, 평활근, 방광, 장, 뇌, 전립선 또는 갑상선 조직을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 본원에서 제공된 임의의 조직에서 수득될 수 있다.

대안적으로, 상기 샘플은 혈액, 혈청, 땀, 모낭, 협측 조직, 눈물, 월경, 소변, 대변 또는 타액을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시 양태에서, 샘플은 조직 샘플, 전혈 샘플, 소변 샘플, 타액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플 또는 분변 샘플일 수 있다.

일부 측면에서, 상기 샘플은 종양 또는 신생물(neoplasm)로부터 유래된 낭성 유체(cystic fluid) 또는 유체로부터 수득된다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 낭종, 종양 또는 신생물은 소화기관(digestive system)에 있다. 본 방법의 일 측면에서, 의사, 간호사 또는 의료 기술자와 같은 의료 전문가는 테스트를 위해 생물학적 샘플을 얻을 수 있다. 현재 방법의 다른 측면에서, 환자 또는 대상(subject)은 전혈 샘플, 소변 샘플, 대변 샘플, 구강(buccal) 샘플 또는 타액 샘플을 얻는 것과 같이 의료 전문가의 도움없이 테스트용 생물학적 샘플을 얻을 수 있다.

다른 실시 양태에서, 샘플은 신선한, 냉동 또는 보존된 샘플이거나 미세 바늘 흡인물(fine needle aspirate)일 수 있다. 일 실시 양태에서, 상기 샘플은 포르말린-고정, 파라핀-임베딩 (FFPE) 샘플이다. 획득한 시료는 적절한 배지, 부형제, 용액 또는 용기에 담아 단기간 또는 장기간 보관할 수 있다. 경우에 따라 보관시 냉장 또는 냉동 환경에서 시료를 보관해야 할 수 있다. 샘플은 냉동 환경에서 보관하기 전에 급속 냉동될 수 있다. 특정 예에서, 동결된 시료는 적절한 저온 보존 매질 또는 화합물과 접촉될 수 있다. 동결 보존(cryopreservation) 매체 또는 화합물의 예로 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 수크로즈 또는 글루코스를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

일부 실시 양태는 리보 핵산 또는 RNA와 같은 핵산을 생물학적 샘플 또는 환자의 샘플로부터 단리하는 것을 추가로 포함한다. 다른 단계는 샘플에서 핵산을 증폭시키는 것 및/또는 하나 이상의 프로브를 증폭되거나 증폭되지 않은 핵산에 하이브리드시키는 것을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 상기 방법은 샘플에서 핵산을 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 실시 양태에서, 마이크로 어레이는 샘플에서 miRNA 발현 수준을 측정하거나 분석하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 유형의 매체에 miRNA 발현 수준을 기록하거나 환자, 헬스 케어 페이어 (health care payer), 의사, 보험 대리인 또는 전자 시스템에 발현 수준을 보고하는 단계를 더 포함할 수 있다.

가중 계수 (weighted coefficients) 또는 발현 수준 간의 차이 또는 가중 비교 (weighted comparisons) 간의 차이는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 15.5, 16.0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0. 19.5, 20.0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 410, 420, 425, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 475, 480, 490, 500, 510, 520, 525, 530, 540, 550, 560, 570, 575, 580, 590, 600, 610, 620, 625, 630, 640, 650, 660, 670, 675, 680, 690, 700, 710, 720, 725, 730, 740, 750, 760, 770, 775, 780, 790, 800, 810, 820, 825, 830, 840, 850, 860, 870, 875, 880, 890, 900, 910, 920, 925, 930, 940, 950, 960, 970, 975, 980, 990, 1000 배(times) 또는 -배(fold)(또는 여기에서 유도할 수 있는 임의의 범위)일 수 있거나 그 이상 또는 그 이하일 수 있다.

일부 실시 양태에서, 진단, 예후 또는 위험 점수의 계산의 결정은 약 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.01, 0.011, 0.012, 0.013, 0.014, 0.015, 0.016, 0.017, 0.018, 0.019, 0.020, 0.021, 0.022, 0.023, 0.024, 0.025, 0.026, 0.027, 0.028, 0.029, 0.03, 0.031, 0.032, 0.033, 0.034, 0.035, 0.036, 0.037, 0.038, 0.039, 0.040, 0.041, 0.042, 0.043, 0.044, 0.045, 0.046, 0.047, 0.048, 0.049, 0.050, 0.051, 0.052, 0.053, 0.054, 0.055, 0.056, 0.057, 0.058, 0.059, 0.060, 0.061, 0.062, 0.063, 0.064, 0.065, 0.066, 0.067, 0.068, 0.069, 0.070, 0.071, 0.072, 0.073, 0.074, 0.075, 0.076, 0.077, 0.078, 0.079, 0.080, 0.081, 0.082, 0.083, 0.084, 0.085, 0.086, 0.087, 0.088, 0.089, 0.090, 0.091, 0.092, 0.093, 0.094, 0.095, 0.096, 0.097, 0.098, 0.099, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 그 이하 또는 그 이상(또는 그안에서 유도할 수 있는 임의의 범위)의 미분식 (differential expression) p 값을 갖는 바이오 마커의 발현 값에 기초한 분류 알고리즘을 적용함으로써 수행된다. 일 실시 양태에서, 예후 점수는 하나 이상의 통계적으로 유의하게 차별 발현된 바이오마커(개별적으로 또는 차이 쌍(difference pairs)으로서)를 사용하여 계산된다.

본원에서 설명되는 임의의 방법은 컴퓨터에 의해 실행될 때 컴퓨터로 하여금 하나 이상의 동작을 수행하게 하는 컴퓨터 판독 가능 코드를 포함하는 유형의 컴퓨터 판독 가능 매체 상에 구현될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 컴퓨터에 의해 실행될 때, 컴퓨터로 하여금 다음 단계를 포함하는 동작을 수행하게 하는 컴퓨터 판독 가능 코드를 포함하는 유형의 컴퓨터 판독 가능 매체가 있다: a) 환자의 샘플에서 miRNA를 암호화하는 유전자의 발현 수준에 대응하는 정보를 제공받는 단계; 및 b) 상기 유전자에 대한 대조군 또는 기준(reference) 발현 수준과 비교하여, 상기 샘플에서의 발현 수준에 해당하는 정보를 사용하여 상기 발현 수준의 차이 값을 판정하는 단계.

다른 측면에서, 유형의 컴퓨터 판독 가능 매체는, 컴퓨터에 의해 실행될 때, 상기 컴퓨터로 하여금 다음을 포함하는 하나 이상의 추가 오퍼레이션을 수행하게 하는 컴퓨터 판독 가능 코드를 포함한다: 상기 단계 a)의 환자는 식도암에 대한 첫 번째 치료 중 또는 이후에, 환자가 증가된 발현 수준을 갖지 않는 경우, 첫 번째 치료제와 동일한 치료제를 환자에게 투여하는 단계; 환자가 증가된 발현 수준을 갖는 경우, 환자에게 첫 번째 치료제와 다른 치료제를 투여하는 단계.

일부 실시 양태에서, 정보를 수신하는 단계는 유형의 저장 장치로부터의 발현 수준에 상응하는 유형의 데이터 저장 장치 정보로부터 수신하는 단계를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 상기 매체는, 컴퓨터에 의해 실행될 때, 상기 컴퓨터로 하여금 다음을 포함하는 하나 이상의 추가 오퍼레이션을 수행하게 하는 컴퓨터-판독 가능 코드를 더 포함한다: 상기 차이 값(difference value)에 대응하는 정보를 유형의 데이터 저장 장치에 전송하고, 상기 환자에 대한 예후 점수를 계산하고, 상기 환자가 발현 수준을 갖지 않으면 전통적인 식도 요법(traditional esophageal therapy)으로 환자를 치료하고/하거나 또는 만일 환자가 발현 수준이 증가하면 대체 식도 요법(alternative esophageal therapy)으로 환자를 치료하는 단계.

상기 유형의 컴퓨터-판독 가능 매체는, 컴퓨터에 의해 실행될 때, 상기 컴퓨터로 하여금 상기 환자에 대한 예후 점수를 계산하는 것을 포함하는 하나 이상의 추가 오퍼레이션을 수행하게 하는 컴퓨터-판독 가능 코드를 더 포함한다. 상기 어퍼레이션은 다음을 포함하는 권고 단계를 더 포함할 수 있다: 감소된 발현 수준을 갖는 것으로 판정되는 환자에게 치료제를 투여하는 단계.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "a" 또는 "an"은 하나 또는 그 이상의 것을 의미할 수 있다. 본원 청구항에서 사용된 바와 같이, "포함한다(comprising)"라는 단어와 함께 사용될 때, "a" 또는 "an"이라는 단어는 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.

청구항에서 "또는"이라는 용어의 사용은, 비록 본 개시가 오로지 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지하기는 하지만, 오로지 대안(alternatives)을 나타내기 위한 것으로 명시되지 않는 한 또는 대안이 상호 배타적인 경우를 제외하고는 "및/ 또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "또 다른(another)"은 적어도 제 2 (second) 또는 그 이상을 의미할 수 있다.

본 명세서 및 청구항에서 사용된 바와 같이, "포함하는(comprising)"(및 "포함한다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)"와 같은 "포함하는(comprising)"의 임의의 형태), "갖는(having)"(및 “갖다(have)” 및 “갖다(has)”와 같은 갖는(having)의 임의의 형태), “포함하는(icluding)”(및 “포함하다(includes)” 및 “포함하다(include)”와 같은 포함하는(icluding)의 임의의 형태) 또는 "포함하는(containing)"(및 “포함하다(contains)” 및 “포함하다(contain)”와 같은 containing의 임의의 형태)이라는 단어는 포괄적이거나 제한이 없으며 언급되지 않은 추가 요소들 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다. 언급된 청구항 요소들을 포함하는 상술된 상기 방법 및 키트는 또한 상기 방법이 언급된 청구항 요소들로 구성되거나 본질적으로 구성되는 실시 양태를 포함할 수 있다.

용어 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"은, 조성물과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 조성물 중의 활성 성분이 청구항에 기재된 활성 성분만으로 구성된 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 시스플라틴 및 5- 플루오로 우라실로 본질적으로 구성된 조성물은, 예를 들어, 임의의 다른 활성 성분을 배제하지만, 임의의 다른 약학 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.

본원 전체에 걸쳐, "약(about)"이라는 용어는, 값이 장치에 대한 오차의 고유 변동(inherent variation), 값을 결정하기 위해 사용된 방법 또는 연구 대상들 사이에 존재하는 편차(variation)를 포함하는 것을 나타내는데 사용된다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 상세한 설명 및 특정예는 본 발명의 바람직한 실시 양태를 나타내는 것으로, 단지 예시이고, 본 발명의 사상 및 범위 내의 다양한 변경 및 수정은 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백한 것으로 이해되어야 한다.

다음의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양태를 추가로 예시하기 위해 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 특정 양태의 상세한 설명과 결합하여 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1A-B: 식도암 miRNA 마이크로 어레이 분석. A는 식도암의 발견 단계의 순서도이다. 12 개의 후보 miRNA가 선택되었다. B는 AUC (곡선 아래 영역)의 순서로 후보 miRNA의 순위를 보여준다.
도 2: 발견 단계 - 식도암에 가장 적합한 miRNA. ROC 곡선 분석 및 상위 5 개 miRNA의 정상(normal) vs 암(cancer)에서의 발현 수준을 보여준다. miR-21, miR-93, miR-27a, miR-24-2 및 miR-17은 암에서 유의하게 증가하였다.
도 3: 로지스틱 회귀 모델에 의한 식도암 (EC) miRNA 조합. A는 AUC 순서로 상위 5개 순위 miRNA의 miRNA 조합의 순위를 보여준다. B는 상위 4 개 순위의 miRNA 조합에 대한 ROC 곡선 분석을 보여준다.
도 4: ESCC 조직 코호트 1(tissue cohort 1). 후보 상위 5 개 miRNA (mir-21, 93, 27a, 24-2, 17)의 수준은 암에서 유의하게 상승하였다.
도 5A-B: ESCC 조직 코호트 1 - 로지스틱 회귀 모델에 의한 miRNA 조합. A는 AUC 순서로 miRNA 조합의 순위를 보여준다. B는 최상의 조합 miRNA의 ROC 곡선 분석을 보여준다. 5 종의 복합 miRNA가 100 % 민감도(sensitivity)와 100 % 특이도(specificity)를 나타내었다.
도 6A-B: 혈청 단계(Serum phase) - ESCC 혈청. A에 표시된 데이터는, derum miR-21, 93 수준이 암에서 유의하게 상승했음을 보여준다. 혈청 miR-21, 93의 AUC 값은 각각 0.871 및 0.925였다. B는 로지스틱 회귀 모델에 의한 혈청 miR-21 + 93 조합의 AUC 값 (0.927)이다.
도 7A-C : 발견 단계(Discovery Phase) - ESCC vs. EAC. A는 ESCC 특이 마커(specific marker)의 순위이다. miR205는 ESCC와 EAC를 구별할 수 있는 민감도와 특이도가 가장 높은 마커이다. miR-205의 AUC 값은 0.998이다. B는 EAC 특이 마커의 순위이다. C는 ESCC 대(vs.) EAC에서 miR-205 발현 수준과 ROC 곡선 분석을 보여준다.
도 8A-B: 검증 단계(Validation Phase) - 코호트 1 조직 miR-205에 의한 ESCC vs. EAC. A에 제시된 데이터는 miR-205 수준이 EACC에서 유의하게 상승했음을 나타낸다. B에 표시된 데이터는 ESCC와 EAC를 구별하기 위한 miR-205의 AUC 값이 0.974임을 나타낸다.
도 9: 혈청 검증(validation) 1: 아시아 코호트 (나고야). 도 9는 아시아 코호트로부터의 샘플 중 혈청에서의, 표시된 miRNA 마커 및 조합물의 특이도 및 민감도를 보여준다.
도 10: 혈청 검증 2: 웨스턴 코호트 (이탈리아). 도 10은 웨스턴 코호트로부터의 샘플 중 혈청에서의, 표시된 miRNA 마커 및 조합물의 특이도 및 민감도를 보여준다.
도 11: 혈청 검증 3: 아프리카 코호트 (남아프리카). 도 11은 아프리카 코호트로부터의 샘플 중 혈청에서의, 표시된 miRNA 마커 및 조합물의 특이도 및 민감도를 보여준다.
도 12: 혈청: 합계(웨스턴+아시아+아프리카 코호트). 도 12는 3 개의 코호트로부터의 데이터가 풀링(pooling)될 때, 혈청에서의, 표시된 miRNA 마커 및 조합물의 특이도 및 민감도를 보여준다.
도 13A-C: 조직 내 ESCC 관련 miRNA 후보의 동정(identification)을 위한 인 실리코(in silico) 발견. A) 3 가지 miRNAs 발현 데이터세트 (TCGA, GSE55856, GSE43732)를 사용하여 ESCC 조직에서 상향 조절된 miRNA를 동정하기 위한 인 실리코(in silico) miRNA 후보 선택. 18 개의 miRNA가 3 개의 데이터세트 사이에서 중첩되었다. B, C) 3 개의 miRNAs 발현 데이터세트에 대한 18 개의 후보 miRNA의 히트 맵(heat map). 18 개의 miRNA 조합 패널은 100 회 반복된 2 배 교차-검증(2-fold cross-validation)을 사용하여 세 개의 데이터세트 (각각 AUC = 0.98, 0.99, 0.98)에 대해 정상 조직과 암 조직을 정확하게 구별할 수 있었다.
도 14: 혈청 검사 코호트에서 후보 miRNAs의 선택. 8 개의 후보 miRNAs는 혈청 테스트 코호트에 대한 ESCC 혈청에서 유의적으로(상당히) 상향조절되었다.
도 15A-D: 8-miRNA 시그니처 모델의 확립, 검증 및 진단 성능 평가. A) 트레이닝 코호트에서 8-miRNA 시그니처 모델에 의해 건강한 대조군과 구별되는 ESCC 혈청의 ROC 곡선 및 워터폴 플롯(waterfall plot). B) 검증 코호트 1(validation cohort 1)에서 8-miRNA 시그니처 모델에 의해 건강한 대조군과 구별되는 ESCC 혈청의 ROC 곡선 및 워터폴 플롯(waterfall plot). C) 검증 코호트 2에서 8-miRNA 시그니처 모델에 의해 건강한 대조군과 구별되는 ESCC 혈청의 ROC 곡선 및 워터폴 플롯(waterfall plot). D) 8-miRNA 시그니처 모델의 진단 성능 평가. ESCC 환자 (단계 I-IV, n = 123)의 모든 단계를 건강한 대조군 (n = 42)과 구별할 수 있었고, SCC-Ag보다 우수하였으며 (각각 AUC = 0.89, 0.71), 단계 I의 ESCC 환자 (n = 20)와 건강한 대조군 (n = 42)을 구별할 수 있었고, SCC-Ag보다 우수하였다 (각각 AUC = 0.81, 0.63).
도 16: ESCC 검출을 위한 순환 miRNA 패널의 동정을 위한 연구 설계.
도 17: 초기의 miRNA 후보에 대한 조직 검증. 32 개의 ESCC와 32 개의 정합된(matched) 인접 정상 조직에서, qRT-PCR을 통해 총 18 개의 인 실리코(in silico) miRNA 후보 전부가 인접 정상 조직과 비교하여 ESCC 조직 샘플에서 유의하게 상향 조절되었다.

본 발명의 일 측면은 의사가 몇몇 대체 치료 옵션(alternative treatment options)으로부터 환자에게 최적의 치료법을 선택하도록 도울 수 있는 테스트를 제공한다.

암 치료에서 주요한 임상 과제는 전이성(metastatic) 및 보조제 설정(adjuvant settings) 모두에서 치료 요법으로부터 혜택을 받을 환자의 서브세트를 확인하는 것이다. 지난 10 년간 항암제와 다약제(multi-drug) 조합의 수는 크게 증가했지만 시행 착오적 접근법(trial-and-error approach)을 통해 경험적으로 치료법이 계속 적용되고 있다. 여기서 암 환자에 대한 최적의 치료 옵션을 결정하기 위해 환자를 진단하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.

I. 정의

"실질적으로 동일하거나 현저하게 상이하지 않은(substantially the same or not significantly different)"이란 용어는 그것이 비교되는 것과 크게 다르지 않은 발현 수준을 지칭한다. 대안적으로, 또는 관련하여, "실질적으로 동일한(substantially the same)"이란 용어는 그것이 비교되는 발현 수준 보다 2 배, 1.5 배 또는 1.25 배 미만인 발현 수준 또는 발현에서 20, 15, 10 또는 5 % 미만의 차이을 지칭한다.

"대상(subject)" 또는 "환자(patient)"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 대상을 의미한다. 또한 질병의 임상적 징후를 보이지 않는 임상 연구 시도(clinical research trials)와 관련된 대상이나 역학 연구와 관련된 임의의 대상 또는 대조군으로 사용되는 대상이 포함되도록 의도되었다.

본원에 사용된 용어 "프라이머(primer)"는 주형-의존적 과정에서 신생(nascent) 핵산의 합성을 프라이밍할 수있는 임의의 핵산을 포함하는 것을 의미한다. 전형적으로, 프라이머는 길이가 10 내지 20 및/또는 30 개의 염기쌍의 올리고 뉴클레오티드이지만, 보다 긴 서열이 사용될 수 있다. 프라이머는 단일 가닥 형태가 선호되지만 이중 가닥 및/또는 단일 가닥 형태로 제공될 수 있다.

본원에서 사용된 "증가된 발현(increased expression)" 또는 "상승된 발현(elevated expression)" 또는 "감소된 발현(decreased expression)"은 동일한 바이오마커 또는 상이한 바이오마커를 나타내는 기준 수준(reference level)과 비교하여 대상 샘플에서의 바이오마커의 발현 수준을 지칭한다. 일 측면에서, 기준 수준은 동일한 대상의 비-암성 조직으로부터의 발현의 기준 수준일 수 있다.

대안으로, 기준 수준은 상이한 대상 또는 대상군으로부터의 발현의 기준 수준일 수 있다. 예를 들어, 발현의 기준 수준은 암이 없는 대상 또는 대상군의 샘플 (예를 들어, 조직, 유체 또는 세포 샘플)로부터 수득된 발현 수준일 수 있거나, 또는 암을 가진 대상 또는 대상군의 비-암성 조직으로부터 수득된 발현 수준일 수 있다. 기준 수준은 단일 값이거나 범위(range)의 값일 수 있다. 발현의 기준 수준은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 기준 수준은 암을 가진 대상자 또는 암을 가지지 않은 대상의 코호트로부터 결정된 평균 발현 수준이다. 기준 수준은 또한 그래프상의 영역으로서 그래픽적으로(graphically) 묘사될 수 있다. 일 실시 양태에서, 기준 수준은 정규화(표준화)된 수준이지만, 다른 실시 양태에서는 시험되는 조직 또는 생물학적 샘플에 대해 안정하지 않은 수준일 수 있다.

"약(about)" 및 "대략(approximately)"은 일반적으로 측정의 성질 또는 정밀도를 고려하여 측정된 양에 대한 허용 오차의 정도를 의미한다. 전형적으로, 예시적인 오차도는 주어진 값 또는 값 범위의 20 퍼센트(%) 이내, 바람직하게는 10 % 이내, 보다 바람직하게는 5 % 이내이다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약(about)" 및 "대략(approximately)"은 주어진 값의 계산 차수(order of magnitude) 이내, 바람직하게는 5 배 이내, 보다 바람직하게는 2 배 이내의 값을 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 논의된 수치가 "약" 또는 "대략"이라는 용어와 함께 사용될 수 있다는 것이 고려된다.

II. MiRNA

일 측면은, 부분적으로는, 식도암의 miRNA(s) 바이오마커의 체계적인 발견 및 검증에 기초한다. 특정 실시 양태에서, 마이크로 RNAs (약칭 miRNAs)는 예후를 결정하고, 대상을 진단하고, 특정 암 치료, 특정 환자에 대한 반응을 판정하고, 식도암 환자를 치료하기 위한 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.

MiRNAs는 생물학적으로 활성인 형태로 길이가 약 17 내지 약 25 뉴클레오티드 염기(nt)인 자연 발생적이고 작은 비-암호화 RNAs일 수 있다. miRNAs는 표적 mRNA 번역을 억제함으로써 유전자 발현을 전사 후 (post-transcriptionally) 조절한다. miRNA는 음성 조절자(negative regulators)로서 기능하며, 즉, 보다 많은 양의 특이(specific) miRNA가 보다 낮은 수준의 표적 유전자 발현과 상호 관련이 있을 것으로 생각된다.

생체 내 존재하는 3 가지 형태의 miRNAs, 초기(primary) miRNA (pri-miRNAs), 미성숙(premature) miRNAs (pre-miRNAs) 및 성숙(mature) miRNAs가 있을 수 있다. 초기 miRNAs (pri-miRNAs)는 약 수백 개 ~ 1kb 이상의 줄기-루프(stem-loop) 구조의 전사물로 발현된다. pri-miRNA 전사체는, 줄기 루프의 염기 근처의두 가닥의 줄기를 절단하는 Drosha라고 불리는 RNase II 엔도뉴클레아제 (endonuclease)에 의해 핵에서 절단된다. Drosha는 3 '말단에 5'인산염과 2nt 오버행(overhang)을 남긴 채, 엇갈림 절단(staggered cuts)으로 RNA 듀플렉스(duplex)를 절단한다.

절단 산물, 미성숙(premature) miRNA (pre-miRNA)는 폴드-백 방식(fold-back manner)으로 형성된 헤어핀 구조로 약 60 내지 약 110nt 길이일 수 있다. Pre-miRNA는 Ran-GTP와 엑스포틴-5(Exportin-5)에 의해 핵에서 세포질로 전달된다. Pre-miRNAs는 Dicer 라 불리는 또 다른 RNase II 엔도뉴클레아제 (endonuclease)에 의해 세포질에서 추가로 가공된다. Dicer는 5 '인산염과 3'오버행을 인식하고 줄기-루프 교차점에서 루프를 절단하여 miRNA 이중 가닥(duplexes)을 형성한다. miRNA 이중 가닥은 RNA-유도성 사일런싱 복합체(RISC)에 결합하며, 여기서 안티센스 가닥은 우선적으로 분해되고 센스 가닥 성숙 miRNA는 RISC를 표적 부위로 향하게 한다. 성숙 miRNA는 miRNA의 생물학적 활성 형태이며 길이가 약 17 ~ 약 25nt이다. 마이크로 RNAs는 표적 유전자의 메시지(mRNA)에서 특정 염기 서열과 염기쌍을 연관(완전 또는 불완전)시킴으로써 기능한다. miRNA는 mRNA의 번역을 저하시키거나 억제하여, 표적 유전자의 발현이 전사 후 조절, 억제 또는 침묵되도록 한다. 동물에서 miRNA는 반드시 그 표적 부위와 완벽하게 상동성을 가질 필요는 없으며, 부분 상동성은 번역 억제를 유도한다. 반면 식물에서, miRNA는 표적 부위에 완전한 상동성을 나타내는 경향이 있는 경우 메시지 (mRNA)의 분해(degradation)가 우세하다.

마이크로 RNAs는 게놈에 광범위하게 분포하고, 유전자 조절을 지배하며, 많은 생리적 및 병리학적 프로세스에 적극적으로 참여한다. 예를 들어 특정 miRNA의 조절 양식은 세포 증식, 분화 및 세포 사멸을 조절하는 것으로 밝혀졌다; 그리고 비정상 miRNA 프로파일은 종양 형성과 관련이 있다. 또한 바이러스 감염은 "전-세포 서바이벌(pro-cell survival)" 유전자를 침묵시키는 miRNA를 증가시키고 아포토시스(apoptosis)(프로그램된 세포 사멸)와 연관된 유전자를 억제하는 miRNA를 감소시킴으로써 아포토시스(apoptosis) 신호를 얻는 쪽으로 균형을 기울인다는 것이 시사된다.

본 발명의 다른 실시 양태에서, miRNA 억제제 또는 길항제인 합성 핵산이 있다. 일부 실시 양태에서, miRNA 저해제 또는 길항제는 antagomir이다. miRNA 억제제는 길이가 약 17 내지 25 뉴클레오티드이고, 성숙한 miRNA의 5 '내지 3'서열에 적어도 90 % 상보적인 5 '내지 3'서열을 포함한다. 특정 실시 양태에서, miRNA 억제제 분자는 길이가 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오티드 또는 그로부터 유도될 수 있는 임의의 범위이다.

또한, miRNA 억제제는 성숙한 miRNA, 특히 성숙한 자연 발생 miRNA의 5 '에서 3'서열에 상보적인 적열을 가지거나, 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100 % 상보적 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위의 상보적 서열을 가진다. 당업자는 miRNA 억제제에 대한 서열로서 성숙한 miRNA의 서열에 상보적인 프로브 서열의 일부를 사용할 수 있다. 또한, 프로브 서열의 그 부분은 여전히 성숙한 miRNA의 서열에 90 % 상보적이 되도록 변경될 수 있다.

일 실시 양태에서, 합성 miRNA는 하나 이상의 변형된 핵산 잔기를 갖는다. 일 실시 양태에서, 당 변형(sugar modification)은 6 번 위치의 탄소에 결합된 카르복시기 상의 2'O-Me 변형, 2'F 변형, 2'H 변형, 2'아미노 변형, 4 '리보스 변형 또는 포스포로티오에이트 변형(phosphorothioate modification)이다. 다른 실시 양태에서, 상보적인 영역의 처음 또는 마지막 2 내지 4 개의 잔기 또는 상보적인 영역의 처음 또는 마지막 4 내지 6 개의 잔기에 하나 이상의 당 변형이 존재한다.

또한, miRNA의 핵산 구조는 핵산의 A-형 형태에서의 3'- 엔도(North) 형태로 리보오스를 고정시키기 위하여, 2 번 산소와 4 '탄소 사이의 메틸렌 다리를 갖는 잠긴 핵산(locked nucleic acid, LNA)으로 변형될 수 있다(Lennox, et al, 2011; Bader, et al 2011). 이러한 변형은 표적 특이성 및 분자의 하이브리드화 특성 모두를 상당히 증가시킨다.

miRNA 영역 및 상보 적 영역은 동일하거나 별개의 폴리뉴클레오티드 상에 존재할 수 있다. miRNA가 동일한 폴리뉴클레오티드에 포함되어있는 경우 miRNA 분자는 단일 폴리뉴클레오티드로 간주될 것이다. 상이한 영역이 별개의 폴리 뉴클레오타이드 상에 존재하는 실시 양태에서, 합성 miRNA는 2 개의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 것으로 간주될 것이다.

RNA 분자가 단일 폴리뉴클레오티드인 경우, miRNA 영역과 상보적 영역 사이에 링커 영역이 존재한다. 일부 실시 양태에서, 단일 폴리뉴클레오티드는 miRNA 영역과 상보적 영역 사이의 결합의 결과로서 헤어핀 루프 구조를 형성할 수 있다. 링커는 헤어핀 루프를 구성한다.

일부 실시 양태에서, 링커 영역은, 길이가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 잔기이거나, 그 이상 또는 그 이하이거나 또는 그로부터 유도될 수 있는 임의의 범위인 것으로 고려될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 링커는, 길이가 3 내지 30개의 잔기(포함된)일 수 있다.

miRNA 영역 및 상보적 영역을 갖는 것 이외에, 영역의 5 '또는 3'말단 중 어느 한쪽에 플랭킹 서열(flanking sequences)이 있을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이들 영역의 한쪽 또는 양쪽 측면에 인접한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개의 뉴클레오티드 또는 그 이상, 또는 그로부터 유도 가능한 임의의 범위의 뉴클레오티드가 존재한다.

발암성 miRNAs’를 네거티브하게(negatively) 조작하는 다른 miRNA-기반의 치료법은 miRNA 스펀지, miRNA 마스크 또는 잠긴 핵산 (LNA)을 더 포함할 수 있다.본 명세서에서 사용되는 용어 "miRNA 스펀지(miRNA sponge)"는, 목적하는 miRNA에 대한 다중 탠덤-결합 부위를 포함하고 목적하는 내인성 miRNA를 적정(titrate)하는 기능을 제공함으로써 목적하는 miRNA가 내인성 표적에 결합하는 것을 억제하는 합성 핵산(예: mRNA 전사체)을 지칭한다.

일 측면에서의 방법은, miRNA 억제제, 길항제 또는 antagomir를 세포에 도입하는 단계를 포함하여, 세포에서 하나 이상의 miRNA의 활성 및/또는 발현을 감소, 제거 또는 억제하는 단계; 또는 세포에서 하나 이상의 miRNAs의 활성을 공급하거나 증강시키는 단계를 포함한다. 또한 일 실시 양태에서 특정 합성 miRNA 분자 또는 합성 miRNA 억제제 분자와 같은 특정 핵산을 세포에 공급함으로써 특정 세포 특성을 유도하는 것에 관한 것이다. 그러나, 본 발명의 방법에서, miRNA 분자 또는 miRNA 억제제는 합성일 필요는 없다. 그들은 자연적으로 발생하는 miRNA와 동일한 서열을 가질 수 있거나, 또는 임의의 디자인 변이(design modifications)를 갖지 않을 수 있다. 일 실시 양태에서, miRNA 분자 및/또는 miRNA 억제제는 상기에서 설명한 바와 같이 합성된 것이다.

III. 식도암 단계 결정(staging) 및 치료

miRNA 발현 수준의 특정 응용(particular applications)으로 식도암을 치료하는 방법 및 조성물이 제공될 수 있다. miRNA 발현 수준의 프로파일을 기반으로, 다른 치료법이 다른 암 환자에게 처방되거나 권고될 수 있다.

식도암 (esophageal cancer) (또는 식도암(esophagus cancer))은 식도를 둘러싸는 세포에서 시작된다. 특히, 식도암은 식도 벽의 내층에서 시작하여 바깥쪽으로 성장한다. 만일 식도 벽을 통해 퍼지면 림프절로 전이될 수 있다. 림프절은 흉부 및 기타 주변 장기의 혈관뿐만 아니라 감염을 방지하는 작은 콩 모양의 장기이다. 식도암은 또한 폐, 간, 위, 그리고 신체의 다른 부위로도 퍼질 수 있다.

식도암에는 두 가지 주요 유형이 있다: 식도를 둘러싸는 편평 세포에서 시작하여 주로 식도의 상부와 중간 부분에 발생하는 식도 편평 세포 암종(esophagus squamous cell carcinoma, ESCC), 및 식도 선암(esophagus adenocarcinoma, EAC). 이 유형은 식도와 위가 함께 있는 식도 하부의 선 조직(glandular tissue)에서 시작된다.

A. 암 단계 결정

본 명세서에 기재된 식도암은 다음 단계 중 어느 하나의 식도암일 수 있다.

1. TNM 단계 결정 시스템

의사가 단계를 기술하기 위해 사용하는 하나의 도구는 TNM 시스템이다. 종양(Tumor, T): 원발 종양이 식도 벽과 주변 조직으로 얼마나 깊이 자랐는가? 노드(Node, N): 종양이 림프절로 전이된 적이 있는가? 만일 그렇다면 어디서 얼마나 많은가? 전이(Metastasis, M): 암이 신체의 다른 부위로 전이된 적이 있는가? 만일 그렇다면 어디서 얼마나? 5단계가 있다: 스테이지 0 (제로)과 스테이지 I에서 IV (1에서 4까지). 다음은 TNM 결정 단계 시스템에 대한 자세한 정보를 제공한다:

TNM 시스템을 사용하여, "T"와 문자 또는 숫자 (0 내지 4)가 종양을 기술하는데 사용되며, 암이 식도 벽이나 인근 조직으로 자라 났는지 여부, 그리고 그렇다면 얼마나 깊은 지 등이 포함된다. 일부 단계는 종양을 보다 자세히 설명하는데 도움이 되는 작은 그룹으로 나뉜다. 특정 종양 단계 정보는 아래와 같다.

TNM 단계 결정 시스템에서의 "N"은 림프절을 나타낸다. 식도암에서, 식도 및 가슴 근처의 림프절을 국소 림프절이라고 한다. 신체의 다른 부분에 있는 림프절은 원격 림프절(distant lymph nodes) 이라고 한다.

TNM 시스템의 "M"은 암이 신체의 다른 부위로 퍼졌는지 여부를 나타낸다

2. 등급 (G)

식도암은 또한 그 등급 (G)에 의해 기술될 수 있는데, 이는 암세포가 현미경 하에서 관찰될 때 얼마나 많이 건강한 세포처럼 보이는지를 설명한다. 의사는 암 조직과 건강한 조직을 비교한다. 건강한 조직에는 대개 여러 종류의 세포가 함께 그룹화되어 있다. 암이 건강한 조직과 유사하게 보이며 다른 세포 그룹을 포함하면, 분화된 또는 저-등급 종양이라고 한다. 암 조직이 건강한 조직과 매우 다른 것처럼 보일 경우, 불량하게 분화된 또는 고-등급(high-grade) 종양이라고 한다. 암의 등급은 의사가 암이 얼마나 빨리 퍼질 것인지 예측할 수 있도록 도움을 줄 수 있다. 일반적으로 종양의 등급이 낮을수록 예후가 좋다.

3. 암 단계 그룹화

의사는 T, N 및 M 분류를 조합하여 암의 단계를 정한다. 식도암의 가장 흔한 2 가지 유형에 대한 별도의 단계 결정 시스템이 있다: 편평 세포 암종 (squamous cell carcinoma)과 선암 (adenocarcinoma). 각 단계 결정 시스템은 아래에 설명되어 있다.

a. 식도 편평 세포 암종의 단계 결정

TNM 분류 이외에, 편평 세포 암종의 경우, 종양이 식도의 상부, 중간 또는 하부 섹션에 위치하는지의 여부, 및 종양 세포의 등급 (G)에 따라 세분될 수 있다.

b. 식도의 선암의 단계 결정

선암에 대하여, 의사는 등급 (G)뿐만 아니라 T, N 및 M 분류를 사용한다.

재발 암은 치료 후 다시 발생한 암이다. 그것은 식도 또는 다른 신체 부위에서 재발될 수 있다. 암이 재발되면 재발의 정도를 알기 위한 또 다른 검사가 있을 것이다. 이러한 검사(test) 및 주사(scan)는 원래 진단 당시에 수행한 것과 유사하다.

B. 치료법

다음의 치료 단계/활성 성분은 본원에 기재된 방법에서 유용하다. 다음의 치료 단계/치료제는 본원에 기재된 실시 양태에서 특별히 배제될 수 있음이 또한 고려된다. 식도와 림프절을 넘어 전이되지 않은 종양이 있는 환자의 경우, 종종 여러 종류의 치료법을 병용하는 권고된다: 방사선 치료, 화학 요법 및 수술. 치료 순서는 다양하며 식도암의 유형을 비롯한 여러 요인이 고려된다.

특히, 편평 세포 암(squamous cell cancer)의 경우, 화학 요법이 얼마나 효과적인지에 따라, 화학 요법 및 방사선 요법, 화학 방사선 요법 (chemoradiotherapy)이라고하는 병용 요법이 제 1 치료로서 일반적으로 권고된다. 최근의 연구는 수술 전에 화학방사선요법을 사용하는 것이 수술만 하는 것보다 좋다는 것을 보여준다.

선암종(adenocarcinoma)의 경우, 미국에서 가장 보편적인 치료법은 화학 요법 및 방사선 요법 다음에 수술이다. 환자의 나이 또는 전반적인 건강 상태와 같은 수술 위험을 증가시키는 요인이 없으면, 화학 방사선 요법 후에 수술이 거의 항상 권고된다.

진행 식도암(advanced esophageal cancer)의 경우, 치료는 통상 화학 요법 및 방사선 치료를 포함한다.

암 및 그 치료는 종종 부작용을 야기한다. 암을 늦추거나 중단시키거나 제거하는 치료 이외에도, 암 치료의 중요한 부분은 사람의 증상과 부작용을 완화하는 것이다. 이 접근법을 완화 치료(palliative care) 또는 지지적 치료(supportive care)라고 하며, 환자의 신체적, 정서적, 사회적 니즈(needs)를 서포팅하는 것을 포함한다.

완화 치료는 증상을 감소시키고, 삶의 질을 향상시키고, 환자 및 그 가족을 서포팅하는 것에 중점을 둔 임의의 치료이다. 나이, 암의 유형 및 단계(stage)와 상관없이 모든 사람이 완화 치료를 받을 수 있다. 암 치료 과정에서, 필요에 따라 완화 치료를 조기 시작할 때 가장 효과적이다. 사람들은 종종 암에 대한 치료와 부작용을 완화하기 위한 치료를 동시에 받는다. 사실상, 두 가지를 모두 받는 환자들은 증상이 덜 심각하고 삶의 질이 더 좋으며, 치료에 더 만족한다고 보고된다.

완화 치료는 광범위하게 다양하며 종종 약물, 영양 변화, 이완 기술, 정서적 지원 및 다른 치료법을 포함한다. 완화 치료에는 또한 화학 요법, 수술 또는 방사선 요법과 같이 암을 제거하기 위한 것과 유사한 요법이 포함될 수 있다.

1. 수술(Surgery)

수술(Surgery)은, 오퍼레이션(operation) 중 종양 및 일부 주위의 건강한 조직을 제거하는 것이다. 외과 종양 전문의는 수술로 암을 치료하는 전문 의사이다. 수술은 전통적으로 식도암의 가장 일반적인 치료법이었다. 그러나, 현재 수술은 초기-단계의 식도암 환자에게만 주 치료(main treatment)로서 사용된다.

국소적으로-진행된(locally-advanced) 식도암 환자의 경우, 종양을 축소시키기 위해 수술 전에 화학 요법과 방사선 요법을 병용(하기 참조)하여 사용할 수 있다. 수술을 받을 수 없는 사람들에게 가장 좋은 치료법은 종종 화학 요법과 방사선 요법의 병용이다.

식도암을 치료하는 가장 일반적인 수술은 식도 절제술 (esophagectomy)로, 의사가 식도의 환부(affected part)를 제거한 다음 식도의 나머지 건강한 부분을 위장에 연결하여 환자가 정상적으로 삼킬 수 있게 한다. 위 또는 소장의 일부는 때때로 연결(connection)을 만드는 데 사용될 수 있다. 외과의사는 또한 식도 주위의 림프절을 제거한다.

질병을 치료하기 위한 수술 이외에, 수술은 환자가 먹는 것을 도와주기 위해 사용될 수 있고, 암에 의해 유발된 증상을 완화시킬 수 있다. 이것을 고식 수술(palliative surgery)이라고 한다. 이를 위해 외과 의사와 위장병 전문의는 다음을 할 수 있다:

1.) 영양보급관(feeding tube)이라고도 불리는, 경피적위조루(percutaneous gastrostomy) 또는 공장조루(jejunostomy)를 넣어, 위(stomach) 또는 장(intestine)으로 직접 영양을 공급받을 수 있도록 한다. 이것은 화학 요법과 방사선 치료 전에 환자가 자신의 체중과 힘(strength)을 유지할 수 있는 충분한 음식을 섭취할 수 있도록 하기 위해 수행될 수 있다; 또는

2.) 종양이 식도를 막지만 수술로 제거할 수 없는 경우, 위장으로 향하는 우회로 또는 새로운 경로를 만든다; 이 절차는 거의 사용되지 않는다.

먹고 마시는데 어려움을 겪은 사람들은 수술 전후 며칠동안 정맥내(IV; into a vein) 영양공급 및 체액(fluids)과, 감염을 예방하거나 치료하기 위한 항생제가 필요할 수 있다. 환자들은 폐를 깨끗하게 유지하기 위해 특별한 기침과 호흡 운동을 배운다.

2. 내시경 요법(Endoscopic therapy)

다음의 치료법은 내시경 (진단 참조)을 사용하여 식도암을 치료하고 종양에 의한 부작용을 관리한다. 내시경 검사와 확장(dilation)은 식도를 확장시키는 절차이다. 종양이 커지면 반복해야 할 수도 있다. 스텐트를 배치한 내시경 검사는 내시경을 사용하여 식도에 스텐트를 삽입하는 절차이다. 식도 스텐트는 식도를 열어두기 위하여 확장되는 금속의 메쉬 장치이다.

광역학 요법(Photodynamic therapy)은 특히 수술, 방사선 치료 또는 화학 요법을 할 수 없거나 선택할 수 없는 사람들에게 삼키는 것을 용이하게 하기 위해 사용되는 고식적인(palliative) 또는 보조적인 치료 옵션이다. 광역학 치료에서, 빛에 민감한 물질이 종양에 주입되어 건강한 세포보다 암 세포에서 더 오래 머물러 있다. 그런 다음 종양을 겨냥하여 빛을 발사하여 암세포를 파괴한다. 광역학 요법은 단기간 동안 연하곤란(swallowing problems)을 완화시킬 수 있지만 식도암을 치료하지는 못한다.

전기 응고 (electrocoagulation)는 암 세포를 전류로 가열함으로써 암세포를 죽이는 것을 돕는 완화 치료(palliative treatment)의 한 유형이다. 이것은 때때로 종양으로 인한 막힘을 제거함으로써 증상 완화에 도움이 된다.

냉동 요법은 종양 조직을 동결 및 제거할 수 있는 프로브가 부착된 내시경을 사용하는 완화 치료의 일종이다. 그것은 환자가 더 잘 삼킬 수 있도록 종양의 크기를 줄이는 데 사용할 수 있다.

3. 방사선 요법(Radiation therapy)

방사선 요법은 고-에너지 x-레이 또는 다른 입자를 사용하여 암세포를 파괴하는 것이다. 방사선 치료 요법(일정)은 보통 일정 기간 동안 주어진 특정 수의 치료로 구성된다. 방사선 치료의 가장 보편적인 유형은 외부-광선 치료 (external-beam radiation therapy)라 불리는데, 이는 신체 외부에 기계로부터 주어지는 방사선 요법이다. 방사선 치료가 신체 내부에 직접 주어지면 이를 내부 방사선 요법 또는 근접 치료(brachytherapy)라고 한다. 식도암의 경우에, 이것은 내시경을 사용하여 일시적으로 식도로 방사성 와이어를 삽입하는 것과 관련된다.

4. 화학 요법(Chemotherapy)

식도암에 대한 화학 요법 및 방사선 요법은 수술 전, 수술 후 또는 수술과 무관하게 사용될 수 있다. 현재 식도암의 치료에 사용되는 대부분의 화학 요법은 알킬화, 대사길항물질(antimetabolite), 안트라사이클린(anthracycline) 및 항미세소관제(antimicrotubule agents)를 포함한다. 편평 세포 식도 암종에 대한 화학 요법은, 일반적으로 편평 세포 암종과 마찬가지로, 시스플라틴(cisplatin)에 기초할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 화학 방사선 요법이 투여된 후 수술이 실시된다. 일부 실시 양태에서, 신보조요법(neoadjuvant therapy)이 사용된다. 일부 실시 양태에서, 신보조요법은 방사선 요법과, 백금 화합물 및 DNA 복제 억제제를 사용한 화학 요법의 병용을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 백금 화합물은 시스플라틴, 카보플 라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트, 페나트리플라 틴(phenathriplatin), 피코플라틴 및 사트라플라틴으로부터 선택된다. 일부 실시 양태에서, 백금 화합물은 시스플라틴이다. 일부 실시 양태에서, DNA 복제 억제제는 5- 플루오로우라실이다.

일부 실시 양태에서, 화학 요법은 카보플라틴, 파클리탁셀, 시스플라틴, 5- 플루오로우라실, 에피루비신, 도세탁셀, 세페시타빈, 옥살리플라틴 및 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 조합 치료(combination treatment)는 카보플 라틴 및 파클리탁셀; 시스플라틴 및 5-플루오로우라실; 에피루비신, 시스플라틴 및 5-플루오로우라실; 도세탁셀, 시스플라틴 및 5-플루오로우라실; 시스플라틴 및 세파시타빈; 옥살리플라틴 및 5-플루오로우라실; 및, 옥살리플라틴과 및 카페시타빈.

5. 표적 요법(Targeted therapy)

표적 요법은 암 성장 및 생존에 기여하는 암의 특정 유전자, 단백질 또는 조직 환경을 표적으로 하는 치료법이다. 이러한 유형의 치료법은 건강한 세포에 대한 손상을 제한하는 반며 암세포의 성장과 확산을 차단한다.

식도암의 경우, 전이성 식도 선암 환자에 대해 화학 요법과 함께 표적 요법 트라스투주맙(허셉틴)을 사용할 수 있다. 트라스투주맙은 인간 표피 성장 수용체 2 (HER2)라고 불리는 단백질을 표적으로 한다. 식도 선암의 약 20 % ~ 30 %가 HER2를 너무 많이 만든다.

표적 요법 라무시루맙(ramucirumab)(Cyramza)은 또한 1 차 요법(first-line therapy) 또는 주어진 첫 번째 치료가 효과를 나타내지 않은 이후에 선택 사항이다. 그 자체로 또는 화학 요법의 일종인 파클리탁셀(탁솔)과 함께 투여될 수 있다.

C. 모니터링(Monitoring)

일 측면에서, 환자가 재발 위험이 높거나 예후가 좋지 않다고 판단되는 경우, 바이오마커-기반의 방법은 증가된 빈도로 하나 이상의 다른 식도암 진단 또는 선별 테스트와 조합될 수 있다.

식도 모니터링은 당업계에 공지된 임의의 방법을 포함할 수 있다. 특히, 모니터링은 진단을 위한 샘플 획득 및 샘플 테스트를 포함한다. 예를 들어, 모니터링은 식도 및/또는 생검의 내시경 검사를 포함할 수 있다.

기타 모니터링 테스트는 이미징 테스트, 바륨 스왈로 테스트(Barium swallow test), CAT 검사(컴퓨터 단층촬영 스캔), 자기 공명 영상(MRI) 검사, 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 검사, 상부 내시경, 내시경 초음파, 기관지 내시경 검사, 흉강경 검사, 복강경 검사, 또는 이들의 조합과 같은 내시경 검사를 포함한다.

추가 양태에서, 모니터링 진단은 생검 샘플의 HER2 테스트, 빈혈을 찾기 위한 CBC(complete blood count) 혈액 검사, 잠혈에 대한 대변 샘플(stool sample)의 검사 및/또는 정상 신장 또는 간 기능을 확인하기 위한 혈액 검사와 같은 실험실 테스트를 포함할 수 있다.

IV. ROC 분석

통계에서, ROC(receiver operating characteristic), 또는 ROC 곡선은 그 식별 임계치가 변화될 때 바이너리 분류기 시스템의 성능을 나타내는 그래픽 플롯이다. 곡선은 여러 임계 값 설정에서 위양성율(false positive rate) 대하여 진양성율(true positive rate)을 플로팅 (plotting)하여 만들어 진다. (진양성율은 또한 생체의학적 정보학에서 민감도 또는 머시러닝(machine learning)에서 리콜(recall)로 알려져 있고, 위양성율은 폴-아웃(fall-out)으로 알려져 있으며 1-특이도로 계산될 수 있다.) 따라서 ROC 곡선은 폴-아웃(fall-out)의 함수로서 민감도이다. 일반적으로, 검출 및 오경보(false alarm)에 대한 확률 분포가 알려지면, ROC 곡선은 y 축의 검출 확률의 누적 분포 함수(- 무한대에서 + 무한대까지의 확률 분포 아래 영역) 대 x 축의 오경보의 누적 분포 함수를 플로팅하여 생성할 수 있다.

ROC 분석은 가능한 최적의 모델을 선택하고, 코스트 컨텍스트(cost context) 또는 클래스 분포(class distribution)와는 독립적으로(그리고 명시하기 전에) 차선책을 폐기하는 툴을 제공한다. ROC 분석은 진단적 의사 결정(diagnostic decision making)의 비용/이익 분석에 직접적이고 자연스러운 방식으로 관련되어 있다.

ROC는 기준 변화에 따라 2 개의 동작 특성 (TPR 및 FPR)의 비교이기 때문에 상대 동작 특성 곡선(relative operating characteristic curve)으로도 알려져 있다. ROC 분석 곡선은 당업계에 공지되어 있고 Metz CE (1978) ROC 분석의 기본 원리에 기술되어 있다. Seminars in Nuclear Medicine 8:283-298; Youden WJ (1950) 등급 진단 테스트에 대한 지수(An index for rating diagnostic tests). Cancer 3:32-35; Zweig MH, Campbell G (1993) ROC(Receiver-operating characteristic ) 플롯: 임상 의학에서의 기본 평가 도구. Clinical Chemistry 39:561-577; and Greiner M, Pfeiffer D, Smith RD (2000) 진단 테스트를 위한 리시버-오퍼레이션 특성 분석의 원리와 실제 적용. Preventive Veterinary Medicine 45:23-41,이들은 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함된다.

V. 샘플 준비(Sample Preparation)

일 측면에서, 방법은 대상으로부터 샘플을 수득하는 것을 포함한다. 본원에서 제공된 수득 방법은 미세 바늘 흡인, 코어 바늘 생검, 진공 보조 생검, 절개 생검, 절제 생검, 펀치 생검, 면도 생검 또는 피부 생검과 같은 생검 방법을 포함할 수 있다. 일 실시 양태에서, 샘플은 전술한 임의의 생검 방법에 의해 식도 조직으로부터의 생검으로부터 얻어진다. 다른 실시 양태에서, 샘플은 비-암성 조직 또는 암성 조직 및, 혈청, 담낭, 점막, 피부, 심장, 폐, 유방, 췌장, 혈액, 간, 근육, 신장, 평활근, 방광, 결장, 내장, 뇌, 전립성, 식도 또는 갑상선 조직으로부터의 비-암성 조직 또는 암성 조직을 포함하지만 이에 한정되지 않는 본원에서 제공되는 임의의 조직으로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 샘플은 혈액, 땀, 모낭, 협측 조직 (buccal tissue), 눈물, 월경, 대변 또는 타액을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 다른 공급원으로부터 수득될 수 있다. 현재의 방법의 일 측면에서 의사, 간호사 또는 의료 기술자와 같은 임의의 의료 전문가는 테스트를 위해 생물학적 샘플을 수득할 수 있다. 또한, 생물학적 샘플은 의료 전문가의 도움없이 수득될 수 있다.

샘플은 조직, 세포 또는 세포 유래의 생물학적 물질 또는 대상체의 세포 유래물을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 생물학적 샘플은 세포 또는 조직의 이종 또는 동종 집단일 수 있다. 생물학적 샘플은 본원에 기재된 분석 방법에 적합한 샘플을 제공할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 샘플은 다음을 포함하되 이에 국한되지 않는 비침습적 방법으로 얻을 수 있다: 피부 또는 자궁경부의 스크레이핑(scraping), 볼의 스와빙(swabbing), 타액 수집, 소변 수집, 배설물 수집, 월경, 눈물 또는 정액의 수집.

샘플은 당업계에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 일 실시 양태에서, 샘플은 생검에 의해 수득된다. 다른 실시 양태에서, 샘플은 스와빙(swabbing), 내시경 검사, 스크레이핑(scraping), 사혈(phlebotomy) 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 수득된다. 경우에 따라, 샘플은 본 방법 키트의 구성부품(컴포넌트)을 사용하여 수득, 저장 또는 수송될 수 있다.

경우에 따라서는, 다중(multiple) 식도 샘플과 같은 다중 샘플을 본원에 설명된 방법으로 진단을 위해 수득할 수 있다. 다른 경우에는, 하나의 조직 유형(예를 들어, 식도)으로부터의 하나 이상의 샘플 및 다른 표본(예를 들어, 혈청)으로부터의 하나 이상의 샘플과 같은 다중 샘플이 본원에 설명된 방법으로 진단을 위해 수득할 수 있다. 일부 경우에는, 하나의 조직 유형(예를 들어, 식도)으로부터의 하나 이상의 샘플 및 다른 표본(예를 들어, 혈청)으로부터의 하나 이상의 샘플과 같은 다중 샘플이 동일하거나 다른 시간에 수득될 수 있다. 서로 다른 시간에 샘플을 얻을 수 있으며 다른 방법으로 저장 및/또는 분석될 수 있다. 예를 들어, 샘플이 수득되고, 일상적인 염색 방법 또는 임의의 다른 세포학 분석 방법에 의해 분석될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 생물학적 샘플은 의사, 간호사, 또는 의료 기술자, 내분비학자, 세포학자, 사혈전문의(phlebotomist), 방사선 전문의 또는 호흡기내과전문의(pulmonologist)와 같은 다른 의료 전문가에 의해 수득될 수 있다. 의료 전문가는 샘플에서 수행할 적절한 테스트 또는 분석을 지시할 수 있다. 일 측면에서 분자 프로파일링 비지니스(molecular profiling business)는 어떤 분석법이나 검사가 가장 적절하게 나타내는 지에 대해 컨설팅할 수 있다. 본 방법의 다른 측면에서, 환자 또는 대상(피험자)은 전혈 샘플, 소변 샘플, 대변 샘플, 협측 샘플 또는 타액 샘플을 얻는 것과 같이 의료 전문가의 도움 없이 테스트용 생물학적 샘플을 얻을 수 있다.

다른 경우, 샘플은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는 침습적 절차에 의해 얻어진다: 생검, 바늘 흡인, 내시경 또는 사혈(phlebotomy). 바늘 흡입의 방법은 미세 바늘 흡인, 코어 바늘 생검, 진공 보조 생검 또는 대형 코어 생검(large core biopsy)을 더 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 충분한 양의 생물학적 물질을 확보하기위해 본원의 방법에 의해 다수의 샘플을 수득할 수 있다.

생물학적 샘플을 수득하기 위한 일반적인 방법은 또한 당업계에 공지되어 있다. Ramzy, Ibrahim Clinical Cytopathology and Aspiration Biopsy 2001과 같은 간행물은 본원에서 참고 문헌으로 인용되며, 생검 및 세포학적 방법에 대한 일반적인 방법을 기술한다. 일 실시 양태에서, 샘플은 식도 또는 의심되는 식도 종양 또는 신생물(eoplasm)의 미세 바늘 흡인이다. 경우에 따라 미세 바늘 흡인 샘플 채취 절차는 초음파, X 선 또는 다른 영상 장치의 사용에 의해 가이드(gudid)될 수 있다.

본 방법의 일부 실시 양태에서, 분자 프로파일링 비지니스는 대상으로부터 직접, 의료 전문가로부터, 제3자로부터, 또는 분자 프로파일링 비지니스 또는 제3자에 의해 제공된 키트로부터 생물학적 샘플을 수득할 수 있다. 경우에 따라. 대상, 의료 전문가 또는 제3자가 생물학적 샘플을 수집하여 분자 프로파일링 비즈니스로 보낸 후, 분자 프로파일링 비즈니스에 의해 생물학적 샘플이 수득될 수 있다. 일부 경우, 분자 프로파일링 비지니스는 생물학적 샘플을 저장 및 운송하기 위한 적합한 용기 및 부형제를 제공할 수 있다.

본원에 기술된 방법의 일부 실시 양태에서, 의료 전문가는 초기 진단 또는 샘플 취득에 관여할 필요가 없다. 개인은 카운터 (OTC) 키트의 사용을 통해 샘플을 얻을 수도 있다. OTC 키트는 본원에 기술된 바와 같이 상기 샘플을 수득하기 위한 수단, 검사용 상기 샘플을 저장하기 위한 수단, 및 키트의 적절한 사용을 위한 지침을 포함할 수 있다.

경우에 따라서는, 분자 프로파일링 서비스는 키트 구매 가격에 포함된다. 다른 경우에, 분자 프로파일링 서비스는 별도로 청구된다. 분자 프로파일링 비지니스에 의한 사용을 위한 적합한 샘플은 검사 대상 개체의 조직, 세포, 핵산, 유전자, 유전자 단편, 발현 산물, 유전자 발현 산물 또는 유전자 발현 산물 단편을 포함하는 임의의 물질일 수 있다. 샘플 적절성(suitability) 및/또는 적합성(adequacy)을 결정하는 방법이 제공된다.

일부 실시 양태에서, 대상(subject)은 종양 전문의, 외과 의사 또는 내분비전문의와 같은 전문가에게 의뢰될 수 있다. 전문가는 마찬가지로 시험을 위해 생물학적 샘플을 얻거나 생물학적 시료를 제출하기 위해 개체를 시험 센터 또는 실험실에 보낼 수 있다. 일부의 경우, 생물학적 시료의 제출을 위해 의료 전문가는 대상(subject)을 시험 센터 또는 실험실에 의뢰할 수 있다. 다른 경우, 대상자가 샘플을 제공할 수 있다. 경우에 따라서는. 분자 프로파일링 비지니스는 샘플을 수득할 수 있다.

VI. 핵산 분석법(Nucleic Acid Assays)

상기 방법의 일 측면은 발현 수준을 결정하기 위해 핵산을 분석(assaying)하는 것을 포함한다. 어레이는 두 샘플 간의 차이점을 감지하는 데 사용할 수 있다. 구체적으로 고려되는 어플리케이션은 정상인 샘플과 정상이 아닌 샘플, 암성 조건과 비-암성 조건, 또는 두 가지 다르게 처리된 샘플 간의 miRNA 간의 차이를 확인 및/또는 정량화하는 것을 포함한다. 또한, miRNA는 특정 질병 또는 질환(condition)에 영향을 받기 쉽다고 여겨지는 샘플과 그 질병 또는 질환에 영향을 받기 쉽지 않거나 저항성이 있는 것으로 여겨지는 샘플 간에 비교될 수 있다. 정상이 아닌 샘플은 질병 또는 질환의 표현형 형질(phenotypic trait)을 나타내는 것 또는 그 질병 또는 상태와 관련하여 정상적이지 않은 것으로 여겨지는 것이다. 그것은 그 질병이나 질환과 관련하여 정상적인 세포와 비교될 수 있다. 표현형 형질은, 구성성분(component)이 과증식성(hyperproliferative) 또는 신생물성(neoplastic) 세포 또는 세포들에 의해 유발되거나 유전성이거나 그렇지 않을 수 있는 질병 또는 질환의 증상 또는 민감도(susceptibility)를 포함한다.

어레이는 지지체에 부착된 핵산 프로브를 갖는 고체 지지체를 포함한다. 어레이는 상이한 공지된 위치에서 기판의 표면에 커플링되는 복수의 상이한 핵산 프로브를 전형적으로 포함한다. "마이크로 어레이 (microarrays)" 또는 구어체로 "칩 (chip)"으로 기술된 이러한 어레이는 일반적으로 당업계에, 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 5,143,854, 5,445,934, 5,744,305, 5,677,195, 6,040,193, 5,424,186 및 Fodor et al., 1991)에 기술되어 있고, 이들 각각은 목적을 위해 그 전체가 참고 문헌으로서 포함된다. 기계적 합성 방법을 사용하여 이들 어레이를 합성하는 기술은 예를 들어, U.S. Pat. No. 5,384,261에 기술되어 있고, 이는 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고 문헌으로서 본원에 포함된다. 일 측면에서 평면 어레이 표면이 사용되지만, 어레이는 사실상 임의의 형상 또는 심지어 다수의 표면 상에 제조될 수 있다. 어레이는 비드 상의 핵산, 겔, 중합체 표면, 광섬유(fiber optics)와 같은섬유, 유리 또는 임의의 다른 적절한 기질(substrate)일 수 있다. U.S. Pat. Nos. 5,770,358, 5,789,162, 5,708,153, 6,040,193 및 5,800,992 에 개시되어 있으며, 이들은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 포함된다.

어레이 및 마이크로 어레이의 사용에 더하여, 다수의 디퍼런스 어세이가 miRNA, 이의 활성 및 이의 효과를 분석하는데 사용될 수 있음이 고려된다. 그러한 어세이는 핵 증폭, 중합효소 연쇄 반응, 정량적 PCR, RT-PCR, 인 시츄(in situ) 하이브리드화, 노던(Northern) 하이브리드화, 하이브리드화 보호 어세이(hybridization protection assay, HPA)(GenProbe), 분지형 DNA(bDNA) 어세이 (Chiron), 회전환증폭(RCA), 단일 분자 혼성화 검출(single molecule hybridization detection)(US Genomics), 인베이더 어세이(der assay)(ThirdWave Technologies) 및/ 또는 브릿지 리티게이션 어세이(Bridge Litigation Assay)(Genaco)를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다 .

VII.약학적 조성물(Pharmaceutical Compositions)

일 측면에서에서, 화학요법제(chemotherapeutic agents)와 같은, 상기 방법에서 사용하기 위한 조성물 또는 제제는 약학적으로 허용 가능한 담체에 적합하게 포함된다. 담체는 비독성이고, 생체 적합성이며, 제제의 생물학적 활성에 유해한 영향을 미치지 않도록 선택된다.

본 발명의 일부 측면에서의 제제는 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 연고제, 용액 제제, 보관제(depositories), 흡입제(inhalants) 및 경구, 비경구, 또는 외과 투여를 허용하는 주사제와 같은 고체, 반고체, 겔, 액체 또는 기체 형태로 국소 전달(즉, 골격근 또는 다른 조직과 같은 신체의 특정 위치) 또는 전신 전달(systemic delivery) 하기 위한 제제로 제형화될 수 있다. 본 발명의 일 측면은 또한 의료 장치(medical devices) 등을 코팅함으로써 조성물의 국부 투여를 고려한다.

주사 가능한, 주입(infusion) 또는 관류(irrigation) 및 국소 전달을 통한 비경구 전달을 위한 적합한 담체는 증류수, 생리적 인산염완충식염수(physiological phosphate buffered saline), 정상 또는 젖산 링거액(Ringer's solutions), 덱스트로스 용액, Hank's 용액 또는 프로판디올을 포함한다. 또한, 무균의, 고정유(fixed oils)가 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 이 목적을 위해, 합성 모노(synthetic mono) 또는 다이글리세라이드를 포함하여 임의의 생체 적합성 오일이 사용될 수 있다. 또한 올레산과 같은 지방산은 주사제의 제조에 사용된다. 담체 및 제제는 액체, 현탁액, 중합성 또는 비중합성 겔, 페이스트 또는 연고로서 배합될 수 있다.

담체는 또한 제제의 전달을 유지(즉 연장, 지연 또는 조절)하거나 치료제 (들)의 전달, 섭취, 안정성 또는 약동학을 향상시키기 위한 전달 비히클을 포함할 수 있다. 이러한 전달 비히클은 비제한적 예로, 단백질, 리포좀, 탄수화물, 합성 유기 화합물, 무기 화합물, 중합 또는 공중합 하이드로 겔 및 중합 마이셀(micelles)로 구성된 미립자, 미소구체, 나노구체 또는 나노입자를 포함할 수 있다.

일 측면에서, 환자 또는 대상에게 투여된 조성물의 실제 투여량은 체중, 질환의 중증도(severity), 치료되는 질병의 유형, 이전(previous) 또는 동시(concurrent) 치료적 개입(therapeutic interventions), 환자의 특발성(idiopathy) 및 투여 경로와 같은 신체적 및 생리학적 요인에 의해 결정될 수 있다. 투여에 책임이있는 종사자는, 어떠한 경우이든, 조성물 내의 활성 성분의 농도 및 개별 대상에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.

일 실시 양태에서, 약학 조성물은 예를 들어 적어도 약 0.1 %의, 격리된 엑소좀, 관련 지질 나노베지클, 또는 치료제 또는 진단 제제에 로딩된 엑소좀 또는 나노베지클과 같은 활성 제제를 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 활성 제제는 단위 중량의 약 2 % 내지 약 75 %, 또는 예를 들어 약 25 % 내지 약 60 % 및 여기에서 유도할 수 있는 임의의 범위를 포함 할 수 있다.다른 비-한정적 실시예에서, 투여량은 또한 약 1 마이크로 그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg 체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중에서, 약 1000mg/kg/체중까지 또는 투여 당 더 많이(more per administration), 및 여기에서 유도되는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치로부터 유도 가능한 범위의 비-제한적인 실시예에서, 약 5 마이크로그램/kg 체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등이 투여될 수 있다.

약학적 조성물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산제는 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기위한 방부제를 함유한다.

일 측면에서, 약학적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사 가능한 조성물의 형태로 유리하게 투여되고; 주사하기 전에 액체에 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태도 또한 제조될 수 있다. 이들 제제는 또한 유화될 수 있다. 이러한 목적을 위해 전형적인 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 인산염완충식염수(phosphate buffered saline) 밀리리터 당 인간 혈청 알부민 10mg 또는 그 이하, 25mg, 50mg 또는 최대 약 100mg을 함유할 수 있다. 다른 약학적으로 허용 가능한 담체는 수용액, 비-독성 부형제, 염, 방부제, 완충제 등을 포함한다.

비-수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 기름 및 에틸올레에이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르가 있다. 수성 담체는 물, 알콜성/수성 용액, 염수 용액, 염화나트륨과 같은 비경구적 비히클, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose) 등을 포함한다. 정맥 주사는 플루이드(fluid) 및 영양 보충제를 포함한다. 방부제에는 항균제, 항곰팡이제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스가 포함된다. 약학적 조성물의 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 잘 알려진 파라미터에 따라 조절된다.

추가의 제형은 경구 투여에 적합하다. 경구 제형은, 예를 들어 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 전형적인 부형제를 포함한다. 상기 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐제, 서방성제형 또는 분말의 형태를 취한다.

다른 측면에서, 약학적 조성물은 전형적인(classic) 약제학적 제제를 포함할 수 있다. 일 측면에 따른 약학적 조성물의 투여는 표적 조직이 그 경로를 통해 이용 가능한 한 임의의 일반적인 경로를 통해 이루어질 수 있다. 이것은 경구, 비강, 협측, 직장, 질 또는 국소를 포함할 수 있다. 국소 투여는 피부암의 치료, 화학요법으로 유발된 탈모증 또는 기타 피부 과증식 장애를 예방하는데 특히 유리할 수 있다. 대안적으로, 정위(orthotopic), 피부내(intradermal), 피하, 근육 내, 복강 내 또는 정맥 내 주사에 의한 투 일 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 생리학적으로 허용되는 담체, 완충제 또는 다른 부형제를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 조성물로서 투여될 것이다. 폐의 질환을 치료하기 위해 에어로졸 딜리버리가 사용될 수 있다. 에어로졸의 부피는 약 0.01 ml 내지 0.5 ml이다.

유효량의 약제 학적 조성물은 의도된 목표에 기초하여 결정된다. 용어 "단위 투여량(unit dose)" 또는 "투여량(dosage)"은 대상(피험자)에서 사용하기에 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하는 것으로, 각 단위는 투여 즉 적절한 경로 및 치료 요법과 관련하여 상기 논의된 바람직한 반응을 생성하도록 계산된, 제약 조성물의 소정량(predetermined-quantity)을 포함한다. 처리 횟수 및 단위 투여량에 따라 투여될 양은 원하는 보호 또는 효과에 의존한다.

약학 조성물의 정확한 양은 또한 실무자(practitioner)의 판단에 의존하며 각 개체에 특유하다. 투여량에 영향을 미치는 요인은 환자의 신체 및 임상 상태, 투여 경로, 의도된 치료 목적(예를 들어, 증상의 완화 versus 치료) 및 특정 치료 물질의 효능(potency), 안정성 및 독성을 포함한다.

VIII. 키트

본 발명의 일 측면은 또한 본 발명의 조성물을 함유하는 키트 또는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 조성물에 관한 것이다. 일부 실시 양태에서, 키트는 하나 이상의 miRNA 분자를 평가하는데 사용될 수 있다. 일 실시 양태에서, 키트는 적어도 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 100, 500, 1,000 개 또는 그 이상 또는 그 이하 또는 더 많은 miRNA 프로브, 합성 miRNA 분자 또는 miRNA 억제제, 또는 임의의 값 또는 범위 및 여기에서 유도될 수 있는 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 세포에서 miRNA 활성을 평가하기 위한 키트가 있다.

키트는 개별적으로 튜브, 병, 바이알, 주사기 또는 다른 적절한 용기 수단과 같은 용기에 포장되거나 또는 배치될 수 있는 성분을 포함할 수 있다.

개별 성분은 또한 농축된 양으로 키트에 제공될 수 있다; 일부 실시 양태에서, 성분은 다른 성분과 함께 용액 내에 존재할 때 동일한 농도로 개별적으로 제공된다. 구성 요소의 농도는 1x, 2x, 5x, 10x 또는 20x 또는 그 이상으로 제공될 수 있다.

예후 또는 진단 어플리케이션을 위하여, 본 발명의 miRNA 프로브, 합성 miRNA, 비 합성 miRNA 및/또는 miRNA 억제제를 사용하기 위한 키트가 본 발명의 일부로서 포함된다. 구체적으로 본원에서 확인된 임의의 miRNA에 상응하는 임의의 그러한 분자가 고려된다.

일 측면에서, 음성 및/또는 양성 대조군 합성 miRNA 및/또는 miRNA 억제제가 일부 키트 구체 실시 양태에에 포함된다. 제어 분자(control molecules)는 형질 감염 효율의 확인 및/또는 형질 감염에 의해 유도된 세포의 변화를 제어하는데 사용될 수 있다.

본원에 기술된 임의의 방법 또는 조성물은 본원에 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있으며 상이한 실시 태양이 결합될 수 있음이 고려된다. miRNA 분자 또는 miRNA와 관련하여 본원에서 논의된 임의의 방법 및 조성물이, 합성 miRNA가 생리학적 환경 하에서 성숙한 miRNA가 되도록 적절한 조건에 노출되는 정도까지의 합성 miRNA와 관련하여 실시될 수 있다는 것이 구체적으로 고려된다. 최초 제출된 클레임은 임의의 제출된 클레임 또는 제출된 클레임의 조합에 따른 다양한 클레임을 포괄(cover)하기 위한 것으로 고려된다.

특정 miRNA와 관련된 본 발명의 임의의 실시 양태는 또한, 특정된 miRNA의 성숙 서열(mature sequence)과 서열이 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % 동일한 miRNAs와 관련된 실시 양태를 포괄한다.

본 발명의 실시 양태는, 적합한 컨테이너(container means)에, 2 개 이상의 miRNA 프로브를 포함하는 샘플에 대한 miRNA 프로파일 평가에 의한 병리학 샘플의 분석용 키트를 포함하며, 상기 miRNA 프로브는 본 명세서에서 확인된 하나 이상의 miRNA를 검출한다. 상기 키트는 샘플에 miRNA를 표지하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트는 아민- 변형된(amine-modified) 뉴클레오티드, 폴리(A) 폴리머라제 및 폴리 (A) 폴리머라제 버퍼 중 적어도 하나를 포함하는 라벨링 시약을 포함할 수 있다. 표지 시약에는 아민-반응 염료가 포함될 수 있다.

IX. 실시예

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 양태를 설명하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술(techniques)은 본 발명을 실시하는데 있어서 잘 기능할 수 있도록 발명자에 의해 발견된 기술(techniques)을 나타내므로 그 실시를 위해 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다.

그러나, 당업자는, 본 발명에 비추어 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 한, 개시된 특정 실시 양태에서 다양한 변화가 이루어질 수 있고 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예 1

본 출원의 도면에 제공된 데이터를 수집하는데 다음의 방법들이 수행되었다.

A. 연구 설계 및 임상 표본

이 연구는 세 부분으로 구성된다: 후보 miRNA 패널 선택 을위한 발견 단계, 검증 단계 및 번역 단계. 식도암 환자에서 혈청 내 miRNA 패널의 잠재성(potentiality)을 평가하기 위한 최종 단계. 발견 단계에서, 발명자는 TCGA (The Cancer Genome Atlas) data로부터 수득한 98 개의 식도 편평-세포 암종 조직(esophagus squamous-cell carcinoma tissues) 및 88 개 식도 선암종 조직(esophagus adenocarcinoma tissues), 및 12 개의 정상 점막 조직을 포함하는 186 개의 단계 I-IV 식도암 조직의 코호트를 사용하였다. 식도암 환자에 대한 miRNA 발현 데이터 및 해당 임상 데이터는 암 게놈 아틀라스(The Cancer Genome Atlas) 데이터 포털에서 다운로드되었다. 66.1±11.8 세, 61.8±11.7 세의 여성 27 명, 남자 157 명의 환자이었다. TCGA의 원본 자료 및 데이터 수집은 인체 보호를 위한 모든 관련 법률, 규정 및 정책을 준수하여 수행되었으며 필요한 IRB 승인이 획득되었다. 데이터는 로그 스케일에서 평균 95 % 신뢰 구간으로 요약되거나 이러한 값이 배수-변화(fold change)을 생성하도록 지수화되었다. 검증 단계에는 224 개의 단계 0-IV 식도암 조직과 224 개의 정합된(matched) 상응하는 정상적인 식도 점막 조직을 포함하였다. 번역 단계는 miRNAs의 혈청 수준을 조사하기 위하여 136 명의 단계 0-IV의 식도암 환자와 112 명의 건강한 대조군을 포함하였다. 일본 나고야 대학 의과 대학 병원에서 총 224 개의 식도암 조직과 224 개의 정합된 상응하는 정상 식도 점막 조직과 단계 0-IV의 136 개의 혈청 샘플 및, 미국 텍사스 주 베일러 대학 메디컬 센터(Baylor University Medical Center, TX, US)에서 112 명의 건강한 대조군을 본 연구에서 사용하였다. 모든 환자로부터 서면 동의서를 얻었고 이 연구는 모든 참여 기관의 기관 검토위원회의 승인을 받았다.

B. 조직으로부터의 RNA 분리 및 qRT-PCR

제조사의 프로토콜에 따라 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 작은 RNA를 포함하는 총 RNA를 조직으로부터 분리하고, QIAcube 장치 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 RNase-프리 워터(free water) 30 μL에서 용출시키고, NanoDrop 분광 광도계 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE)를 사용하여 정량화 하였다. miRNA 기반 RT-PCR 어세이를 위해, 조직 샘플에서 얻은 농축된 소형 RNA 2 μL를 TaqMan MicroRNA Reverse Transcriotion Kit (Applied Biosystems, San Diego, CA)를 사용하여 10 μL의 총 반응 부피에서 다음 조건으로 역전사 시켰다: 16℃에서 30분간, 42℃에서 30분간, 85℃에서 5분간 및 4℃에서 유지. 실시간 PCR은 MicroRNA Assay Kits와 TaqMan Universal Master Mix II, no UNG (Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다. miRNA의 정량을 위한 PCR 반응은 다음의 사이클링 조건을 갖는 QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 다음의 순환 조건으로 수행되었다 : 95℃에서 10분, 이후 95℃에서 15초 및 60 ℃에서 1분간 40회 반복. 결과는2^-ΔΔCt로 나타내었고 그 결과는 RNU6B (Applied Biosystems)로 정규화하고 이중으로 수행되었다.

C. 혈청 및 qRT-PCR로부터 RNA 분리

작은 RNAs(small RNAs)는 Qiagen miRNAeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 모든 혈청 샘플로부터 농축되었다. 간단히, 250 μL의 혈청을 얼음 위에서 해동시키고 10,000rpm에서 5 분간 원심 분리하여 세포 파편을 제거 하였다. 다음에, 200 μL의 상청액을 1000 μL의 Qiazol Lysis Reagent에서 용해시켰다. RNA 분리 과정 동안 샘플 간 편차를 정규화(normalization)하기 위하여, 25 fmol의 합성 C. elegans miRNA (cel-miR-39)를 각 변성된 샘플에 첨가하였다. 작은 RNA를 포함하는 총 RNA를 추출하여 QIAcube 장치 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 RNase-프리 워터 30 μL에서 용리시켰다. miRNA 기반 RT-PCR 어세이을 위해, 다음의 조건으로, 총 반응 부피 10μL에서 TaqMan MicroRNA Reverse Transcriotion Kit (Applied Biosystems, San Diego, CA)를 사용하여 혈청 샘플로부터 얻은 농축된 작은 RNA 2 μL를 역전사시켰다: 16℃에서 30분, 42℃에서 30분, 85℃에서 5분 및 4 ℃에서 유지. 실시간 PCR은 MicroRNA Assay Kits와 TaqMan Universal Master Mix II, no UNG (Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다. miRNA의 정량을 위한 PCR 반응은 QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 다음의 순환 조건으로 수행되었다: 95℃에서 10분, 이후 95℃에서 15초, 60℃에서 1분간 40회 반복 . 결과를 2^-ΔΔCt로 표현하였고, 그 결과를 cel-miR-39로 정규화하고 이중으로 수행하였다.

D. 통계 분석

2 개의 정합된(matched) 페어(pair) 그룹 사이 또는 2 개의 독립적인 그룹의 샘플들 사이의 유의한 차이를 평가하기 위하여, 대응표본 t 테스트(paired t test) 및 Mann-Whitney U 테스트가 각각 사용되었다.

모든 P-값은 양측(two-sided)이고 P-값 < 0.05 는 유의한 것으로 간주되었다. ROC(Receiver operating characteristic) 곡선을 생성하고 95 % 신뢰 구간 (CI)을 갖는 ROC 곡선 아래의 면적(AUC)을 계산하여 miRNA의 차별적 성능을 평가하였다. 로지스틱 회귀는 결과를 결정하는 하나 이상의 독립 변수가 있는 데이터집합(데이터세트)을 분석하는데 사용되었다. 모든 통계 분석은 Medcalc 통계 소프트웨어 v.12.7.7.(Medcalc Software bvba, Ostend, Belgium)을 사용하여 수행되었다.

하기 표는 EAC 또는 ESCC-특이 마커에 대한 후보 mRNA 및 이들의 백분율을 나타낸다.

하기 표는 EAC/ESCC 마커에 대한 후보 mRNA 및 이들의 백분율을 나타낸다.

실시예 2 : 식도 편평 세포 암종(esophageal squamous cell carcinoma)의 검출을 위한 신규 miRNA-기반, 비-침습성 진단 패널

이 실시예에서 기술된 바와 같이, 포괄적인 인 실리코(in silico) 분석을 사용하여 ESCC에서 과발현된 후보 miRNA를 동정하였다. 이후, 이 miRNA는 혈청 샘플에서 테스트되었고 8-miRNA 진단 패널로 정제되었다. 패널의 항내성(robustness)은 두 개의 큰 독립적인 코호트에서 검증되었다. 또한, 패널은 건강한 대조군과 초기 단계 ESCC 환자를 구별하였며, 현재 사용되는 혈청 ESCC 마커인, SCC-Ag보다 상당히 우수했다.

식도 편평 세포 암종 (ESCC)이 모든 식도암의 약 80 %를 차지하지만, 현재 조기 진단을 위한 혈청 분자 마커는 확립되어 있지 않다. 본 연구의 목적은 여러 독립 ESCC 환자 코호트에서 체계적이고 포괄적인 miRNA 발현 분석을 통해 ESCC 용 순환 miRNA-기반 진단 패널을 확립하는 것이었다. 세 가지 조직 RNA-Seq 데이터세트를 사용하여 초기 miRNA 후보를 확인하고 이들 후보 miRNA의 발현을 임상 조직 샘플에서 검증하였다. ESCC 환자의 건강한 대조군에 대한 연령, 성별 및 인종과 일치하는 혈청 샘플을 사용하여 발명자는 순환 miRNA 패널(circulating miRNA-panel)을 수학적으로 개발하였다. 2 개의 독립적인 환자 코호트가 miRNA 패널의 진단 성능을 평가하는데 사용되었다. 처음에는 18 개의 일관되게 과발현된 miRNA가 3 개의 데이터세트에서 확인되었다. 이어서, 이들 miRNA의 발현이 임상 조직 샘플에서 확인되었다. 이 조직- 후보(tissue-candidates)의 발현은 혈청 표본에서 평가되었으며 8-miRNA 패널 (miR-103, 106b, 151, 17, 181a, 21, 25 및 93)을 사용하여 다변수 위험 점수 계산 공식(multivariate risk scoring formula)을 유도하였다. miRNA 시그니처의 진단 성능은 트레이닝 코호트 (AUC = 0.83)와 두 개의 큰 독립적인 검증 코호트 (AUC: 각각 0.80, 0.89)에서 입증되었다. 또한, miRNA 패널은 조기 ESCC 환자 (1 단계)와 건강한 대조군 (AUC = 0.81)을 구별하였고, 이는 임상 혈청 마커(clinical serological marker), SCC-Ag (AUC = 0.63)보다 우수하였다(p 값 = 0.02.) 현재까지 분석된 ESCC 환자의 잠재적으로 가장 큰 코호트에서 통합적이고 포괄적인 바이오마커 발견 및 검증 접근법을 사용하여, 본 발명자들은 ESCC의 조기 발견을 위한 신규의 강력한 (robust) miRNA-기반 패널을 개발하고 검증하였다.

A. 재료 및 방법

1. 데이터 출처

ESCC 작은(small) RNA-Seq 데이터세트 및 상응하는 임상 데이터는 암 게놈 아틀라스(The Cancer Genome Atlas, TCGA) 데이터 포털로부터 다운로드되었다. TCGA 데이터세트는 98 개의 단계 I-IV ESCC 조직과 13 개의 정상 식도 점막을 포함 하였다. ESCC miRNA 마이크로어레이 데이터세트는 접근 코드(accession codes) GSE55856(108 개의 단계 I-IV ESCC 조직과 108 개의 인접한 정상 식도 조직) 및 GSE43732(119 개의 단계 I-IV ESCC 조직 및 119 개의 인접한 정상 식도 조직)를 갖는 GEO(Gene Expression Omnibus)로부터 수득하였다.

Affymetrix Multispecies miRNA 2.0 어레이 플랫폼 array platform (Affymetrix, Santa Clara, California, USA)이 GSE55856에 사용되었고, Agilent-038166 cbc Human miRNA18.0 마이크로어레이 플랫폼 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)이 GSE43732에 사용되었다.

2. 임상 표본

ESCC 혈청 샘플 559 개, 건강한 혈청 샘플 240 개, ESCC 조직 샘플 32 개 및 인접한 정상 식도 점막 32 개를 포함하여 총 863 개의 임상 표본(clinical specimens)이 2001년과 2016년 사이에 수집되었다. 조직 유효성 검사(tissue validation)를 위해, 수술 전 치료 없이, ESCC에 대한 식도 절제술을 시행한 환자로부터 32 개의 단계 I-III ESCC 조직과 32 개의 정합된(matched) 상응하는 정상 식도 점막 조직이 수집되었다. 첫째, 혈청 정제 코호트(serum refining cohort)의 경우, 2009년과 2011년 사이에 일본 구마모토의 구마모토대학교 병원(Kumamoto University Hospital)에서 50 개의 단계 I-III ESCC 혈청 샘플과 50 명의 건강한 대조군을 수집하였다. 다음으로, 혈청 트레이닝 코호트의 경우, 발명자들은 2001년부터 2015년 사이에 남아프리카 공화국의 케이프 타운에 있는 Groote Schuur Hospital로부터 280 개의 단계 I-IV ESCC 혈청 샘플 및 128 명의 건강한 대상자들을 수집하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 2012년에서 2016년 사이에 구마모토 대학 병원에서 수집한 106 개의 단계 ESCC 혈청 샘플 및 20 개의 건강한 대조군을 포함하는 혈청 검증(validation) 코호트 1과, 2001년에서 2015년 사이에 일본 나고야에 있는 나고야 대학교 병원에서 수집한 123 개의 단계 I-III ESCC 혈청 샘플 및 42 개의 건강한 대조군을 포함하는 혈청 검정 코호트 2를 수집하였다. 모든 절차는 각 병원의 기관 검토 위원회 (Institutional Review Boards)에 의해 승인되었으며 각 참가자로부터 서면 동의를 얻었다. 각 참가자의 전혈 샘플을 치료(treatment) 전에 수집하고 수집 후 12 시간 이내에 3000g에서 10 분간 처리했다. 그런 다음, 세포 파편을 완전히 제거하기 위하여, 무-세포(cell-free) 혈청을 10,000 g에서 2 분간 원심 분리하여 추가로 용해시켰다. 혈청 샘플은 사용하기 전까지 -80℃에서 RNase-프리(free) 에펜도르프(eppendorf) 튜브에 보관하였다.

3. 연구 설계

연구 설계 (도 16)는 다음 단계를 포함한다 : (1) 인 실리코(In silico) 발견 단계. 3 개의 조직 기반 miRNA 발현 데이터 세트 (TCGA, GSE55856, GSE43732)는 강력한 (rubust) miRNA 패널을 발견하는데 사용되었다. 각 데이터세트에서 유의하게 과발현된 miRNA가 각 데이터세트로부터 먼저 확인되었다(기준 : log2 배수-변화(fold-change)> 0.5, FDR 보정된(adjusted) p 값 <0.05, ESCC에서 상향 조정, AUC> 0.7, 평균 miRNA 발현 수준은 모든 차별 발현된 miRNA의 중간 값보다 크다). 3개의 데이터 세트에서 공통적으로 확인된 18 개의 miRNA가 후보 miRNA로 선택되었다. (2) 조직 검증 단계. 18 개의 후보 miRNA의 발현 수준은 qRT-PCR에 의해 32 개의 ESCC 조직 샘플 및 32 개의 인접한 정상 조직에서 qRT-PCR에 의해 평가되었다. 모든 후보 miRNA는 ESCC 조직 샘플에서 유의하게 상향 조절되었다 (p 값 <0.05). (3) 혈청 정제 단계. 진단 miRNA 패널을 개발하기 위해, 본 발명자는 연령, 성별 및 인종이 일치하는 50 명의 ESCC 환자 및 50 명의 건강한 대조군을 포함하는 혈청 정제 코호트를 사용하여 혈청 내 18 개의 후보 miRNA의 발현 수준을 평가 하였다. ESCC 혈청 시료에서 8 개의 miRNA가 유의하게 상향 조절되었고 (p 값 <0.05), 다음 분석을 위해 선택되었다. (4) 혈청 트레이닝 및 검증 단계. 결과적으로 우리는 다변수 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 남아프리카 Groote Schuur Hospital의 280 명의 ESCC 환자와 128 명의 건강 대조군을 대상으로 한 혈청 트레이닝 코호트를 사용하여 ESCC 진단에 대한 위험 점수 부여 공식을 확립하였다. 또한, 본 발명자들은 혈청 검증 코호트 1 (구마모토 대학교 병원의 ESCC 환자 106 명과 건강한 대조군 20 명) 및 혈청 검증 코호트 2 (나고야 대학교 병원의 123 명의 ESCC 환자 및 42 명의 건강 대조군)를 사용하여 8-miRNA 패널의 진단적 가치를 확인하였다. 본 발명자는 miRNA 시그니처 모델을 이용하여 민감도, 특이도, 곡선 아래 면적 (AUC) 및 상응하는 95 % 신뢰 구간에 의해 트레이닝, 검증 1 및 검증 2 코호트에 대한 진단 성능을 평가하였다. 모든 혈청 코호트의 경우, 위험 점수는 logistic function 1 / (1 + exp (- 선형 예측 인자))를 사용하여 계산되며, 컷오프(cutoff)는 트레이닝 코호트의 Youden's 인덱스이다: 0.582. 본 발명자들은 또한 혈청 검증 코호트 2에 혈청 SCC-Ag를 포함시킴으로써 ESCC의 예측 성능을 테스트하였다.

4. 조직으로부터의 RNA 분리

제조사의 프로토콜에 따라 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 작은 RNA를 포함하는 총 RNA를 조직으로부터 분리하고, QIAcube 반-자동화 로봇 장치 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 30 μL의 RNase-프리 워터에 용리하였고 NanoDrop 분광 광도계 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE)를 사용하여 정량화하고 추가 사용을 위해 -80 ℃에서 보관하였다.

5. 혈청으로부터의 RNA 분리

작은 RNA는 Qiagen miRNAeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen)를 사용하여 모든 혈청 샘플로부터 농축되었다. 간단히 말하면, 혈청 샘플을 얼음 위에서 해동시키고 10,000 rpm에서 5 분간 원심 분리하여 세포 파편을 제거하였다. 다음에, 200 μL의 상청액을 1000 μL의 Qiazol Lysis Reagent에서 용해시켰다. RNA 분리 과정 동안 샘플 간(sample-to-sample) 편차의 정규화를 위해, 25 fmol의 합성 C. elegans miRNA (cel-miR-39, Qiagen)를 각 변성된 샘플에 첨가하였다. 작은 RNA를 포함한 총 RNA를 추출하여 QIAcube 반자동화 장치 (Qiagen)를 사용하여 RNase-프리 워터 30 μL에서 용리시키고 이후 사용을 위해 -80 ℃에서 보관하였다.

6. 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)

miRNA-기반 RT-PCR 분석을 위해, 조직/혈청 샘플로부터의 농축된 소형 RNA 1.2 μL를 TaqMan MicroRNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)를 사용하여 총 반응 부피 6 μL에서 하기 조건으로 역전사시켰다: 16℃에서 30분간, 42℃에서 30분간, 85 ℃에서 5분간 및 4 ℃로 유지. 실시간 PCR은 MicroRNA Assay Kits와 TaqMan Universal Master Mix II, no UNG (Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다. miRNA의 정량화를 위한 PCR 반응은 QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System (Applied Biosystems)을 사용하여 다음 순환 조건으로 수행되었다: 95 ℃에서 10 분간, 이후 95 ℃에서 15 초간, 60 ℃에서 1 분간 40 회 반복. 결과는 2^-ΔΔCt로 표현되었다. 조직 표본에서, 결과는 U6 (Ambion, Austin, TX)로 정규화되었고, 혈청 표본에서, 결과는 내부 내인성 대조군 miR-16으로 정규화되었다.

7. 통계 분석

2 개의 정합된 페어(pair) 그룹 사이 또는 2 개의 독립적인 샘플 그룹 사이의 차별적인(differential) miRNA 발현의 통계적 유의성을 정량하기 위해, 대응표본 t 테스트 (paired t test) 및 양측 독립표본 t-테스트 (two-sided student’s t-test)가 각각 사용되었다. 모든 p 값은 양측(two-sided) 이었고 p-값 < 0.05 는 유의 한 것으로 간주되었다. ROC(Receiver operating characteristic) 곡선을 생성하고 95 % 신뢰 구간 (CI)을 갖는 ROC 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하여 miRNA의 차별 성능을 평가하였다. ESCC 진단을 위해, 8 개의 시그니처 miRNA의 발현 수준에 기초하여 암 위험을 예측하기 위한 다변량 로지스틱 회귀 모델을 트레이닝하였다. 모든 통계 분석은 Medcalc 통계 소프트웨어 (v.12.7.7, Medcalc Software bvba, Ostend, Belgium), JMP 소프트웨어 (10.0.2., SAS Institute, Cary, NC, USA) 및 R (3.3.3, R Development Core Team, https://cran.r-project.org/)를 사용하여 수행하였다.

B. 결과

1. 대상(subject)의 특성

ESCC 혈청 샘플에는 절제 가능한 종양이 있는 환자 (n = 538)에 대한 수술 전 모든 전처치(pretreatment) 샘플 및 절제 불가능한 종양이 있는 환자 (n = 21)에 대한 화학요법 전의 모든 전처치 샘플이 포함되었다. 또한 건강한 대조군에서 총 240 개의 혈청 샘플을 얻었다. 연령 분포에 유의한 차이가 없었으며 혈청 정제 코호트, 혈청 트레이닝 코호트 및 혈청 검증 코호트 1에서 ESCC 환자와 건강 대조군간에 인종 및 성별에 있어서 유의한 차이는 없었으며, 건강한 참가자의 샘플링 제한으로 인해, 혈청 검증 코호트 2 에서 ESCC 환자와 건강한 참가자간에 연령에 있어서 유의한 차이가 있었다(평균 차이, 26.7 세 [95 % CI, 26.4 - 28.9 세]).

2. ESCC와 관련된 miRNA 패널 후보의 동정

도 16의 플로우 차트는, 전반적인 연구 설계를 도시한다. 발견 단계에서, 본 발명자는 miRNA 패널 후보의 우선 순위를 매기기 위하여 세 가지 조직 기반 miRNA 발현 데이터세트 (TCGA, GSE55856, GSE43732)를 조사하였다. 각 데이터세트에서, miRNA가 다음과 같은 경우 잠재적 후보로 간주된다: (1) ESCC와 정상 샘플간에 차별적으로 발현됨 (log2 배수-변화 > 0.5, FDR- 보정된 p 값 < 0.05); (2) ESCC 및 정상 샘플간 변별됨 (AUC> 0.7); (3) ESCC에서 상향 조절되고 임상에서의 검출을 용이하게하는 상대적으로 높은 발현을 가짐 (평균 발현> 모든 차별적으로 발현된 miRNA의 평균 발현의 중앙값). 결과적으로, TCGA, GSE55856 및 GSE43732 데이터세트로부터 각각 79, 431 및 136 개의 miRNA가 동정되었으며, 그 중 3 개의 데이터세트 사이에서 중첩된 18 개의 miRNA가 miRNA 패널 후보로서 우선 순위로 선정되었다(도 13A). 18-miRNA 패널의 진단적 가치를 평가하기 위해 두 가지 다른 전략이 사용되었다. (1) 각각의 코호트 내에서, 2 배 교차 검증 (100 회 반복)을 갖는 다변수 로지스틱 회귀는 항내성(robust) 진단 값을 나타내었다(각각, 평균 AUC = 0.98, 0.99, 0.98)(도 13B, 13C). (2) GSE55856에서 트레이닝된 다변량 로지스틱 회귀 모델은 세가지 데이터세트 모두에서 높은 예측 성능을 달성하였다(각각, AUC = 0.99, 1.00, 0.99) (데이터는 표시되지 않음). 또한, 본 발명자들은 32 개의 ESCC 및 정합된 인접한 32 개의 정상 조직에서 qRT-PCR을 수행하였고, ESCC 임상 조직 샘플에서 18 개의 모든 miRNA가 상당히 상향 조절(p 값 <0.05) 되었다는 것을 확인하였다(도 17).

3. ESCC의 예측을 위한 순환 miRNA 패널의 수립.

혈청 정제 코호트 (50 ESCC, 50 개의 건강한 대조군)를 사용하여, 본 발명자는 순환 miRNA 패널을 개발하기 위해 18 개의 조직-유래 후보 물질을 정제하는 것을 다음 목표로 하였다. 총 18 명의 후보 중에서 검출 한계 (평균 사이클 임계 값> 35) 미만의 4 개의 miRNA (miR-182, miR-183, miR-18a, miR-505)는 제외되었다. ESCC 혈청에서 다른 14개의 검출 가능한 miRNA 중, 8 개 (miR-103, miR-106b, miR-151, miR-17, miR-181a, miR-21, miR-25, miR-93)가 ESCC 혈청에서 유의하게 상향 조절되었다(도 14). 본 발명자들은 이어서 혈청 트레이닝 코호트 (208 ESCC, 128 건강한 대조군)에서 8 개의 miRNA에 대해 qRT-PCR을 수행하고, 다변량 로지스틱 회귀 모델을 트레이닝시켰다. 위험 점수 계산 공식은 다음과 같이 다변수 모델로부터 유도되었다: logit(P) = 0.209*miR21 + 0.968*miR93 + 0.454*miR106b + 3.753*miR17 - 8.505*miR181a + 4.149*miR25 -1.375*miR103 - 3.278*miR151 - 0.998. 트레이닝 코호트에서, 8-miRNA 모델은 0.83 (95 % CI, 0.79-0.87)의 AUC, 78 %의 민감도 및 75 %의 특이도를 달성하였다 (도 15A).

4. 두 개의 검증 코호트에서 순환 miRNA 패널의 진단 성능

8-miRNA 패널의 진단적 가치를 확인하기 위해, 본 발명자들은 2 개의 추가적인 독립 혈청 코호트에 대해 qRT-PCR을 수행하였다: 혈청 검증 코호트 1 (ESCC 환자 106 명, 건강한 대조군 20 명), 혈청 검증션 코호트 2 (123 명의 ESCC 환자, 건강한 대조군 42 명). 각 코호트에 대하여, 본 발명자는 8-miRNA 모델을 사용하여 위험 점수를 계산하고, 혈청 트레이닝 코호트로부터 유도된 상응하는 컷오프 값 (0.582)을 사용하여 고위험 또는 저위험 그룹을 결정하였다. 8-miRNA 모델은 혈청 검증 코호트 1 (도 15B, AUC : 0.80, 95 % CI : 0.69-0.91, 민감도 : 89 %, 특이도 : 60 %) 및 혈청 검증 코호트 2 (도 15C, AUC : 0.89, 95 % CI : 0.83-0.94, 민감도 : 87 %, 특이도 : 85 %)에 대하여 항내성의 예측 성능을 달성하였다. 중요한 것은, 종래의 종양 표지자인 편평 세포 암종-관련 항원 (SCC-Ag)이 혈청 검증 코호트 2 (123 명의 단계 I-IV ESCC 환자 VS 42 명의 건강한 대조군)에서 보여준 ESCC 진단 값 (AUC : 0.71, 95 % CI : 0.60-0.84, 민감도 : 0.91, 특이도 : 0.69)에 비해, 8-miRNA 모델은 유의하게 높은 진단 성능을 보였다(p-값 = 0.003, DeLong’s 테스트). 특히, 8-miRNA 패널은 건강한 대조군 (n = 42) (AUC : 0.81, 95 % CI : 0.70-0.94, 민감도 : 0.76, 특이도 : 0.91)과 단계 I 의 ESCC 환자 (n = 20)를 구별할 수 있고, 이는 SCC-Ag (AUC = 0.63, 95 % CI : 0.50-0.78, 민감도 : 0.75, 특이도 : 0.69)보다 우수하다(p 값 = 0.025, DeLong’s 테스트). 이 검증 결과는 병원에서 ESCC의 비-침습적 검출을 위한 강력한 바이오 마커로서 8-miRNA 모델을 사용할 유망한 가능성을 보여 주었다.

C. 논의

ESCC는 예후가 좋지 않은 가장 공격적인 암 중 하나이며, 환자의 낮은 생존율은 주로 진단 지연에 기인한다. 따라서 ESCC의 조기 발견은 환자 치료 결과를 개선하기 위해 효과적인 치료법과 시기 적절한 개입을 시행할 수 있는 기회를 제공한다. 그러나 현재 ESCC 진단을 위한 임상적으로 실행 가능한 분자 마커는 없다. 이 연구에서, 본 발명자는 3 개의 인 실리코(in silico) 데이터세트로부터 후보 miRNA를 동정하기 위하여 생물 정보학 접근법을 이용하였다. 본 발명자들은 혈청에서 이들 miRNA의 발현을 평가하고 ESCC에 대한 비-침습성 진단 마커로서 확고한 miRNA 패널을 확립하고 3 개의 독립적인 코호트에서 검증 하였다. 흥미롭게도, 초기 ESCC 환자에 대해서 조차도, 본 발명자들은 miRNA 패널이 ESCC의 가장 일반적으로 사용되는 혈청 진단 마커인 SCC-Ag보다 현저하게 우수한 검출능을 가짐을 보여주었다. 결론적으로, 3 개의 독립적인 검증 코호트로 포괄적인 바이오마커 발견 프로세스를 사용하여 처음으로 ESCC의 조기 발견을 위한 새롭고 강력한 miRNA-기반 패널을 개발하고 성공적으로 검증했으며,이는 미래에 ESCC 환자의 비침습적 진단법을 변형시킬 잠재성을 가지고 있다.

* * *

본원에 개시되고 청구된 방법 모두는 본 개시 내용에 비추어 과도한 실험없이 행해질 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 바람직한 양태로 설명하였지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않는 한, 본 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음는 당업자에 자명하다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 관련있는 특정 제제가 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 경우 본원에 기재된 제제를 대체 할 수 있음은 자명할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다. 본 명세서 전반에 걸쳐 언급된 모든 참고 문헌 및 출판물은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.

Claims

식도암으로 판정된 환자를 치료하는 방법으로서,
상기 환자에게 식도암 치료제를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 환자는, 대조군 샘플에서의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준에 비교하여, 환자로부터의 샘플에서 miR-103, miR-106b, miR-151, miR-17, miR-181a, miR-21, miR-25, 및 miR-93으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준이 상승된 것으로 판정된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 환자로부터의 샘플은 혈청 샘플인 것인 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 식도암은 식도 편평-세포 암종(ESCC)인 것인 방법.
환자에서 식도암(EC)을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는 것인 방법:
대조군 샘플에서의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준과 비교하여, 환자로부터의 샘플에서 mir-15b, miR-17, mir-18a, mir-21, mir-23a, mir-24-2, mir-25, mir-27a, mir-93, mir-103, mir-106b, mir-129-2, mir-139, mir-146b, mir-148a, mir-151, miR-155, mir-181a-1, mir-181a, mir-181b-1, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-192, mir-194-1, mir-194-2, mir-196a-1, mir-196a-2, mir-196b, mir-205, mir-215, mir-223, mir-224, mir-335, mir-338, mir-375, mir-421, mir-484, mir-505, mir-769, mir-944, mir-1468, mir-3648, 및 let-7i로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 상승 또는 감소된 것으로 판정되면 식도암 환자로 진단하는 단계; 및
상기 진단된 환자에게 유효량의 식도 치료제를 투여하는 단계.
식도암으로 판정된 환자를 치료하는 방법으로서,
상기 환자에게 식도암 치료제를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 환자는, 대조군 샘플에서의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준과 비교하여, 환자로부터의 샘플에서 mir-15b, miR-17, mir-18a, mir-21, mir-23a, mir-24-2, mir-25, mir-27a, mir-93, mir-103, mir-106b, mir-129-2, mir-139, mir-146b, mir-148a, mir-151, miR-155, mir-181a-1, mir-181a, mir-181b-1, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-192, mir-194-1, mir-194-2, mir-196a-1, mir-196a-2, mir-196b, mir-205, mir-215, mir-223, mir-224, mir-335, mir-338, mir-375, mir-421, mir-484, mir-505, mir-769, mir-944, mir-1468, mir-3648, 및 let-7i로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 상승 또는 감소된 것으로 판정된 환자인 것인 방법.
다음을 포함하는, 식도암 환자를 진단하는 방법:
환자로부터의 샘플에서 mir-15b, miR-17, mir-18a, mir-21, mir-23a, mir-24-2, mir-25, mir-27a, mir-93, mir-103, mir-106b, mir-129-2, mir-139, mir-146b, mir-148a, mir-151, miR-155, mir-181a-1, mir-181a, mir-181b-1, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-192, mir-194-1, mir-194-2, mir-196a-1, mir-196a-2, mir-196b, mir-205, mir-215, mir-223, mir-224, mir-335, mir-338, mir-375, mir-421, mir-484, mir-505, mir-769, mir-944, mir-1468, mir-3648, 및 let-7i로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 판정하는 단계; 및
상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준에 기초하여 식도암을 진단하는 단계.
청구항 6에 있어서, 상기 하나 이상의 검출된 miRNA의 발현 수준이 대조군 샘플과 비교하여 유의하게 상이할 경우, 상기 환자는 EC로 진단되는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 환자로부터 샘플을 얻는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 대조군과 비교하여 상승된 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 대조군과 비교하여 감소된 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 비-EC 환자 샘플에서의 하나 이상의 miRNA의 수준인 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 환자로부터의 샘플에서 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 판정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군 샘플은 비-암성 생물학적 샘플인 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA는 mir-21, mir-93, mir-103 , mir-151, mir-25, mir-106b, mir-27a, miR-17 및/또는 mir-181a 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA는 mir-93을 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA는 mir-93 및 mir-21을 포함하는 것인 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA는 mir-103, mir-106b, mir-151, mir-17, miR-181a, mir-21, miR-25, 및 mir-93 중에서 적어도 2개를 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA는 mir-181a, mir-21, 및 mir-17를 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 14, 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA는 mir-181a, mir-17, mir-21, 및 mir-27a를 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA는 mir-21, mir-93, 및 mir-27a를 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA는 mir-205를 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA는 let-7i, mir-103, mir-106b, mir-17, mir-151, mir-155, mir-181a, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-18a, mir-21, mir-223, mir-23a, mir-25, mir-484, mir-505, 및 mir-93을 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식도암은 식도 편평-세포 암종 (ESCC)인 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA는 mir-196a-1, mir-196b, 및/또는 mir-21를 포함하는 것인 방법.
청구항 24에 있어서, 상기 식도함은 식도 선암(EAC)인 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자 샘플 및/또는 대조군 샘플은 조직 샘플인 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자 샘플 및/또는 대조군 샘플은 혈청 샘플인 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식도암 치료는 화학 요법, 방사선 요법, 수술 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
청구항 28에 있어서, 상기 화학 요법은 카보플라틴, 파클리탁셀, 시스플라틴, 5-플루오로우라실, 에피루비신, 도세탁셀, 세페시타빈, 옥살리플라틴 및 이들의 조합물을 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 환자로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 환자로부터의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 대조군 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 더 포함하는 것인 방법. .
청구항 4 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 단계 I, IA, IB, II, IIA, IIB, III, IIIA, IIIB, IIIC 또는 IV의 식도암을 갖거나 또는 갖는 것으로 판정된 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자로부터의 생물학적 샘플은 원발 종양으로부터의 샘플인 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식도암은 카테고리 T1, T2, T3 또는 T4 식도암을 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식도암은 카테고리 N0, N1, N2 또는 N3 식도암을 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식도암은 카테고리 M0 또는 M1 식도암을 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식도암은 림프절 전이를 포함하는 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식도암은 원격 전이를 포함하는 것인 방법.
청구항 38에 있어서, 상기 원격 전이는 페, 간 및/또는 골 전이인 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 39 중 어느 한 항에 있어서, 발현 수준의 상승 또는 감소가 컷-오프 값으로부터 판정된 것인 방법.
청구항 40에 있어서, 상기 컷-오프 값은 ROC 분석에 의해 판정된 것인 방법.
청구항 4 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 이전에 식도암에 대해 치료된 것인 방법.
mir-15b, mir-17, mir-18a, mir-21, mir-23a, mir-24-2, mir-25, mir-27a, mir-93, mir-103, mir-106b, mir-129-2, mir-139, mir-146b, mir-148a, mir-151, miR-155, mir-181a-1, mir-181a, mir-181b-1, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-192, mir-194-1, mir-194-2, mir-196a-1, mir-196a-2, mir-196b, mir-205, mir-215, mir-223, mir-224, mir-335, mir-338, mir-375, mir-421, mir-484, mir-505, mir-769, mir-944, mir-1468, mir-3648, 및 let-7i로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 검출용 제제를 포함하는 키트.
청구항 43에 있어서, 상기 제제는 생물학적 샘플로부터의 miRNA를 증폭하기 위한 하나 이상의 핵산 프로브를 포함하는 것인 키트.
청구항 43 또는 44에 있어서, 상기 제제는 표지된 것인 키트.
청구항 43 내지 45 중 어느 한 항에에 있어서, 사용 설명서를 더 포함하는 것인 키트.
EC-차별 발현된 miRNA 검출용 제제를 포함하는 키트로서, 상기 차별 발현된 miRNA는 mir-21, mir-93, mir-106b, mir-27a, miR-17 및 mir-181a로 이루어진 것인 키트.
EC-차별 발현된 miRNA 검출용 제제를 포함하는 키트로서, 상기 차별 발현된 miRNA는 mir-103, mir-106b, mir-151, mir-17, mir-181a, mir-21, mir-25, 및 mir-93으로 이루어진 것인 키트.
EC-차별 발현된 miRNA 검출용 제제를 포함하는 키트로서, 상기 차별 발현된 miRNA는 let-7i, mir-103, mir-106b, mir-17, mir-151, mir-155, mir-181a, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-18a, mir-21, mir-223, mir-23a, mir-25, mir-484, mir-505, 및 mir-93으로 이루어진 것인 키트.
EC-차별 발현된 miRNA 검출용 제제를 포함하는 키트로서, 상기 차별 발현된 miRNA는 mir-205로 이루어진 것인 키트.
EC-차별 발현된 miRNA 검출용 제제를 포함하는 키트로서, 상기 차별 발현된 miRNA는 mir-196a-1로 이루어진 것인 키트.
EC-차별 발현된 miRNA 검출용 제제를 포함하는 키트로서, 상기 차별 발현된 miRNA는 mir-196b로 이루어진 것인 키트.
EC-차별 발현된 miRNA 검출용 제제를 포함하는 키트로서,상기 차별 발현된 miRNA는 mir-21로 이루어진 것인 키트.
청구항 47 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대조군을 검출하기 위한 하나 이상의 제제를 더 포함하는 것인 키트.
청구항 43 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 생물학적 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 시약을 추가로 포함하는 것인 키트.
청구항 55에 있어서, 상기 시약은 혈청 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 것인 키트.
환자에서 하나 이상의 miRNA를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는 것인 방법:
인간 환자로부터 샘플을 수득하는 단계;
miRNA 검출제와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 상기 샘플에서 하나 이상의 miRNA 발현의 증가 또는 감소 여부를 검출하는 단계; 및
상기 하나 이상의 miRNA가 mir-15b, miR-17, mir-18a, mir-21, mir-23a, mir-24-2, mir-25, mir-27a, mir-93, mir-103, mir-106b, mir-129-2, mir-139, mir-146b, mir-148a, mir-151, miR-155, mir-181a-1, mir-181a, mir-181b-1, mir-181b, mir-182, mir-183, mir-192, mir-194-1, mir-194-2, mir-196a-1, mir-196a-2, mir-196b, mir-205, mir-215, mir-223, mir-224, mir-335, mir-338, mir-375, mir-421, mir-484, mir-505, mir-769, mir-944, mir-1468, mir-3648, 및 let-7i로부터 선택되는 것인, 방법.
청구항 57에 있어서, 상기 방법은 환자로부터의 샘플에서 상기 하나 이상의 miRNA가 상승될 때 환자에게 식도암을 치료하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
청구항 57 또는 청구항 58에 있어서, 상기 방법은 환자로부터의 샘플에서의 miRNA의 발현 수준과 대조군 샘플에서의 miRNA의 발현 수준을 비교하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 57 내지 59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 혈청 샘플을 포함하는 것인 방법.
청구항 59 내지 60 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군 샘플은 식도암(EC)이 없는 인간 환자로부터의 생물학적 샘플을 포함하는 것인 방법.
청구항 57 내지 61 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 환자는 식도암을 갖는 것으로 의심되는 것인, 방법.