CN108728525B - 蛛网膜下腔出血的循环microRNA生物标记物和其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了表明不良预后的蛛网膜下腔出血的生物标记物，所述不良预后为发生迟发性脑梗塞，所述标记物由以下miRNA组成：miR‑4463,miR‑4532和miR‑1290，还可以包括miR‑4793。本发明还提供了采用所述生物标记物诊断蛛网膜下腔出血或其预后的方法。本发明还提供了包含所述生物标记物诊断蛛网膜下腔出血或其预后的试剂盒和芯片，及其制备方法。

Description

蛛网膜下腔出血的循环microRNA生物标记物和其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和疾病诊断试剂制备领域。具体的，本发明涉及蛛网膜下腔出血和其后发生迟发性脑梗塞的microRNA生物标记物，以及所述microRNA在制备用于诊断或检测蛛网膜下腔出血和其后发生迟发性脑梗塞的试剂盒或基因芯片的应用，特别是用在外周血样品，包括血清和血浆样品中。
背景技术
蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)占中风的3-5 ％左右，而且是年轻人中风的重要原因，在全球带来严重的社会经济负担。三分之一以上的SAH患者患有认知障碍，生活质量受损，可能无法回到患病前的工作。
迟发性脑梗塞(Delayed cerebral infarction，DCI)在高达44％的 SAH患者中发生，通常在初次出血后第4至7天开始。DCI是一个公认的SAH后神经性影响的临床相关替代性标志。据已知报道，引起蛛网膜下腔出血后的迟发性脑梗塞的相关因素包括年龄，初期神经功能损伤，脑室内出血，蛛网膜下腔出血负荷和动脉瘤大小等。
微小RNA(miRNA)是一种小的(19-23bp)，非编码和非常保守的RNA分子。miRNA在转录后通过抑制mRNA翻译或使mRNA分子去稳定(destablize)来调节基因的表达。人类基因组中有1,881个 miRNA，其中296个在miRBase 21.0被注释为高置信度。循环miRNAs 已经被证明是脑血管病症的可能的诊断或预后生物标志物，这些脑血管病症包括例如在心肌梗塞，动脉粥样硬化，中风，脑梗死，高血压，颅内动脉瘤(IA)和蛛网膜下腔出血(SAH)等。
对蛛网膜下腔出血后的迟发性脑梗塞做出及时的预测和诊断对及时防治有重要的意义。然而本领域还需要一种对蛛网膜下腔出血后的迟发性脑梗塞的诊断，特别是通过特异性相关miRNA的表达水平来对蛛网膜下腔出血后的迟发性脑梗塞进行准确和快速的检测或预测的方法、试剂盒或基因芯片。
发明内容
本发明提供了表明蛛网膜下腔出血后的迟发性脑梗塞的由miRNA 组成的生物标记物。本发明提供了通过在外周血样品，包括血清和血浆样品中检测所述生物标记物的miRNA的表达水平变化来检测或诊断蛛网膜下腔出血的预后(特别是对迟发性脑梗塞的预后)的方法以及用于这些方法的试剂盒或基因芯片。
在本发明的一个方面，提供了表明不良预后的蛛网膜下腔出血 (SAH)的生物标记物，所述不良预后为发生迟发性脑梗塞(DCI)，所述标记物包括以下miRNA：miR-4463,miR-4532，miR-1290， miR-4793，miR-421，miR-4492，miR-574，miR-4689，miR-4449， miR-93-5p，miR-4497和miR-297。上述miRNA中的一个，或其中多个miRNA的任意组合，可用于诊断诊断蛛网膜下腔出血的不良预后，，所述不良预后为发生迟发性脑梗塞(DCI)。
在本发明的一个方面，提供了表明不良预后的蛛网膜下腔出血 (SAH)的生物标记物，所述不良预后为发生迟发性脑梗塞(DCI)，所述标记物由以下miRNA组成：miR-4463,miR-4532和miR-1290。在本发明的其中又一个方面，所述标记物还包括miR-4793。在本发明的更进一个方面，所述标记物还包括一个或多个以下miRNA：miR-421， miR-4492，miR-574，miR-4689，miR-4449，miR-93-5p，miR-4497和 miR-297。
本发明提供了通过测量下述miRNA的表达水平来诊断蛛网膜下腔出血的不良预后的方法：miR-4463,miR-4532和miR-1290。在本发明的其中又一个方面，所述标记物还包括miR-4793。所述不良预后为发生迟发性脑梗塞(DCI)。在本发明的其中一个方面，所述方法通过下述步骤诊断蛛网膜下腔出血(SAH)的不良预后：a.测量受试者样品中所述miRNA的表达水平；b.比较受试者样品中所述miRNA的表达水平与无患病对照样品中所述miRNA的表达水平。在本发明的其中又一个方面，当受试者样品中所述miRNA的表达水平与无患病对照样品中对应miRNA的水平相比，测试样品中所述miRNA的水平的降低，指示着不良预后，即发生DCI的可能性较大。在本发明的其中一个方面，其中所述样品为外周血样品，例如血清和血浆样品中。
在本发明的更进一个方面，上述本发明的通过测量miRNA的表达水平来诊断蛛网膜下腔出血(SAH)的不良预后的方法中还包括测量一个或多个以下miRNA的表达水平：miR-421，miR-4492，miR-574， miR-4689，miR-4449，miR-93-5p，miR-4497和miR-297。
本发明还提供了测量miRNA的表达水平的试剂在用于制备诊断蛛网膜下腔出血(SAH)的预后的试剂盒或装置中的用途，其中包括用测量下述miRNA的表达水平的试剂：miR-4463,miR-4532和miR-1290。在本发明的其中又一个方面，其中还包括用于测量下述miRNA的表达水平的试剂：miR-4793。所述不良预后为发生迟发性脑梗塞(DCI)。在本发明的其中一个方面，其中所述试剂盒和装置通过下述步骤诊断蛛网膜下腔出血(SAH)：a.测量受试者样品中所述miRNA的表达水平；b.比较受试者样品中所述miRNA的表达水平与无患病对照样品中所述miRNA的表达水平。在本发明的其中又一个方面，当受试者样品中所述miRNA的表达水平与无患病对照样品中对应miRNA的水平相比，测试样品中所述miRNA的水平的降低，指示着不良预后，即发生DCI的可能性较大。在本发明的其中一个方面，其中所述样品为外周血样品，例如血清和血浆样品中。
在本发明的更进一个方面，上述本发明的测量miRNA的表达水平的试剂在用于制备诊断蛛网膜下腔出血(SAH)的预后的试剂盒或装置中的用途中，所述测量miRNA的表达水平的试剂还包括测量一个或多个以下miRNA的表达水平的试剂：miR-421，miR-4492，miR-574， miR-4689，miR-4449，miR-93-5p，miR-4497和miR-297。
本发明还提供了用于诊断蛛网膜下腔出血(SAH)的预后的试剂盒或装置中，其中包括用于测量下述miRNA的表达水平的试剂： miR-4463,miR-4532和miR-1290。在本发明的其中又一个方面，其中还包括用于测量下述miRNA的表达水平的试剂：miR-4793。所述不良预后为发生迟发性脑梗塞(DCI)。在本发明的其中一个方面，其中所述试剂盒和装置通过下述步骤诊断蛛网膜下腔出血(SAH)：a.测量受试者样品中所述miRNA的表达水平；b.比较受试者样品中所述 miRNA的表达水平与无患病对照样品中所述miRNA的表达水平。在本发明的其中又一个方面，当受试者样品中所述miRNA的表达水平与无患病对照样品中对应miRNA的水平相比，测试样品中所述miRNA 的水平的降低，指示着不良预后，即发生DCI的可能性较大。在本发明的其中一个方面，其中所述样品为外周血样品，例如血清和血浆样品中。
在本发明的更进一个方面，上述本发明的用于制备诊断蛛网膜下腔出血(SAH)的预后的试剂盒或装置中，还包括测量一个或多个以下 miRNA的表达水平的试剂：miR-421，miR-4492，miR-574，miR-4689， miR-4449，miR-93-5p，miR-4497和miR-297。
在本发明的其中又一个方面，前述试剂盒中包含所述miRNA的基因产物。在所述试剂盒中，还可以包含检测所述miRNA的基因产物的试剂，例如与所述基因产物结合的抗体或抗体片段。所述试剂还可被标记，例如被放射性标记或生物素标记等。
在本发明的其中又一个方面，前述装置为基因芯片，或称为微矩阵。所述芯片包括对针对miRNA的抗体和标记。
在本发明中，对miRNA的表达水平的测量通过检测转录的多核苷酸或其部分的存在来进行，其中转录的多核苷酸包含miRNA的编码区。
在本文中，术语“微小RNA”、“microRNA”、“miR基因产物”、“miR”和“miRNA”互换使用，是指来自miR基因的未加工的或加工过的RNA转录物。由于miR基因产物不翻译成蛋白，术语“miR基因产物”不包括蛋白。未加工的miR基因转录物也称作“miR前体”，通常包含长度为约70-100个核苷酸的RNA转录物。miR前体可以消化加工成有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。该有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也称作“加工过的miR基因转录物”或“成熟的miRNA”。本发明的miRNA主要是指哺乳动物的miRNA，特别是指人的miRNA。
所述有活性的19-25个核苷酸的RNA分子可以通过天然加工途径 (例如，使用完整细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶，例如分离的Dicer,Argonaut,或RNA酶III)从miR前体得到。应当理解，所述有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也可以通过生物或化学合成直接生成，不必从miR前体加工。当在本文中用名称提及miRNA时，该名称对应着前体和成熟形式两者，除非另有说明。
本发明的miRNA主要是指人的miRNA。例如，在本文中，“miR-4433”也代表“hsa-miR-4433”。在本发明中涉及的miRNA包括其miRNA家族，其家族成员和序列在例如http:// www.mirbase.org/等网站公开。
在本文中，蛋白符号不用斜体，并全部大写；基因符号使用斜体。但有时在本文中基因符号也不使用斜体。例如有时本文中的miRNA “miR-4463”也写为“miR-4463”。
有关miRNA的序列如下：
Figure BDA0001273983390000061
Figure BDA0001273983390000071
可以测量从受试者得到的生物样品的细胞中的miR基因产物的水平。例如，通过常规活检技术，可以从被怀疑患有肺癌的受试者取出组织样品。在另一个实施方案中，可以从受试者取出血液样品，并通过标准技术，分离白细胞用于DNA提取。优选地，在放疗、化疗或其它治疗性处理之前，从受试者得到血液或组织样品。相应的对照组织或血液样品或对照参照样品，可以从受试者的未受影响的组织、从正常人个体或正常个体的群体、或从与受试者样品中大多数细胞相对应的培养细胞得到。然后与来自受试者的样品一起，加工处理对照组织或血液样品，从而可以将来自受试者样品的细胞中从给定miR基因产生的miR基因产物的水平与来自对照样品的细胞的相应miR基因产物水平相对比。或者，可以与测试样品单独分开地得到和加工处理参照样品(例如在不同时间)，并将来自测试样品的细胞中从给定miR基因产生的miR基因产物的水平与来自参照样品的相应的miR基因产物水平相对比。
在一个实施方案中，测试样品中至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达被“增量调节”)。如本文使用的，当来自受试者的细胞或组织样品中miR 基因产物的量大于对照细胞或组织样品中相同基因产物的量时，该miR 基因产物的表达被“增量调节”。在另一个实施方案中，测试样品中至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达被“减量调节”)。如本文使用的，当从来自受试者的细胞或组织样品的基因产生的miR基因产物的量小于从对照细胞或组织样品中相同基因产生的量时，该miR基因产物的表达被“减量调节”。可以相对于一种或多种RNA表达标准，测定对照和正常样品中的相对miR基因表达。所述标准可包括，例如，零miR基因表达水平,标准细胞系中的miR基因表达水平，受试者的未受影响的组织中的miR基因表达水平，或以前对正常人对照群体得到的miR基因表达的平均水平。
使用适用于检测生物样品中的RNA表达水平的任意技术，可以测量样品中miR基因产物的水平。用于测定生物样品(例如，细胞，组织) 中RNA表达水平的合适技术(例如，RNA印迹分析，RT-PCR，原位杂交)是本领域技术人员已知的。
通过逆转录miR基因转录物，随后通过聚合酶链式反应(RT-PCR) 扩增逆转录的转录物，也可以测定细胞中miR基因转录物的相对数目。可通过与内部标准例如来自存在于相同样品中的“管家”基因的mRNA 的水平比较，来定量miR基因转录物的水平。用作内部标准的合适的“管家”基因包括例如肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。用于定量和半-定量RT-PCR的方法和其变化形式，是本领域技术人员众所周知的。
另外，还可构建基因芯片(即＝微阵列)的寡物文库，其包含对于一组 miR基因特异性的一组寡核苷酸(例如，寡脱氧核苷酸)探针。通过使用该微阵列，可通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸，然后使其与微阵列上的探针寡脱氧核苷酸杂交，从而产生杂交或表达谱，来测定生物样品中多种微小RNA的表达水平。然后科将测试样品的杂交谱与对照样品进行比较，以确定在实体癌细胞中具有改变的表达水平的微小RNA。如本文所用的，“探针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”是指能够与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”是指待检测(例如通过杂交)的分子。“miR-特异性的探针寡核苷酸”或“对miR特异性的探针寡核苷酸”是指具有经选择与特定miR 基因产物杂交或与该特定miR基因产物的逆转录物杂交的序列的探针寡核苷酸。
可以从由已知的miRNA序列产生的基因特异性寡核苷酸探针制备基因芯片，即微阵列。
附图说明
图1为对样品的miRNA实时荧光定量PCR测量和分析图。
图2为对样品中的本发明的miRNA组合(即miR-4463,miR-4532, 和miR-1290，以及miR-4793)在发生DCI的SAH和无发生DCI的SAH 患者的血液样品中的表达水平的LASSO算法分析以及结果示意图。
图3为对样品中的本发明的miRNA的组合(即miR-4463,miR-4532, 和miR-1290，以及miR-4793)在发生DCI的SAH和无发生DCI的SAH 患者的血液样品，以及在对照组血液样品中的表达水平的LASSO算法分析以及结果示意图。
图4本发明的生物标记物中的miRNA(即miR-4463,miR-4532,和 miR-1290，以及miR-4793)的下游靶标分析图。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实施例1病人和样品
该研究获得香港新界东医院联网-中文大学(NTEC-CUHK)临床研究伦理联合委员会批准，并获得所有参与患者或其最近血亲的书面知情同意书。在健康对照(N＝20)，发生迟发性脑梗塞(DCI)的蛛网膜下腔出血(SAH)患者(N＝20)的SAH后第7天，无发生DCI的 SAH患者(N＝20)的SAH后第7天，收集外周血miRNA。SAH患者自2012年至2013年期间来自香港中文大学威尔斯亲王医院。破裂性脑通过计算机断层扫描血管造影(CTA)诊断。相对于SAH患者，健康对照(n＝20)是从没有重大医学风险(包括无吸烟史和高血压) 的SAH患者家属招募的。病人情况和体征如表1所示。
表1受试者体征
Figure BDA0001273983390000101
表中数据为％(N),平均值±SD,或中位数。
其中：GCS,格拉斯哥昏迷分级(Glasgow Coma Scale)；IVH,脑室内出血(Intraventricular hemorrhage)；mRS，改良Rankin量表评分 (modified Rankin Scale)；3mo,3个月；WFNS Grade,世界神经外科学会分级(World Federation of NeurosurgicalSocieties Grade)
实施例2迟发性脑梗塞(DCI)定义
在本研究中，迟发性脑梗塞(DCI)被定义为在排除手术相关梗塞 (Procedurerelated infarction)后，由CT鉴定的脑梗塞(Wong GK等， Journal of neurology,neurosurgery,and psychiatry.2012；83:1112-1117； Vergouwen MD等，Proposal of amultidisciplinary research group.Stroke； a journal of cerebralcirculation.2010；41:2391-2395)。手术相关梗塞是指治疗后在约12-24h时在术后CT显示的低密度区。所有参与研究的病人在2-3周后进行CT延时扫描。DCI由两个神经放射医师达至一致同意确诊。
实施例3实时荧光定量PCR
根据标准程序采用EDTA管获得外周血样品。将样品立即置于冰上，并以在4℃，1000g离心15分钟。收集血浆部分，在-80℃等分分储。根据常规方法进行RNA分离和定量实时PCR，包括通过将20％ w/v CaCl2(Sigma，St.Louis，MO)加入到血浆样品中来制备血清，然后凝固过夜并离心。根据制造商的说明书，使用miRNeasy血清/血浆试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从得到的血清样品中分离总RNA。提取的RNA的量由Nanodrop 2000UV-Vis分光光度计(Thermo Scientific，Waltham，MA)测量。用Applied Biosystems SDS软件(Applied Biosystems，Waltham，MA)对Ct值和熔解曲线进行分析。
本研究对总共28个特定的miRNA进行表达分析。这28个miRNA 是从与SAH相关的99种可能异常调控(deregulated)的miRNAs中(Su XW等，PLoS One.2015；10:e0144724)，选择了在发生DCI和无发生 DCI的SAH患者之间存在差异调节的前20个miRNA，以及选择了在SAH患者与健康对照之间存在差异调节的前8个miRNA(其中有两个与前述20个miRNA有重叠)，以及miR-132-3p和miR-324-3p共有。表2是本研究中使用的miRNAs表达谱的qPCR引物的列表。
表2用于对miRNA进行qPCR的对应引物
Figure BDA0001273983390000121
实施例4统计分析方法
使用R package 3.0.1(R Foundation for Statistical Computing，Austria，Austria)分别使用来自stats包的函数pHeatmap和prcomp来计算并显示具有分层聚类和PCA(主成分分析)的热图。采用R package pROC用于绘制和可视化ROC曲线，计算AUC和置信区间以评估基于miRNA的分类器(miRNA-based classifier)的有效性(Robin X,等，BMCBioinformatics.2011；12:77)。使用不同的R package和函数构建四个分类模型来找到可以区分发生DCI或无发生DCI的SAH 患者的分类器，即：线性支持向量机(the linearsupport vector machine， L-SVM：R package e1071，function svm，kernel＝“linear”)，非线性支持向量器(the non-linear support vector machine，Non-L-SVM：R packagee1071，function svm，kernel＝“redial”)，线性判别分析(linear discriminantanalysis,LDA：R package MASS，function lda)和逻辑回归(LR：R package stats，function glm，family＝“binomial”)(Lin XJ 等，Lancet Oncol.2015；16:804-815)。采用R package glmnet用于通过补偿最大似然度拟合LASSO回归模型来定义基于miRNA的分类器 (Friedman J等，J Stat Softw.2010；33:1-22)。基于交叉验证 (cross-validation)的λ值为0.07765104。采用t检验计算p值。p<0.05 的值被认为具有统计学意义。
实施例5发生DCI或无发生DCI的SAH相关miRNA的分类群聚 (Hierarchicalclustering)分析
对来自以下三组被测者的28个miRNA进行分类群聚来对miRNA 的平均表达进行作图分析：发生DCI的SAH、无发生DCI的SAH和健康对照。根据制造商提供的操作方法手册，采用芯片Affymetrix GeneChip miRNA3.0 Arrays Kit(Affymetrix，Santa Clara，CA)测量miRNA表达；采用Affymetrix Scanner 3000 7G(Affymetrix，Santa Clara， CA)对芯片信号进行扫描和采集分析。从显示上述三组受试者的全数据矩阵的热图代表的系统树图看出，这三组受试者的miRNA表达图谱具有明显的聚类差异性，即表示这28个miRNA的分组能够区分发生 DCI或无发生DCI的SAH患者。
实施例6
对这28个SAH相关miRNA的表达水平进行实时荧光定量PCR (qPCR)，并采用主成分分析(Principal Component Analysis，PCA) 进行模式识别，以评估发生或不发生DCI的两种SAH类型的间距联系 (distance connectivity)。图1显示实时荧光定量PCR的结果。其中图 1A给出的是实时荧光定量PCR测得的28个SAH相关miRNA的表达水平；miRNA表达水平经过相对对照的标准化，以ΔΔCt表示；图1B 是所述发生或不发生DCI的两种SAH类型的miRNA表达水平的PCA 图。
如图所示，PCA分析得到两个明显区别的发生DCI的SAH和不发生DCI的SAH类型的群聚，其产生的重叠很小，证明了可以通过特定的miRNA组合来对这两种SAH类型进行区分和分类。
实施例7评估用于表征发生DCI的SAH的单个miRNA
采用受试者特征曲线分析(receiver operating characteristics analysis，ROC analysis)对可以用于区分和分类发生DCI的SAH和不发生DCI的SAH的单个miRNA进行评估(Hajian-Tilaki K.Caspian J Intern Med.2013；4:627-635)。根据在不同阈值的敏感度(真阳性率)和特异性(假阳性率)，ROC分析能被用于选择可区分发生DCI的SAH 和不发生DCI的SAH。
对前述在发生或不发生DCI的SAH患者组别获得的28个SAH相关miRNA的qPCR测量的表达水平绘制受试者特征曲线(ROC curve)。结果如下表3所示，其曲线下面积(AUC)超过80％(p<0.0005)的包括以下miRNA：miR-4463,miR-4532，miR-1290，miR-4793，miR-421，miR-4492，miR-574，miR-4689，miR-4449，miR-93-5p，miR-4497和 miR-297。其中，miR-1290在阈值水平8.653的AUC，敏感度(真阳性率)和特异性分别为95.3％(95％CI:0.897-1),0.900和0.850。
表3SAH分类中各miRNA的表达
Figure BDA0001273983390000151
从这些miRNA中需要选择出能够区分发生或不发生DCI的SAH 的miRNA组合。
实施例8用于表征发生DCI的SAH的miRNA组合
对本发明提供的用于区别发生DCI的SAH和无发生DCI的SAH，即可表征发生DCI的SAH的miRNA组合进行分析。
采用最小绝对值收敛和选择算子算法，即LASSO算法(least absolute shrinkageand selection operator method)分析采用四个miRNA 的组合(即miR-4463,miR-4532,miR-4793和miR-1290)在区别发生 DCI的SAH和无发生DCI的SAH的准确性。结果如图2所示。图2 为对样品中的四个miRNA的组合(即miR-4463,miR-4532,miR-4793 和miR-1290)在发生DCI的SAH和无发生DCI的SAH患者的血液样品中的表达水平的LASSO算法分析以及结果示意图。其中图2A是 LASSO算法获得的系数；图2B显示出LASSO算法分析得到的上述四个miRNA组合用于区别发生DCI的SAH和无发生DCI的SAH的结果：图2B上部是LASSO算法结果箱线图；下部左侧为4个miRNA 的ROC曲线；下部右侧是4个miRNA的PCA曲线。
ROC分析显示，根据LASSO算法得到的系数(其中miR-4463的为0.16589606；miR-4532的为0.43352951；miR-4793x0.09569081； miR-1290的为0.2602013)，采用公式ln(Y/1-Y)＝-4.29759355+ miR-4463x0.16589606+miR-4532x0.43352951+miR-4793x0.09569081+miR-1290x0.2602013进行计算，所述四个miRNA的组合(即miR-4463,miR-4532,miR-4793和miR-1290)的曲线下面积 (AUC)达到100％(95％CI:1-1,p<0.0001)。PCA分析证明，所述四个 miRNA的组合(即miR-4463,miR-4532,miR-4793和miR-1290)能够产生两个明显区别发生DCI的SAH和不发生DCI的SAH类型的群聚。
由于miR-4793的系数为0.09569081，在公式中的贡献相对其它三个miRNA(即miR-4463,miR-4532和miR-1290)的较小，可以计算出由三个miRNA(即miR-4463,miR-4532和miR-1290)形成的组合也能够明显区别发生DCI的SAH和不发生DCI的SAH类型。
图3为对样品中的所述四个miRNA的组合(即miR-4463,miR-4532, miR-4793和miR-1290)在发生DCI的SAH和无发生DCI的SAH患者的血液样品，以及在对照组血液样品中的表达水平的LASSO算法分析以及结果示意图。其中图3A中是所述4个miRNA在发生DCI的SAH 患者的血液样品和在对照组血液样品中的表达水平；图3B是所述4 个miRNA在不发生DCI的SAH患者的血液样品和在对照组血液样品中的表达水平。
意想不到的是，如图3所显示的，所述四个miRNA(即miR-4463, miR-4532,miR-4793和miR-1290)的活性在发生DCI的SAH患者的血液样品中被强烈地抑制，而在不发生DCI的SAH患者的血液样品中还是具有很高的活性。这四个miRNA在发生DCI的SAH和不发生DCI的SAH患者中的表达具有两相性，其中，在ROC分析中，四个miRNA (即miR-4463,miR-4532,miR-4793和miR-1290)的活性在发生DCI 的SAH患者的血液样品中与对照组受试者的血液样品中比较，曲线下面积(AUC)达到99.3％(95％CI:0.977–1,p<0.0001)；不发生DCI的 SAH患者的血液样品中与对照组受试者的血液样品中比较，AUC达到 82.0％(95％CI:0.685-0.955,p<0.0005)。这进一步证明了本发明的这三个miRNA(miR-4463,miR-4532和miR-1290)或四个miRNA (miR-4463,miR-4532,miR-4793和miR-1290)的组合能够用于区别和定义发生DCI的SAH和不发生DCI的SAH。
实施例9
由于本发明采用的4个miRNA(miR-4463，miR-4532，miR-4793 和miR-1290)的下游靶标和特定作用还没有明确的研究，发明人采用了3种算法(即TargetScan算法，miRanda算法和PITA算法)对这几个 miRNA进行基因中心性分析(gene-centric analysis)来研究其共同和特异性的潜在靶标。图4 是本发明4个miRNA(miR-4463，miR-4532， miR-4793和miR-1290)的下游靶标分析和结果图。图4A 显示3种算法(即TargetScan算法，miRanda算法和PITA算法)的结果；图4B 是分析结果的网络图。
如图4所示，这4个miRNA的下游靶点有相当多的重叠。由此，进一步证明这4个存在于影响到蛛网膜下腔出血后迟发性脑梗塞的共同调节途径中。
结论
本发明第一次提供了可区别和定义发生或不发生迟发性脑梗塞的蛛网膜下腔出血的生物标记物，该生物标记物包括三个miRNA的组合 (即miR-4463,miR-4532和miR-1290)或是四个miRNA的组合(即 miR-4463,miR-4532,miR-4793和miR-1290)。在本发明之前，本发明发现的上述生物标记物中的miRNA都没有被发现与SAH的病理相关。曾经有报道，miR-4532与乳腺癌细胞化学耐药有关；miR-4793的表达在散发性结直肠癌(sCRC)患者的肝转移中升高。miR-1290与不同类型的癌症相关，包括结肠直肠癌，子宫颈癌，癌症，非小细胞肺癌，乳腺癌，肝细胞癌，胃癌，喉癌，淋巴细胞白血病，食管鳞状细胞癌 (ESCC)，肺腺癌，前列腺癌，胰腺癌和膀胱癌以及口腔黏膜下层纤维化，非酒精性脂肪性肝病和慢性鼻鼻窦炎；miR-4463已被证明是多囊卵巢综合征(PCOS)和闭塞性动脉硬化症(ASO)的生物标志物。但没有报道这些miRNA与蛛网膜下腔出血的关联。
本发明发现的生物标记物可有效和准确地区分发生或不发生迟发性脑梗塞的蛛网膜下腔出血。本发明由此提供了用于区分和判断发生 DCI的SAH和无发生DCI的SAH的方法。本发明提供的用于分辨和区分发生DCI的SAH和无发生DCI的SAH的分类器(即简便这两种 SAH的miRNA组合)还可以区分健康对照与发生或不发生DCI的SAH 类型，进一步证明了本发明miRNA组合针对发生DCI的SAH和无发生DCI的SAH的特异性。
本发明的方法可用于在外周血样品中检测相关miRNA的表达水平由此实现对蛛网膜下腔出血引起的迟发性脑梗塞的预后诊断。外周血样品具有取样操作简单的优点，能大大方便对脑部病症的诊断。并且外周血循环miRNA具有相对较高的稳定性，使得本发明发现的miRNA 生物标记物具有比其它生物标记物更好的应用前景。
上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。
如无特别表示，本文中出现的温度的单位“度”是指摄氏度，即℃。
序列表
<110> 香港中文大学 山大生殖研发中心有限公司
<120> 蛛网膜下腔出血的循环microRNA生物标记物和其应用
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人
<400> 1
caaagugcug uucgugcagg uag 23
<210> 2
<211> 67
<212> RNA
<213> 人
<400> 2
aauagauuau uggucaccac cuccaguuuc ugaauuugug agacuggggu ggggccugag 60
aauuugc 67
<210> 3
<211> 85
<212> RNA
<213> 人
<400> 3
gcacauugua ggccucauua aauguuuguu gaaugaaaaa augaaucauc aacagacauu 60
aauugggcgc cugcucugug aucuc 85
<210> 4
<211> 80
<212> RNA
<213> 人
<400> 4
cugcagcgug cuucuccagg ccccgcgcgc ggacagacac acggacaagu cccgccaggg 60
gcugggcgcg cgccagccgg 80
<210> 5
<211> 87
<212> RNA
<213> 人
<400> 5
uuucuccucg cugcccgcac auccugcucc acagggcaga gggaggccaa gaagaccucu 60
gcacugugag uuggcuggcu ggaggaa 87
<210> 6
<211> 70
<212> RNA
<213> 人
<400> 6
gguuucuccu ugaggagaca uggugggggc cggucaggca gcccaugcca uguguccuca 60
uggagaggcc 70
<210> 7
<211> 66
<212> RNA
<213> 人
<400> 7
agcagcccuc ggcggcccgg ggggcgggcg gcggugcccg ucccggggcu gcgcgaggca 60
caggcg 66
<210> 8
<211> 78
<212> RNA
<213> 人
<400> 8
gagcgucacg uugacacuca aaaaguuuca gauuuuggaa cauuucggau uuuggauuuu 60
uggaucaggg augcucaa 78
<210> 9
<211> 89
<212> RNA
<213> 人
<400> 9
accuccggga cggcugggcg ccggcggccg ggagauccgc gcuuccugaa ucccggccgg 60
cccgcccggc gcccguccgc ccgcggguc 89
<210> 10
<211> 66
<212> RNA
<213> 人
<400> 10
uguauguaug ugugcaugug cauguaugug uauauacaua uauauguauu auguacucau 60
auauca 66
<210> 11
<211> 96
<212> RNA
<213> 人
<400> 11
gggaccugcg ugggugcggg cgugugagug ugugugugug aguguguguc gcuccggguc 60
cacgcucaug cacacaccca cacgcccaca cucagg 96
<210> 12
<211> 51
<212> RNA
<213> 人
<400> 12
acagaccccg gggagcccgg cggugaagcu ccugguaucc ugggugucug a 51

Claims (13)

1.一种表明蛛网膜下腔出血的不良预后的生物标记物，所述不良预后为发生迟发性脑梗塞，且所述迟发性脑梗塞为排除手术相关梗塞的脑梗塞，所述标记物由以下miRNA组成：miR-4463, miR-4532和miR-1290。
2.权利要求1所述的生物标记物，其中所述标记物还包括miR-4793。
3.权利要求2所述的生物标记物，其中还包括一个或多个以下miRNA：miR-421，miR-4492，miR-574，miR-4689，miR-4449，miR-93-5p，miR-4497和miR-297。
4.测量miRNA的表达水平的试剂在用于制备诊断蛛网膜下腔出血的不良预后的试剂盒或装置中的用途，所述不良预后为发生迟发性脑梗塞，且所述迟发性脑梗塞为排除手术相关梗塞的脑梗塞，其中所述测量miRNA的表达水平的试剂用于测量下述miRNA的表达水平：miR-4463, miR-4532和miR-1290。
5.权利要求4所述的用途，其中所述miRNA还包括miR-4793。
6.权利要求5所述的用途，其中所述miRNA还包括一个或多个以下miRNA：miR-421，miR-4492，miR-574，miR-4689，miR-4449，miR-93-5p，miR-4497和miR-297。
7.权利要求4-6中任一项所述的用途，其中所述试剂盒和装置通过下述步骤诊断蛛网膜下腔出血的不良预后：
a．测量受试者样品中所述miRNA的表达水平；
b. 比较受试者样品中所述miRNA的表达水平与无患病对照样品中所述miRNA的表达水平。
8.权利要求7所述的用途，其中所述样品为外周血样品。
9.诊断蛛网膜下腔出血的不良预后的试剂盒或装置，所述不良预后为发生迟发性脑梗塞，且所述迟发性脑梗塞为排除手术相关梗塞的脑梗塞，其中包含测量下述miRNA的表达水平的试剂：miR-4463, miR-4532和miR-1290。
10.权利要求9所述的试剂盒或装置，其中所述miRNA还包括miR-4793。
11.权利要求10所述的试剂盒或装置，其中所述miRNA还包括一个或多个以下miRNA：miR-421，miR-4492，miR-574，miR-4689，miR-4449，miR-93-5p，miR-4497和miR-297。
12.权利要求9-11中任一项所述的试剂盒或装置，其中所述试剂盒和装置通过下述步骤诊断蛛网膜下腔出血：
a．测量受试者样品中所述miRNA的表达水平；
b. 比较受试者样品中所述miRNA的表达水平与无患病对照样品中所述miRNA的表达水平。
13.权利要求12所述的试剂盒或装置，其中所述样品为外周血样品。
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