CN106011294A - miRNA在软骨母细胞型骨肉瘤诊断中的用途 - Google Patents

miRNA在软骨母细胞型骨肉瘤诊断中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了miRNA在软骨母细胞型骨肉瘤诊断中的用途，所述miRNA为miRNA‑4482‑3p。本发明发现了miRNA‑4482‑3p与骨肉瘤的发生发展相关，可作为骨肉瘤的分子标志物。鉴于此，本发明提供了用于骨肉瘤早期诊断的产品，该产品在临床上具有较好的应用前景。

Description

miRNA在软骨母细胞型骨肉瘤诊断中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及miRNA在软骨母细胞型骨肉瘤诊断中的用途，具体的所述miRNA为miRNA-4482-3p。
背景技术
microRNA是一种不编码蛋白质的，约21-25nt大小的单链小分子RNA。通过特异性的结合靶基因来调控其表达。从1993年，第一个microRNA：lin-4被发现后，在过去的几十年，大量的microRNA被发现并认为在细胞的发生、分化、增殖和凋亡起着重要的作用。据报道，miRNAs调控人类60％编码蛋白基因的表达，通过结合其目标基因mRNA的3’非翻译区而导致mRNA的降解或者翻译抑制。除了沉默作用外，某些miRNAs还被证实能激活基因的表达。在不同的肿瘤类型中，microRNA呈现两种不一样的角色：抑癌基因和癌基因。主要的作用机制包括：miRNA位点的缺失、扩增、突变，表观遗传水平改变，转录调控因子的异常表达等。
原发性骨肿瘤临床较为罕见，每百万人口中仅约有10例被诊断该病，而在这10例之中大约2-5例，就可能是患有骨肉瘤，这一现象在儿童和青少年人群中尤其常见。虽然骨肉瘤发病率并不算高，但其却是最常见的原发性骨恶性肿瘤，其恶性程度甚高，进展迅速，极易发生早期肺转移，是儿童和青少年群体中引起肿瘤相关性死亡的最主要诱因，给患者及其家庭带来极大的精神损害，给社会乃至国家亦带来沉重的经济负担。骨肉瘤发病率男女比例约为1.5：1，近80％-90％发生与股骨、胫骨和肱骨等，发生在手和足等四肢末端的不到1％。骨肉瘤患者预后很差，高分化骨肉瘤单纯手术切除后5年生存率小于20％，近年来应用新辅助化疗治疗骨肉瘤使得骨肉瘤患者长期生存率有了大幅提高，无转移的高分化骨肉瘤患者5年生存率从原来的小于20％提高到60％-70％。但是，转移或者复发的患者长期生存率仍低于20％，对化疗药物的耐药是造成治疗失败及复发的主要原因。
骨肉瘤可分为不同的亚型，其中软骨母细胞型骨肉瘤为骨肉瘤的一种亚型。软骨母细胞型骨肉瘤以产生软骨基质为主，大多为高级别透明软骨，除了颌骨和盆骨的软骨母细胞型骨肉瘤以外，肿瘤内的软骨基质很少有明显黏液变性或出现其他形式的软骨肉瘤成分。软骨母细胞型骨肉瘤的瘤组织中，1/2以上呈软骨肉瘤样结构，在此基础上可化生形成肿瘤骨。软骨母细胞型骨肉瘤作为普通型骨肉瘤的一个亚型和其他普通型骨肉瘤的临床治疗和预后并无大的差别。
由于骨肉瘤给人类健康带来的巨大危害，研究者们正通过各种途径寻找有效的治疗骨肉瘤的方法。分子靶向治疗正在被尝试应用到骨肉瘤的诊断和治疗当中。最近的研究表明microRNA(miRNA)在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，寻找与骨肉瘤发生发展相关的miRNA对骨肉瘤的机制研究以及临床上的诊断和治疗就有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于骨肉瘤诊断的miRNA，该miRNA为miRNA-4482-3p。
本发明的目的之二，提供一种对骨肉瘤进行早期诊断的产品。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测微小RNA的试剂在制备诊断骨肉瘤的产品中的应用，其中，所述微小RNA为miRNA-4482-3p或其同源物。
进一步，所述骨肉瘤为软骨母细胞型骨肉瘤。
进一步，所述产品通过测定样本中miRNA-4482-3p或其同源物的表达水平以诊断骨肉瘤。其中，miRNA-4482-3p或其同源物在骨肉瘤患者中表达下调。
进一步，所述产品包括通过使用qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测miRNA-4482-3p或其同源物的水平以诊断骨肉瘤的产品。
进一步，所述产品包括芯片和/或试剂盒。其中，所述芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于上面所述的miRNA-4482-3p的部分或全部序列。所述试剂盒包括用于检测上面所述的miRNA-4482-3p的表达水平的试剂。
进一步，所述试剂盒包括扩增miRNA-4482-3p的引物对，序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了一种诊断骨肉瘤的产品，所述产品能够通过检测样本中miRNA-4482-3p或其同源物的水平来诊断骨肉瘤。
进一步，所述样本包括血液、尿液、脑脊液、组织液、汗液、唾液、泪液。在本发明的具体实施方式中，所述样本为血液。
进一步，所述产品包括通过使用qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测miRNA-4482-3p或其同源物的表达水平。
进一步，所述产品包括芯片和/或试剂盒。其中，所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于上面所述的miRNA-4482-3p的部分或全部序列。所述试剂盒包括针对miRNA-4482-3p的引物和/或探针。
在本发明中，试剂盒还包括针对现有技术中已经报道的用于诊断骨肉瘤的miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断骨肉瘤的情况也包含在本发明的保护范围之内。
所述芯片(即微阵列)包含针对miRNA-4482-3p特异性的一组寡核苷酸(如寡脱氧核苷酸)探针。通过使用该微阵列，可通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸，然后使其与微阵列上的探针寡脱氧核苷酸杂交，从而产生杂交或表达谱，来测定生物样品中多种微小RNA的表达水平。miRNA特异性的探针寡核苷酸或对miRNA特异性的探针寡核苷酸是指具有经选择与特定miRNA基因产物杂交或与该特定miRNA基因产物的逆转录物杂交的序列的探针寡核苷酸。
在本发明的具体实施方式中，所述miRNA-4482-3p核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示。
应当知道，本发明的miRNA-4482-3p包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，“变体”是指，与对应野生型miRNA基因产物具有少于100％的同一性并且具有对应野生型miRNA基因产物的一个或多个生物活性的miRNA。此类生物活性的实例包括但不限于，与骨肉瘤发生发展的细胞过程(例如，细胞分化、细胞生长、细胞死亡)的抑制。这些变体包括物种变体和由于miRNA基因的一个或多个突变(例如，置换、缺失、插入)而产生的变体。在某些实施方案中，变体与对应野生型miRNA基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。其显示完整miRNA-4482-3p核酸分子相同的功能，它们可能通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。
本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miRNA-4482-3p功能的条件下，对miRNA-4482-3p进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
本发明的miRNA-4482-3p核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟的miRNA-4482-3p主要呈单链形式，而miRNA-4482-3p前体是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
根据SEQ ID NO.1所示的核酸序列，可以生成用于给定miRNA基因产物的RNA印记杂交的合适探针，包括但不限于，与目标miRNA基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或完全互补的探针。标记的DNA和RNA采用常规方法制备，例如核酸探针用下述物质标记，如放射性核素3H、32P、33P、14C或35S，重金属，能起到标记配体的特异性结合对成员功能的配体如生物素、抗生物素蛋白或抗体等，荧光分子，化学发光分子、酶等。
通过切口平移法或随机引物法，可以将探针标记成高比放射性，后者是从单链DNA或从RNA模板合成高比放射性的32P-标记的探针的选择方法。例如，通过根据切口平移法用高效放射性的核苷酸替换现有的核苷酸，可以制备比放射性大大超过108cpm/微克的32P-标记的核酸探针。然后通过使杂交的滤膜曝光于照相胶片，可以进行杂交的放射自显影检测。对杂交的滤膜曝光的照相胶片的光密度扫描，会提供miRNA基因转录产物水平的精确测量。
本发明所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断骨肉瘤的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断骨肉瘤的情况也包含在本发明的保护范围之内。上面所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断骨肉瘤miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断骨肉瘤的情况也包含在本发明的保护范围之内。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploringthe metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
本发明的miRNA-4482-3p可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miRNA-4482-3p的DNA片段的载体转染细胞获得。
可以表达miRNA-4482-3p的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找miRNA-4482-3p在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定miRNA-4482-3p初始miRNA的位置，在miRNA-4482-3p初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达miRNA-4482-3p的DNA片段。
在本发明中，“阵列”或“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。微阵列可从产生自已知miRNA序列的基因-特异的寡核苷酸探针来制备。阵列可含有每个miRNA的2种不同的寡核苷酸探针，一种含有活性的成熟序列，而另一种特异于miRNA的前体。阵列还可含有对照，诸如与人类直向同源物仅几个碱基不同的一种或多种小鼠序列，其可作为杂交严紧条件的对照。来自两个物种的tRNA也可印在微芯片上，提供了特异杂交的内部、相对稳定的阳性对照。非特异杂交的一个或多个适当的对照也可包括于微芯片上。
术语“引物”涵盖任何能够在模板依赖性过程中启动初生核酸的合成的核酸。引物可为十至二十和/或三十个碱基对长的寡核苷酸，也可采用更长的序列。引物可以双链和/或单链形式提供，优选的为单链形式。
miRNA基因产物的“生物活性片段”是指，具有对应野生型miRNA基因产物的一个或多个生物活性的miRNA基因产物的RNA片段。如上文中所述，此类生物活性的实例包括但不限于，骨肉瘤的细胞增殖过程的抑制。在某些实施方案中，生物活性片段在长度上为至少约5、7、10、12、15或17个核苷酸。在具体的实施方案中，可将分离的miRNA基因产物与一种或多种另外的抗癌治疗组合来给受试者施用。适当的抗癌治疗包括但不限于，化学疗法、放射疗法以及组合(例如，放化疗)。
术语“miRNA基因产物”或“同源物”可以是任何从miRNA基因转录得到的产物，包括初级转录产物、pre-miRNA、颈环序列、pri-miRNA、miRNA前体、单顺反子转录产物、多顺反子转录产物、miRNA*、成熟miRNA或其变体。pre-miRNA是指具有发夹结构并含有miRNA的非编码RNA；颈环序列是指具有发夹结构并含有成熟miRNA序列的RNA；pri-miRNA是指非编码RNA，其具有作为双链RNA特异性核糖核酸酶Drosha的底物的发夹结构；miRNA前体是指起源于基因组DNA的转录物，并包含含有一个或多个miRNA序列的非编码结构性RNA；单顺反子转录产物是指含有单个miRNA序列的miRNA前体；多顺反子转录产物是指含有两个或更多个miRNA序列的miRNA前体。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了miRNA-4482-3p在骨肉瘤患者中表达下调，通过检测miRNA-4482-3p的水平，可以判断患者是否患有骨肉瘤或者患骨肉瘤的风险。
本发明提供了一种诊断骨肉瘤的产品，该产品可以实现骨肉瘤的早期诊断，为降低骨肉瘤患者的死亡率提供
附图说明
图1显示利用高通量测序检测miRNA-4482-3p在骨肉瘤患者血液中的表达情况；
图2显示利用qPCR检测miRNA-4482-3p在骨肉瘤患者血液中的表达情况。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1与骨肉瘤相关的miRNA的筛选
1、样本获取：收集10例软骨母细胞型骨肉瘤患者及10名正常人。受试者要求空腹至少12h，于次日清晨7：00～8：00室温下，抽取10ml静脉血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，提取外周血单个核细胞PBMCs，加入1ml Trizol试剂(Invitrogen公司)，充分混匀，-80℃保存标本，以用于RNA提取。所有的血样和病理结果应真实可靠，研究经伦理委员会批准，患者知情同意。
2、血液单核细胞RNA的提取
使用Invitrogen公司的RNA提取试剂盒提取总RNA。步骤如下：
(1)先加1ml Trizol于1×107细胞中，若冻存细胞直接加入Trizol，不需解冻，吹打裂解后室温静置5-10min。
(2)加入0.2ml氯仿(三氯甲脘)，剧烈震荡15s，室温静置2-3min。
(3)在4℃下12000g离心15min。
(4)小心吸出上清水相约500μl移入另一离心管(注意不要抽到蛋白层)，加入500μl异丙醇(专用)，颠倒混匀，室温静置10min。
(5)4℃12000g离心10min，倒去上清液，底部可见针尖大小白色物质。
(6)加入1ml 70％乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇。
(7)4℃7500g离心5min，去除乙醇(尽量用枪头吸干净)后晾5-10min，不要太干，否则难以溶解，放置于-70℃保存。
3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop2000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280≧1.8。
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent 2100(RNA 6000Nano kit)检测RNA样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，要求28S:18S≥1；RIN值≧7.0。
4、SRNA文库构建
实验采用Illumina TruSeq Small RNA试剂盒构建文库，在总RNA中回收长度18-30nt RNA，通过RT-PCR逆转录成单键cDNA，cDNA扩增后，回收cDNA产物，建成小RNAs文库。
5、测序
运用llumina Hiseq2500/Miseq第二代高通量测序技术对mRNA和miRNA进行测序，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据的处理，得到最终数据。
6、结果：
通过转录组数据分析软件对miRNA原始数据进行背景校正后进行t-test得到P值，然后利用Fisher检验合并P值，筛选差异表达的miRNA。设定p值＜0.01且log2(Fold_change)normalized的绝对值≥3作为显著性阈值。如图1所示，miRNA-4482-3p在正常人和骨肉瘤患者中差异表达，在软骨母细胞型骨肉瘤患者血液中显著下调(P<0.05)。
实施例2 QPCR验证差异表达的miRNA-4482-3p
1、根据miRNA芯片的检测结果选择miRNA-4482-3p进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择正常人和软骨母细胞型骨肉瘤样本各60例。
2、RNA提取过程同实施例1。
3、逆转录：
1)将10pg-1μg的总RNA模板与2μl 10×缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μlpolyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase freewater)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。
2)反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min。
3)立即冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。
4)将上述20μl反应混合物与4μl 5×缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，42℃孵育1h。
4、QPCR反应：
1)引物设计
扩增miRNA-4482-3p的引物
正向引物：TTTCTATTTCTCAGTGGGGCTC(SEQ ID NO.2)
反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.3)
扩增U6snRNA的引物
正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQ ID NO.4)
反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQ ID NO.5)
2)按照表1配制PCR反应体系：
其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表1 PCR反应体系
体积
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl
正向引物 1μl
反向引物 1μl
cDNA模板 2μl
ddH2O 8.5μl
总体积 25μl
3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，以U6snRNA作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、结果
如图2所示，与正常人血液相比，骨肉瘤患者血液中的miRNA-4482-3p的表达水平显著降低，与高通量测序结果一致(P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测微小RNA的试剂在制备诊断骨肉瘤的产品中的应用，其特征在于，所述微小RNA为miRNA-4482-3p或其同源物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨肉瘤为软骨母细胞型骨肉瘤。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品通过测定样本中miRNA-4482-3p或其同源物的表达水平以诊断骨肉瘤。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述miRNA-4482-3p或其同源物在骨肉瘤患者中表达下调。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过使用qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测miRNA-4482-3p或其同源物的水平以诊断骨肉瘤的产品。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片和/或试剂盒。
7.一种诊断骨肉瘤的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测样本中miRNA-4482-3p或其同源物的水平来诊断骨肉瘤。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述样本包括血液、尿液、脑脊液、组织液、汗液、唾液、泪液。
9.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品包括通过使用qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测miRNA-4482-3p或其同源物的表达水平。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片和/或试剂盒；所述芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于上面所述的miRNA-4482-3p的部分或全部序列；所述试剂盒包括针对miRNA-4482-3p的引物和/或探针。
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