CN105349666B - 缺血性脑卒中miRNA标记物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种miRNA标记物，该miRNA标记物是miRNA‑4252。通过检测miRNA‑4252的表达水平可用于诊断患者是否患有缺血性脑卒中。经实验证明，miRNA‑4252可有效区分缺血性脑卒中患者和健康人。在此基础上，miRNA‑4252可以用于制备诊断缺血性脑卒中的产品。本发明大大能提高了缺血性脑卒中诊断的敏感性和特异性，实现缺血性脑卒中的早期诊断。

Description

缺血性脑卒中miRNA标记物

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种缺血性脑卒中miRNA标记物及其应用。

背景技术

脑卒中是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞造成血液循环障碍而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，缺血性脑卒中是指局部脑组织包括神经细胞、腔质细胞和血管由于血液供应缺乏而发生的坏死。我国每年新发脑卒中病人约150～200万人，其中缺血性脑卒中占脑卒中病例的60～80％，颈内动脉和椎动脉闭塞和狭窄可引起缺血性脑卒中，年龄多在40岁以上，且男性较女性多，严重者可引起死亡。

miRNA是天然存在于体内的21-22nt的非编码RNA分子，是一类通过转录后基因沉默对靶基因表达进行调节的RNA。据估计，生物体内约有1/3的基因受miRNA的调控。miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA 5’-UTR或者3’-UTR中的互补序列相结合，抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。

检测miRNA的表达水平可以为缺血性脑卒中的临床诊断提供参考。而miRNA的异常表达直接导致一些与疾病发生相关基因的表达异常，诱发疾病的发生。虽然已有报道证明miRNA可以通过调控靶基因mRNA的表达，在缺血性脑卒中中起重要作用，但是其还没有应用到临床上。目前，尚无快速简便的实验室血液检测方法用于缺血性脑卒中的筛查和早期检测。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于诊断缺血性脑卒中的miRNA标记物。相比传统的缺血性脑卒中的诊断方法，使用miRNA标记物来诊断缺血性脑卒中具有及时性、灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，从而采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了miRNA-4252在制备诊断缺血性脑卒中的产品中的应用，所述miRNA-4252选自以下组中的至少一种：miRNA-4252初始miRNA、miRNA-4252前体miRNA、成熟miRNA-4252；所述miRNA-4252初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA-4252；所述miRNA-4252前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA-4252。

进一步，所述miRNA-4252是成熟miRNA-4252，核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO.1所示。

进一步，诊断缺血性脑卒中的产品包括芯片或试剂盒；其中，所述芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于所述miRNA-4252的部分或全部序列；所述试剂盒包括用于检测所述miRNA-4252的表达水平的试剂。

应当知道，本发明的miRNA-4252包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示完整miRNA-4252核酸分子相同的功能，它们可能通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。

本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miRNA-4252功能的条件下，对miRNA-4252进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。

在本发明的一些具体的实施方式中，所述miRNA-4252是成熟miRNA-4252。

虽然在某些具体实施方式中所使用的是成熟miRNA-4252，但是本领域技术人员可以预期，初始miRNA(pri-miRNA-4252)、前体miRNA(pre-miRNA-4252)将可以获得与成熟miRNA-4252同样的技术效果，因为细胞有能力进一步将初始miRNA(pri-miRNA-4252)、前体miRNA(pre-miRNA-4252)加工为成熟miRNA-4252。

本发明的miRNA-4252核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟的miRNA-4252主要呈单链形式，而miRNA-4252前体是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。

本发明提供了miRNA-4252在高通量测序平台中的应用。通过高通量测序能获知待检测样本中miRNA-4252的表达水平，将待测样本的结果同健康人的样本相比，容易判断待测样本是否患有缺血性脑卒中以及患缺血性脑卒中的风险。因此，通过高通量测序获得miRNA-4252表达水平与缺血性脑卒中相关性的应用同样包含在本发明的保护范围之内。

本发明提供了一种诊断缺血性脑卒中的产品，所述产品能够通过检测miRNA-4252的表达水平来诊断缺血性脑卒中。

进一步，上面所述的产品包括芯片或试剂盒。其中，所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于上面所述的miRNA-4252的部分或全部序列；所述试剂盒包括用于检测上面所述的miRNA-4252的表达水平的试剂。

进一步，上面所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断缺血性脑卒中的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断缺血性脑卒中的情况也包含在本发明的保护范围之内。

进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

进一步，所述试剂盒包括SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增miRNA-4252和内参的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。

进一步，所述扩增miRNA-4252的引物对序列如下：正向引物序列为5’-GGCCACTGAGTCAGCACCA-3’，反向引物序列为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；所述内参为U6snRNA，扩增内参的引物对序列如下：正向引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

进一步，所述试剂盒还包括M-MLV逆转录体系，所述M-MLV逆转录体系包括T重复寡核苷酸Oligo-dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。

进一步，可以将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断缺血性脑卒中的情况也包含在本发明的保护范围之内。

本发明的miRNA-4252可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miRNA-4252的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核表达载体。

病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。

真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。

可以表达miRNA-4252的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找miRNA-4252在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定miRNA-4252初始miRNA的位置，在miRNA-4252初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达miRNA-4252的DNA片段。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了miRNA-4252表达水平与缺血性脑卒中的发生发展相关，通过检测受试者miRNA-4252的表达水平，可以判断受试者是否患有缺血性脑卒中或者判断受试者是否存在患有缺血性脑卒中的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

附图说明

图1显示利用QPCR检测miRNA-4252在缺血性脑卒中患者血液中的表达情况。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 与缺血性脑卒中相关的miRNA的筛选

1、样本获取：各收集10例健康人和缺血性脑卒中患者的血液样本。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、样本总RNA的提取

使用U-gene公司的Blood RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：

1)每体积新鲜血液(最大1ml)加入5倍体积的1×XR-I缓冲液，例如：每1ml血液中加入5ml的XR-I缓冲液，漩涡振荡混匀；

2)冰浴15min，在漩涡振荡器上迅速混匀两次，溶液变清表明红血细胞已裂解。如果个别样品的血细胞计容或ECR升高时，延长冰浴时间至20min；

3)4℃下450g离心10min沉淀白细胞，完全弃去含有裂解红细胞的上清液；

4)用2倍体积的XR-I缓冲液洗涤在步骤1中用到的每体积的全血，漩涡振荡以完全悬浮细胞；

5)4℃下450g离心10min，并再次去掉上清；

6)往成团的白细胞中加入XR-II溶解缓冲液/2－巯基乙醇，漩涡振荡充分混匀。500μl以下的全血就加入400μl XR-II溶解缓冲液，如果在步骤1中用到的是0.5～1.0ml的血液，则加650μl XR-II溶解缓冲液。在加入XR-II溶解缓冲液之后，样品应保存于－70℃的条件下；

7)加入等体积的70％乙醇，漩涡振荡混匀；

8)把所有的样品(包括所有的沉淀)加到一个固定在一个2ml收集试管上的Mu-PuRNA分离柱上。10,000g离心的15s，弃去流出液体；

9)重复步骤7、8；

10)用移液枪吸750μl RNA洗涤缓冲液I直接加到自旋柱上洗涤柱子。如上方法离心并弃去2ml收集管；

11)把柱子装到提供的一干净的新2ml收集试管上，加入500μl用乙醇稀释的RNA洗涤缓冲液II，离心，弃去流出液，重复使用该收集试管；

12)加入400μl Wash solution，14000g离心2min；

13)再用500μl的RNA洗涤缓冲液II洗涤柱子，离心并弃去流出液。然后用一个空的收集试管，极速离心空柱子1min以甩干Mu-Pu柱基质；

14)洗脱RNA。把柱子转移到一干凈的1.5ml离心管(试剂盒无提供)并用50～100μl的DEPC-水(由试剂盒提供)洗脱RNA。确保加入的DEPC-水是直接加在柱基质上，极速离心1min；

15)加入100μl Enzyme Incubation Buffer和15μl DNase I，14000g离心1min；

16)将收集管中的溶液重新移入柱，室温放置15min；

17)将收集到的RNA保存在-70℃冰箱中，待用。

3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为28S:18S≥2可以初步判定总RNA质量较好。

4、miRNA的提取和标记

1)用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA，具体操作按照相应说明书。样品用T4 RNA连接酶标记步骤依照Thomson的方法。miRNA标记方法大致如下：1.4μg miRNA和500ng 5’-磷酸盐-胞嘧啶-尿嘧啶cy3-3’(Dharmacon，Chicago，USA)及2单位T4 RNAligase(NEB，Ipswich，USA)，于4℃孵育2小时。每份miRNA样品均设等量的相应阴性对照。

2)标记的RNA用0.3M醋酸钠和2.5倍体积的乙醇进行沉淀，再用15μl含3×SSC、0.2％SDS和15％甲酰胺的杂交液重悬，所有的杂交重复两次，杂交用LifterSlipTM(Erie，PA USA)以保证杂交液在芯片和盖片之间均匀流动。

3)将杂交室放在杂交仪BioMixerTMII上(CapitalBio Corp，Beijing，China)于42℃水浴过夜，用洗液洗两遍。

5、miRNA芯片操作：

miRNA芯片，采用博奥生物有限公司的miRNA表达谱芯片(单通道芯片)，按照说明书的指示进行miRNA表达谱的检测。

6、结果：

分析miRNA芯片表达谱的检测结果，可知miRNA-4252在缺血性脑卒中患者血液和健康人的血液中的表达存在显著差异，与健康人的血液相比，在缺血性脑卒中患者血液中的miRNA-4252的水平显著升高。

实施例2 QPCR验证差异表达的miRNA-4252

1、根据miRNA芯片的检测结果选择miRNA-4252进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择缺血性脑卒中患者血液样本和健康人血液样本各80例。

2、RNA提取过程同实施例1。

3、逆转录：

1)将10pg-1μg的总RNA模板与2μl 10×缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl polyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。

2)反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min。

3)立即冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。

4)将上述20μl反应混合物与4μl 5×缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，42℃孵育1h。

4、QPCR反应：

1)引物设计

扩增miRNA-4252的引物

正向引物：GGCCACTGAGTCAGCACCA(SEQ ID NO.2)

反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.3)

扩增U6 snRNA的引物

正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQ ID NO.4)

反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQ ID NO.5)

2)按照表1配制PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表1PCR反应体系

	体积
		SYBR Green聚合酶链式反应体系	12.5μl
正向引物	1μl
		反向引物	1μl
cDNA模板	2μl
		ddH2O	8.5μl
总体积	25μl

3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，以U6 snRNA作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

如图1所示，与健康人的血液相比，缺血性脑卒中患者血液中的miRNA-4252的表达水平显著升高，与miRNA芯片结果一致。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.检测miRNA-4252的试剂在制备诊断缺血性脑卒中的产品中的应用，其特征在于，所述miRNA-4252选自以下组中的至少一种：miRNA-4252初始miRNA、miRNA-4252前体miRNA、成熟miRNA-4252；所述miRNA-4252初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA-4252；所述miRNA-4252前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA-4252。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA-4252是成熟miRNA-4252。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断缺血性脑卒中的产品包括芯片或试剂盒；其中，所述芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于权利要求1所述的miRNA-4252的部分或全部序列；所述试剂盒包括用于检测权利要求1所述的miRNA-4252的表达水平的试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增miRNA-4252和内参的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述扩增miRNA-4252的引物对序列如下：正向引物序列为5’-GGCCACTGAGTCAGCACCA-3’，反向引物序列为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述内参为U6snRNA，扩增内参的引物对序列如下：正向引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

7.根据权利要求3-6任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括M-MLV逆转录体系，所述M-MLV逆转录体系包括T重复寡核苷酸Oligo-dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。