WO2021162065A1 - 食道扁平上皮癌の検出を補助する方法 - Google Patents

食道扁平上皮癌の検出を補助する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021162065A1
WO2021162065A1 PCT/JP2021/005110 JP2021005110W WO2021162065A1 WO 2021162065 A1 WO2021162065 A1 WO 2021162065A1 JP 2021005110 W JP2021005110 W JP 2021005110W WO 2021162065 A1 WO2021162065 A1 WO 2021162065A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
esophageal squamous
esophageal
cell carcinoma
cancer
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/005110
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
栄俊 田原
Original Assignee
国立大学法人広島大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人広島大学 filed Critical 国立大学法人広島大学
Priority to JP2022500456A priority Critical patent/JPWO2021162065A1/ja
Publication of WO2021162065A1 publication Critical patent/WO2021162065A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a method for assisting the detection of esophageal squamous epithelial cancer.
  • Esophageal cancer is a common carcinoma with a poor prognosis all over the world.
  • improvement has been observed due to the development of treatment technology and perioperative management, the treatment results are still poor, and it has been reported that the 5-year survival rate is about 20% even in developed countries (Non-Patent Document 1).
  • One of the causes of poor prognosis for esophageal cancer is that many patients are found in the advanced stage (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Documents 3 and 4 On the other hand, in the case of early esophageal cancer, especially mucosal cancer, almost all patients can be expected to be cured by endoscopic treatment.
  • MicroRNAs are small RNAs consisting of 19-25 base pairs and are classified as non-coding RNAs that do not encode proteins. MicroRNAs are known to have many effects by controlling multiple messenger RNAs, and in particular, microRNAs possessed by cancer cells have the function of promoting cancer progression and avoiding tumor suppressor mechanisms. It has been clarified to have. MicroRNAs exist stably in the state of being encapsulated in exosomes, and these "circulating" microRNAs are used as communication tools between cells and tissues and are important for creating favorable conditions for cancer progression and metastasis. Plays a role. Since the expression profiles of cancer patients and healthy subjects are significantly different, circulating microRNAs are expected to be put into practical use as diagnostic biomarkers for cancer. In fact, many carcinomas have been investigated, and there are multiple reports on esophageal cancer (Non-Patent Documents 8 to 12).
  • NGS next-generation sequencer
  • Isoforms of these microRNAs are slightly different in number of bases and sequences from mature microRNAs and are called isomiRs.
  • isomiR Although the function of isomiR has not been completely clarified, it is considered to have an important role in cancer progression as well as mature microRNA (Non-Patent Documents 13 and 14).
  • a novel miR-451a isomiR associated with amelanotypic phenotype, acts as a tumor suppressor in melanoma by retarding cell migration and invasion.
  • Nejad C, Pillman KA, Siddle KJ, Pepin G, Anko ML, McCoy CE, et al. MiR-222 isoforms are differentially regulated by type-I interferon. RNA. 2018; 24: 332-41.
  • An object of the present invention is to provide a novel method for assisting the detection of esophageal squamous epithelial carcinoma, which has high specificity and can accurately detect esophageal squamous epithelial carcinoma.
  • the present invention has been completed by finding that miRNAs or isoform miRNAs of the above are significantly increased in patients with esophageal squamous epithelial cancer.
  • the base sequences contained in the test sample isolated from the living body are SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13.
  • the present invention provides a novel method for assisting the detection of esophageal squamous epithelial carcinoma, which has high specificity and can detect esophageal squamous epithelial carcinoma relatively accurately.
  • the mean value of Panel Index was significantly higher in the esophageal squamous epithelial cancer patient group than in the healthy group (13.3 ⁇ 8.9 vs. 3.1 ⁇ 1.3, p ⁇ 0.001).
  • the cutoff value of Panel index was 4.0, the sensitivity and specificity were 93.8% and 81% (A).
  • the Panel Index was significantly higher in the esophageal squamous cell carcinoma patient group than in the healthy group (16.8 ⁇ 21.2 vs. 3.6 ⁇ 1.3, p ⁇ 0.001), and when the same cutoff value was used. Sensitivity and specificity were 88.9% and 72.2% (B). It is a figure which shows the comparison of the Panel Index in the esophageal adenocarcinoma, severe dysplasia, and esophageal squamous epithelial cancer patients obtained in the following Examples.
  • the average value of the Panel Index of patients with esophageal adenocarcinoma was 4.2 ⁇ 1.7, and that of patients with severe dysplasia was 6.2 ⁇ 4.5, which was significantly lower than that of patients with esophageal squamous epithelial cancer (14.1 ⁇ 13.3), while that of the healthy group. No significant difference was observed (3.2 ⁇ 1.3).
  • the Panel Index of the esophageal squamous epithelial cancer patient group is shown in a boxplot by clinical stage (A) and pathological stage (B). The values were significantly higher than those in the healthy group at all stages.
  • Clinical stage IV (31.2 ⁇ 28.9) tends to be higher than other stages [stage I (11.4 ⁇ 6.3), stage II (13.8 ⁇ 7.2), stage III (12.8 ⁇ 11.7)]. There was, but no significant difference was found.
  • Pathological stage IV (27.3 ⁇ 17.8) is also from other stages [stage IA (10.9 ⁇ 7.2), stage IB (12.8 ⁇ 6.2), stage II (10.9 ⁇ 6.1), stage III (8.8 ⁇ 6.6) The value was high, but no significant difference was observed.
  • the preoperative Panel Index of 4 patients with postoperative recurrence was set to 1.0, showing changes over time. In all cases, it decreased after treatment compared with before treatment, and in 3 cases, it increased again at the time of recurrence. It is a figure which shows the diagnostic usefulness of miR / isomiR used for the diagnostic panel obtained in the following Example.
  • miR-574-3p 3'deletion A
  • miR-205-5p 3'deletion G
  • miR-30a-5p C
  • the ROC curve showing the diagnostic accuracy is shown.
  • miRNA or the like As described above, in the method of the present invention, the presence of a specific miRNA or isoform miR (isomiR) (hereinafter, may be referred to as “miRNA or the like” for convenience) contained in the test sample isolated from the living body. Use the amount as an index.
  • miRNAs and the like are known, and their nucleotide sequences are as shown in the sequence listing. A list of miRNAs and the like used in the method of the present invention is shown in Table 1 below.
  • test sample is not particularly limited as long as it is a body fluid containing miRNA or the like, but a blood sample (including plasma, serum and whole blood) is usually preferably used. Methods for extracting total RNA in serum or plasma are well known and are specifically described in the Examples below.
  • next-generation sequencer It is preferable to measure (quantify) the abundance of each miRNA, etc. using a next-generation sequencer.
  • the model is not limited as long as it is a device that reads an array such as a next-generation sequencer.
  • cut-off value of the abundance of each miRNA or the like used for the determination there is a statistically significant difference (p ⁇ 0.05, preferably p ⁇ 0.01, more preferably p ⁇ 0.01 in the t-test) for each miRNA or the like with respect to healthy subjects. It is preferable to use the presence or absence of 0.001) as a reference. Specifically, for example, the number of log2 reads (cutoff value) at the plot point where the false positive rate is the best value (the lowest value) can be set for each miRNA or the like. Examples of cut-off values for the abundance of each miRNA and the like are shown in Table 1 above.
  • the cutoff values shown in Table 1 are merely examples, and other values can be adopted as the cutoff values as long as there is a statistically significant difference. Also, different populations of patients and healthy individuals for whom data are collected have different best cutoff values. However, usually, the cutoff value can be set within the range of ⁇ 20% of the cutoff value shown in Table 1, particularly within the range of ⁇ 10%.
  • esophageal squamous epithelial carcinoma can be treated.
  • Methods for treating esophageal squamous epithelial cancer include surgery (including surgery using an endoscope), anticancer drug treatment such as cisplatin and 5-FU, radiotherapy, and combinations thereof.
  • the treatment strategies of the inventors of the present application were determined according to the clinical stage and the patient's condition.
  • endoscopic resection is performed, and for submucosal cancer without lymph node metastasis, surgery is performed, and adjuvant treatment is performed based on pathological findings.
  • surgery is performed after preoperative treatment if the general condition is good.
  • Curative chemical radiation may be selected if the patient's wishes or general condition are judged to be unsuitable for surgery. If accompanied by distant metastasis, give systemic chemotherapy.
  • RNA extraction After obtaining the consent of the patient, 2 ml of peripheral blood of the preoperative patient (or healthy control) was collected. The sera were separated by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was collected as a serum sample in a new tube and stored at -80 ° C until use. Total RNA was extracted using Qiagen's miReasy according to the protocol.
  • the number of reads of all samples was assumed to be 1 million reads, and each small RNA was compared by the number of reads per 1 million reads (Normalize, standardized).
  • To search for candidates for diagnostic biomarkers we compared the mean read numbers of miR / isomiR detected in the patient and healthy groups (Student t-test).
  • the definition of the diagnostic biomarker was defined as that it can be detected in 90% or more of the samples in the patient group and the healthy group, and that the difference is more than doubled with a significant difference (p ⁇ 0.05) in the comparison of the average values.
  • MiR / isomiR satisfying this definition was examined by multivariate linear regression analysis, and a diagnostic panel for esophageal squamous epithelial cancer was prepared.
  • the Panel index is calculated from the number of readings of miR / isomiR selected for the diagnostic panel and the index indicating the importance of each miR / isomiR produced as a result of multivariate analysis.
  • ROC curves showing the accuracy of diagnosis of esophageal squamous epithelial carcinoma were created for miR / isomiR and Panel index selected for the diagnostic panel.
  • Panel Index Relationship with clinical stage and pathological stage
  • Figure 6A shows the Panel Index for each clinical stage in patients with esophageal squamous epithelial cancer.
  • the average values of the Panel Index were 11.4 ⁇ 6.3, 13.8 ⁇ 7.2, 12.8 ⁇ 11.7, and 31.2 ⁇ 28.9 in stages I, II, III, and IV, respectively.
  • stage IV stage IV
  • stage I-III stage IV
  • a similar tendency was observed when the Panel Index was examined for each pathological stage.
  • Patients with clinical stage I tended to have a lower Panel Index than patients with other advanced stages, but were clearly higher than the healthy group.
  • the ROC curve showing the usefulness of diagnosis in stage I patients and healthy groups shows that the AUC is 0.93 (95% CI, 0.85-1.0, p ⁇ 0.001; Fig. 11), and the sensitivity is 91.0% when the cutoff value is 4.0.
  • the specificity was 77.4%.
  • FIG. 8 shows changes over time in the Panel Index of 4 cases with postoperative recurrence. In all 4 cases, a decrease was observed after treatment compared to before treatment, and in 3 cases, a re-elevation was observed at the time of recurrence (Fig. 13).

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

要約　特異度が高く、正確に食道扁平上皮癌を検出することができる、食道扁平上皮癌の検出を補助する新規な方法が開示されている。食道扁平上皮癌の検出を補助する方法は、生体から分離された被検試料中に含まれる、特定の塩基配列を持つmiRNA又はアイソフォームmiRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする方法である。miRNA又はアイソフォームmiRNAの存在量が健常者よりも多いことが、食道扁平上皮癌を発症している可能性が大きいことを示す。

Description

食道扁平上皮癌の検出を補助する方法
　本発明は、食道扁平上皮癌の検出を補助する方法に関する。
　食道癌は世界中で頻度の高く、予後不良の癌腫である。近年、治療技術や周術期管理の発展により改善は認めるものの、治療成績はまだ不良であり、先進国においても5年生存率は20%程度と報告されている（非特許文献１）。食道癌の予後不良の一つの原因として、多くの患者が進行期で発見されることが挙げられる（非特許文献２）。一方で食道早期癌、特に粘膜癌であればほぼ全ての患者が内視鏡治療で治癒が望める（非特許文献３、４）。この事実は特異的な診断バイオマーカーにより早期発見が可能となれば食道癌の大幅な予後の改善が期待できるという事を示唆している。食道癌においては複数の腫瘍特異抗原（SCC（非特許文献５）、CEA（非特許文献６）、CYFRA（非特許文献７）など）が既にバイオマーカーとして実用化されているが、その有用性を評価した検討では特異度の低さを指摘されている。
　マイクロRNAは19-25塩基対からなる小分子RNAでタンパク質をコードしないノンコーディングRNAに分類される。マイクロRNAは複数のメッセンジャーRNAを制御することで多くの作用を持つことが知られており、特に癌細胞が有するマイクロRNAでは癌の進展を促進したり、癌抑制機構を回避したりする機能を有することが明らかにされている。マイクロRNAはエクソソームに内包された状態で安定して存在しており、これら「循環」マイクロRNAは細胞や組織間のコミュニケーションツールとして利用され、癌の進展や転移に有利な状況を作るのに重要な役割を果たしている。癌患者と健常者では発現プロファイルが大きく異なることから、循環マイクロRNAは癌の診断バイオマーカーとして実用化が期待されている。実際多くの癌腫において検討がなされており、食道癌においても複数の報告が存在する（非特許文献８～１２）。
　近年、次世代シークエンサー（NGS）に代表されるディープシークエンス解析の発展によりマイクロRNAに多様性が認められることが明らかにされた。これらマイクロRNAのアイソフォームは成熟型マイクロRNAと比べてわずかに塩基数や配列が異なっており、isomiR（アイソミア）と呼ばれる。isomiRの機能は完全には明らかにされていないが、成熟型マイクロRNAと同様に癌の進展に重要な役割を持っていると考えられている（非特許文献１３、１４）。
Njei B, McCarty TR, Birk JW. Trends in Esophageal Cancer Survival in United States Adults from 1973 to 2009: A SEER Database Analysis J Gastroenterol Hepatol. 2016; 31: 1141-46. Zhang Y. Epidemiology of esophageal cancer. World J Gastroenterol. 2013;19:5598-606. Yamashina T, Ishihara R, Nagai K, Matsuura N, Matsui F, Ito T, et al. Long-term outcome and metastatic risk after endoscopic resection of superficial esophageal squamous cell carcinoma. Am J Gastroenterol. 2013;108:544-51. Probst A, Aust D, Markl B, Anthuber M, Messmann H. Early esophageal cancer in Europe: endoscopic treatment by endoscopic submucosal dissection. Endoscopy. 2015;47:113-21. Shimada H, Nabeya Y, Okazumi S, Matsubara H, Shiratori T, Gunji Y, et al. Prediction of survival with squamous cell carcinoma antigen in patients with resectable esophageal squamous cell carcinoma. Surgery. 2003;133: 486-94 Munck-Wikland E, Kuylenstierna R, Wahren B, Lindholm J, Haglund S. Tumor markers carcinoembryonic antigen, CA 50, and CA 19-9 and squamous cell carcinoma of the esophagus. Pretreatment screening. Cancer. 1988; 62: 2281-6 Brockmann JG, St Nottberg H, Glodny B, Heinecke A, Senninger NJ. CYFRA 21-1 serum analysis in patients with esophageal cancer. Clin Cancer Res. 2010; 6: 4249-52 Zhang C, Wang C, Chen X, Yang C, Li K, Wang J, et al. Expression profile of microRNAs in serum: a fingerprint for esophageal squamous cell carcinoma. Clin Chem. 2010; 56:1871-9. Komatsu S, Ichikawa D, Hirajima S, Kawaguchi T, Miyamae M, Okajima W, et al. Plasma microRNA profiles: identification of miR-25 as a novel diagnostic and monitoring biomarker in oesophageal squamous cell carcinoma.　Br J Cancer. 2014; 111:1614-24. Wu C, Wang C, Guan X, Liu Y, Li D, Zhou X, et al. Diagnostic and prognostic implications of a serum miRNA panel in oesophageal squamous cell carcinoma. PLoS One. 2014; 9:e92292. Zhou X, Wen W, Zhu J, Huang Z, Zhang L, Zhang H, et al. A six-microRNA signature in plasma was identified as a potential biomarker in diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2017;8:34468-80. Huang Z, Zhang L, Zhu D, Shan X, Zhou X, Qi LW, et al. A novel serum microRNA signature to screen esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Med. 2017; 6:109-19. Babapoor S, Fleming E, Wu R, Dadras SS. A novel miR-451a isomiR, associated with amelanotypic phenotype, acts as a tumor suppressor in melanoma by retarding cell migration and invasion. PLoS One. 2014; 9:e107502. Nejad C, Pillman KA, Siddle KJ, Pepin G, Anko ML, McCoy CE, et al. miR-222 isoforms are differentially regulated by type-I interferon.　RNA. 2018; 24:332-41.
　本発明の目的は、特異度が高く、正確に食道扁平上皮癌を検出することができる、食道扁平上皮癌の検出を補助する新規な方法を提供することである。
　本願発明者らは、下記実施例に具体的に記載するように、NGSを用い、食道扁平上皮癌患者及び健常者の血清中の各種小分子RNAの存在量を網羅的に測定した結果、特定のmiRNA又はアイソフォームmiRNAが、食道扁平上皮癌患者において有意に増大することを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1)　生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号２、配列番号７、配列番号１９、配列番号１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１３、配列番号１８、配列番号４、配列番号１１、配列番号５、配列番号２４、配列番号３、配列番号１２、配列番号２０、配列番号６、配列番号１０、配列番号９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号８及び配列番号２１のいずれかで示されるmiRNA又はアイソフォームmiRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする食道扁平上皮癌の検出を補助する方法であって、その存在量が健常者よりも多いことが、食道扁平上皮癌を発症している可能性が大きいことを示す、方法。
(2)　塩基配列が配列番号１９、配列番号２及び配列番号７でそれぞれ示される３種のmiRNA又はアイソフォームmiRNAを指標とする(1)記載の方法。
(3)　前記被検試料が血液試料である、(1)又は(2)記載の方法。
　本発明により、特異度が高く、比較的正確に食道扁平上皮癌を検出することができる、食道扁平上皮癌の検出を補助する新規な方法が提供された。
下記実施例で行った試験の概要を説明する図である。 下記実施例において、診断パネルに用いたmiR/isomiRの健常群、食道扁平上皮癌群のリード数の比較を示す図である。miR-574-3p (3’ deletion A) (A)、 miR-205-5p (3’ deletion G) (B)、miR-30a-5p (C)でそれぞれ箱ひげ図による健常群、食道扁平上皮癌患者群のリード数を表示した。 下記実施例において得られた、第一群、第二群におけるPanel IndexのROC曲線を示す図である。第一群、第二群におけるPanel Indexの食道扁平上皮癌患者の診断正確性を示すROC曲線を示した（AUC=0.95; 95% CI, 0.92-1.0; p<0.001.）。 下記実施例において得られた、診断パネルの有用性を示す図である。第一群、第二群においてPanel Indexの平均値は食道扁平上皮癌患者群で健常群に比較して有意に高値であった（13.3±8.9 vs. 3.1±1.3, p<0.001）。Panel indexのカットオフ値を4.0とした場合感度と特異度は93.8％と81%であった(A)。第三群においてもPanel Indexは食道扁平上皮癌患者群で健常群に比較して有意に高値であり（16.8±21.2 vs. 3.6±1.3, p<0.001）、同様のカットオフ値を用いた場合感度と特異度は88.9%と72.2%であった（B）。 下記実施例において得られた、食道腺癌、高度異形成、食道扁平上皮癌患者におけるPanel Indexの比較を示す図である。食道腺癌患者のPanel Indexの平均値は4.2±1.7、高度異形成患者では6.2±4.5で、食道扁平上皮癌患者（14.1±13.3）に比較すると有意に低値であり、一方で健常群と有意差を認めなかった(3.2 ± 1.3)。 下記実施例において得られた、病期別のPanel Indexの比較を示す図である。食道扁平上皮癌患者群のPanel Indexを臨床病期別（A）、病理病期別（B）に箱ひげ図で示した。全病期で健常群より有意に高値であった。臨床病期IV期(31.2±28.9)は、ほかの病期[ I期 (11.4±6.3)、 II期 (13.8±7.2)、III期 (12.8±11.7)]と比較して高値となる傾向があったが、有意差は認めなかった。病理病期IV期（27.3±17.8) も同様に他の病期[ IA期 (10.9±7.2)、 IB期 (12.8±6.2)、II期 (10.9± 6.1)、III期 (8.8 ±6.6)より高値であったが有意差を認めなかった。 下記実施例において得られた、治療前後のPanel Indexの比較を示す図である。22症例のPanel Indexの治療前後の比較を示した。治療後のPanel Indexの平均値は治療前より低下していた (6.2±5.6 vs 11.6±11.5, p=0.03)。 下記実施例において得られた、術後再発患者におけるPanel Indexの経時的変化比率を示す図である。4例の術後再発を来した患者の術前のPanel Indexを1.0として経時的変化を示した。全例で治療前に比較し治療後に低下し、3例では再発時に再上昇を認めた。 下記実施例において得られた、診断パネルに用いたmiR/isomiRの診断有用性を示す図である。miR-574-3p (3’ deletion A) (A)、 miR-205-5p (3’ deletion G) (B)、miR-30a-5p (C)のリード数を用いて食道扁平上皮癌患者の診断正確性を示すROC曲線を示した。AUCは以下の通りであった。miR-574-3p (3’ deletion A): AUC=0.84; 95% CI, 0.75-0.93; p<0.001、miR-205-5p (3’ deletion G): AUC=0.92; 95% CI, 0.86-0.97; p<0.001、miR-30a-5p: AUC=0.89; 95% CI, 0.82-0.96; p<0.001。 下記実施例において得られた、第三群におけるPanel IndexのROC曲線を示す図である。第三群におけるPanel Indexの食道扁平上皮癌患者の診断正確性を示すROC曲線を示した（AUC=0.89; 95% CI, 0.78-1.0; p<0.001.）。 下記実施例において得られた、臨床病期I期食道扁平上皮癌における診断パネルの有用性を示す図である。Panel indexを用いて臨床病期I期の食道扁平癌患者を診断するROC曲線を示した（AUC =0.93; 95% CI, 0.9-1.0; p<0.001）。カットオフ値を4.0とした場合の感度は90.4％、特異度は78.4％であった。 下記実施例において得られた、治療前後のPanel Indexの比率の変化を示す図である。22症例におけるPanel Indexの治療前後の推移を治療前を1.0として示した。Panel Indexは治療前に比較し治療後に低下する傾向があり、平均減少率は0.28±0.15であった。 下記実施例において得られた、術後再発患者におけるPanel Indexの経時的変化を示す図である。4例の術後再発を来した患者のPanel Indexの治療前後、再発時の比較を示した。
　上記の通り、本発明の方法では、生体から分離された被検試料中に含まれる特定のmiRNA又はアイソフォームmiR（isomiR)（以下、便宜的に「miRNA等」と呼ぶことがある）の存在量を指標とする。これらのmiRNA等自体は公知であり、その塩基配列は配列表に示すとおりである。本発明の方法に用いるmiRNA等の一覧を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示す各miRNA等は、その存在量が健常者よりも多いことが、食道扁平上皮癌を発症している可能性が大きい。
　被検試料としては、miRNA等を含む体液であれば特に限定されないが、通常、血液試料（血漿、血清及び全血を包含する）が好ましく用いられる。血清又は血漿中の全ＲＮＡの抽出方法は周知であり、下記実施例に具体的に記載されている。
　各miRNA等の存在量の測定（定量）は、次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。次世代シーケンサーのように配列を読む機器であれば、機種は限定されない。なお、血清又は血漿中のmiRNA等を定量する場合には、リード数を100万リード当たりに換算した値で標準化して、比較することが望ましい。
　判定に用いる、各miRNA等の存在量のカットオフ値としては、各miRNA等について、健常者に対する統計学的有意差(t検定で、p<0.05、好ましくはp<0.01、さらに好ましくはp<0.001)の有無を基準とすることが好ましい。具体的には、好ましくは、例えば、偽陽性率が最良の値（最も低くなる値）なるプロット点におけるlog2リード数（カットオフ値）を各miRNA等について設定することができる。各miRNA等の存在量のカットオフ値の例が上記表１に示されている。なお、表１に示されるカットオフ値は、単なる例に過ぎず、統計学的有意差が出る限り、他の値をカットオフ値として採用することができる。また、データを採取する患者及び健常者の集団が異なれば、最良のカットオフ値も異なる。もっとも、通常、表１に示されるカットオフ値の±２０％の範囲内、特には±１０％の範囲内でカットオフ値を設定することができる。
　本発明の方法を用いて食道扁平上皮癌が検出された場合には、食道扁平上皮癌を治療することができる。食道扁平上皮癌の治療方法は公知であり、手術（内視鏡を用いる手術を包含）、シスプラチンや5-FU等の抗がん剤治療、放射線治療やこれらの組合せを挙げることができる。
　以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．　方法
(1)　検体
　2010年1月から2018年7月まで広島大学病院で食道癌に対する治療を受けた患者から前向きに採取した血清検体を用いた。2016年4月までは手術を受ける患者から手術の際に検体を採取していた。その後、全ての食道癌患者から治療前に検体を採取するようにした。2010年1月から2012年12月までの連続した18検体を第1群、2013年1月から2017年2月までの30検体を第2群、2017年2月から2018年7月までの18検体をそれぞれ第3群とした。健常コントロールの検体は我々の研究室で同時期に採取した癌の既往のない健常者の検体を用いた。年齢や性別が患者群と同等になるように健常コントロール群として12、30、18検体を第1，2，3群に割り付けた。患者群は全て組織学的証明された食道扁平上皮癌患者であり、その病期はTNM分類8版[15]に従って診断された。
　本願発明者らの治療戦略は臨床病期と患者の状態に応じて決定された。粘膜癌は内視鏡切除を行い、リンパ節転移を認めない粘膜下層癌は手術を行ない、病理所見によって補助治療を行う。切除可能な進行癌に対しては全身状態が良好であれば術前治療後に手術を行う。患者の希望や全身状態が手術に向かないと判断する場合は根治的な化学放射線を選択することもある。遠隔転移をと伴う場合は全身化学療法を行う。
　治療前に検体を採取した全66検体のうち、22検体は治療1か月後の検体も採取していた。そのうち4検体は術後再発を来し、その時の血清検体も採取した。食道扁平上皮癌と対比するために食道腺癌、高度異形成の患者の血清検体も4検体ずつ採取した。この試験は広島大学の倫理審査委員会で承認を受けている。
(2)　RNA抽出
　患者の同意を得た後で、術前の患者（あるいは健常コントロール）末梢血2mlを採取した。４℃下で3000rpmで10分間遠心分離をかけ、血清を分離した。その上澄みを新しいチューブに血清検体として採取し、使用するまで-80℃で保存した。Qiagen社のmiReasyをプロトコールに準じて使用し、全RNA抽出を行った。
(3)　cDNAライブラリ作製
　抽出したRNAは小分子RNA シークエンスにかけるためにIon Total RNA-Seq Kit v2（Thermo Fisher Scientific社）を用いてcDNAに逆転写し、ライブラリ化を行った。その濃度や塩基数はAgilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technology社）を用いて評価した。
エマルジョンPCR、ビーズ濃縮、チップローディングはIon Chef（商品名）（Thermo Fisher Scientific社）を用いて自動的に実行した。Ion 540（商品名）チップを使用し、Ion Sphere Particle（ISP）と検体をロードした。 混合されたテンプレートはIon S5（商品名）XLシークエンサー（Thermo Fisher Scientific社）に供し解析を行った。
(4)　データ解析
　NGSを用いたシークエンス反応で得られたデータの品質チェックを行った。適切なデータを70％以上のISPローディング、ISPあたり60以上のテンプレート、全リード中に30％以上が使用可能かつテストフラグメントが5％未満、全リード数が10万以上、の全てを満たすものと定義した。これらの定義を満たすデータをCLC genomics work bench 7(CLC bio.)を用いて解析した。小分子RNAはリード数によって統合されmiRbase ver.21(http://www.mirbase.org/) に準じて命名した。isomiRは成熟型マイクロRNAと比べて塩基の欠失や付加が認められるかで分類した。検体間のリード数を比較するために全サンプルのリード数を100万リードと仮定し、それぞれの小分子 RNAを100万リードあたりのリード数で比較した（Normalize, 標準化）。診断バイオマーカーの候補を探索するために、患者群と健常群で検出されたmiR/isomiRを標準化されたリード数の平均値を比較した（Student t-test）。診断バイオマーカーの定義は患者群、健常群でそれぞれ90%以上の検体で検出が可能かつ、平均値の比較で有意差(p<0.05)をもって2倍以上の差異が認められることと定義した。この定義を満たすmiR/isomiRを多変量線形回帰解析で検討し、食道扁平上皮癌診断パネルを作成した。Panel indexは診断パネルに選ばれたmiR/isomiRのリード数と多変量解析の結果産出されたそれぞれのmiR/isomiRの重要性を示す指数から算出される。食道扁平上皮癌の診断の正確性を示すROC曲線を診断パネルに選ばれたmiR/isomiR及び、Panel indexに関して作成した。食道扁平上皮癌の特異性を見るために食道腺癌、高度異形成の検体から算出されたPanel indexを食道扁平上皮癌のものと比較した（Student t-test）。また、治療前後の検体におけるPanel indexの変化も比較した（paired t-test）。全ての統計解析はJMP（商品名）14 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)を用いて行った。
２．　結果
(1)　食道扁平上皮癌診断バイオマーカーの同定
　第一群の少なくとも一つの検体で5451のmiR/isomiRが検出された(図９)。これらの中で303のmiR/isomiRが健常群、患者群のそれぞれ90％以上の検体で検出可能であった。28の成熟型マイクロRNAと60のisomiR2が診断バイオマーカーの定義を満たしていた。これら88の候補の再現性を第二群で検証した。第二群の解析結果を図１０に示した。結果的に9の成熟型マイクロRNAと15のisomiRが第二群でも再度診断バイオマーカーの定義を満たしていた。上記表１にこれら２４の診断バイオマーカーの候補の詳細（第一群、第二群それぞれの患者群、健常群の平均リード数、Fold Change、P値）を示した。
(2)　診断パネルの作成
　再現性をもって診断バイオマーカーの定義を満たした24のバイオマーカー候補を多変量線形回帰解析モデルでステップワイズ法を用いて検討し、食道扁平上皮癌診断パネルを作成した。モデルが選択したのは一つの成熟型マイクロRNA(miR-30a-5p)と２つのisomiR（miR-574-3p (3’ deletion A) と miR-205-5p (3’ deletion G)]であった。診断パネルに使用した3つのmiR/isomiRリード数を図２に示し、診断の正確性のROC曲線を図９に示した。Panel Indexは回帰分析モデルにより算出された係数とそれぞれのリード数を代入することで計算できる。
[Panel Index=0.83+0.015 × miR-574-3p(3’ deletion A) + 0.004 × miR-205-5p (3’ deletion G)+0.0018 × miR-30a-5p]
このPanel Indexは有意に食道扁平上皮癌患者群で健常群に比べて有意に高値であった(3.1±1.3 vs. 13.3±8.9, p<0.001)。診断の正確性を示すROC曲線のAUCは0.95 (95% CI, 0.91-1.0, p<0.001; 図３).Panel Indexのカットオフ値を4.0と定めると感度と特異度は93.8％と81%であった（図４Ａ）。
(3)　診断パネルの再現性
　開発した食道扁平上皮癌の診断パネルの診断能力を確かめるために、パネルの作成に関係のない独立したコホート（第3群；図１１）を用いて検証した。Panel Indexの比較では健常群3.6±1.3に対し、食道扁平上皮癌患者群16.8±20.8であった（p<0.001）。同じくカットオフ値を4.0とした場合 感度と特異度は88.9％と72.3%であった（図４Ｂ）、ROC曲線のAUCは0.89 であった(95%CI, 0.78-1.0, p<0.001; 図１０)。
(4)　Panel Index:食道扁平上皮癌、腺癌、高度異形成の比較
　食道腺癌、高度異形成患者のmiR/isomiRの発現プロファイルを食道扁平上皮癌同様に評価した（図１２）。Panel Indexの平均値は食道腺癌で4.2±1.7、高度異形成で6.2±4.5であった。これらの値は食道扁平上皮癌患者群のPanel Indexより有意に低値であり、一方で健常群より高値ではあるものの有意差を認めなかった(図５)。
(5)　Panel Index:臨床病期、病理病期との関連
　図６Ａに食道扁平上皮癌患者の臨床病期ごとのPanel Indexを示した。Panel Indexの平均値はI期、II期、III期、IV期でそれぞれ11.4±6.3、13.8±7.2、12.8±11.7、31.2±28.9であった。有意差は無いもののIV期でI-III期より高い傾向を認めた。同様の傾向が病理病期ごとにPanel Indexを検討した際も認められた。臨床病期Ｉ期の患者は他の進行期の患者に比べてPanel Index低い傾向があったが健常群よりは明らかに高値であった。I期の患者と健常群で診断の有用性を示すROC曲線ではAUCは0.93 (95%CI, 0.85-1.0, p<0.001; 図１１)、カットオフ値を4.0とした場合、感度91.0%、特異度77.4%であった。
(6)　Panel Indexの経時的変化-治療前、治療後、再発時-
　22症例で治療前後の血清検体のmiR/isomiRの発現プロファイルを評価し、Panel Indexを計算した。治療後のPanel Indexの平均値は治療前に比較して有意に低下していた。(6.2±5.6 vs 11.6±11.5, p=0.03; 図７)。18症例（81.8%）の症例で治療前に比較して減少しており、平均の減少比は0.28±0.15であった（図１２）。図８に4例の術後再発を来した症例のPanel Indexの経時的変化を示した。４例全てで治療前に比べて治療後に減少を認め、3例で再発時に再上昇を認めた（図１３）。

Claims (3)

  1. 　生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号２、配列番号７、配列番号１９、配列番号１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１３、配列番号１８、配列番号４、配列番号１１、配列番号５、配列番号２４、配列番号３、配列番号１２、配列番号２０、配列番号６、配列番号１０、配列番号９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号８及び配列番号２１のいずれかで示されるmiRNA又はアイソフォームmiRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする食道扁平上皮癌の検出を補助する方法であって、その存在量が健常者よりも多いことが、食道扁平上皮癌を発症している可能性が大きいことを示す、方法。
  2. 　塩基配列が配列番号１９、配列番号２及び配列番号７でそれぞれ示される３種のmiRNA又はアイソフォームmiRNAを指標とする請求項１記載の方法。
  3. 　前記被検試料が血液試料である、請求項１又は２記載の方法。
PCT/JP2021/005110 2020-02-10 2021-02-10 食道扁平上皮癌の検出を補助する方法 WO2021162065A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022500456A JPWO2021162065A1 (ja) 2020-02-10 2021-02-10

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020021005 2020-02-10
JP2020-021005 2020-02-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021162065A1 true WO2021162065A1 (ja) 2021-08-19

Family

ID=77293070

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/005110 WO2021162065A1 (ja) 2020-02-10 2021-02-10 食道扁平上皮癌の検出を補助する方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2021162065A1 (ja)
WO (1) WO2021162065A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115323066A (zh) * 2022-09-23 2022-11-11 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种与鸡产蛋数和连产性状杂种优势相关的miRNA及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101851682A (zh) * 2010-06-25 2010-10-06 中国人民解放军南京军区南京总医院 一种用于检测食管鳞状细胞癌的微小核糖核酸组合及其应用
JP2011501943A (ja) * 2007-10-11 2011-01-20 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション 食道腺癌の診断及び治療のための方法及び組成物
CN105176983A (zh) * 2015-09-23 2015-12-23 河南师范大学 一种用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒
WO2019117270A1 (ja) * 2017-12-13 2019-06-20 国立大学法人広島大学 頭頸部がんの検出を補助する方法
US20190249262A1 (en) * 2016-10-21 2019-08-15 Thomas Jefferson University Leveraging the presence or absence of mirna isoforms for recommending therapy in cancer patients
JP2019529351A (ja) * 2016-08-04 2019-10-17 ベイラー リサーチ インスティテュートＢａｙｌｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 食道癌を診断するおよび治療するための方法
CN111826438A (zh) * 2019-04-19 2020-10-27 深圳大学 一组辅助诊断食管鳞癌的miRNA标志物及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011501943A (ja) * 2007-10-11 2011-01-20 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション 食道腺癌の診断及び治療のための方法及び組成物
CN101851682A (zh) * 2010-06-25 2010-10-06 中国人民解放军南京军区南京总医院 一种用于检测食管鳞状细胞癌的微小核糖核酸组合及其应用
CN105176983A (zh) * 2015-09-23 2015-12-23 河南师范大学 一种用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒
JP2019529351A (ja) * 2016-08-04 2019-10-17 ベイラー リサーチ インスティテュートＢａｙｌｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 食道癌を診断するおよび治療するための方法
US20190249262A1 (en) * 2016-10-21 2019-08-15 Thomas Jefferson University Leveraging the presence or absence of mirna isoforms for recommending therapy in cancer patients
WO2019117270A1 (ja) * 2017-12-13 2019-06-20 国立大学法人広島大学 頭頸部がんの検出を補助する方法
CN111826438A (zh) * 2019-04-19 2020-10-27 深圳大学 一组辅助诊断食管鳞癌的miRNA标志物及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUO LI, ZHENG LIANG, ZHAO YANG, WANG QIANYUN: "Profiling and Bioinformatic Analyses Indicate Differential circRNA and miRNA/isomiR Expression and Interactions", BIOMED RESEARCH INTERNATIONAL, vol. 2018, 8518563, 1 January 2018 (2018-01-01), pages 1 - 9, XP055848340, ISSN: 2314-6133, DOI: 10.1155/2018/8518563 *
IBUKI YUTA, NISHIYAMA YUKIE, TSUTANI YASUHIRO, EMI MANABU, HAMAI YOICHI, OKADA MORIHITO, TAHARA HIDETOSHI: "Circulating microRNA/isomiRs as novel biomarkers of esophageal squamous cell carcinoma", PLOS ONE, vol. 15, no. 4, 6 April 2020 (2020-04-06), pages 1 - 18, XP055848342, DOI: 10.1371/journal.pone.0231116 *
YUTA IBUKI: "O45-1 Exploratory research on blood microRNA/isorniR , which is a biomaker for esophageal cancer by analysis of next-generation sequencing", JAPANESE JOURNAL OF GASTROENTEROLOGICAL SURGERY, vol. 52, no. S1, 1 July 2019 (2019-07-01), pages 417, XP055848338 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115323066A (zh) * 2022-09-23 2022-11-11 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种与鸡产蛋数和连产性状杂种优势相关的miRNA及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2021162065A1 (ja) 2021-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lin et al. Plasma circular RNA panel acts as a novel diagnostic biomarker for colorectal cancer
Hu et al. The plasma lncRNA acting as fingerprint in non-small-cell lung cancer
Ma et al. Circulating miR-148a is a significant diagnostic and prognostic biomarker for patients with osteosarcoma
Wang et al. Investigation of serum miR-411 as a diagnosis and prognosis biomarker for non-small cell lung cancer.
Zheng et al. Identification of serum MicroRNAs as novel biomarkers in esophageal squamous cell carcinoma using feature selection algorithms
Guo et al. Evaluating the diagnostic and prognostic value of long non-coding RNA SNHG15 in pancreatic ductal adenocarcinoma.
WO2011085163A2 (en) Protein markers for lung cancer detection and methods of using thereof
Li et al. Plasma circular RNA panel acts as a novel diagnostic biomarker for colorectal cancer detection
Bai et al. Expression of miR-32 in human non-small cell lung cancer and its correlation with tumor progression and patient survival
Li et al. Salivary extracellular microRNAs for early detection and prognostication of esophageal cancer: a clinical study
Skallevold et al. Salivary biomarkers in lung cancer
Rentoft et al. Transcriptional profiling of formalin fixed paraffin embedded tissue: pitfalls and recommendations for identifying biologically relevant changes
JP2023113877A (ja) 膵がんの検出を補助する方法
WO2021162065A1 (ja) 食道扁平上皮癌の検出を補助する方法
Radwan et al. Evaluation of circulating microRNAs-211 and 25 as diagnostic biomarkers of colorectal cancer
Guo et al. Plasma extracellular vesicle long RNA profiling identifies a diagnostic signature for stage I lung adenocarcinoma
Linke et al. Quantification of mitochondrial cfDNA reveals new perspectives for early diagnosis of colorectal cancer
WO2019117257A1 (ja) 乳がんの検出を補助する方法
Liu et al. RNA sequencing of tumor-educated platelets reveals a three-gene diagnostic signature in esophageal squamous cell carcinoma
Huang et al. The ratio of ssDNA to dsDNA in circulating cell-free DNA extract is a stable indicator for diagnosis of gastric cancer
Gayosso-Gómez et al. Identification of circulating miRNAs profiles that distinguish malignant pleural mesothelioma from lung adenocarcinoma
Gong et al. Diagnostic and prognostic performance of microRNA-25, carbohydrate antigen 19-9, carcinoembryonic antigen, and carbohydrate antigen 125 in pancreatic ductal adenocarcinoma
Wang et al. Plasma microRNA-1207-5p as a Potential Biomarker for Diagnosis and Prognosis of Colorectal Cancer.
EP3298165B1 (en) Method and kit for the diagnosis of colorectal cancer
WO2020178172A1 (en) Protein signature for the diagnosis of colorectal cancer and/or pre-cancerous stage thereof

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21753098

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022500456

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21753098

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1