CN109371124A - miR-6802-3p在绝经后妇女骨质疏松症早期诊断中的应用 - Google Patents

miR-6802-3p在绝经后妇女骨质疏松症早期诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了miR‑6802‑3p在绝经后妇女骨质疏松症早期诊断中的应用。本发明通过测序筛选出在绝经后妇女骨质疏松症患者和正常对照之间存在差异表达的miRNA，后经大样本QPCR实验证明miR‑6802‑3p确实在绝经后妇女骨质疏松症患者血液中的含量显著上调，因此认为miR‑6802‑3p可以作为诊断绝经后妇女骨质疏松症的分子标志物以用于开发绝经后妇女骨质疏松症的诊断产品。

Description

miR-6802-3p在绝经后妇女骨质疏松症早期诊断中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及miR-6802-3p在绝经后妇女骨质疏松症早期诊断中的应用。
背景技术
骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量低下、骨微结构破坏、导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病(WHO)。2001年美国国立卫生研究院(NIH)提出骨质疏松症是以骨强度下降、骨折风险性增加为特征的骨骼系统疾病，骨强度反映了骨骼的两个主要方面，即骨矿密度和骨质量。
该病可发生于不同性别和任何年龄，但多见于绝经后妇女和老年男性。骨质疏松症分为原发性和继发性两大类。原发性骨质疏松症又分为绝经后骨质疏松症(I型)、老年性骨质疏松症(II型)和特发性骨质疏松(包括青少年型)3种。绝经后骨质疏松症一般发生在妇女绝经后5-10年内，因绝经后卵巢合成雌激素减少所致，为骨量减少和骨组织微结构破坏，以致骨骼脆性增高从而易发生骨骼的一种全身性疾病。女性绝经后骨密度(bonemineral density，BMD)丢失速度很快，年丢失率为1.5％-2.5％，从而导致骨密度急剧下降，使得绝经后女性成为骨质疏松症的高发人群。
具有以下高危因素者易患绝经后骨质疏松症：
雌激素缺乏：雌激素缺乏，被认为是引起绝经后骨质疏松症的主要因素，绝经后卵巢功能减退，分泌雌激素水平降低，同时伴有维生素D、钙的摄入不足，造成继发性骨丢失。
遗传因素：骨质疏松症多见于白种人，其次是黄种人，而黑种人最少。骨密度为诊断骨质疏松症的主要指标，骨密度值主要决定于遗传因素，其次是受环境因素的影响。
营养因素：钙缺乏，已发现青幼年时钙的摄入量与成年人的骨量峰直接有关。低钙饮食(<10mg·kg-1·d-1)者有3/4患有骨质疏松，而高钙饮食(10mg·kg-1·d-1)者有1/4患有骨质疏松；长期蛋白质营养缺乏，造成血浆蛋白降低，骨基质合成不足，新骨生成落后，如同是伴有钙的缺乏，骨质疏松会加快出现；维生素C缺乏，是骨基质羟脯氨酸合成不可缺少的，如缺乏可使骨基质合成减少。
废用因素：肌肉对骨组织是一种机械力的影响，肌肉发达则骨骼粗壮，骨密度高。老年人活动减少，肌肉强度减弱，机械刺激减少，骨量减少。同时肌肉强度的减弱和协调障碍是老年人较容易摔倒，伴骨量减少时，则已发生骨折。
其他因素：酗酒、嗜烟、过多咖啡和咖啡因的摄入、肝素使用均是本病的危险因素。酒精中毒可影响钙的吸收，酒精也直接作用于成骨细胞，抑制骨的形成。咖啡因摄入过多是尿钙和内源性粪钙丢失：肝素可引起骨质疏松，一般研究表明每天接受1500U以上的肝素治疗患者中60％的发展成为骨质疏松症。
此外，年龄增长、服用皮质类固醇和抗惊厥药物、具有骨质疏松症家族史或具有影响骨量的特殊基因、早绝经或绝经前行双侧卵巢切除术也是绝经后骨质疏松症的高危因素。
绝经后骨质疏松症早期可以没有任何症状，骨质在不知不觉中流失，直到发生骨折后才被意识到，亦被称之为“无声杀手”，由于早期没有典型的临床症状，所以常常不能引起医患足够的重视，以致许多患者只能无奈的面对从病痛到恢复的漫漫长路。
诊断骨质疏松症，首先必须进行骨密度的测定。骨密度实际上就是表示骨的健康程度，或是反过来说表示骨的老化程度。常用的检测手段：
X线摄片法：使用历史最早，但由于有放射性，其测验结果不能量化，已逐渐被取代。
单光子测定仪：费用低、方便、辐射量小而安全。但因不能测躯干骨以及不能区别皮质骨、松质骨、软组织等而受限制，已逐渐被取代。
定量超声法：低廉、方便、又无放射性损伤。适合各年龄段人群的骨状态普查工作。不仅能检测骨密度，还能了解骨的质量即可反应骨的微结构及弹性。但目前只用于跟骨、胫骨和指骨，不能进行全身骨骼的检测。
双能X线吸收法：是目前最理想的测定法，是诊断骨质疏松症的金标准，国内外通用，可测全身各部位骨骼，也能测软组织厚度，但该设备数量较少且价格昂贵，因此对于骨质疏松症患者的诊断来说经济负担大。为此寻找一种敏感性高、准确度高且价格合理的诊断骨质疏松症的方法是亟待解决的问题。
miRNA是天然存在于体内的21-22nt的非编码RNA分子，是一类通过转录后基因沉默对靶基因表达进行调节的RNA。据估计，生物体内约有1/3的基因受miRNA的调控。miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA5’-UTR或者3’-UTR中的互补序列相结合，抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。
检测miRNA的表达水平可以为疾病的临床诊断提供参考。而miRNA的异常表达直接导致一些与疾病发生相关基因的表达异常，诱发疾病的发生。已有报道证明miRNA可以通过调控靶基因mRNA的表达，在疾病发生、发展及转移中发挥重要作用。在未来临床治疗中，miRNA不仅可以成为新的疾病早期诊断和疾病进程相关的标记物，而且也有望通过改变miRNA的表达或者其靶基因的表达治疗疾病。寻找和鉴定与疾病发生相关的miRNA及其靶基因为miRNA的临床治疗提供基础。
发明内容
本发明首次发现miR-6802-3p在绝经后妇女骨质疏松症患者血液中的含量比正常绝经后妇女高很多，miR-6802-3p的差异表达可作为诊断绝经后妇女骨质疏松症的一种方法，据此可以开发诊断绝经后妇女骨质疏松症的工具。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种微小RNA在制备绝经后妇女骨质疏松症诊断工具中的应用，所述微小RNA选自以下组：初始miRNA、前体miRNA、成熟miRNA；初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；所述微小RNA是miR-6802-3p。
应当知道，本发明的微小RNA包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示完整微小RNA核酸分子相同的功能，尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。
本领域人员应该了解，为了保证微小RNA的稳定性，可以在微小RNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对微小RNA碱基进行修饰，但是上述修饰不影响微小RNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miR-6802-3p功能的条件下，对miR-6802-3p进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
在本发明的一些具体的实施方式中，所述miR-6802-3p是成熟miR-6802-3p。
虽然在某些具体实施方式中所使用的是成熟miRNA，但是本领域技术人员可以预期，初始miRNA、前体miRNA将可以获得与成熟miRNA同样的技术效果，因为细胞有能力进一步将初始miRNA、前体miRNA加工为成熟miRNA。
本发明的微小RNA核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟miRNA主要呈单链形式，而前体miRNA是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
进一步，上述诊断工具包括但不限于，芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台。所述诊断工具包括用于检测样本中miR-6802-3p的表达水平的试剂。
进一步，所述样本的来源包括但不限于血液、尿液、泪液、唾液、组织液、脑脊液、汗液。在本发明的具体实施方案中，所述样本的来源是血液。
进一步，所述试剂盒包括针对miR-6802-3p的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miR-6802-3p的部分或全部序列；所述试纸包括针对miR-6802-3p的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对miR-6802-3p的引物和/或探针。
本发明提供了一种绝经后妇女骨质疏松症的诊断工具，所述诊断工具包括检测样本中miR-6802-3p表达水平的试剂。
进一步，所述样本的来源包括但不限于血液、尿液、泪液、唾液、组织液、脑脊液、汗液。在本发明的具体实施方案中，所述样本的来源是血液。
进一步，所述诊断工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。
进一步，所述试剂盒包括针对miR-6802-3p的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miR-6802-3p的部分或全部序列；所述试纸包括针对miR-6802-3p的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对miR-6802-3p的引物和/或探针。
进一步，所述试剂盒中的针对miR-6802-3p的引物和/或探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于检测前面所述的微小RNA表达水平的引物和/或探针。将多种微小RNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种微小RNA指标联合诊断绝经后妇女骨质疏松症的情况也包含在本发明的保护范围之内。
进一步，所述芯片上固定的所述寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于检测miR-6802-3p的表达水平的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断绝经后妇女骨质疏松症也包含在本发明的保护范围之内。
进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
本发明的miR-6802-3p可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miR-6802-3p的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核载体。
病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
可以表达微小RNA的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找微小RNA在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定初始miRNA的位置，在初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达微小RNA的DNA片段。
本发明中使用的“微小RNA”与“miRNA”、“miR”通用。
本发明中使用的“诊断绝经后妇女骨质疏松症”包括对绝经后妇女骨质疏松症的预判，即判断受试者是否存在患有绝经后妇女骨质疏松症的风险，也包括对绝经后妇女骨质疏松症的诊断，即判断受试者是否已经患有绝经后妇女骨质疏松症，也包括对绝经后妇女骨质疏松症预后的判断，即判断受试者是否存在复发的可能性或者判断受试者已经复发。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了miR-6802-3p与绝经后妇女骨质疏松症相关，通过检测受试者miR-6802-3p的表达，可以判断受试者是否患有绝经后妇女骨质疏松症、或者判断受试者是否存在患有绝经后妇女骨质疏松症的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-miR-6802-3p，相比传统的检测手段，微小诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现绝经后妇女骨质疏松症的早期诊断，从而降低绝经后妇女骨质疏松症的死亡率。
附图说明
图1显示利用QPCR检测miR-6802-3p在正常绝经后妇女和绝经后妇女骨质疏松症患者血液中含量的统计图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1测序筛选与绝经后妇女骨质疏松症相关的miRNA
1、研究对象及样本收集
3例绝经后妇女骨质疏松症患者及3名正常绝经后妇女，正常绝经后妇女作为对照。临床信息如表1所示。
表1研究对象临床信息
研究对象要求空腹至少12h，于次日清晨7：00～8：00室温下，抽取10ml静脉血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，提取外周血单个核细胞PBMCs，加入1ml Trizol试剂(Invitrogen公司)，充分混匀，-80℃保存标本，以用于RNA提取。所有的血样和病理结果应真实可靠，研究经伦理委员会批准，患者知情同意。
2、血液单核细胞RNA提取
将步骤(1)中的细胞融化，加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1分钟左右，室温下静置5分钟。4℃，12,000rpm离心15分钟后小心转移上清液入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70％乙醇，4℃，12000rpm离心洗涤沉淀5分钟。去上清，将沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解，测定OD260和OD280值。采用无RNA酶的DNA酶I处理，QIAGEN RNeasy试剂盒纯化总RNA，详细操作原理和方法见试剂盒说明书。
3、RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18SrRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。28S/18S≧1；RNA完整性：RIN值≧7.0。
4、sRNA文库构建
实验采用Illumina TruSeq Small RNA试剂盒构建文库，在总RNA中回收长度18-30nt RNA，通过RT-PCR逆转录成单键cDNA，cDNA扩增后，回收cDNA产物，建成小RNAs文库。
RNA提取与建库信息如表2所示。
表2RNA提取与建库信息
5、上机测序
从总RNA里面通过跑胶提取出18-30bp范围内的RNA，然后两端加上接头后再进行反转录PCR扩增，之后再库检后使用Illumina Hiseq 4000平台进行测序。
详细参考流程如下：
1)富集Small RNA：使用5μg-10μg RNA样品，然后用聚丙烯酰胺凝胶分离不同片段大小的RNA，选择18-30nt(14-30ssRNA Ladder Marker，TAKARA)条带回收。
2)5＇Adaptor ligation：5＇连接接头反应体系：反应条件：20℃，6h；聚丙烯酰胺凝胶分离不同片段大小的RNA；选择40-60nt条带回收。
3)3＇Adaptor ligation：3＇连接接头反应体系：反应条件：20℃，6h；用聚丙烯酰胺凝胶分离不同片段大小的RNA；选择60-80nt条带回收。
4)RT-PCR：反转录PCR：反应条件：65℃，10min；48℃，3min；42℃，1h；70℃，15min。
5)PCR扩增:反应条件：98℃,30s；12-15循环(98℃，10s，72℃，15s)；72℃，10min；4℃保存。
6)纯化PCR产物：PAGE纯化，选择～110bp条带回收，EB溶解。胶回收产物即为终文库。
7)文库质检:使用Agilent 2100Bioanalyzer和QPCR对文库质量进行检测。
8)上机测序：HiSeq4000上机测序，SE50策略。
6、生物信息学分析
1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads(用fastQC看一下测序数据的质量，拿到的数据完成处理时可跳过此步)；
2)用bowtie把reads map到基因组上。成熟miRNA和miRNA前体序列下载自miRBase，参考基因组为GRCh38；
3)用miRDeep2定量已知miRNA的表达；
4)在R环境下用DESeq2包比较两组的表达差异。
7、结果分析
显著差异miRNA筛选条件：P<0.05，|log2FC|>1。用以上标准筛选得到差异表达miRNA有33个，其中表达上调miRNA有18个，表达下调的miRNA有15个。结果显示，miR-6802-3p在正常绝经后妇女和绝经后妇女骨质疏松症患者中存在差异表达，在绝经后妇女骨质疏松症患者血液中miR-6802-3p的水平显著升高。
实施例2QPCR验证差异表达的miR-6802-3p
1、根据实施例1中测序结果选择miR-6802-3p进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择正常绝经后妇女和绝经后妇女骨质疏松症患者各30例，进行血液单核细胞的分离与保存。
2、RNA提取过程同实施例1。
3、逆转录：将10pg-1μg的总RNA模板与2μl 10*缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μlpolyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl 5*缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，42℃孵育1h。
4、QPCR反应：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，57℃55s)*42个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。扩增miR-6802-3p的正向引物序列为：5’-TTCACCCCTCTCACCTAAGCAG-3’(SEQ ID NO.1)，反向引物为通用反向引物(购自北京旷博生物技术有限公司)。以snRNA U6作为参照基因，其上游引物序列为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQ ID NO.2)；下游引物序列为：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID NO.3)。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、结果
结果显示，与正常绝经后妇女的平均水平比，30例绝经后妇女骨质疏松症患者血液中的miR-6802-3p的表达水平均显著上调。统计结果如图1所示，与正常绝经后妇女相比，绝经后妇女骨质疏松症患者血液中miR-6802-3p的表达水平显著上调，与测序结果一致(*P＜0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 王冉东
<120> miR-6802-3p在绝经后妇女骨质疏松症早期诊断中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttcacccctc tcacctaagc ag 22
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (10)

1.微小RNA在制备绝经后妇女骨质疏松症诊断工具中的应用，其特征在于，所述微小RNA选自以下组：初始miRNA、前体miRNA、成熟miRNA；初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；所述微小RNA是miR-6802-3p。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微小RNA是成熟miR-6802-3p。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断工具包括检测样本中权利要求1所述的微小RNA表达水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述样本的来源包括血液、尿液、泪液、唾液、组织液、脑脊液、汗液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述诊断工具包括试剂盒、芯片、试纸、或高通量测序平台。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于权利要求1所述的微小RNA的部分或全部序列；所述试纸包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针。
7.一种绝经后妇女骨质疏松症的诊断工具，其特征在于，所述诊断工具包括检测样本中权利要求1所述的微小RNA表达水平的试剂。
8.根据权利要求7所述的诊断工具，其特征在于，所述样本的来源包括血液、尿液、泪液、唾液、组织液、脑脊液、汗液。
9.根据权利要求7所述的诊断工具，其特征在于，所述诊断工具包括试剂盒、芯片、试纸、或高通量测序平台。
10.根据权利要求9所述的诊断工具，其特征在于，所述试剂盒包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于权利要求1所述的微小RNA的部分或全部序列；所述试纸包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针。
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