CN105803067B - miR-1304在转移性肺鳞癌诊治中的应用 - Google Patents

miR-1304在转移性肺鳞癌诊治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种miRNA标记物，该miRNA标记物是miRNA‑1304。miRNA‑1304可用于判断肺鳞癌是否发生转移或者预判肺鳞癌转移风险。经检验证明，miRNA‑1304可有效区分肺鳞癌转移样本和非转移样本。在此基础上，miRNA‑1304还可以用于制备抑制肺鳞癌转移或预防肺鳞癌转移的药物。本发明为临床在分子水平上诊断肺鳞癌转移提供了新的诊断方法，同时为肺鳞癌转移的基因治疗提供了新的药物靶点。

Description

miR-1304在转移性肺鳞癌诊治中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及miR-1304在转移性肺鳞癌诊治中的应用。
背景技术
非小细胞肺癌是造成全世界癌症相关死亡的首要原因之一。它主要包括四种组织学亚型：腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌和其他(神经内分泌癌，良性肿瘤等)。鳞状细胞癌大约占所有非小细胞肺癌的30％，是致死率仅次于腺癌的非小细胞癌，肺鳞癌多见于老年男性，与吸烟有密切关系。由于非小细胞肺癌的五年生存率低于15％，早期诊断能有效的降低其死亡率。
miRNA是天然存在于体内的21-22nt的非编码RNA分子，是一类通过转录后基因沉默对靶基因表达进行调节的RNA。据估计，生物体内约有1/3的基因受miRNA的调控。miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA 5’-UTR或者3’-UTR中的互补序列相结合，抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。
检测miRNA的表达水平可以为疾病的临床诊断提供参考。而miRNA的异常表达直接导致一些与疾病发生相关基因的表达异常，诱发疾病的发生。已有报道证明miRNA可以通过调控靶基因mRNA的表达，在疾病发生、发展及转移中发挥重要作用。在未来临床治疗中，miRNA不仅可以成为新的疾病早期诊断和疾病进程相关的标记物，而且也有望通过改变miRNA的表达或者其靶基因的表达治疗疾病。寻找和鉴定与疾病发生相关的miRNA及其靶基因为miRNA的临床治疗提供基础。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种可用于早期诊断肺鳞癌转移的微小RNA标记物。
本发明的目的之二在于提供上述微小RNA的用途。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种微小RNA在制备肺鳞癌转移诊断工具中的应用，所述微小RNA选自以下组：初始miRNA、前体miRNA、成熟miRNA；初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；所述微小RNA是miR-1304。
应当知道，本发明的微小RNA包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示完整微小RNA核酸分子相同的功能，尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。
本领域人员应该了解，为了保证微小RNA的稳定性，可以在微小RNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对微小RNA碱基进行修饰，但是上述修饰不影响微小RNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miR-1304功能的条件下，对miR-1304进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
在本发明的一些具体的实施方式中，所述miR-1304是成熟miR-1304。成熟miR-1304包括miR-1304-3p和miR-1304-5p。优选的，本发明的成熟miR-1304是miR-1304-5p。
虽然在某些具体实施方式中所使用的是成熟miRNA，但是本领域技术人员可以预期，初始miRNA、前体miRNA将可以获得与成熟miRNA同样的技术效果，因为细胞有能力进一步将初始miRNA、前体miRNA加工为成熟miRNA。
本发明的微小RNA核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟miRNA主要呈单链形式，而前体miRNA是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
进一步，上述诊断工具包括但不限于，芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台。所述诊断工具包括用于检测样本中miR-1304的表达水平的试剂。
进一步，所述样本的来源是肺组织。
进一步，所述试剂盒包括针对miR-1304的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miR-1304的部分或全部序列；所述试纸包括针对miR-1304的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对miR-1304的引物和/或探针。
本发明提供了一种肺鳞癌转移的诊断工具，所述诊断工具包括检测样本中miR-1304表达水平的试剂。
进一步，所述样本的来源是肺组织。
进一步，所述诊断工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。
进一步，所述试剂盒包括针对miR-1304的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miR-1304的部分或全部序列；所述试纸包括针对miR-1304的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对miR-1304的引物和/或探针。
进一步，所述试剂盒中的针对miR-1304的引物和/或探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于检测前面所述的微小RNA表达水平的引物和/或探针。将多种微小RNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种微小RNA指标联合诊断肺鳞癌的情况也包含在本发明的保护范围之内。
进一步，所述芯片上固定的所述寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于检测miR-1304的表达水平的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断肺鳞癌也包含在本发明的保护范围之内。
进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
本发明的miR-1304可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miR-1304的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核载体。
病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
可以表达微小RNA的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找微小RNA在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定初始miRNA的位置，在初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达微小RNA的DNA片段。
本发明中使用的“微小RNA”与“miRNA”、“miR”通用。
本发明中使用的“诊断肺鳞癌转移”包括对肺鳞癌转移的预判，即判断受试者是否存在患有肺鳞癌转移的风险，也包括对肺鳞癌转移的诊断，即判断受试者是否已经患有肺鳞癌转移，也包括对肺鳞癌转移预后的判断，即判断受试者是否存在复发的可能性或者判断受试者已经复发。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了miR-1304与肺鳞癌转移相关，通过检测受试者miR-1304的表达，可以判断受试者是否患有肺鳞癌转移、或者判断受试者是否存在患有肺鳞癌转移的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-miR-1304，相比传统的检测手段，微小诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现肺鳞癌转移的早期诊断，从而降低肺鳞癌转移的死亡率。
附图说明
图1显示利用miRNA芯片检测miR-1304在转移性肺鳞癌组织和非转移性肺鳞癌组织中的表达差异；
图2显示利用QPCR检测miR-1304在人肺上皮细胞和肺鳞癌细胞株中的表达差异；
图3显示利用QPCR检测anti-miRNA-1304的抑制效果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1与肺鳞癌转移相关的miRNA的筛选
1、样本获取：40例肺鳞癌组织(包括20例有转移样本和20例无转移样本)上述样本为肺鳞癌患者的手术切除标本。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。组织样本的临床资料包括：性别、年龄、肿瘤大小、病理分级(Edmonson)、转移与否、复发与否等。
2、组织总RNA的提取
每100mg组织加入1mL Trizol，用液氮研磨充分研碎组织块。加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1分钟左右，室温下静置5分钟。4℃，12,000rpm离心15分钟后小心转移上清液入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70％乙醇，4℃，12000rpm离心洗涤沉淀5分钟。去上清，将沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解，测定OD260和OD280值。采用无RNA酶的DNA酶I处理，QIAGEN RNeasy试剂盒纯化总RNA，详细操作原理和方法见试剂盒说明书。琼脂糖胶电泳评价总RNA质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为28S:18S≥2可以初步判定总RNA质量较好。
3、miRNA的提取和标记
3.1用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA，具体操作按照相应说明书。样品用T4 RNA连接酶标记步骤依照Thomson的方法。miRNA标记方法大致如下：1.4μgmiRNA和500ng 5’-磷酸盐-胞嘧啶-尿嘧啶cy3-3’(Dharmacon，Chicago，USA)及2单位T4RNAligase(NEB，Ipswich，USA)，于4℃孵育2小时。每份miRNA样品均设等量的相应阴性对照。
3.2标记的RNA用0.3M醋酸钠和2.5倍体积的乙醇进行沉淀，再用15μl含3×SSC、0.2％SDS和15％甲酰胺的杂交液重悬，所有的杂交重复两次，杂交用LifterSlipTM(Erie，PA USA)以保证杂交液在芯片和盖片之间均匀流动。
3.3将杂交室放在杂交仪BioMixerTMII上(CapitalBio Corp，Beijing，China)于42℃水浴杂交过夜，之后用洗液洗两遍。
4、miRNA芯片操作：
miRNA芯片，采用博奥生物有限公司的miRNA表达谱芯片(单通道芯片)，按照说明书的指示进行miRNA表达谱的检测。
5、结果：
分析miRNA芯片表达谱的检测结果，可知miRNA-1304在已发生转移的肺鳞癌组织中和未发生转移的肺鳞癌组织中的表达存在显著差异，与未发生转移的肺鳞癌组织相比，在已发生转移的肺鳞癌组织中miRNA-1304的水平显著升高(图1)。
实施例2 miRNA-1304在肺鳞癌细胞系中的表达
1、细胞培养
将肺鳞癌细胞株NCI-H520，NCI-H596，NCI-H2170、NCI-H226于DMEM培养基和10％胎牛血清中培养，将人肺上皮细胞株BEAS-2B于BEGM培养液和10％胎牛血清中培养，置于37℃、5％CO2培养箱中。
2、QPCR
2.1细胞总RNA提取：利用QINGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，按照说明书指示进行。
2.2逆转录：将10pg-1μg的总RNA模板与2μl 10*缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μlpolyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl 5*缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，42℃孵育1h。
2.3QPCR：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃20s，60℃55s)*50个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。扩增miRNA-1304的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物为通用反向引物(购自北京旷博生物技术有限公司)。以snRNA U6作为参照基因，其上游引物序列为SEQ ID NO.2所示；下游引物序列为SEQ IDNO.3所示。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
3、结果
如图2所示，与人肺上皮细胞株BEAS-2B相比，肺鳞癌细胞株NCI-H520，NCI-H596，NCI-H2170、NCI-H226中miRNA-1304的表达明显升高(P<0.05)。
实施例3研究miRNA-1304对肺鳞癌细胞粘附能力的影响
1、设计合成针对miRNA-1304的反义寡核苷酸(anti-miRNA-1304)
在miRNA数据库(http://www.sanger.ac.uk)中找到miRNA-1304的序列信息，根据miRNA-1304的序列信息由大连宝生物生物技术有限公司设计合成anti-miRNA-1304和随机对照序列。
2、细胞培养：NCI-H520培养方法同实施例2。
3、细胞转染
将NCI-H520细胞分为两组，分别为抑制阴性对照组(anti-NC)、miRNA-1304抑制组(anti-miRNA-1304)。将阴性对照组及抑制组分别转染anti-NC和anti-miRNA-1304，运用转染试剂LipofectamineTM 2000进行转染，转染方法参照说明书。anti-NC和anti-miRNA-1304的工作浓度均为5μM。转染后48h收集各组细胞用于后续实验。
4、QPCR实验
细胞总RNA提取和PCR步骤同实施例2。
结果如图3所示，与抑制阴性对照组(anti-NC)相比，miRNA-1304抑制组(anti-miRNA-1304)的miRNA-1304的水平显著下降，表明anti-miRNA-1304能够有效抑制miRNA-1304的表达。
5、细胞粘附实验
将转染48h的NCI-H520细胞使用0.25％胰酶消化成细胞悬液，以5×104个/ml接种于96孔细胞培养板，每孔0.1ml，60min后，37℃PBS洗去未粘附的细胞，MTT法测各孔490nm波长光吸收值。用光吸收值大小代表粘附活细胞的相对数量。
6、结果
miRNA-1304抑制组(anti-miRNA-1304)相对光密度值为0.197±0.021，抑制阴性对照组(anti-NC)相对光密度值为1.741±0.102。与抑制阴性对照组(anti-NC)相比，miRNA-1304抑制组(anti-miRNA-1304)光吸收值显著下降(P<0.05)。上述实验结果表明anti-miRNA-1304能够显著抑制NCI-H520细胞粘附能力，同时表明miRNA-1304有利于肺鳞癌细胞粘附。
实施例4研究miRNA-1304对肺鳞癌细胞迁移、侵袭能力的影响
1、细胞培养和转染同实施例3。
2、迁移实验
转染48h的NCI-H520细胞使用胰酶消化并计数，取105个细胞置于1.5mLEP管中，加入200μL无血清培养基重悬细胞，加入transwell小室中，下层小室加入10％胎牛血清的DMEM培养基，放入37℃，5％CO2孵箱培养24h。取transwell小室，用棉签擦除里面的细胞，并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。固定染色后显微镜下取8个随机视野进行计数。
3、侵袭实验
转染48h的NCI-H520细胞使用胰酶消化并计数，取105个细胞置于1.5mL EP管中，加入200μL无血清培养基重悬细胞，加入经过铺基质胶的transwell小室中，下层小室加入10％FBS的DMEM培养基，放入37℃，5％CO2孵箱培养24h。取transwell小室，用棉签擦除里面的细胞，并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。固定染色后显微镜下取8个随机视野进行计数。
4、结果
迁移实验：与抑制阴性对照组(anti-NC)相比，miRNA-1304抑制组(anti-miRNA-1304)穿过transwell小室基底膜的细胞减少了约72％。
侵袭实验：与抑制阴性对照组(anti-NC)相比，miRNA-1304抑制组(anti-miRNA-1304)穿过已经铺过基质胶的transwell小室基底膜的细胞减少了67％。
上述实验结果表明，anti-miRNA-1304能够显著抑制NCI-H520细胞迁移、侵袭能力，同时表明miRNA-1304有利于NCI-H520细胞的迁移和侵袭。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.定量检测肺组织中微小RNA表达的试剂在制备肺鳞癌转移诊断工具中的应用，其特征在于，所述微小RNA选自以下组：初始miRNA、前体miRNA、成熟miRNA；初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；所述微小RNA是miR-1304。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微小RNA是成熟miR-1304。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断工具包括检测肺组织中权利要求1所述的微小RNA表达水平的试剂。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述诊断工具包括试剂盒、芯片、试纸、或高通量测序平台。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于权利要求1所述的微小RNA的部分或全部序列；所述试纸包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针。
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miRNA analysis of formalin-fixed squamous cell carcinomas of the tongue is affected by age of the samples;M. RENTOFT et al.;《INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY》;20110101;第38卷;摘要，第61页第4段至第66页第1段，表IV

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