CN105543389A - 脑卒中的miRNA分子标志物及其应用 - Google Patents
脑卒中的miRNA分子标志物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105543389A CN105543389A CN201610077599.8A CN201610077599A CN105543389A CN 105543389 A CN105543389 A CN 105543389A CN 201610077599 A CN201610077599 A CN 201610077599A CN 105543389 A CN105543389 A CN 105543389A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir
- cerebral apoplexy
- mirna
- expression
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及脑卒中的miRNA分子标志物及其应用,更具体的涉及mir-4330和/或miR-4330在诊治脑卒中的新用途。发明通过生物信息学方法对已发表的脑卒中的miRNA高通量转录组数据进行整合分析,选取后备miRNA进行分子生物学验证,RT-PCR结果显示,本发明提供的miR-4330和脑卒中密切相关,可用于临床诊断及预防检测,具有很好的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,具体的涉及脑卒中的miRNA分子标志物及其应用,更具体的涉及mir-4330和/或miR-4330在诊治脑卒中的新用途。
背景技术
脑卒中是一个症候群,包括缺血性脑卒中、出血性脑卒中。众所周知,脑卒中一旦发生,死亡率极高,而且存活后的残废率高达70%,且复发率极高。根据卫生部公布的统计资料,目前中国约有600万脑卒中残存者,每年新发病例150万,而且发病逐渐年轻化。连续几年来,心脑血管疾病的死亡构成居各类疾病的第一位,占死亡构成的40%以上。而其中单独脑卒中一项的发病率和死亡率一直居第二位,占各类疾病死亡的20%以上。脑卒中传统的危险因素包括年龄、高血压、吸烟、饮酒、糖尿病、高血脂及冠心病史等,但这些传统危险因素只能解释约50%的脑卒中发病,提示存在其它危险因素,如遗传危险因素。寻找脑卒中的致病基因,从分子水平揭示脑卒中的发病机理,可为及早发现脑卒中的危险人群、预防脑卒中的发生提供帮助。
miRNAs是内源性非编码的约20-25个核苷酸单链RNA分子。通过结合到相应mRNA3‘非翻译区,诱导mRNA降解或抑制其翻译。miRNAs被报道在多种病理和生理过程发挥关键作用,包括细胞增殖,凋亡,细胞分化,心血管疾病,神经障碍和癌症等。
本发明通过生物信息学方法对已发表的脑卒中的miRNA高通量转录组数据进行整合分析,选取后备miRNA进行分子生物学验证,RT-PCR结果显示,本发明提供的miR-4330和脑卒中密切相关,可用于临床诊断及预防检测,具有很好的实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供mir-4330和/或其成熟miRNA在制备预防、诊断和/或治疗脑卒中试剂中的应用。mir-4330的序列见序列表SEQIDNO1。mir-4330的成熟miRNA为miR-4330其序列见序列表SEQIDNO2。
进一步,预防、诊断脑卒中试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录或基于免疫检测方法检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况,优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录;采用ELISA和/或胶体金试纸条检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况。
优选的,基于定量PCR方法包括特异性扩增mir-4330和/或miR-4330的引物;所述的基于探针杂交方法包括与mir-4330和/或miR-4330的核酸序列杂交的探针;所述免疫检测方法包括与miR-4330调控基因表达蛋白特异性结合的抗体。
进一步,检测外周血中mir-4330和/或miR-4330的转录或miR-4330调控的靶基因的表达情况。
进一步,所述的治疗脑卒中试剂包括抑制剂和/或抑制剂组合物下调mir-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性。
优选的,采用反义寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海绵、miRNAErasers、TargetMasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性。
本发明的目的还在于提供一种抑制脑卒中试剂,所述抑制脑卒中试剂包含:
(a)抑制剂和/或抑制剂组合物,所述的抑制剂和/或抑制剂组合物下调mir-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性;
(b)药剂学上能接受的载体。
优选的,采用反义寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海绵、miRNAErasers、TargetMasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性。
本发明的目的还在于提供一种脑卒中诊断试剂,所述脑卒中诊断试剂能够检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录或免疫检测方法检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况。
优选的,所述脑卒中诊断试剂基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录或基于免疫方法检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况,优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录;采用ELISA和/或胶体金试纸条检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况。
更优选的,所述的用于定量PCR方法包括特异性扩增mir-4330和/或miR-4330的引物;所述的基于探针杂交方法包括与mir-4330和/或miR-4330的核酸序列杂交的探针;所述免疫检测方法包括与miR-4330调控基因表达蛋白特异性结合的抗体。
定义:
现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法,不需要对样本RNA进行预扩增,包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。
(1)Northern杂交
又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小,估计其丰度的实验方法。基本原理如下:首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定miRNA样本,再与经过标记的探针杂交,洗涤多余的杂交探针后进行信号检测;也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补的DNA探针,然后与经过标记的样本miRNA杂交,再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。
(2)miRNA表达谱芯片
原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA基因及内参序列,可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因芯片具有高通量的优点,可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相芯片(Liquidchip)又称多功能悬浮点阵(Multianalytesuspensionarray,MASA),是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成,每种小球体上固定有不同的探针分子,为了区分不同的探针,每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号,将这些小球体悬浮于一个液相体系中,就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析,这种检测技术被称为FMAP(Flexiblemultianalyteprofiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行,检测速度极快。
(3)核酶保护分析技术(RPA)
miRNA的检测还可以采用核酶保护分析技术,将标记好的探针和待测RNA样本混合,热变性后杂交,未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化,热失活核酸酶后纯化受保护的RNA分子,最后通过变性PAGE电泳分离探针,显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速,灵敏度高,但也只能用于分析已知miRNA。
(4)RAKE法
RAKE法(RNAprimedarraybasedKlenowemzyme)是在miRNAmicroarray的基础上利用DNA聚合酶I的Klenow片段,使miRNA与固定的DNA探针杂交的方法。RAKE可以敏感特异地检测miRNA,适用于大量快速的筛选所有己知的miRNA。能够在特定的细胞和肿瘤中检测miRNA表达谱情况。不仅如此,RAKE法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出miRNA并对其进行分析,为从存档标本中分析miRNA开启了希望之门。
(5)原位杂交(insituhybridization)
原位杂交技术可直观了解miRNA表达方式,是观测miRNA时空表达的一种较简便的方法,常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(LockedNucleicAcid(LNA)basedinsituhybridization(LNA-ISH))是当前应用较多的探针方式。
(6)基于微球的流式细胞术(bead-basedflowcytometry)
是一种液相芯片技术,该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来,兼有通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。
(7)实时荧光定量PCR技术(Real-timePCR,RT-PCR)
荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大,要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用特定阈值循环数Ct来表达)越少。由于miRNA长度仅为22nt,传统的qRT-PCR不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于miRNA的实时定量PCR方法,如加尾法、颈环法等。颈环法是一种理想的miRNA检测qRT-PCR方法:首先设计特殊的茎环结构引物,以待测miRNA为模板逆转录合成cDNA第一链,该cDNA一端为茎环状引物,茎环状结构被打开便增加了cDNA的长度,随后以合成的cDNA为模板设计引物进行实时定量PCR扩增。qRT-PCR具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。
(8)测序法
大部分已知的miRNA都是通过cDNA克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建miRNA的cDNA文库,再进行PCR扩增,扩增产物随后克隆到表达载体上测序。Takada开发了一种改进的扩增克隆法(miRNAamplificationprofiling,mRAP),mRAP法先在miRNA的3’端连上接头,然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸转移酶活性,一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cDNA链的3’末端。当5’端接头与cDNA链的poly(C)粘性末端退火后,加入一对共用引物即可实现对cDNA的PCR扩增。由于mRAP高度灵敏,可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中miRNA的表达量。标签序列克隆法是一种在在基因表达系列分析(SAGE)技术的基础上发展了检测效率更高的miRAGE(miRNASAGE)克隆法,该法通过生成大的串联子,通过单个测序反应可检测多个miRNA,明显提高了检测效率。
高通量测序(High-throughputsequencing)又称下一代测序技术(nextgenerationsequencing)是对传统测序一次革命性的改变,一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度,为获取所有miRNA的序列信息,解密miRNA图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(deepsequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(RochGSFLXsequencer),Illumina公司的Solexa基因组分析仪(IlluminaGenomeAnalyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABISOLiDsequencer)。
免疫检测方法是以一种抗体或多种抗体作为分析试剂,对待测物进行定量或定性分析的检测方法。其基本原理是抗体和抗原之间的相互作用。为提高抗原和抗体检测的敏感性,将已知抗体或抗原标记上易显示的物质,通过检测标记物,反映有无抗原抗体反应,从而间接测出微量的抗原或抗体。常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金及电子致密物质等。这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术(immunolabellingtechnique)。目前应用最广的免疫检测技术主要有:酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA),胶体金免疫层析法等。
酶联免疫吸附试验原理是将抗原或抗体与底物(酶)结合,使其保持免疫反应和酶的活性。把标记的抗原或抗体与包被于固相载体上的配体结合,再使之与相应的无色底物作用而显示颜色,根据显色深浅程度目测或用酶标仪测定OD值判定结果。
胶体金试纸条一般由样品垫、金标垫、层析膜、吸水垫四部分组成。层析材料有硝化纤维膜(NC)、聚酯膜、尼龙膜和PVDF膜等,根据试验需要可选择不同要求的膜,其中NC膜最为常用,使用前可根据试验具体情况确定是否需要活化或处理,多数情况下无需处理,即可直接使用。将金标蛋白溶液均匀喷涂在金标垫上,于室温下晾干备用。NC膜可捕获一定量的包被(抗体)和二抗作为检测线和质控线。最后将样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸依次固定于PVC板,即成试纸条。
所述抑制剂和/或抑制剂组合物下调mir-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性属于使miRNA功能丧失,理论上可以对miRNA合成及发挥功能过程中的多个关键步骤进行干预:1)阻断pri-miRNA或pre-miRNA的加工及出核过程;2)通过与pre-miRNA结合,阻止其被加工和进入诱导沉默复合体(RISC);3)通过与RISC中的成熟miRNA结合,发挥竞争性抑制作用。但目前主要通过导入外源性miRNA拮抗剂以阻断其对靶基因的作用。具体干预方法包括:反义寡核苷酸(antisensemiRNAoligonucleotides,AMOs),antagomiRs、miRNA海绵(miRNASponge)、miRNAErasers、TargetMasking和多靶点反义寡核苷酸(multipletargetAMU,MTgAMU)等。
反义寡核苷酸技术即根据碱基配对原则,人工合成的与成熟的miRNA互补的单链逆序核苷酸链,发挥竞争性抑制剂的作用。为了防止被核酸酶和磷酸二酯酶等的降解,需对该反义核糖核酸链进行不同的化学修饰,实际应用中常采取多种技术混合修饰的方式以获得最佳的稳定性。本发明中作为有效成分利用的反义寡核苷酸具有与在序列表中SEQIDNO2的核苷酸序列中的第1-第8、第2-第8或第2-第7核苷酸序列互补的序列。最优选的,本发明中作为有效成分利用的反义寡核苷酸具有与序列表SEQIDNO2的整个核苷酸序列互补的序列。
antagomiRs技术即对反义寡核苷酸链的3’端进行胆固醇修饰和4个硫代磷酸位点修饰,5’端进行2个硫代磷酸位点修饰,全链采用2’-OMe-AMOs修饰。该技术优点在于,硫代磷酸修饰降低了antagomiR二聚体的解链温度,从而保证了其稳定性。
miRNASponge技术即多个重复的反义miRNA寡核苷酸片段,该序列与靶miRNA的种子序列部分互补,将其插入到己构建好的绿色荧光蛋白报告基因的3’UTR中,由巨细胞病毒启动子引导,发挥多结合域竞争性抑制剂的作用。为了与靶miRNA更稳定的结合,在AGO2的剪切区域(第9-12位核苷酸)设计了4个不配对的碱基对。实验证明,miRNASponge具有和AMOs相似的作用效果。该技术常被用来抑制某个miRNA家族的功能。
miRNAErasers技术。与miRNASponge技术相似,但仅将2个重复的反义miRNA寡核苷酸片段插入到报告基因的3’UTR中,且与靶miRNA完全互补,在U6启动子的控制下,通过腺病毒载体转染细胞。由于其并非种子序列特异性,所以仅被用来抑制某个miRNA的功能。miRNAErasers技术的作用持续时间也比miRNASpong技术短。
miR-Masking技术。1种miRNA迪常有多个靶mRNA结合位点,同时调控着多种蛋白质的表达。因此,抑制某1种miRNA的表达,不仅可对目标mRNA进行调控,还可能会产生不需要的“靶外效应(off-targeteffect)"。而miR-Masking技术的出现较好地解决了这一问题。它是1段与靶mRNA结合的反义核苷酸序列,以极高的亲和性与miRNA的某个靶mRNA3’UTR端互补结合,从而特异地阻断miRNA和该靶mRNA的相互作用,对该miRNA的水平或其它功能并不产生影响。
多靶点反义寡核苷酸技术即指将多个反义寡核苷酸片段设计到同1条核苷酸链上,使其具有同时抑制多个miRNA的活性,进而调节多种靶蛋白质。该技术适用于同时调节作用于某mRNA的多个miRNA。
包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载体,该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methylcellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearicacidmagnesium)及矿物油(mineraloil)等,但并非局限于此。
本发明的药剂学组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。
本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药,作为非口服给药时,能通过静脉内注射,鼻腔内注射,局部注射,脑室内注射,脊髓腔注射,皮下注射,腹腔注射,经皮给药等方式进行给药。
本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方,通常,熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。
本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法,利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化,从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时,剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态,或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态,还可以包括分散剂或者稳定剂。
附图说明
图1是RT-PCR检测患者组及对照组外周血miR-4330表达水平图
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1NCBIGEO数据检索
限制研究类型为“expressionprofilingbyarray”、“Non-codingRNAprofilingbyarray”符合以下标准的数据集将纳入我们的研究中:
①所选数据集必须为全基因组的mRNA转录组数据或miRNA表达数据;
②这些数据来自于脑卒中病例组和对照组的血液样本(无药物刺激或被转染);
③本研究均考虑经标准化或者原始数据集;
经筛选得到2套脑卒中高通量mRNA数据集和1套高通量miRNA数据集。
通过转录组数据分析软件对miRNA及mRNA原始数据进行背景校正后进行t-test得到P值,然后利用Fisher检验合并P值,筛选差异表达miRNA及mRNA。设定P<0.01,共筛选出16个差异表达的miRNA,其中表达水平上调的miRNA13个,表达水平下调的miRNA3个,其中hsa-miR-4330上调表达明显,进入我们的研究范围。同时,在脑卒中病中hsa-miR-4330预测靶基因有:ABCF2,LRPPRC,CDK6,WDR5,KLF12,KTI12,EARS2,6-Sep,C2CD2,SLC25A42,ST6GALNAC6,ILF3,IVD,MFGE8,ZNF589,PDE4D,TRMT13,ANKRD16,SHQ1,PRKX,ZNF250,MRPS26,SNX1,UROS,C21orf2,ZNF10,NOL9,EDC3,C2orf44,CSRNP2,CASK,RNMT,TMEM261,SEC22C,CBFA2T2,SNX29,PREPL,SH3PXD2A,RNF144A,RIMS3,ZBTB5。
实施例2样品的收集及总RNA提取
46例脑卒中患者及31例健康人群对照均来自医院(2014年1月-2015年9月),抽取他们的外周血,4000rpm离心分离血浆加TRIzoI试剂(l:3)并保持在-80℃直至进行RNA提取。所有受试者均签署了知情同意书。
1RNA提取方法
1)解冻含TRIzoI试剂的血浆,震荡后静止5分钟。
2)加氯仿(三氯甲烷0.2m1),剧烈震荡30秒,静止15分钟。
3)离心15分钟(12000g,15分钟、4℃)。
4)取上清,加异丙醇(0.5m1)剧烈震荡,静止10分钟。
5)离心10分钟(12000g,10分钟,4℃),然后弃上清。
6)加75%去污乙醇1ml(无水乙醇用DEPC处理的去离子水配,无水乙醇:DEPC水=3:1)。用震荡器震荡0.5分钟。
7)离心5分钟(7500g,5分钟,4℃)弃上清,倒扣于卫生纸上片刻后正置5分钟。
8)加5ulDEPC-H2O手掌离心机瞬时离心,60℃水浴10分钟。
9)测浓度,用RNA浓度测量仪器。
2逆转录
1)逆转录配制:每个EP管加去离子水水14u1,RtprimemiX4u1,RNA1-3ul。
2)70℃水浴10分钟。
3)冰上制冷2分钟。
4)加入2×tsmix25u1,TS(逆转录酶)2.5u1,去离子水3.5u1,离心摇匀,行RT逆转录cDNA。
实施例3Real-timePCR检测脑卒中组和对照组miR-4330的表达
荧光定量PCR
RT-PCR体系的配制:
miRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应,以snRNAU6作为内参。
PCR程序:
95℃10min;40个循环(95℃10s,60℃30s)。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性:从60℃缓慢升温至97℃,每℃采集5次荧光信号。
统计学分析
采用OriginPro8.1软件进行分析。统计方法均数间比较采用t检验,P<0.05(差异显著)和P<0.01(差异非常显著)定为有统计学意义,分析脑卒中和正常对照样本中外周血miR-4330表达水平,结果显示脑卒中组中miR-4330的表达明显高于正组织,前者是后者的约1.4倍,具体见图1。
实施例4一种检测脑卒中的试剂盒
荧光定量PCR
RT-PCR体系的配制:
miRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应,以snRNAU6作为内参。
虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明,但本领域技术人员理解,可进行各种变化,并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外,可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。
因此,本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案;相反地,本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。
Claims (10)
1.mir-4330和/或miR-4330在制备预防、诊断和/或治疗脑卒中试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,预防、诊断脑卒中试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录或基于免疫检测方法检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况,优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录;采用ELISA和/或胶体金试纸条检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,基于定量PCR方法包括特异性扩增mir-4330和/或miR-4330的引物;基于探针杂交方法包括与mir-4330和/或miR-4330的核酸序列杂交的探针;免疫检测方法包括与miR-4330调控基因表达蛋白特异性结合的抗体。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,检测脑卒中样本为外周血。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,治疗脑卒中试剂包括抑制剂和/或抑制剂组合物下调mir-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,采用反义寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海绵、miRNAErasers、TargetMasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性。
7.一种抑制脑卒中试剂,其特征在于,抑制脑卒中试剂包含:
(a)抑制剂和/或抑制剂组合物,所述的抑制剂和/或抑制剂组合物下调mir-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性;
(b)药剂学上能接受的载体。
8.根据权利要求7所述的抑制脑卒中试剂,其特征在于,反义寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海绵、miRNAErasers、TargetMasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-4330和/或miR-4330的转录和/或阻断miR-4330的活性。
9.一种脑卒中诊断试剂,其特征在于,脑卒中诊断试剂能够检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录或免疫检测方法检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况。
10.根据权利要求9所述的脑卒中诊断试剂,其特征在于,所述脑卒中诊断试剂基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录或基于免疫方法检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况,优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交检测脑卒中样本中mir-4330和/或miR-4330的转录;采用ELISA和/或胶体金试纸条检测脑卒中样本中miR-4330调控的靶基因的表达情况。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610077599.8A CN105543389B (zh) | 2016-02-03 | 2016-02-03 | 脑卒中的miRNA分子标志物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610077599.8A CN105543389B (zh) | 2016-02-03 | 2016-02-03 | 脑卒中的miRNA分子标志物及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105543389A true CN105543389A (zh) | 2016-05-04 |
CN105543389B CN105543389B (zh) | 2017-05-03 |
Family
ID=55822946
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610077599.8A Active CN105543389B (zh) | 2016-02-03 | 2016-02-03 | 脑卒中的miRNA分子标志物及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105543389B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106434982A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-02-22 | 汕头大学医学院第附属医院 | 缺血性脑卒中相关的分子标记物及其应用 |
CN106834430A (zh) * | 2016-05-27 | 2017-06-13 | 郴州市第人民医院 | 一种脑卒中预警和早期诊断相关标志物及应用 |
WO2018192499A1 (zh) * | 2017-04-19 | 2018-10-25 | 香港中文大学 | 蛛网膜下腔出血的循环microRNA生物标记物和其应用 |
CN110261609A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-09-20 | 上海四核生物科技有限公司 | Zbtb5蛋白作为胃癌血清生物标志物的应用及其试剂盒 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103421905A (zh) * | 2013-08-20 | 2013-12-04 | 张飚 | 从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法 |
CN103476947A (zh) * | 2011-03-02 | 2013-12-25 | 格路福生物制药公司 | 寡聚体的增强的生物分布 |
CN103961706A (zh) * | 2013-01-30 | 2014-08-06 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 微小rna或其抑制剂在脂代谢调控中的应用 |
-
2016
- 2016-02-03 CN CN201610077599.8A patent/CN105543389B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103476947A (zh) * | 2011-03-02 | 2013-12-25 | 格路福生物制药公司 | 寡聚体的增强的生物分布 |
CN103961706A (zh) * | 2013-01-30 | 2014-08-06 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 微小rna或其抑制剂在脂代谢调控中的应用 |
CN103421905A (zh) * | 2013-08-20 | 2013-12-04 | 张飚 | 从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
DI WU等: "Genome-wide association study combined with", 《BMC GENOMICS》 * |
MUSAFFE TUNA等: "Genetic and Epigenetic Alterations of", 《GENES, CHROMOSOMES & CANCER》 * |
YAVUZ DODURGA等: "Investigation of microRNA expression changes in HepG2 cell line", 《MOL BIOL REP》 * |
朱耀魁等: "《MicroRNA-181家族与疾病的相关性研究》", 《暨南大学学报(医学版)》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106834430A (zh) * | 2016-05-27 | 2017-06-13 | 郴州市第人民医院 | 一种脑卒中预警和早期诊断相关标志物及应用 |
CN106834430B (zh) * | 2016-05-27 | 2020-12-29 | 郴州市第一人民医院 | 一种脑卒中预警和早期诊断相关标志物及应用 |
CN106434982A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-02-22 | 汕头大学医学院第附属医院 | 缺血性脑卒中相关的分子标记物及其应用 |
WO2018192499A1 (zh) * | 2017-04-19 | 2018-10-25 | 香港中文大学 | 蛛网膜下腔出血的循环microRNA生物标记物和其应用 |
CN108728525A (zh) * | 2017-04-19 | 2018-11-02 | 香港中文大学 | 蛛网膜下腔出血的循环microRNA生物标记物和其应用 |
CN108728525B (zh) * | 2017-04-19 | 2021-06-22 | 香港中文大学 | 蛛网膜下腔出血的循环microRNA生物标记物和其应用 |
CN110261609A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-09-20 | 上海四核生物科技有限公司 | Zbtb5蛋白作为胃癌血清生物标志物的应用及其试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105543389B (zh) | 2017-05-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101711287B (zh) | 确定肝细胞癌亚型和检测肝癌干细胞的方法 | |
CN105543389A (zh) | 脑卒中的miRNA分子标志物及其应用 | |
CN105561341B (zh) | mir-1292及其靶基因在预防和治疗骨肉瘤转移中的应用 | |
KR102014407B1 (ko) | 파킨슨병 바이오마커로서의 miR3064 및 이를 이용한 진단키트 | |
CA2736626A1 (en) | Genes associated with posttraumatic-stress disorder (ptsd) | |
EP3502269B1 (en) | Detection of brain cancer | |
CN109609653A (zh) | 诊断或治疗胶质瘤的分子标记物及其应用 | |
CN105483275B (zh) | mir-1299及其成熟miRNA的新用途 | |
Liu et al. | TUG1 long non‐coding RNA enlists the USF1 transcription factor to overexpress ROMO1 leading to hepatocellular carcinoma growth and metastasis | |
CN106244688B (zh) | 一种评估结肠腺癌患病风险的标志物 | |
CN108624693A (zh) | miR-577在制备肾病诊断标志物中的应用 | |
KR101620274B1 (ko) | 비만의 진단용 조성물 및 이의 용도 | |
CN105343896B (zh) | 鼻咽癌的新诊治靶点及其应用 | |
CN105734155B (zh) | 软骨母细胞型骨肉瘤致病基因及其应用 | |
CN109593843A (zh) | 生物标志物klhl35在阿尔茨海默诊治中的应用 | |
CN105505936B (zh) | 一种抗骨肉瘤转移生物制剂及其应用 | |
CN105664163B (zh) | mir-5010及其成熟miRNA在制备骨肉瘤诊疗制剂的应用 | |
CN104826133A (zh) | 一种与肺腺癌有关的miRNA及其药物组合物 | |
CN104789683B (zh) | 用于诊治癌转移的生物标志物及其用途 | |
JP7394441B2 (ja) | 脳腫瘍を検査する方法 | |
CN104894132B (zh) | 一种鼻咽癌抑制剂及其应用 | |
CN109593860A (zh) | Tmsb10在诊治胶质瘤中的应用 | |
CN104857513A (zh) | 鼻咽癌诊治标志物及其应用 | |
US20110195420A1 (en) | Estrogen and anti-estrogen marker genes | |
KR102320882B1 (ko) | 성별에 따른 알코올 중독 진단용 바이오마커 및 이의 이용 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |