CN103476947A - 寡聚体的增强的生物分布 - Google Patents

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Abstract

本发明一般地涉及可用于调控RNA或基因的表达和/或活性的寡聚体。更具体地，本发明涉及用于抑制多种细胞、组织或器官中的RNA表达的、具有广泛生物分布特性的单链的、双链的、部分双链的和形成发夹结构的化学修饰的寡聚体，还涉及制备和使用所述修饰的寡聚体的方法。

Description

寡聚体的增强的生物分布
关于序列表的声明
以文本格式提供了与本申请有关的序列表来替代纸件副本，并特此通过引用并入本说明书中。含有所述序列表的文本文件的名称是GROO_001_01WO_ST25.txt。所述文本文件是4KB，创建于2012年3月2日，并通过EFS-Web电子提交。
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2011年3月2日提交的美国临时申请号61/448,618的权益，其通过引用整体并入。
背景
技术领域
本发明一般地涉及可用于调控多种组织中的基因表达的寡聚体。更具体地，本发明涉及下述发现：与一种或多种小沟结合剂缀合的寡聚体与现有寡聚体相比具有有利的生物分布性能。
背景技术
人类基因组包含大量遗传调节。调节存在于转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平。近年来，科学家已经试图通过RNA干扰来调节基因表达。RNA干扰是指动物中通过RNA干扰途径(RNAi)介导的序列特异性的转录后基因沉默过程。合成的双螺旋寡核苷酸，诸如短干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)模拟物和微RNA(miRNA)模拟物，已经被用于成功地调控基因表达，从而导致特定信使RNA(mRNA)的切割。
还存在许多在调节基因组中起作用的表观遗传的调节剂。大多数转录后调节被认为由基因3′非翻译区中稳定化序列的存在与否来介导。但是，最近，科学家已经发现了一类新的小型非编码RNA，其被称作“微RNA”。
微RNA是以序列特异性的方式调节基因表达的小型非编码RNA家族。微RNA家族的2个基础成员最初在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中被鉴别为发育事件的定时调节所必需的基因。此后，已经在几乎所有后生动物(包括蠕虫、苍蝇、植物和哺乳动物)的基因组中鉴别出了数百种微RNA。微RNA具有不同的表达模式，并调节不同的发育和生理过程。单个miRNA或miRNA簇可以调节与发育过程、细胞代谢和平衡、以及细胞增殖、生长和细胞死亡有关的基因。miRNA的失调可以导致多种病理学状况，包括肥胖、癌症、心脏病、神经退行性疾病和退行性肌肉骨骼疾病。
因而，miRNA是一种有吸引力的药物靶标。但是，在克服与候选药物(诸如抗-miRNA分子、siRNA、shRNA、piRNA模拟物和miRNA模拟物)的全身性给予有关的不良生物分布问题方面几乎没有取得进展。除了有限的生物分布以外，抗-miRNA分子、siRNA、shRNA、piRNA模拟物和miRNA模拟物可以具有有害的“脱靶”效应，这意味着，它们不仅下调病理性的基因表达，而且可能抑制对其它必需的和有益的细胞过程进行调节的基因表达。因而，这些分子尚未准备好在临床中用于主流应用。
因此，本领域迫切需要开发这样的抗-miRNA、siRNA、shRNA、piRNA模拟物和miRNA模拟物化合物：其生物分布更广泛，具有增加的生物利用度，且可高效地调节基因表达。
本发明的方法和组合物为本领域的这些问题和其它问题提供了解决方案。
发明概述
本发明一般地涉及具有改善的生物分布性能的寡聚体化合物和使用它们的方法。
在一个实施方案中，本发明部分地涵盖了为多种细胞类型、组织或器官提供寡聚体的方法，所述方法包括：给予受试者包含一个或多个小沟结合部分(MGB)的寡聚体。
在另一个实施方案中，本发明部分地涵盖了将寡聚体给予多种细胞类型、组织或器官的方法，所述方法包括：给予受试者包含一个或多个MGB的寡聚体。
在不同的实施方案中，所述寡聚体是单链寡核苷酸。在不同的其它实施方案中，所述寡聚体是双链寡核苷酸。在不同的特定实施方案中，所述寡聚体选自：抗-miRNA、siRNA、shRNA、piRNA模拟物和miRNA模拟物。在特定实施方案中，通过胃肠外给予所述寡聚体。
在某些实施方案中，胃肠外给予选自：静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内和胸骨内注射和输注。
在某些特定实施方案中，通过静脉内给予所述寡聚体。
在其它实施方案中，所述多种细胞类型选自：癌细胞、免疫细胞、上皮细胞、内皮细胞、中胚层细胞和间质细胞、骨细胞、造血细胞、皮肤细胞、毛细胞、眼细胞、神经细胞、神经胶质细胞、肌细胞、脑膜细胞、乳房细胞、肝细胞、肾细胞、胰腺细胞、胃细胞、肠细胞、结肠细胞、前列腺细胞、子宫颈细胞和阴道细胞。
在其它实施方案中，所述多种组织选自：中胚层组织、结缔组织、平滑肌组织、横纹肌组织、心肌组织、骨组织、骨髓组织、骨海绵组织、软骨组织、脂肪组织、内胚层组织、肺组织、血管组织、胰腺组织、肝组织、胰管组织、脾组织、胸腺组织、扁桃体组织、派伊尔斑组织、淋巴结组织、甲状腺组织、内皮组织、血细胞、膀胱组织、肾组织、消化道组织、食管组织、胃组织、小肠组织、大肠组织、子宫组织、睾丸组织、卵巢组织、前列腺组织、内分泌组织、肠系膜组织和脐带的组织、外胚层组织、表皮组织、真皮组织、眼组织和神经系统组织。
在特定实施方案中，所述多种器官选自：膀胱、骨、脑、乳房、软骨、子宫颈、结肠、角膜、眼、神经组织、神经胶质、食管、输卵管、心脏、胰腺、肠、胆囊、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、甲状旁腺、松果腺、垂体、前列腺、脊髓、脾、骨骼肌、皮肤、平滑肌、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫和阴道。
在某些实施方案中，所述寡聚体能与pre-mRNA杂交。在另一个实施方案中，所述寡聚体能与包含靶miRNA的pre-mRNA杂交。
在另一个实施方案中，所述寡聚体能与包含靶pri-miRNA的pre-mRNA杂交。
在某些实施方案中，所述一个或多个MGB中的至少一个与所述寡聚体的5′末端或3′末端缀合。
在某些特定实施方案中，所述一个或多个MGB中的至少一个用接头与寡聚体缀合。
在其它实施方案中，所述接头包含约10个至约100个原子的链，所述原子选自：C、O、N、S和P。
在特定实施方案中，所述接头选自：a)–P(=O)(OH)O(CH2)6NH-；b)–P(=O)(OH)O(CH2)4NH-；c)–P(=O)(OH)(OCH2CH2)6OP(=O)(OH)O(CH2)6NH-；d)羟基{[5-(羟基甲基)-1-甲基吡咯烷-3-基]氧基}氧代鏻(oxophosphonium)；和e)–(CH2)5OP(=O)(OH)-。
在不同的实施方案中，所述一个或多个MGB中的至少一个选自：纺锤菌素、偏端霉素和Lexitropsin、光神霉素、色霉素A3、橄榄霉素、安曲霉素、西伯里亚霉素、1,2-二氢-3H-吡咯并[3,2-e)吲哚-7-羧酸(DPI)(1-10)、N3氨甲酰基1,2-二氢-3H-吡咯并[3,2-e)吲哚-7-羧酸(CDPI)(1-10)和N-甲基吡咯-4-羧基-2-酰胺(MPC)(1-10)。
在特定实施方案中，所述一个或多个MGB中的至少一个是CDPI3或CDPI4。
在某些实施方案中，所述所述一个或多个MGB中的至少一个是CDPI3。
在其它实施方案中，所述寡聚体包含6-100个核苷酸。
在其它特定实施方案中，所述寡聚体包含10-50个核苷酸。
在其它某些实施方案中，所述寡聚体包含15-23个核苷酸。
在其它实施方案中，所述寡聚体包含与靶序列具有至少70%互补性的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述靶序列是mRNA，在另一个实施方案中，所述靶序列是miRNA序列。
在某些实施方案中，所述核苷酸选自：脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和修饰的核苷酸。
在某些特定实施方案中，所述修饰的核苷酸包含选自下述的碱基：5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-烷基腺嘌呤、6-烷基鸟嘌呤、2-烷基腺嘌呤、2-烷基鸟嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、5-炔基尿嘧啶、5-炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、吩噁嗪胞苷、吩噻嗪胞苷、G-夹、咔唑胞苷、吡啶吲哚胞苷、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶、2-吡啶酮、2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
在特定实施方案中，所述寡聚体包含至少一个修饰的核苷间键。
在某些特定实施方案中，所述至少一个修饰的核苷间键选自：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、膦酸烷基酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫羰烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonate)、硫羰烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、吗啉代、硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、甲酰基(formacetyl)、硫代甲酰基(thioformacetyl)、亚甲基甲酰基、核乙酰基(riboacetyl)、含烯烃的主链、氨基磺酸酯、亚甲基亚氨基、亚甲基肼基、磺酸酯、磺酰胺或酰胺。
在其它特定实施方案中，所述至少一个修饰的核苷间键是硫代磷酸酯键。
在其它某些实施方案中，所述寡聚体的所有核苷间键都是硫代磷酸酯键。
在特定实施方案中，所述寡聚体包含至少一个2’修饰的糖部分。
在某些实施方案中，所述至少一个2’修饰的糖部分选自：OH、卤素、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基、O-烷基-O-烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、被取代的甲硅烷基、烷氧基烷氧基、二甲基氨基氧乙氧基、烯丙基和O-烯丙基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是被取代的或未被取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。
在其它实施方案中，所述至少一个2’修饰的糖部分是2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-MOE)糖部分。
在有关的其它实施方案中，所述至少一个2’修饰的糖部分包含2’-O,4’-C亚甲基桥。
在其它实施方案中，所述寡聚体包含至少一个或多个含有3’亲脂基团的碱基。
在特定实施方案中，所述3’亲脂基团选自：胆固醇；胆汁酸；和脂肪酸。
在一个实施方案中，本发明部分地涵盖了减少一种或多种细胞、组织或器官中一种或多种基因表达的方法，所述方法包括：将包含一个或多个MGB的寡聚体给予受试者，其中一种或多种基因在所述受试者的一种或多种细胞、组织或器官中的基因表达与另一个给予不包含MGB的寡聚体的受试者中的基因表达相比减少。
在一个实施方案中，本发明部分地涵盖了降低一种或多种细胞、组织或器官中的miRNA的miRNA活性的方法，所述方法包括：将包含一个或多个MGB的寡聚体给予受试者，其中所述受试者的一种或多种细胞、组织或器官中的miRNA活性与另一个给予不包含MGB的寡聚体的受试者中的miRNA活性相比降低。
在另一个实施方案中，本发明部分地涵盖了治疗患有疾病、障碍或病症的受试者的方法，所述疾病、障碍或病症与多种细胞类型、组织或器官中的一种或多种基因的基因表达增加有关，所述方法包括：a)鉴别多种细胞类型、组织或器官中的一种或多种基因，所述基因在患病的细胞、组织或器官中的基因表达与所述一种或多种基因在正常细胞中的基因表达相比增加；和b)给予包含一个或多个MGB的寡聚体，所述寡聚体能与所述一种或多种基因杂交。
在另一个实施方案中，本发明部分地涵盖了治疗患有疾病、障碍或病症的受试者的方法，所述疾病、障碍或病症与多种细胞类型、组织或器官中一种或多种miRNA的活性增加有关，所述方法包括：a)鉴别多种细胞类型、组织或器官中的一种或多种miRNA，所述miRNA在患病的细胞、组织或器官中的miRNA活性与所述一种或多种miRNA在正常细胞中的miRNA活性相比增加；和b)给予包含一个或多个MGB的寡聚体，所述寡聚体能与所述一种或多种miRNA杂交。
在特定实施方案中，所述疾病、障碍或病症选自：肿瘤介导的血管生成、癌症、炎症、纤维化疾病、自身免疫疾病和丙型肝炎感染介导的疾病。
在其它特定实施方案中，所述疾病、障碍或病症选自：肺癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、宫颈癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、骨肉瘤、中枢神经系统的癌症、结肠癌、结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、乳头状肾细胞癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌和头颈癌以及黑素瘤。
在其它特定实施方案中，所述疾病、障碍或病症选自：自身免疫性甲状腺疾病(包括格雷夫斯氏病和桥本甲状腺炎)、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、舍格伦综合征、免疫血小板减少性紫癜(ITP)、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、银屑病、硬皮病和炎性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)。
在某些特定实施方案中，所述疾病、障碍或病症是丙型肝炎感染或丙型肝炎感染介导的疾病。
在某些其它特定实施方案中，所述疾病、障碍或病症选自：新血管形成、中风、缺血和心肌梗塞。
在不同的实施方案中，所述miRNA选自：hsa-let-7a-1;hsa-let-7a-2;hsa-let-7a-3;hsa-let-7b;hsa-let-7c;hsa-let-7d;hsa-let-7e;hsa-let-7f-1;hsa-let-7f-2;hsa-let-7g;hsa-let-7i;hsa-mir-100;hsa-mir-101-1;hsa-mir-101-2;hsa-mir-103-1;hsa-mir-103-1-as;hsa-mir-103-2;hsa-mir-103-2-as;hsa-mir-105-1;hsa-mir-105-2;hsa-mir-106a;hsa-mir-106b;hsa-mir-107;hsa-mir-10a;hsa-mir-10b;hsa-mir-1-1;hsa-mir-1178;hsa-mir-1179;hsa-mir-1180;hsa-mir-1181;hsa-mir-1182;hsa-mir-1183;hsa-mir-1184-1;hsa-mir-1184-2;hsa-mir-1184-3;hsa-mir-1185-1;hsa-mir-1185-2;hsa-mir-1193;hsa-mir-1197;hsa-mir-1-2;hsa-mir-1200;hsa-mir-1202;hsa-mir-1203;hsa-mir-1204;hsa-mir-1205;hsa-mir-1206;hsa-mir-1207;hsa-mir-1208;hsa-mir-122;hsa-mir-1224;hsa-mir-1225;hsa-mir-1226;hsa-mir-1227;hsa-mir-1228;hsa-mir-1229;hsa-mir-1231;hsa-mir-1233-1;hsa-mir-1233-2;hsa-mir-1234;hsa-mir-1236;hsa-mir-1237;hsa-mir-1238;hsa-mir-124-1;hsa-mir-124-2;hsa-mir-1243;hsa-mir-124-3;hsa-mir-1244-1;hsa-mir-1244-2;hsa-mir-1244-3;hsa-mir-1245;hsa-mir-1246;hsa-mir-1247;hsa-mir-1248;hsa-mir-1249;hsa-mir-1250;hsa-mir-1251;hsa-mir-1252;hsa-mir-1253;hsa-mir-1254;hsa-mir-1255a;hsa-mir-1255b-1;hsa-mir-1255b-2;hsa-mir-1256;hsa-mir-1257;hsa-mir-1258;hsa-mir-125a;hsa-mir-125b-1;hsa-mir-125b-2;hsa-mir-126;hsa-mir-1260;hsa-mir-1260b;hsa-mir-1261;hsa-mir-1262;hsa-mir-1263;hsa-mir-1264;hsa-mir-1265;hsa-mir-1266;hsa-mir-1267;hsa-mir-1268;hsa-mir-1269;hsa-mir-127;hsa-mir-1270-1;hsa-mir-1270-2;hsa-mir-1271;hsa-mir-1272;hsa-mir-1273;hsa-mir-1273c;hsa-mir-1273d;hsa-mir-1274a;hsa-mir-1274b;hsa-mir-1275;hsa-mir-1276;hsa-mir-1277;hsa-mir-1278;hsa-mir-1279;hsa-mir-1280;hsa-mir-1281;hsa-mir-128-1;hsa-mir-1282;hsa-mir-128-2;hsa-mir-1283-1;hsa-mir-1283-2;hsa-mir-1284;hsa-mir-1285-1;hsa-mir-1285-2;hsa-mir-1286;hsa-mir-1287;hsa-mir-1288;hsa-mir-1289-1;hsa-mir-1289-2;hsa-mir-1290;hsa-mir-1291;hsa-mir-129-1;hsa-mir-1292;hsa-mir-129-2;hsa-mir-1293;hsa-mir-1294;hsa-mir-1295;hsa-mir-1296;hsa-mir-1297;hsa-mir-1298;hsa-mir-1299;hsa-mir-1301;hsa-mir-1302-1;hsa-mir-1302-10;hsa-mir-1302-11;hsa-mir-1302-2;hsa-mir-1302-3;hsa-mir-1302-4;hsa-mir-1302-5;hsa-mir-1302-6;hsa-mir-1302-7;hsa-mir-1302-8;hsa-mir-1302-9;hsa-mir-1303;hsa-mir-1304;hsa-mir-1305;hsa-mir-1306;hsa-mir-1307;hsa-mir-130a;hsa-mir-130b;hsa-mir-132;hsa-mir-1321;hsa-mir-1322;hsa-mir-1323;hsa-mir-1324;hsa-mir-133a-1;hsa-mir-133a-2;hsa-mir-133b;hsa-mir-134;hsa-mir-135a-1;hsa-mir-135a-2;hsa-mir-135b;hsa-mir-136;hsa-mir-137;hsa-mir-138-1;hsa-mir-138-2;hsa-mir-139;hsa-mir-140;hsa-mir-141;hsa-mir-142;hsa-mir-143;hsa-mir-144;hsa-mir-145;hsa-mir-1468;hsa-mir-1469;hsa-mir-146a;hsa-mir-146b;hsa-mir-147;hsa-mir-1470;hsa-mir-1471;hsa-mir-147b;hsa-mir-148a;hsa-mir-148b;hsa-mir-149;hsa-mir-150;hsa-mir-151;hsa-mir-152;hsa-mir-153-1;hsa-mir-153-2;hsa-mir-1537;hsa-mir-1538;hsa-mir-1539;hsa-mir-154;hsa-mir-155;hsa-mir-15a;hsa-mir-15b;hsa-mir-16-1;hsa-mir-16-2;hsa-mir-17;hsa-mir-181a-1;hsa-mir-181a-2;hsa-mir-181b-1;hsa-mir-181b-2;hsa-mir-181c;hsa-mir-181d;hsa-mir-182;hsa-mir-1825;hsa-mir-1827;hsa-mir-183;hsa-mir-184;hsa-mir-185;hsa-mir-186;hsa-mir-187;hsa-mir-188;hsa-mir-18a;hsa-mir-18b;hsa-mir-190;hsa-mir-1908;hsa-mir-1909;hsa-mir-190b;hsa-mir-191;hsa-mir-1910;hsa-mir-1911;hsa-mir-1912;hsa-mir-1913;hsa-mir-1914;hsa-mir-1915;hsa-mir-192;hsa-mir-193a;hsa-mir-193b;hsa-mir-194-1;hsa-mir-194-2;hsa-mir-195;hsa-mir-196a-1;hsa-mir-196a-2;hsa-mir-196b;hsa-mir-197;hsa-mir-1972-1;hsa-mir-1972-2;hsa-mir-1973;hsa-mir-1976;hsa-mir-198;hsa-mir-199a-1;hsa-mir-199a-2;hsa-mir-199b;hsa-mir-19a;hsa-mir-19b-1;hsa-mir-19b-2;hsa-mir-200a;hsa-mir-200b;hsa-mir-200c;hsa-mir-202;hsa-mir-203;hsa-mir-204;hsa-mir-205;hsa-mir-2052;hsa-mir-2053;hsa-mir-2054;hsa-mir-206;hsa-mir-208a;hsa-mir-208b;hsa-mir-20a;hsa-mir-20b;hsa-mir-21;hsa-mir-210;hsa-mir-211;hsa-mir-2110;hsa-mir-2113;hsa-mir-2114;hsa-mir-2115;hsa-mir-2116;hsa-mir-2117;hsa-mir-212;hsa-mir-214;hsa-mir-215;hsa-mir-216a;hsa-mir-216b;hsa-mir-217;hsa-mir-218-1;hsa-mir-218-2;hsa-mir-219-1;hsa-mir-219-2;hsa-mir-22;hsa-mir-221;hsa-mir-222;hsa-mir-223;hsa-mir-224;hsa-mir-2276;hsa-mir-2277;hsa-mir-2278;hsa-mir-2355;hsa-mir-23a;hsa-mir-23b;hsa-mir-23c;hsa-mir-24-1;hsa-mir-24-2;hsa-mir-25;hsa-mir-26a-1;hsa-mir-26a-2;hsa-mir-26b;hsa-mir-27a;hsa-mir-27b;hsa-mir-28;hsa-mir-2861;hsa-mir-2909;hsa-mir-296;hsa-mir-297;hsa-mir-298;hsa-mir-299;hsa-mir-29a;hsa-mir-29b-1;hsa-mir-29b-2;hsa-mir-29c;hsa-mir-300;hsa-mir-301a;hsa-mir-301b;hsa-mir-302a;hsa-mir-302b;hsa-mir-302c;hsa-mir-302d;hsa-mir-302e;hsa-mir-302f;hsa-mir-3065;hsa-mir-3074;hsa-mir-30a;hsa-mir-30b;hsa-mir-30c-1;hsa-mir-30c-2;hsa-mir-30d;hsa-mir-30e;hsa-mir-31;hsa-mir-3115;hsa-mir-3116-1;hsa-mir-3116-2;hsa-mir-3117;hsa-mir-3118-1;hsa-mir-3118-2;hsa-mir-3118-3;hsa-mir-3118-4;hsa-mir-3118-5;hsa-mir-3118-6;hsa-mir-3119-1;hsa-mir-3119-2;hsa-mir-3120;hsa-mir-3121;hsa-mir-3122;hsa-mir-3123;hsa-mir-3124;hsa-mir-3125;hsa-mir-3126;hsa-mir-3127;hsa-mir-3128;hsa-mir-3129;hsa-mir-3130-1;hsa-mir-3130-2;hsa-mir-3131;hsa-mir-3132;hsa-mir-3133;hsa-mir-3134;hsa-mir-3135;hsa-mir-3136;hsa-mir-3137;hsa-mir-3138;hsa-mir-3139;hsa-mir-3140;hsa-mir-3141;hsa-mir-3142;hs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-2;hsa-mir-512-1;hsa-mir-512-2;hsa-mir-513a-1;hsa-mir-513a-2;hsa-mir-513b;hsa-mir-513c;hsa-mir-514-1;hsa-mir-514-2;hsa-mir-514-3;hsa-mir-514b;hsa-mir-515-1;hsa-mir-515-2;hsa-mir-516a-1;hsa-mir-516a-2;hsa-mir-516b-1;hsa-mir-516b-2;hsa-mir-517a;hsa-mir-517b;hsa-mir-517c;hsa-mir-518a-1;hsa-mir-518a-2;hsa-mir-518b;hsa-mir-518c;hsa-mir-518d;hsa-mir-518e;hsa-mir-518f;hsa-mir-519a-1;hsa-mir-519a-2;hsa-mir-519b;hsa-mir-519c;hsa-mir-519d;hsa-mir-519e;hsa-mir-520a;hsa-mir-520b;hsa-mir-520c;hsa-mir-520d;hsa-mir-520e;hsa-mir-520f;hsa-mir-520g;hsa-mir-520h;hsa-mir-521-1;hsa-mir-521-2;hsa-mir-522;hsa-mir-523;hsa-mir-524;hsa-mir-525;hsa-mir-526a-1;hsa-mir-526a-2;hsa-mir-526b;hsa-mir-527;hsa-mir-532;hsa-mir-539;hsa-mir-541;hsa-mir-542;hsa-mir-543;hsa-mir-544;hsa-mir-544b;hsa-mir-545;hsa-mir-548a-1;hsa-mir-548a-2;hsa-mir-548a-3;hsa-mir-548aa-1;hsa-mir-548aa-2;hsa-mir-548b;hsa-mir-548c;hsa-mir-548d-1;hsa-mir-548d-2;hsa-mir-548e;hsa-mir-548f-1;hsa-mir-548f-2;hsa-mir-548f-3;hsa-mir-548f-4;hsa-mir-548f-5;hsa-mir-548g;hsa-mir-548h-1;hsa-mir-548h-2;hsa-mir-548h-3;hsa-mir-548h-4;hsa-mir-548i-1;hsa-mir-548i-2;hsa-mir-548i-3;hsa-mir-548i-4;hsa-mir-548j;hsa-mir-548k;hsa-mir-548l;hsa-mir-548m;hsa-mir-548n;hsa-mir-548o;hsa-mir-548p;hsa-mir-548q;hsa-mir-548s;hsa-mir-548t;hsa-mir-548u;hsa-mir-548v;hsa-mir-548w;hsa-mir-548x;hsa-mir-548y;hsa-mir-548z;hsa-mir-549;hsa-mir-550a-1;hsa-mir-550a-2;hsa-mir-550b-1;hsa-mir-550b-2;hsa-mir-551a;hsa-mir-551b;hsa-mir-552;hsa-mir-553;hsa-mir-554;hsa-mir-555;hsa-mir-556;hsa-mir-557;hsa-mir-558;hsa-mir-559;hsa-mir-561;hsa-mir-562;hsa-mir-563;hsa-mir-564;hsa-mir-566;hsa-mir-567;hsa-mir-568;hsa-mir-569;hsa-mir-570;hsa-mir-571;hsa-mir-572;hsa-mir-573;hsa-mir-574;hsa-mir-575;hsa-mir-576;hsa-mir-577;hsa-mir-578;hsa-mir-579;hsa-mir-580;hsa-mir-581;hsa-mir-582;hsa-mir-583;hsa-mir-584;hsa-mir-585;hsa-mir-586;hsa-mir-587;hsa-mir-588;hsa-mir-589;hsa-mir-590;hsa-mir-591;hsa-mir-592;hsa-mir-593;hsa-mir-595;hsa-mir-596;hsa-mir-597;hsa-mir-598;hsa-mir-599;hsa-mir-600;hsa-mir-601;hsa-mir-602;hsa-mir-603;hsa-mir-604;hsa-mir-605;hsa-mir-606;hsa-mir-607;hsa-mir-608;hsa-mir-609;hsa-mir-610;hsa-mir-611;hsa-mir-612;hsa-mir-613;hsa-mir-614;hsa-mir-615;hsa-mir-616;hsa-mir-617;hsa-mir-618;hsa-mir-619;hsa-mir-620;hsa-mir-621;hsa-mir-622;hsa-mir-623;hsa-mir-624;hsa-mir-625;hsa-mir-626;hsa-mir-627;hsa-mir-628;hsa-mir-629;hsa-mir-630;hsa-mir-631;hsa-mir-632;hsa-mir-633;hsa-mir-634;hsa-mir-635;hsa-mir-636;hsa-mir-637;hsa-mir-638;hsa-mir-639;hsa-mir-640;hsa-mir-641;hsa-mir-642a;hsa-mir-642b;hsa-mir-643;hsa-mir-644;hsa-mir-645;hsa-mir-646;hsa-mir-647;hsa-mir-648;hsa-mir-649;hsa-mir-650;hsa-mir-651;hsa-mir-652;hsa-mir-653;hsa-mir-654;hsa-mir-655;hsa-mir-656;hsa-mir-657;hsa-mir-658;hsa-mir-659;hsa-mir-660;hsa-mir-661;hsa-mir-662;hsa-mir-663;hsa-mir-663b;hsa-mir-664;hsa-mir-665;hsa-mir-668;hsa-mir-670;hsa-mir-671;hsa-mir-675;hsa-mir-676;hsa-mir-708;hsa-mir-7-1;hsa-mir-711;hsa-mir-718;hsa-mir-7-2;hsa-mir-720;hsa-mir-7-3;hsa-mir-744;hsa-mir-758;hsa-mir-759;hsa-mir-760;hsa-mir-761;hsa-mir-762;hsa-mir-764;hsa-mir-765;hsa-mir-766;hsa-mir-767;hsa-mir-769;hsa-mir-770;hsa-mir-802;hsa-mir-873;hsa-mir-874;hsa-mir-875;hsa-mir-876;hsa-mir-877;hsa-mir-885;hsa-mir-887;hsa-mir-888;hsa-mir-889;hsa-mir-890;hsa-mir-891a;hsa-mir-891b;hsa-mir-892a;hsa-mir-892b;hsa-mir-9-1;hsa-mir-9-2;hsa-mir-920;hsa-mir-921;hsa-mir-922;hsa-mir-924;hsa-mir-92a-1;hsa-mir-92a-2;hsa-mir-92b;hsa-mir-93;hsa-mir-9-3;hsa-mir-933;hsa-mir-934;hsa-mir-935;hsa-mir-936;hsa-mir-937;hsa-mir-938;hsa-mir-939;hsa-mir-940;hsa-mir-941-1;hsa-mir-941-3;hsa-mir-941-4;hsa-mir-942;hsa-mir-943;hsa-mir-944;hsa-mir-95;hsa-mir-96;hsa-mir-98;hsa-mir-99a;hsa-mir-99b.ebv-miR-BHRFl-1,ebv-miR-BHRFl-2*,ebv-miR-BHRFl-2,ebv-miR-BHRFl-3,ebv-miR-BARTl-5p,ebv-miR-BART2,hcmv-miR-UL22A,hcmv-miR-UL22A*,hcmv-miR-UL36,hcmv-miR-UL112,hcmv-miR-UL148D,hcmv-miR-US5-1,hcmv-miR-US5-2,hcmv-miR-US25-l,hcmv-miR-US25-2-5p,hcmv-miR-US25-2-3p,hcmv-miR-US33,kshv-miR-K12-10a,kshv-miR-K12-10b,kshv-miR-K12～ll,kshv-miR-K12-l,kshv-miR-K12-2,kshv-miR-K12-9*,kshv-miR～K12-9,kshv-miR-K12-8,kshv-miR-K12-7,kshv-miR-K12-6-5p,kshv-miR-K12-6-3p,kshv-miR-K12-5,kshv-miR-K12-4-5p,kshv-miR-K12-4-3p,kshv-miR-K12-3,kshv-miR-K12-3*,hcmv-miR-US4,hcmv-miR-UL70-5p,hcmv-20miR-UL70-3p,ebv-miR-BART3-5p,ebv-miR-BART3-3p,ebv-miR-BART4,ebv-miR-BART5,ebv-miR-BART6-5p,ebv-miR-BART6-3p,ebv-miR-BART7,ebv-miR-BART8-5p,ebv-miR-BART8-3p,ebv-miR-BART9,ebv-miR-BARTIO,ebv-miR-BARTll-5p,ebv-miR-BARTll-3p,ebv-miR～BART12,ebv-miR-BART13,ebv-miR-BART14-5p,ebv-miR-BART14-3p,kshv-miR-25K12-12,ebv-miR-BART15,ebv-miR-BART16,ebv-miR-BART17-5p,ebv-miR-BART17-3p,ebv-miR-BART18,ebv-miR-BART19,ebv-miR-BART20-5p,ebv-miR-BART20-3p和hsvl-miR-Hl。
附图说明
图1显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01452以后0.167小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图2显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01452以后0.5小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图3显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01452以后1小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图4显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01452以后2小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图5显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01452以后4小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图6显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01452以后8小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图7显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01452以后24小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图8显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01453以后0.167小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图9显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01453以后0.5小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图10显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01453以后1小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图11显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01453以后2小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图12显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01453以后4小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图13显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01453以后8小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图14显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01453以后24小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图15显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01454以后0.167小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图16显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01454以后0.5小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图17显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01454以后1小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图18显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01454以后2小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图19显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01454以后4小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图20显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01454以后8小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图21显示了在静脉内给予20mg/kg的14C标记的MI-01454以后24小时时，雄性CD-1小鼠中的放射性分布的代表性全身放射自显影图。
图22显示了生殖道、肌肉和呼吸道的组织中的抗-miRNA浓度随时间的分布。每组小鼠接受静脉内给予的20mg/kg的14C标记的抗-miRNA。给予组I小鼠[14C]MI-01452(图22A)；给予组II小鼠[14C]MI-01453(图22B)；和给予组III小鼠[14C]MI-01454(图22C)。
图23显示了中枢神经系统(CNS)、内分泌和分泌系统的组织中的抗-miRNA浓度随时间的分布。每组小鼠接受静脉内给予的20mg/kg的14C标记的抗-miRNA。给予组I小鼠[14C]MI-01452(图23A)；给予组II小鼠[14C]MI-01453(图23B)；和给予组III小鼠[14C]MI-01454(图23C)。
图24显示了血管和排泄系统的组织中的抗-miRNA浓度随时间的分布。每组小鼠接受静脉内给予的20mg/kg的14C标记的抗-miRNA。给予组I小鼠[14C]MI-01452(图24A)；给予组II小鼠[14C]MI-01453(图24B)；和给予组III小鼠[14C]MI-01454(图24C)。
图25显示了在单次静脉内给予20mg/kg(325μCi/kg)的[14C]MI-01452以后，雄性CD1小鼠组织中的放射性的浓度(μg当量/g)的数据表。
图26显示了在单次静脉内给予20mg/kg(325μCi/kg)的[14C]MI-01453以后，雄性CD1小鼠组织中的放射性的浓度(μg当量/g)的数据表。
图27显示了在单次静脉内给予20mg/kg(260μCi/kg)的[14C]MI-01454以后，雄性CD1小鼠组织中的放射性的浓度(μg当量/g)的数据表。
序列标识符的简要描述
SEQ ID NO:1示出了抗-miRNA的核酸序列。
SEQ ID NO:2示出了抗-miRNA的核酸序列。
SEQ ID NO:3示出了抗-miRNA的核酸序列。
详细描述
A.概述
抗-miRNA分子、siRNA、shRNA、piRNA模拟物、miRNA模拟物和其它基于核酸的治疗剂向组织的普遍递送是这些分子的临床应用的主要障碍。基于寡聚体的治疗应用的有限成功利用在可容易接近的组织中的局部给药，所述组织例如眼(Shen et al,Suppression of ocularneovascularization with siRNA targeting VEGF receptor1.Gene Ther(2006).13:225–234)、肺(Bitko et al,Inhibition of respiratory viruses by nasallyadministered siRNA.Nat Med(2005)11:50–55)和阴道(Palliser et al.AnsiRNA-based microbicide protects mice from lethal herpes simplex virus2infection.Nature(2006)439:89–94)。基于RNA的治疗剂的全身给药会导致较差的生物分布：治疗剂优先积累在肾和肝中(Shayne C.Gad.DrugDiscovery Handbook.(2005).John Wiley&Sons.P.1281)。
因而，尽管抗-miRNA分子、siRNA、shRNA、piRNA模拟物、miRNA模拟物是有吸引力的药物候选物，但在克服与这些候选药物的全身性给药有关的较差生物分布问题方面几乎没有取得进展。这类化合物的全身性给药的现有策略不能有效地将它们递送至广泛的组织。在没有开发出更有效的试剂来促进组织摄取的情况下，这些化合物仍然是治疗疾病的较差临床选择。因此，迫切需要这样的寡聚体：其具有广泛的生物分布谱，并且有效地调节基因表达和miRNA表达水平。
本发明提供了许多需要的、用于治疗与增加的基因表达或miRNA表达有关的疾病、障碍和病症的解决方案。本发明提供了新型的寡聚体，其具有胜过靶向基因和miRNA的现有技术方法的大量优点。本发明的寡聚体具有令人惊讶的和意外的广泛的生物分布谱，并提供了更安全的且更稳健的与更少脱靶效应有关的治疗范例。在不同的实施方案中，本发明部分地涵盖了提供广泛生物分布的寡聚体的方法，所述寡聚体与至少一个MGB部分缀合。因而，本发明的寡聚体和包含它们的组合物的给予提供了新的且非常合乎需要的将它们递送至受试者内的多种组织的策略。因此，本发明的方法和组合物提供了用于调节多种细胞和组织中的基因表达以及miRNA和miRNA簇的表达的优选策略。
B.siRNA和RNAi
RNA干扰是指动物中通过短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性的转录后基因沉默过程(Zamore et al,2000,Cell,101,25-33;Fire et al,1998,Nature,391,806;Hamilton et al,1999,Science,286,950-951;Lin et al,1999,Nature,402,128-129;Sharp,1999,Genes&Dev.,13,139-141；和Strauss,1999,Science,286,886)。
细胞中长dsRNA的存在刺激被称作Dicer的核糖核酸酶III酶的活性(Bass,2000,Cell,101,235;Zamore et al,2000,Cell,101,25-33;Hammondet al,2000,Nature,404,293)。Dicer参与dsRNA向被称作短干扰RNA(siRNA)的短dsRNA片段的加工(Zamore et al,2000,Cell,101,25-33;Bass,2000,Cell,101,235;Berstein et al,2001,Nature,409,363)。源自dicer活性的短干扰RNA的长度通常为约21至约23个核苷酸，且包含约19个碱基对的双螺旋(Zamore et al,2000,Cell,101,25-33;Elbashir et al,2001,Genes Dev.,15,188)。Dicer还涉及21个和22个核苷酸的小暂时RNA(stRNA)从参与翻译控制的具有保守结构的前体RNA的切除(Hutvagner etal,2001,Science,293,834)。RNAi应答还以内切核酸酶复合物(其通常被称作RNA诱导的沉默复合物(RISC))为特征，其介导具有与siRNA双螺旋的反义链互补的序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双螺旋的反义链互补的区域的中央(Elbashir et al,2001,Genes Dev.,15,188)。
Elbashir et al,2001,Nature,411,494和Tuschl et al,国际PCT公开号WO01/75164描述了通过在培养的哺乳动物细胞(包括人胚胎肾和HeLa细胞)中引入合成的21个核苷酸的RNA的双螺旋而诱导的RNAi。最近在果蝇属(Drosophila)胚胎裂解物中产生作用(Elbashir et al,2001,EMBOJ.,20,6877和Tuschl et al,国际PCT公开号WO01/75164)已经揭示了，对介导有效的RNAi活性所必需的siRNA长度、结构、化学组成和序列的某些要求。这些研究已经证实，21个核苷酸的siRNA双螺旋在含有3′-端二核苷酸悬突时是最有效的。
此外，用2′-脱氧(2′-H)或2′-O-甲基核苷酸完全取代一条或两条siRNA链会消除RNAi活性，而用2′-脱氧核苷酸(2′-H)取代3′-端siRNA悬突核苷酸被证实是耐受的。还证实了在siRNA双螺旋的中央的单个错配序列会消除RNAi活性。另外，这些研究还表明，靶RNA中的切割位点的位置是由siRNA引导序列的5′-末端(而不是引导序列的3′-末端)限定(Elbashir et al,2001,EMBO J,20,6877)。其它研究已经表明，siRNA双螺旋的靶标互补链上的5′-磷酸是siRNA活性所必需的，并且利用ATP来维持siRNA上的5′-磷酸部分(Nykanen et al,2001,Cell,107,309)。
已经描述了更长的dsRNA的用途。例如，Tuschl et al,国际PCT公开号WO01/75164描述了一种果蝇属体外RNAi系统以及特定siRNA分子用于某些功能性基因组应用和某些治疗应用的用途。Fire et al,国际PCT公开号WO99/32619描述了用于将某些长dsRNA分子引入细胞中用于抑制线虫类中的基因表达的具体方法。Mello et al,国际PCT公开号WO01/29058描述了在dsRNA介导的RNAi中涉及的特定基因的鉴别。Driscoll et al,国际PCT公开号WO01/49844描述了用于促进靶向的生物体中的基因沉默的特定DNA表达构建体。Fire et al,美国专利号6,506,559描述了使用某些介导RNAi的长dsRNA(299bp-1033bp)构建体体外抑制基因表达的某些方法。
RNA干扰的示例性机制包括、但不限于：转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或表观遗传RNAi。例如，本发明的siRNA分子可以用于在转录后水平或转录前水平表观遗传地使基因沉默。在一个非限制性实例中，本发明的siRNA分子对基因表达的表观遗传调控可以源自siRNA介导的对染色质结构或甲基化模式的修饰，从而改变基因表达(参见，例如，Verdel et al,2004,Science,303,672-676;Pal-Bhadra et al,2004,Science,303,669-672;Allshire,2002,Science,297,1818-1819;Volpe et al,2002,Science,297,1833-1837;Jenuwein,2002,Science,297,2215-2218；和Hallet al,2002,Science,297,2232-2237)。在另一个非限制性例子中，本发明的siRNA分子对基因表达的调控可以源自siRNA介导的经由RISC对RNA(编码或非编码RNA)的切割，或者可选择地，源自本领域中已知的翻译抑制。在另一个非限制性例子实施方案中，本发明的siRNA分子对基因表达的调控可以源自转录抑制(参见例如Janowski et al,2005,NatureChemical Biology,1,216-222)。
本发明另外部分地涵盖了被称作“siRNA”或“短干扰RNA”的寡聚体。本文中使用的术语“siRNA”和“短干扰RNA”是指单分子核酸，并且是指由2条单独的链构成的这样的核酸：其能够执行RNAi，并且具有长度为14-30个碱基对的双螺旋区。另外，术语siRNA和短语“短干扰RNA”包括这样的核酸：其也含有除了核糖核苷酸部分以外的部分，包括、但不限于，修饰的核苷酸、修饰的核苷酸间键、非核苷酸、脱氧核苷酸和前述核苷酸的类似物。siRNA可以是双螺旋，并且也可以包含短发夹RNA(shRNA)、具有环(长达例如4-23个或更多个核苷酸)的RNA、具有茎环凸起的RNA、微-RNA和短暂时RNA。具有环或发夹环的RNA可以包括这样的结构：其中所述环通过接头(诸如柔性接头)与茎连接。柔性接头可以由多种化学结构构成，只要它们具有足够的长度和材料以确保茎元件的有效分子内杂交。通常，所跨的长度是至少约10-24个原子。当siRNA是发夹时，有义链和反义链是一个更长分子的一部分。
C.miRNA
微RNA(miRNA)在引起疾病的生物学过程、发育时序、分化、细胞凋亡、细胞增殖、器官发育和代谢中是重要的。miRNA的生源说是众所周知的，且已经在下述文献中进行了综述：Kim,MicroRNA biogenesis:coordinated cropping and dicing.Nature Reviews Molecular Cell Biology,6(May2005):376-385，以及He and Hannon,MicroRNAs:Small RNAs with abig role in gene regulation.Nature Reviews Genetics,5(2004):522-531。
大多数miRNA基因由RNA聚合酶II(Pol II)转录。经过转录的miRNA转录物被称作初级miRNA(pri-miRNA或pri-miRNA转录物)。大部分由已知的Pol II转录的miRNA存在于基因间区域中或与基因成反义取向存在，且含有它们自己的miRNA基因启动子和调节单元。这样的pri-miRNA的长度可以为数百或数千个核苷酸，并且经过剪接、在5′末端加帽和聚腺苷酸化，例如，聚腺苷酸尾。许多miRNA在2个或更多个miRNA基因的簇中编码；因而，从在miRNA基因启动子控制下的miRNA基因簇转录的pri-miRNA被称作多顺反子pri-miRNA转录物。
另一大部分由已知的Pol II转录的miRNA是在现有基因内(例如，在5′或3′非翻译区(UTR)中)、在内含子内和非蛋白编码基因编码。经常，这样的miRNA是呈有义取向，且被转录为宿主基因pre-mRNA和/或mRNA转录物的一部分。因而，在该情况下，宿主基因的pre-mRNA(例如，内含子miRNA)或mRNA转录物包括pri-miRNA转录物。类似地，当miRNA基因簇集在宿主基因中时，宿主基因的pre-mRNA(例如，内含子miRNA)或mRNA转录物包括miRNA基因簇的多顺反子pri-miRNA转录物。
pri-miRNA转录物在细胞核中被核RNase III Drosha切割，以释放出miRNA的前体，即长度为约65-70个核苷酸的更小的茎-环发夹结构(pre-miRNA)。在由Drosha实现核加工以后，pre-miRNA被输出蛋白-5输出至细胞质。一旦到那里，RNase III酶Dicer将pre-miRNA加工成约18-24个核苷酸的双螺旋。所述双螺旋的一条链(其掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中并使基因表达沉默)被称作引导链或miRNA；而双螺旋的另一条链被降解，并被称作过客链或miRNA*(星链)。
不希望受任何特定理论约束，据信，依赖于pre-miRNA的茎-环结构中的5’-链和3’-链的热力学稳定性，细胞优先选择稳定性更低的一条链作为引导链，并破坏miRNA*或过客链。但是，靶标预测和确认测定证实，miRNA对的两条链可以靶向相等数目的基因，并且二者都能够抑制它们的靶基因的表达。使用347种miRNA前体(pre-miRNA)的数据集，Hu和同事确定，超过73%的前体从引导链和过客链产生成熟的miRNA(Hu etal,Sequence features associated with microRNA strand selection in humansand flies.BMC Genomics,10(2009):413)。因此，生物活性的miRNA可以从约18-24个核苷酸双螺旋的任一条链产生。
因而，本文中使用的术语“miRNA”或在数字前面的缩写“miR-”是指，掺入沉默复合物中并具有RNA沉默活性(miRNA活性)的生物活性的单链RNA。当讨论特定miRNA时，使用的命名习惯与在miRBase微RNA数据库(www.mirbase.org)中使用的相同。例如，如果miRNA克隆研究已经鉴别出2条源自相同预测前体的约18-24个核苷酸的序列miRNA，并且相对丰度指示其中哪一个是优势表达的miRNA，那么成熟序列被分配形式miR-17(优势产物；引导链)和miR-17*(得自前体的相对臂；过客链)的名称。当数据不足以确定哪个序列是优势序列时，使用诸如miR-142-5p(得自5’臂)和miR-142-3p(得自3’臂)的名称。在数据不足以确定哪个序列是优势序列的情况下，将5′臂命名为引导链序列，并将3′臂命名为过客链序列，作为使用通用术语来表示序列的方式。
到目前为止(桑格研究所(Sanger Institute)的2010年9月版miRBase)报道的人miRNA的数目是1049，这几乎是指定的最初计算值的5倍。另外，远远更多的预测的miRNA基因正在等待实验证实。
示例性的靶miRNA包括、但不限于：hsa-let-7a-1;hsa-let-7a-2;hsa-let-7a-3;hsa-let-7b;hsa-let-7c;hsa-let-7d;hsa-let-7e;hsa-let-7f-1;hsa-let-7f-2;hsa-let-7g;hsa-let-7i;hsa-mir-100;hsa-mir-101-1;hsa-mir-101-2;hsa-mir-103-1;hsa-mir-103-1-as;hsa-mir-103-2;hsa-mir-103-2-as;hsa-mir-105-1;hsa-mir-105-2;hsa-mir-106a;hsa-mir-106b;hsa-mir-107;hsa-mir-10a;hsa-mir-10b;hsa-mir-1-1;hsa-mir-1178;hsa-mir-1179;hsa-mir-1180;hsa-mir-1181;hsa-mir-1182;hsa-mir-1183;hsa-mir-1184-1;hsa-mir-1184-2;hsa-mir-1184-3;hsa-mir-1185-1;hsa-mir-1185-2;hsa-mir-1193;hsa-mir-1197;hsa-mir-1-2;hsa-mir-1200;hsa-mir-1202;hsa-mir-1203;hsa-mir-1204;hsa-mir-1205;hsa-mir-1206;hsa-mir-1207;hsa-mir-1208;hsa-mir-122;hsa-mir-1224;hsa-mir-1225;hsa-mir-1226;hsa-mir-1227;hsa-mir-1228;hsa-mir-1229;hsa-mir-1231;hsa-mir-1233-1;hsa-mir-1233-2;hsa-mir-1234;hsa-mir-1236;hsa-mir-1237;hsa-mir-1238;hsa-mir-124-1;hsa-mir-124-2;hsa-mir-1243;hsa-mir-124-3;hsa-mir-1244-1;hsa-mir-1244-2;hsa-mir-1244-3;hsa-mir-1245;hsa-mir-1246;hsa-mir-1247;hsa-mir-1248;hsa-mir-1249;hsa-mir-1250;hsa-mir-1251;hsa-mir-1252;hsa-mir-1253;hsa-mir-1254;hsa-mir-1255a;hsa-mir-1255b-1;hsa-mir-1255b-2;hsa-mir-1256;hsa-mir-1257;hsa-mir-1258;hsa-mir-125a;hsa-mir-125b-1;hsa-mir-125b-2;hsa-mir-126;hsa-mir-1260;hsa-mir-1260b;hsa-mir-1261;hsa-mir-1262;hsa-mir-1263;hsa-mir-1264;hsa-mir-1265;hsa-mir-1266;hsa-mir-1267;hsa-mir-1268;hsa-mir-1269;hsa-mir-127;hsa-mir-1270-1;hsa-mir-1270-2;hsa-mir-1271;hsa-mir-1272;hsa-mir-1273;hsa-mir-1273c;hsa-mir-1273d;hsa-mir-1274a;hsa-mir-1274b;hsa-mir-1275;hsa-mir-1276;hsa-mir-1277;hsa-mir-1278;hsa-mir-1279;hsa-mir-1280;hsa-mir-1281;hsa-mir-128-1;hsa-mir-1282;hsa-mir-128-2;hsa-mir-1283-1;hsa-mir-1283-2;hsa-mir-1284;hsa-mir-1285-1;hsa-mir-1285-2;hsa-mir-1286;hsa-mir-1287;hsa-mir-1288;hsa-mir-1289-1;hsa-mir-1289-2;hsa-mir-1290;hsa-mir-1291;hsa-mir-129-1;hsa-mir-1292;hsa-mir-129-2;hsa-mir-1293;hsa-mir-1294;hsa-mir-1295;hsa-mir-1296;hsa-mir-1297;hsa-mir-1298;hsa-mir-1299;hsa-mir-1301;hsa-mir-1302-1;hsa-mir-1302-10;hsa-mir-1302-11;hsa-mir-1302-2;hsa-mir-1302-3;hsa-mir-1302-4;hsa-mir-1302-5;hsa-mir-1302-6;hsa-mir-1302-7;hsa-mir-1302-8;hsa-mir-1302-9;hsa-mir-1303;hsa-mir-1304;hsa-mir-1305;hsa-mir-1306;hsa-mir-1307;hsa-mir-130a;hsa-mir-130b;hsa-mir-132;hsa-mir-1321;hsa-mir-1322;hsa-mir-1323;hsa-mir-1324;hsa-mir-133a-1;hsa-mir-133a-2;hsa-mir-133b;hsa-mir-134;hsa-mir-135a-1;hsa-mir-135a-2;hsa-mir-135b;hsa-mir-136;hsa-mir-137;hsa-mir-138-1;hsa-mir-138-2;hsa-mir-139;hsa-mir-140;hsa-mir-141;hsa-mir-142;hsa-mir-143;hsa-mir-144;hsa-mir-145;hsa-mir-1468;hsa-mir-1469;hsa-mir-146a;hsa-mir-146b;hsa-mir-147;hsa-mir-1470;hsa-mir-1471;hsa-mir-147b;hsa-mir-148a;hsa-mir-148b;hsa-mir-149;hsa-mir-150;hsa-mir-151;hsa-mir-152;hsa-mir-153-1;hsa-mir-153-2;hsa-mir-1537;hsa-mir-1538;hsa-mir-1539;hsa-mir-154;hsa-mir-155;hsa-mir-15a;hsa-mir-15b;hsa-mir-16-1;hsa-mir-16-2;hsa-mir-17;hsa-mir-181a-1;hsa-mir-181a-2;hsa-mir-181b-1;hsa-mir-181b-2;hsa-mir-181c;hsa-mir-181d;hsa-mir-182;hsa-mir-1825;hsa-mir-1827;hsa-mir-183;hsa-mir-184;hsa-mir-185;hsa-mir-186;hsa-mir-187;hsa-mir-188;hsa-mir-18a;hsa-mir-18b;hsa-mir-190;hsa-mir-1908;hsa-mir-1909;hsa-mir-190b;hsa-mir-191;hsa-mir-1910;hsa-mir-1911;hsa-mir-1912;hsa-mir-1913;hsa-mir-1914;hsa-mir-1915;hsa-mir-192;hsa-mir-193a;hsa-mir-193b;hsa-mir-194-1;hsa-mir-194-2;hsa-mir-195;hsa-mir-196a-1;hsa-mir-196a-2;hsa-mir-196b;hsa-mir-197;hsa-mir-1972-1;hsa-mir-1972-2;hsa-mir-1973;hsa-mir-1976;hsa-mir-198;hsa-mir-199a-1;hsa-mir-199a-2;hsa-mir-199b;hsa-mir-19a;hsa-mir-19b-1;hsa-mir-19b-2;hsa-mir-200a;hsa-mir-200b;hsa-mir-200c;hsa-mir-202;hsa-mir-203;hsa-mir-204;hsa-mir-205;hsa-mir-2052;hsa-mir-2053;hsa-mir-2054;hsa-mir-206;hsa-mir-208a;hsa-mir-208b;hsa-mir-20a;hsa-mir-20b;hsa-mir-21;hsa-mir-210;hsa-mir-211;hsa-mir-2110;hsa-mir-2113;hsa-mir-2114;hsa-mir-2115;hsa-mir-2116;hsa-mir-2117;hsa-mir-212;hsa-mir-214;hsa-mir-215;hsa-mir-216a;hsa-mir-216b;hsa-mir-217;hsa-mir-218-1;hsa-mir-218-2;hsa-mir-219-1;hsa-mir-219-2;hsa-mir-22;hsa-mir-221;hsa-mir-222;hsa-mir-223;hsa-mir-224;hsa-mir-2276;hsa-mir-2277;hsa-mir-2278;hsa-mir-2355;hsa-mir-23a;hsa-mir-23b;hsa-mir-23c;hsa-mir-24-1;hsa-mir-24-2;hsa-mir-25;hsa-mir-26a-1;hsa-mir-26a-2;hsa-mir-26b;hsa-mir-27a;hsa-mir-27b;hsa-mir-28;hsa-mir-2861;hsa-mir-2909;hsa-mir-296;hsa-mir-297;hsa-mir-298;hsa-mir-299;hsa-mir-29a;hsa-mir-29b-1;hsa-mir-29b-2;hsa-mir-29c;hsa-mir-300;hsa-mir-301a;hsa-mir-301b;hsa-mir-302a;hsa-mir-302b;hsa-mir-302c;hsa-mir-302d;hsa-mir-302e;hsa-mir-302f;hsa-mir-3065;hsa-mir-3074;hsa-mir-30a;hsa-mir-30b;hsa-mir-30c-1;hsa-mir-30c-2;hsa-mir-30d;hsa-mir-30e;hsa-mir-31;hsa-mir-3115;hsa-mir-3116-1;hsa-mir-3116-2;hsa-mir-3117;hsa-mir-3118-1;hsa-mir-3118-2;hsa-mir-3118-3;hsa-mir-3118-4;hsa-mir-3118-5;hsa-mir-3118-6;hsa-mir-3119-1;hsa-mir-3119-2;hsa-mir-3120;hsa-mir-3121;hsa-mir-3122;hsa-mir-3123;hsa-mir-3124;hsa-mir-3125;hsa-mir-3126;hsa-mir-3127;hsa-mir-3128;hsa-mir-3129;hsa-mir-3130-1;hsa-mir-3130-2;hsa-mir-3131;hsa-mir-3132;hsa-mir-3133;hsa-mir-3134;hsa-mir-3135;hsa-mir-3136;hsa-mir-3137;hsa-mir-3138;hsa-mir-3139;hsa-mir-3140;hsa-mir-3141;hsa-mir-3142;hsa-mir-3143;hsa-mir-3144;hsa-mir-3145;hsa-mir-3146;hsa-mir-3147;hsa-mir-3148;hsa-mir-3149;hsa-mir-3150;hsa-mir-3150b;hsa-mir-3151;hsa-mir-3152;hsa-mir-3153;hsa-mir-3154;hsa-mir-3155;hsa-mir-3156-1;hsa-mir-3156-2;hsa-mir-3156-3;hsa-mir-3157;hsa-mir-3158-1;hsa-mir-3158-2;hsa-mir-3159;hsa-mir-3160-1;hsa-mir-3160-2;hsa-mir-3161;hsa-mir-3162;hsa-mir-3163;hsa-mir-3164;hsa-mir-3165;hsa-mir-3166;hsa-mir-3167;hsa-mir-3168;hsa-mir-3169;hsa-mir-3170;hsa-mir-3171;hsa-mir-3173;hsa-mir-3174;hsa-mir-3175;hsa-mir-3176;hsa-mir-3177;hsa-mir-3178;hsa-mir-3179-1;hsa-mir-3179-2;hsa-mir-3179-3;hsa-mir-3180-1;hsa-mir-3180-2;hsa-mir-3180-3;hsa-mir-3180-4;hsa-mir-3180-5;hsa-mir-3181;hsa-mir-3182;hsa-mir-3183;hsa-mir-3184;hsa-mir-3185;hsa-mir-3186;hsa-mir-3187;hsa-mir-3188;hsa-mir-3189;hsa-mir-3190;hsa-mir-3191;hsa-mir-3192;hsa-mir-3193;hsa-mir-3194;hsa-mir-3195;hsa-mir-3196;hsa-mir-3197;hsa-mir-3198;hsa-mir-3199-1;hsa-mir-3199-2;hsa-mir-32;hsa-mir-3200;hsa-mir-3201;hsa-mir-3202-1;hsa-mir-3202-2;hsa-mir-320a;hsa-mir-320b-1;hsa-mir-320b-2;hsa-mir-320c-1;hsa-mir-320c-2;hsa-mir-320d-1;hsa-mir-320d-2;hsa-mir-320e;hsa-mir-323;hsa-mir-323b;hsa-mir-324;hsa-mir-325;hsa-mir-326;hsa-mir-328;hsa-mir-329-1;hsa-mir-329-2;hsa-mir-330;hsa-mir-331;hsa-mir-335;hsa-mir-337;hsa-mir-338;hsa-mir-339;hsa-mir-33a;hsa-mir-33b;hsa-mir-340;hsa-mir-342;hsa-mir-345;hsa-mir-346;hsa-mir-34a;hsa-mir-34b;hsa-mir-34c;hsa-mir-3605;hsa-mir-3606;hsa-mir-3607;hsa-mir-3609;hsa-mir-361;hsa-mir-3610;hsa-mir-3611;hsa-mir-3612;hsa-mir-3613;hsa-mir-3614;hsa-mir-3615;hsa-mir-3616;hsa-mir-3617;hsa-mir-3618;hsa-mir-3619;hsa-mir-362;hsa-mir-3620;hsa-mir-3621;hsa-mir-3622a;hsa-mir-3622b;hsa-mir-363;hsa-mir-3646;hsa-mir-3647;hsa-mir-3648;hsa-mir-3649;hsa-mir-3650;hsa-mir-3651;hsa-mir-365-1;hsa-mir-3652;hsa-mir-365-2;hsa-mir-3653;hsa-mir-3654;hsa-mir-3655;hsa-mir-3656;hsa-mir-3657;hsa-mir-3658;hsa-mir-3659;hsa-mir-3660;hsa-mir-3661;hsa-mir-3662;hsa-mir-3663;hsa-mir-3664;hsa-mir-3665;hsa-mir-3666;hsa-mir-3667;hsa-mir-3668;hsa-mir-3669;hsa-mir-367;hsa-mir-3670;hsa-mir-3670;hsa-mir-3670;hsa-mir-3671;hsa-mir-3672;hsa-mir-3673;hsa-mir-3674;hsa-mir-3675;hsa-mir-3676;hsa-mir-3677;hsa-mir-3678;hsa-mir-3679;hsa-mir-3680;hsa-mir-3680;hsa-mir-3681;hsa-mir-3682;hsa-mir-3683;hsa-mir-3684;hsa-mir-3685;hsa-mir-3686;hsa-mir-3687;hsa-mir-3688;hsa-mir-3689a;hsa-mir-3689b;hsa-mir-369;hsa-mir-3690;hsa-mir-3691;hsa-mir-3692;hsa-mir-370;hsa-mir-371;hsa-mir-3713;hsa-mir-3714;hsa-mir-372;hsa-mir-373;hsa-mir-374a;hsa-mir-374b;hsa-mir-374c;hsa-mir-375;hsa-mir-376a-1;hsa-mir-376a-2;hsa-mir-376b;hsa-mir-376c;hsa-mir-377;hsa-mir-378;hsa-mir-378b;hsa-mir-378c;hsa-mir-379;hsa-mir-380;hsa-mir-381;hsa-mir-382;hsa-mir-383;hsa-mir-384;hsa-mir-3907;hsa-mir-3908;hsa-mir-3909;hsa-mir-3910-1;hsa-mir-3910-2;hsa-mir-3911;hsa-mir-3912;hsa-mir-3913-1;hsa-mir-3913-2;hsa-mir-3914-1;hsa-mir-3914-2;hsa-mir-3915;hsa-mir-3916;hsa-mir-3917;hsa-mir-3918;hsa-mir-3919;hsa-mir-3920;hsa-mir-3921;hsa-mir-3922;hsa-mir-3923;hsa-mir-3924;hsa-mir-3925;hsa-mir-3926-1;hsa-mir-3926-2;hsa-mir-3927;hsa-mir-3928;hsa-mir-3929;hsa-mir-3934;hsa-mir-3935;hsa-mir-3936;hsa-mir-3937;hsa-mir-3938;hsa-mir-3939;hsa-mir-3940;hsa-mir-3941;hsa-mir-3942;hsa-mir-3943;hsa-mir-3944;hsa-mir-3945;hsa-mir-409;hsa-mir-410;hsa-mir-411;hsa-mir-412;hsa-mir-421;hsa-mir-422a;hsa-mir-423;hsa-mir-424;hsa-mir-425;hsa-mir-4251;hsa-mir-4252;hsa-mir-4253;hsa-mir-4254;hsa-mir-4255;hsa-mir-4256;hsa-mir-4257;hsa-mir-4258;hsa-mir-4259;hsa-mir-4260;hsa-mir-4261;hsa-mir-4262;hsa-mir-4263;hsa-mir-4264;hsa-mir-4265;hsa-mir-4266;hsa-mir-4267;hsa-mir-4268;hsa-mir-4269;hsa-mir-4270;hsa-mir-4271;hsa-mir-4272;hsa-mir-4273;hsa-mir-4274;hsa-mir-4275;hsa-mir-4276;hsa-mir-4277;hsa-mir-4278;hsa-mir-4279;hsa-mir-4280;hsa-mir-4281;hsa-mir-4282;hsa-mir-4283-1;hsa-mir-4283-2;hsa-mir-4284;hsa-mir-4285;hsa-mir-4286;hsa-mir-4287;hsa-mir-4288;hsa-mir-4289;hsa-mir-429;hsa-mir-4290;hsa-mir-4291;hsa-mir-4292;hsa-mir-4293;hsa-mir-4294;hsa-mir-4295;hsa-mir-4296;hsa-mir-4297;hsa-mir-4298;hsa-mir-4299;hsa-mir-4300;hsa-mir-4301;hsa-mir-4302;hsa-mir-4303;hsa-mir-4304;hsa-mir-4305;hsa-mir-4306;hsa-mir-4307;hsa-mir-4308;hsa-mir-4309;hsa-mir-431;hsa-mir-4310;hsa-mir-4311;hsa-mir-4312;hsa-mir-4313;hsa-mir-4314;hsa-mir-4315-1;hsa-mir-4315-2;hsa-mir-4316;hsa-mir-4317;hsa-mir-4318;hsa-mir-4319;hsa-mir-432;hsa-mir-4320;hsa-mir-4321;hsa-mir-4322;hsa-mir-4323;hsa-mir-4324;hsa-mir-4325;hsa-mir-4326;hsa-mir-4327;hsa-mir-4328;hsa-mir-4329;hsa-mir-433;hsa-mir-4330;hsa-mir-448;hsa-mir-449a;hsa-mir-449b;hsa-mir-449c;hsa-mir-450a-1;hsa-mir-450a-2;hsa-mir-450b;hsa-mir-451;hsa-mir-452;hsa-mir-454;hsa-mir-455;hsa-mir-466;hsa-mir-483;hsa-mir-484;hsa-mir-485;hsa-mir-486;hsa-mir-487a;hsa-mir-487b;hsa-mir-488;hsa-mir-489;hsa-mir-490;hsa-mir-491;hsa-mir-492;hsa-mir-493;hsa-mir-494;hsa-mir-495;hsa-mir-496;hsa-mir-497;hsa-mir-498;hsa-mir-499;hsa-mir-500a;hsa-mir-500b;hsa-mir-501;hsa-mir-502;hsa-mir-503;hsa-mir-504;hsa-mir-505;hsa-mir-506;hsa-mir-507;hsa-mir-508;hsa-mir-509-1;hsa-mir-509-2;hsa-mir-509-3;hsa-mir-510;hsa-mir-511-1;hsa-mir-511-2;hsa-mir-512-1;hsa-mir-512-2;hsa-mir-513a-1;hsa-mir-513a-2;hsa-mir-513b;hsa-mir-513c;hsa-mir-514-1;hsa-mir-514-2;hsa-mir-514-3;hsa-mir-514b;hsa-mir-515-1;hsa-mir-515-2;hsa-mir-516a-1;hsa-mir-516a-2;hsa-mir-516b-1;hsa-mir-516b-2;hsa-mir-517a;hsa-mir-517b;hsa-mir-517c;hsa-mir-518a-1;hsa-mir-518a-2;hsa-mir-518b;hsa-mir-518c;hsa-mir-518d;hsa-mir-518e;hsa-mir-518f;hsa-mir-519a-1;hsa-mir-519a-2;hsa-mir-519b;hsa-mir-519c;hsa-mir-519d;hsa-mir-519e;hsa-mir-520a;hsa-mir-520b;hsa-mir-520c;hsa-mir-520d;hsa-mir-520e;hsa-mir-520f;hsa-mir-520g;hsa-mir-520h;hsa-mir-521-1;hsa-mir-521-2;hsa-mir-522;hsa-mir-523;hsa-mir-524;hsa-mir-525;hsa-mir-526a-1;hsa-mir-526a-2;hsa-mir-526b;hsa-mir-527;hsa-mir-532;hsa-mir-539;hsa-mir-541;hsa-mir-542;hsa-mir-543;hsa-mir-544;hsa-mir-544b;hsa-mir-545;hsa-mir-548a-1;hsa-mir-548a-2;hsa-mir-548a-3;hsa-mir-548aa-1;hsa-mir-548aa-2;hsa-mir-548b;hsa-mir-548c;hsa-mir-548d-1;hsa-mir-548d-2;hsa-mir-548e;hsa-mir-548f-1;hsa-mir-548f-2;hsa-mir-548f-3;hsa-mir-548f-4;hsa-mir-548f-5;hsa-mir-548g;hsa-mir-548h-1;hsa-mir-548h-2;hsa-mir-548h-3;hsa-mir-548h-4;hsa-mir-548i-1;hsa-mir-548i-2;hsa-mir-548i-3;hsa-mir-548i-4;hsa-mir-548j;hsa-mir-548k;hsa-mir-548l;hsa-mir-548m;hsa-mir-548n;hsa-mir-548o;hsa-mir-548p;hsa-mir-548q;hsa-mir-548s;hsa-mir-548t;hsa-mir-548u;hsa-mir-548v;hsa-mir-548w;hsa-mir-548x;hsa-mir-548y;hsa-mir-548z;hsa-mir-549;hsa-mir-550a-1;hsa-mir-550a-2;hsa-mir-550b-1;hsa-mir-550b-2;hsa-mir-551a;hsa-mir-551b;hsa-mir-552;hsa-mir-553;hsa-mir-554;hsa-mir-555;hsa-mir-556;hsa-mir-557;hsa-mir-558;hsa-mir-559;hsa-mir-561;hsa-mir-562;hsa-mir-563;hsa-mir-564;hsa-mir-566;hsa-mir-567;hsa-mir-568;hsa-mir-569;hsa-mir-570;hsa-mir-571;hsa-mir-572;hsa-mir-573;hsa-mir-574;hsa-mir-575;hsa-mir-576;hsa-mir-577;hsa-mir-578;hsa-mir-579;hsa-mir-580;hsa-mir-581;hsa-mir-582;hsa-mir-583;hsa-mir-584;hsa-mir-585;hsa-mir-586;hsa-mir-587;hsa-mir-588;hsa-mir-589;hsa-mir-590;hsa-mir-591;hsa-mir-592;hsa-mir-593;hsa-mir-595;hsa-mir-596;hsa-mir-597;hsa-mir-598;hsa-mir-599;hsa-mir-600;hsa-mir-601;hsa-mir-602;hsa-mir-603;hsa-mir-604;hsa-mir-605;hsa-mir-606;hsa-mir-607;hsa-mir-608;hsa-mir-609;hsa-mir-610;hsa-mir-611;hsa-mir-612;hsa-mir-613;hsa-mir-614;hsa-mir-615;hsa-mir-616;hsa-mir-617;hsa-mir-618;hsa-mir-619;hsa-mir-620;hsa-mir-621;hsa-mir-622;hsa-mir-623;hsa-mir-624;hsa-mir-625;hsa-mir-626;hsa-mir-627;hsa-mir-628;hsa-mir-629;hsa-mir-630;hsa-mir-631;hsa-mir-632;hsa-mir-633;hsa-mir-634;hsa-mir-635;hsa-mir-636;hsa-mir-637;hsa-mir-638;hsa-mir-639;hsa-mir-640;hsa-mir-641;hsa-mir-642a;hsa-mir-642b;hsa-mir-643;hsa-mir-644;hsa-mir-645;hsa-mir-646;hsa-mir-647;hsa-mir-648;hsa-mir-649;hsa-mir-650;hsa-mir-651;hsa-mir-652;hsa-mir-653;hsa-mir-654;hsa-mir-655;hsa-mir-656;hsa-mir-657;hsa-mir-658;hsa-mir-659;hsa-mir-660;hsa-mir-661;hsa-mir-662;hsa-mir-663;hsa-mir-663b;hsa-mir-664;hsa-mir-665;hsa-mir-668;hsa-mir-670;hsa-mir-671;hsa-mir-675;hsa-mir-676;hsa-mir-708;hsa-mir-7-1;hsa-mir-711;hsa-mir-718;hsa-mir-7-2;hsa-mir-720;hsa-mir-7-3;hsa-mir-744;hsa-mir-758;hsa-mir-759;hsa-mir-760;hsa-mir-761;hsa-mir-762;hsa-mir-764;hsa-mir-765;hsa-mir-766;hsa-mir-767;hsa-mir-769;hsa-mir-770;hsa-mir-802;hsa-mir-873;hsa-mir-874;hsa-mir-875;hsa-mir-876;hsa-mir-877;hsa-mir-885;hsa-mir-887;hsa-mir-888;hsa-mir-889;hsa-mir-890;hsa-mir-891a;hsa-mir-891b;hsa-mir-892a;hsa-mir-892b;hsa-mir-9-1;hsa-mir-9-2;hsa-mir-920;hsa-mir-921;hsa-mir-922;hsa-mir-924;hsa-mir-92a-1;hsa-mir-92a-2;hsa-mir-92b;hsa-mir-93;hsa-mir-9-3;hsa-mir-933;hsa-mir-934;hsa-mir-935;hsa-mir-936;hsa-mir-937;hsa-mir-938;hsa-mir-939;hsa-mir-940;hsa-mir-941-1;hsa-mir-941-3;hsa-mir-941-4;hsa-mir-942;hsa-mir-943;hsa-mir-944;hsa-mir-95;hsa-mir-96;hsa-mir-98;hsa-mir-99a;hsa-mir-99b.ebv-miR-BHRFl-1,ebv-miR-BHRFl-2*,ebv-miR-BHRFl-2,ebv-miR-BHRFl-3,ebv-miR-BARTl-5p,ebv-miR-BART2,hcmv-miR-UL22A,hcmv-miR-UL22A*,hcmv-miR-UL36,hcmv-miR-UL112,hcmv-miR-UL148D,hcmv-miR-US5-1,hcmv-miR-US5-2,hcmv-miR-US25-l,hcmv-miR-US25-2-5p,hcmv-miR-US25-2-3p,hcmv-miR-US33,kshv-miR-K12-10a,kshv-miR-K12-10b,kshv-miR-K12～ll,kshv-miR-K12-l,kshv-miR-K12-2,kshv-miR-K12-9*,kshv-miR～K12-9,kshv-miR-K12-8,kshv-miR-K12-7,kshv-miR-K12-6-5p,kshv-miR-K12-6-3p,kshv-miR-K12-5,kshv-miR-K12-4-5p,kshv-miR-K12-4-3p,kshv-miR-K12-3,kshv-miR-K12-3*,hcmv-miR-US4,hcmv-miR-UL70-5p,hcmv-20miR-UL70-3p,ebv-miR-BART3-5p,ebv-miR-BART3-3p,ebv-miR-BART4,ebv-miR-BART5,ebv-miR-BART6-5p,ebv-miR-BART6-3p,ebv-miR-BART7,ebv-miR-BART8-5p,ebv-miR-BART8-3p,ebv-miR-BART9,ebv-miR-BARTIO,ebv-miR-BARTll-5p,ebv-miR-BARTll-3p,ebv-miR～BART12,ebv-miR-BART13,ebv-miR-BART14-5p,ebv-miR-BART14-3p,kshv-miR-25K12-12,ebv-miR-BART15,ebv-miR-BART16,ebv-miR-BART17-5p,ebv-miR-BART17-3p,ebv-miR-BART18,ebv-miR-BART19,ebv-miR-BART20-5p,ebv-miR-BART20-3p和hsvl-miR-Hl。
D.miRNA簇
近年来，在发现了许多miRNA基因以后，一些研究组指明，簇集miRNA联合起作用以完成它们在许多生物学过程中的功能。如上面所指出的，许多miRNA是在miRNA基因簇中编码。本文中使用的术语“miRNA基因簇”和“miRNA簇”可互换使用，并指编码2种或更多种miRNA基因的基因组基因座或转录单元。
例如，在结肠癌以及在某些其它癌细胞系中，mir-143簇的表达被下调(Michael et al,Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectalneoplasia,Mol.Cancer Res.1(2003)882–891)。经证实，mir-430簇调节斑马鱼中的神经生成(Giraldez et al,MicroRNAs regulate brain morphogenesisin zebrafish,Science308(2005)833–838)。mir-17簇调控E2F1表达，且可能是潜在的人癌基因(O’Donnell et al,c-Myc-regulated microRNAsmodulate E2F1expression,Nature435(2005)839–843)，以及mir-15a簇可以通过靶向BCL2而诱导白血病细胞细胞凋亡(Cimmino et al,miR-15andmiR-16induce apoptosis by targeting BCL2,Proc.Natl.Acad.Sci.102(2005)13944–13949)。
在一项新近的研究中，人类中簇集miRNA的比例远远超过以前所预见到的结果(Altuvia et al,Clustering and conservation patterns of humanmicroRNAs,Nucleic Acids Res.33(2005)2697–2706)。miRNA基因的该天然基因组组织模式为它们提供了协同起作用的内部机制，但是迄今为止，尚未描述这类机制，并且没有充分理解集簇在调节发育和疾病中的作用。在另一项新近的研究中，Yu和同事们进行了不同类型的白血病细胞系中的簇集miRNA的子集的绘图(Yu et al,Human microRNA clusters:Genomic organization and expression profile in leukemia cell lines,349B.B.R.C.:59-68)。尽管Yu等人发现，多种miRNA在白血病细胞所表达的集簇中表现出活性，但是该分析就此结束。
几个研究组已经利用基因组方案来鉴别miRNA簇(参见，例如，Zhang et al,Sci China Ser C-Life Sci,(2009)52:261-266;Yu et al,2006;Altuvia et al,2005)。Altuvia和同事们使用一组207种人miRNA来鉴别31个miRNA簇。Yu和同事们使用326种人miRNA基因的数据集，并鉴别出被组织成51个集簇的148种miRNA。本发明使用了英国桑格中心(Sanger Center)的miRNA数据库的最新纪录。使用709种miRNA基因的数据集，鉴别出了被组织成73个集簇的224种miRNA。所述73个集簇含有Yu et al(2006)的所有集簇。表1显示了示例性的靶miRNA簇、染色体位置和旁系同源物组的组织。
表1：miRNA簇
Figure BDA0000383241560000321
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Figure BDA0000383241560000341
Figure BDA0000383241560000351
Figure BDA0000383241560000371
miRNA基因的编号是简单连续的。名称/标识符是呈hsa-mir-121形式。前3个字母表示生物体；“hsa”是指智人。前缀“mir-”是指miRNA基因，并且也是指初级转录物的预测茎-环部分。表达相同成熟序列的不同前体序列和基因组基因座具有hsa-mir-121-1和hsa-mir-121-2形式的名称。表达相差1个或2个核苷酸的几乎相同序列的不同前体序列和基因组基因座用额外的小写字母进行注解，例如hsa-mir-121a和hsa-mir-121b。
E.miRNA模拟物
本发明另外部分地涵盖了被称作miRNA模拟物的寡聚体。术语“微RNA模拟物”或“miRNA模拟物”或“miRNA模仿物”是指，能够进入RNAi途径中并调节基因表达的合成的非编码RNA。miRNA模拟物模仿内源性微RNA(miRNA)的功能，且可以被设计为成熟的双链分子或模仿前体(例如，pri-miRNA或pre-miRNA)。miRNA模拟物可以由修饰的或未修饰的RNA、DNA、RNA-DNA杂交物或替代性的核酸化学试剂(例如，锁核酸(LNA)或2′-O,4′-C亚乙基桥连核酸(ENA))构成。对于成熟的双链miRNA模拟物，双螺旋区的长度可以在约16个至31个核苷酸之间变化，且化学修饰模式可以包括以下：有义链含有核苷酸1和2(从有义寡核苷酸的5′末端计算)和所有C和U的2′-O-甲基修饰。另外，有义链可以包含增强功能性、递送或特异性的缀合物。反义链修饰可以包括所有C和U的2′F修饰、寡核苷酸的5′末端的磷酸化、和与2个核苷酸的3′悬突有关的稳定化核苷酸间键。
F.piRNA模拟物
本发明另外部分地涵盖了被称作piRNA模拟物的寡聚体。术语“piRNA模拟物”是指，能够进入RNAi途径中并调节基因表达的合成的非编码RNA。piRNA模拟物模仿内源性Piwi相互作用RNA(一类被认为参与转录沉默的小RNA)的功能(参见Lau,N.C.et al(2006)Science,313:305-306)。
G.shRNA
本发明另外部分地涵盖了被称作shRNA的寡聚体。shRNA是由单条自互补的RNA链形成的双链结构。RNA双螺旋形成可以在细胞内部或外部开始。抑制是序列特异性的，因为与RNA的双螺旋区相对应的核苷酸序列被靶向用于遗传抑制。含有与靶基因的编码或非编码序列的一部分相同的核苷酸序列的shRNA构建体是抑制优选的。还已经发现，与靶序列相比具有插入、缺失、和单个点突变的RNA序列对于抑制而言是有效的。因为在RNA和靶基因之间的100%序列同一性不是实施本发明所必需的，所以本发明具有下述优点：能够耐受可能由于基因突变、品种多态性或进化趋异而预见到的序列变异。可以如下优化序列同一性：进行本领域中已知的序列比较和比对算法(参见Gribskov和Devereux,Sequence Analysis Primer,Stockton Press,1991，和其中引用的参考文献)，并计算核苷酸序列之间的差异百分比，例如，通过在BESTFIT软件程序中执行的Smith-Waterman算法，使用默认参数(例如，University ofWisconsin Genetic Computing Group)。在抑制性的RNA和靶基因的一部分之间的大于90%序列同一性或甚至100%序列同一性是优选的。可选择地，RNA的双螺旋区可以在功能上被定义为能够与靶基因转录物的一部分杂交(例如，400mM NaCl,40mM PIPES pH6.4,1mM EDTA,50℃或70℃杂交12-16小时；随后洗涤)的核苷酸序列。在某些优选实施方案中，shRNA的双螺旋形成部分的长度是至少20、21或22个核苷酸的长度，例如，其大小与由Dicer依赖性的切割产生的RNA产物相对应。在某些实施方案中，所述shRNA构建体的长度是至少25、50、100、200、300或400个碱基。在某些实施方案中，所述shRNA构建体的长度是400-800个碱基。shRNA构建体高度耐受环序列和环大小的变异。
细胞的内源性RNA聚合酶可以介导在核酸构建体中编码的shRNA的转录。所述shRNA构建体也可以由在细胞中表达的噬菌体RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)合成。在优选实施方案中，shRNA的表达由RNA聚合酶III启动子调节；已知这样的启动子会产生有效的沉默。尽管可以使用基本上任意的PolIII启动子，但是可取的例子包括：人U6snRNA启动子、小鼠U6snRNA启动子、人和小鼠H1RNA启动子、以及人tRNA-val启动子。U6snRNA前导序列可以附加于初级转录物上；这样的前导序列倾向于增加次优shRNA的效率，同时通常对有效的shRNA几乎没有影响或没有影响。对于在体内从转基因的转录，可以使用调节区(例如，启动子、增强子、沉默子、剪接供体和受体、聚腺苷酸化)来调节shRNA链(或链们)的表达。下述因素可以控制抑制：器官、组织或细胞类型中的特异性转录；环境条件(例如，感染、应激、温度、化学诱导物)的刺激；和/或在发育阶段或年龄的工程化转录。RNA链可以是聚腺苷酸化的或不是聚腺苷酸化的；RNA链可以能够或不能通过细胞的翻译机构翻译成多肽。表达构建体的应用和生产是本领域已知的(也参见WO97/32016；美国专利号5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214和5,804,693；和其中引用的参考文献)。
可以将shRNA构建体设计成具有在U6snRNA前导序列之后的29bp螺旋，转录物由人U6snRNA启动子产生。该转录单元可以通过基于鼠干细胞病毒(MSCV)的逆转录病毒来递送，表达盒插入在包装信号的下游。关于shRNA构建体的优化的其它信息，可以参见例如下述参考文献：Paddison,P.J.,A.A.Caudy,and G.J.Hannon,Stable suppression of geneexpression by RNAi in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA,2002.99(3):第1443-8页;13.Brummelkamp,T.R.,R.Bemards,and R.Agami,A Systemfor Stable Expression of Short Interfering RNAs in Mammalian Cells.Science,2002.21:第21页;Kawasaki,H.and K.Taira,Short hairpin type of dsRNAsthat are controlled by tRNA(Val)promoter significantly induceRNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells.Nucleic AcidsRes,2003.31(2):第700-7页,Lee,N.S.,et al,Expression of smallinterfering RNAs targeted against HIV-1rev transcripts in human cells.NatBiotechnol,2002.20(5):第500-5页;Miyagishi,M.and K.Taira,U6promoter-driven siRNAs with four uridine3′overhangs efficiently suppresstargeted gene expression in mammalian cells.Nat Biotechnol,2002.20(5):第497-500页;Paul,C P.,et al,Effective expression of small interferingRNA in human cells.Nat Biotechnol,2002.20(5):第505-8页。
H.抗-miRNA
在特定实施方案中，本发明部分地涵盖了作为抗-miRNA分子的寡聚体。本文中使用的术语“抗-miRNA分子”或“抗-miRNA”是指，干扰pre-miRNA、pri-miRNA和/或miRNA的表达和/或活性的寡聚体。
I.寡聚体
本发明部分地涵盖了包含寡聚体或寡聚化合物的抗-miRNA分子。本文中使用的术语“寡聚体”、“寡聚的”或其等同术语是指，与存在于细胞中的靶RNA序列杂交的聚合结构。寡聚体可以是单链的或双链的，且包括抗-miRNA、siRNA、shRNA、piRNA模拟物和miRNA模拟物。
靶RNA序列包括、但不限于pre-mRNA、mRNA、pre-miRNA、pri-miRNA和miRNA。靶序列存在于miRNA或pri-miRNA转录物中，所述miRNA或pri-miRNA各自可以由miRNA基因启动子转录或由宿主基因启动子转录，在该情况下，pri-miRNA转录物被包括在宿主基因的pre-mRNA或mRNA序列中。
本发明的寡聚体包含下述特征中的一项或多项：小沟结合部分(MGB)、修饰的或未修饰的核苷酸和核苷、核苷酸类似物、核苷类似物、核苷酸模拟物(前述每一种都可以包含不同的修饰的糖或修饰的核苷酸间键/核苷间键)、缀合物(例如，胆固醇)和促进缀合物和/或MGB与所述寡聚体的共价结合的接头。在一个实施方案中，术语“寡聚体”是指，包含一个或多个MGB部分的寡聚体。在一个实施方案中，术语“寡聚体”是指，多个包含一个或多个MGB部分的单体单元。本发明的寡聚体与未缀合的寡聚体和/或缺少MGB的分子相比具有增加的生物分布。
本文中使用的术语“生物分布”是指，给予或递送给受试者的寡聚体的细胞和/或组织和/或器官分布。本文中使用的术语“促进”、“增强”、“刺激”或“增加”通常是指，与由媒介物或对照分子/组合物引起的应答相比，本发明的寡聚体具有更大的或更广的组织分布的能力。可以使用技术人员已知的多种方法来评估和增加细胞或组织的生物分布，所述方法包括、但不限于：核医学、全身放射自显影术、显微放射自显影术；磷光体成像、冷冻-成像、纳米-次级离子质谱法(nanoSIMS)、基质辅助的激光解吸成像(MALDI-MS)、放射摄影术(X-Ray)、磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)、微-超声单光子发射CT(SPECT)、正电子发射断层摄影术(PET)等。本发明的寡聚体的增加的生物分布包括，与媒介物或对照分子/组合物相比增加了至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%或更多。“增加的”或“增强的”组织分布或生物分布通常是“统计上显著的”增加，且可以包括为媒介物或对照组合物的分布的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括在其间且大于1的所有整数和小数，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。不希望受限于任何特定理论，与缺少MGB的寡聚体相比，如本文别处所述的一个或多个MGB与寡聚体的缀合可以增加寡聚体及其靶RNA核酸序列之间的杂交的杂交稳定性和严谨性。另外，如本文别处所述的一个或多个MGB与寡聚体的缀合导致所述寡聚体的增加的组织分布和生物利用度。这些特征在改善全身性给予的寡聚体的递送和效力方面是重要的。
在一个实施方案中，本发明部分地涵盖了包含修饰的寡聚体，所述修饰会促进所述寡聚体穿过细胞、组织或器官屏障从而实现基于核酸的药物进入的能力(与未修饰的寡聚体相比)。在一个非限制性实例中，与缺少MGB部分的寡聚体相比，与一个或多个MGB缀合或连接的寡聚体具有大幅增加的穿透细胞、组织或器官屏障的频率。
在一个实施方案中，本发明的寡聚体表现出惊人的和意外的增加的生物分布的特性。在一个优选实施方案中，与缺少MGB部分的抗-miRNA相比，寡聚体抑制更多数目的细胞或组织类型和/或器官中的基因表达或miRNA表达。
在特别优选的实施方案中，寡聚体抑制2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、或8种或更多种细胞或组织类型和/或器官中的靶RNA的表达。
在一个实施方案中，寡聚体能与包含引导链miRNA序列的靶miRNA序列杂交。在另一个实施方案中，寡聚体能与包含过客或星链miRNA序列的靶miRNA序列杂交。
在某些实施方案中，本发明的寡聚体减少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种或更多种RNA在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多种细胞类型、组织或器官中的表达或活性。在其它实施方案中，本发明提供了使用寡聚体来抑制每个细胞类型、组织或器官中的RNA表达和/或RNA活性的方法。在其它实施方案中，本发明提供了使用寡聚体来抑制在单一细胞类型、单个组织或单个器官中的RNA表达或RNA活性的方法。
在某些实施方案中，具有增加的细胞、组织或器官分布的寡聚体包含至少一个MGB部分以及下述特征(但不限于此)的任意组合：修饰的或未修饰的核苷酸和核苷、核苷酸类似物、核苷类似物、核苷酸模拟物(前述每一种都可以包含不同的修饰的糖或修饰的核苷酸间键/核苷间键)、缀合物(例如，胆固醇)和促进缀合物和/或MGB与所述寡聚体的共价结合的接头。在下面更详细地讨论每个特征。
在不同的实施方案中，寡聚体包含多个共价连接的单体亚基，其中每个连接的单体亚基包含杂环碱基部分和糖部分或糖替代物。所述单体单元可以通过本领域中已知的或本文中描述的各种核苷酸间键/核苷间键连接。所述寡聚体的每种组分可以独立于所述寡聚体中的其它单体单元以修饰的或未修饰的形式存在。寡聚体的示例性单体单元包括、但不限于：修饰的或未修饰的核苷酸和核苷、核苷酸类似物、核苷类似物、核苷酸模拟物，它们中的每一种都可以包含不同的修饰的糖或修饰的核苷酸间键/核苷间键。因此，本发明的寡聚体包含修饰的和/或未修饰的单体单元的任意合适的组合，只要所述寡聚体保留期望的活性(例如，杂交特异性、杂交亲和力、核进入和抗-RNA催化活性)或具有期望的活性的增加。
在特定的示例性实施方案中，修饰的寡聚体比未修饰的寡聚体优选。不希望受任何特定理论约束，在特定实施方案中，因为可取的性质，例如，增加的核进入、增加的与靶核酸的杂交亲和力、增加的与靶核酸的杂交特异性、增强的细胞摄取、增加的对核酸酶的抗性和降低的治疗毒性，修饰的寡聚体比天然形式优选。本文中使用的术语“修饰”包括对核苷间键、糖部分、碱基部分、与缀合物的缀合、接头和MGB部分(诸如下述的那些)的取代和/或任何变化。在某些实施方案中，所述寡聚体被完全地修饰，且在其它实施方案中，所述寡聚体被部分地修饰。此外，与未缀合或连接MGB部分的修饰的寡聚体相比，包含一个或多个MGB部分的寡聚体会大幅增强所述寡聚体向细胞、组织和/或器官的递送、与靶核酸的杂交亲和力、与靶核酸的杂交特异性、细胞摄取、组织摄取、器官摄取、对核酸酶的抗性，并大幅降低治疗毒性。
根据本发明的寡聚体可以包含约6至约100个单体亚基、约10至约50个单体亚基、约12至约35个单体亚基、约15至约25个单体亚基、约18至约23个单体亚基、或任意其间数目的单体亚基。本领域普通技术人员会明白，本发明包括长度为6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个或100个亚基的寡聚体。
本文中使用的术语“杂交”是指寡聚体与互补核酸序列(例如，靶RNA序列)的配对。包含靶RNA序列的示例性核酸序列包括、但不限于：pre-mRNA序列、mRNA序列、pri-miRNA序列、pre-miRNA序列、成熟的miRNA序列、以上的互补物、及其片段或部分。在一个实施方案中，包含pri-miRNA转录物的pre-mRNA或mRNA包含靶miRNA序列。在另一个实施方案中，pri-miRNA转录物包含靶miRNA序列。在本发明中，配对机制涉及本发明的寡聚体和靶miRNA序列之间的氢键合，所述氢键合可以是沃森-克里克氢键合、Hoogsteen氢键合或反向Hoogsteen氢键合。
本文中使用的术语“可特异性地杂交的”是指，在期望特异性杂交的条件下，即，在生理条件下(在体内或离体测定或治疗性处理的情况下)和在标准测定条件下(在体外测定的情况下)，存在足以避免所述寡聚体与非靶核酸的非特异性结合的互补性程度。在一个实施方案中，可与靶miRNA序列特异性地杂交的寡聚体干扰靶miRNA的正常功能。结果，所述寡聚体改变miRNA的活性和/或破坏miRNA的功能。
本领域普通技术人员会理解，通过本文讨论的任一种修饰(例如，修饰的核苷碱基、修饰的糖)，可以调控本发明的寡聚体的特异性。除了这些修饰以外，包含与一个或多个MGB部分连接的寡聚体(例如，多个寡聚单元)的寡聚体与缺少MGB部分的寡聚体相比大幅增加与靶miRNA的杂交特异性。
本文中使用的术语“严谨杂交”或“严谨条件”是指这样的条件：在该条件下，本发明的寡聚体会与其靶RNA序列特异性地杂交。严谨条件是序列依赖性的，且随不同的情况而在本文中变化；寡聚体与靶RNA杂交的“严谨条件”取决于所述寡聚体的性质和组成以及在其中研究它们的测定。本领域普通技术人员会理解实验方案的变化，并且能够确定哪种条件对于具有最少非特异性杂交事件的严谨杂交而言是最佳的。此外，与缺少MGB部分的寡聚体相比，包含一个或多个MGB部分的寡聚体大幅增加杂交的严谨性，并使非特异性杂交事件最少化。
本文中使用的术语“互补性”是指一个核苷碱基与另一个核苷碱基精确配对的能力。例如，如果在寡聚体的某个位置处的单体亚基能够与在靶RNA序列的某个位置处的单体亚基形成氢键，那么所述位置被视作互补位置。相比而言，当单体亚基不能形成氢键时，位置被视作“非互补的”。在下述情况下，寡聚体与靶RNA序列是基本上互补的：在每个分子中的足够数目的互补位置被可以彼此形成氢键的单体亚基占据。本文中使用的术语“基本上互补的”是指，在足够数目的单体亚基内足够的精确配对程度，使得在所述寡聚体和靶RNA之间发生稳定的且特异性的结合。
在特定的示例性实施方案中，寡聚体与靶RNA序列完全互补。在某些实施方案中，寡聚体与靶RNA序列具有约75%至约95%、约80%至约95%、约85%至约95%、或约90%至约95%互补性。在另一个实施方案中，寡聚体与靶RNA序列具有约75%、约80%、约85%、约90%、或约95%或更多互补性。
因此，寡聚体可以与靶RNA序列具有约95%同一性、约90%同一性、约85%同一性、约80%同一性或更多同一性。
在另一个实施方案中，所述寡聚体可以在一个或多个区段内杂交，使得插入的或邻近的区段不参与杂交(例如，凸起、环结构或发夹结构)。本文中使用的术语“错配”是指所述寡聚体和靶RNA之间的非互补碱基。
在特定实施方案中，准许在寡聚体和靶RNA之间的非互补或错配位置，前提条件是，所述寡聚体保持与靶RNA序列的其它部分基本上互补。本发明的寡聚体可以包含这样的寡核苷酸化合物：其具有1个、2个或3个与靶RNA序列的错配，而不造成所述寡聚体的调控靶RNA的表达或活性的能力的显著下降。在优选实施方案中，在与靶RNA的种子序列互补的寡聚体区域之外的错配是优选的。在另一个优选实施方案中，所述寡聚体含有0个、1个或2个与靶RNA序列的错配。在一个更优选实施方案中，所述寡聚体含有至多1个与靶RNA序列的错配。在另一个优选实施方案中，所述寡聚体能与包含种子序列的靶RNA序列杂交。
在不同的实施方案中，本发明的寡聚体可以形成为2个或更多个如本文所述的修饰的或未修饰的核苷酸和核苷、核苷酸类似物、核苷类似物、核苷酸模拟物的复合结构。这样的寡聚体在本领域中还被称作杂合物、hemimer、gapmer或反向gapmer。教导了这样的杂合结构的制备的代表性美国专利包括、但不限于：美国专利号5,013,830、5,149,797、5,220,007、5,256,775、5,366,878、5,403,711、5,491,133、5,565,350、5,623,065、5,652,355、5,652,356和5,700,922，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。
1.核苷碱基
本发明部分地涵盖，寡聚体可以包含一个或多个修饰的或未修饰的核苷酸和/或核苷。本发明的包含一个或多个修饰的或未修饰的核苷酸和/或核苷的寡聚体可以具有增加的对核酸酶的抗性、增加的与靶核酸的结合亲和力和其它有益的生物学特性。
本文中使用的术语“核苷酸”是指与磷酸化的糖形成N-糖苷键的杂环含氮碱基。核苷酸被理解为包括天然碱基和多种本领域公知的修饰的碱基。这样的碱基通常位于核苷酸糖部分的1′位置处。核苷酸通常包含碱基、糖和磷酸基团。在核糖核酸(RNA)中，所述糖是核糖，在脱氧核糖核酸(DNA)中，所述糖是脱氧核糖，即，缺少在核糖中存在的羟基的糖。示例性天然含氮碱基包括嘌呤、腺苷(A)和胍(G)以及嘧啶、胞苷(C)和胸苷(T)(或在RNA的背景下，为尿嘧啶(U))。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核苷酸通常是单磷酸、二磷酸或三磷酸。核苷酸可以是未修饰的，或在糖、磷酸和/或碱基部分处被修饰(也可互换地称作核苷酸类似物、核苷酸衍生物、修饰的核苷酸、非天然的核苷酸和非标准的核苷酸；参见例如，WO92/07065和WO93/15187)。Limbach et al(1994,Nucleic Acids Res.22,2183-2196)总结了修饰的核酸碱基的例子。
在特定的示例性实施方案中，本发明的寡聚体包含一个或多个修饰的核苷酸。在某些实施方案中，所有核苷酸都是修饰的，且在其它某些实施方案中，没有一个核苷酸是修饰的。在不同的实施方案中，所述寡聚体包含约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%的修饰的核苷酸。
核苷酸也可以视作核苷的磷酸酯，其中酯化发生在与糖的C-5连接的羟基上。本文中使用的术语“核苷”是指与糖形成N-糖苷键的杂环含氮碱基。本领域中公认的核苷包括天然碱基，并且还包括众所周知的修饰的碱基。这样的碱基通常位于核苷糖部分的1′位置处。核苷通常包含碱基和糖基。核苷可以是未修饰的，或在糖和/或碱基部分处被修饰(也可互换地称作核苷类似物、核苷衍生物、修饰的核苷、非天然的核苷或非标准的核苷)。也如上所指出的，Limbach et al(1994,Nucleic Acids Res.22,2183-2196)总结了修饰的核酸碱基的例子。
在特定的示例性实施方案中，本发明的寡聚体包含一个或多个修饰的核苷。在某些实施方案中，所有核苷都是修饰的，且在其它某些实施方案中，没有一个核苷是修饰的。在不同的实施方案中，所述寡聚体包含约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%的修饰的核苷。
本文中使用的术语“修饰的碱基”、“修饰的核酸碱基”和“修饰的核苷碱基”在本文中可互换地使用，并指在1′位置处的除了腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的碱基或它们的等效物；这样的碱基可以用在任意位置处，例如，在酶促核酸分子的催化核心内和/或在核酸分子的底物结合区中。
可以引入核酸中的示例性化学修饰的和其它天然的核酸碱基包括、但不限于：5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、二氢尿苷、次黄嘌呤(hypoxathanine)、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、N6-甲基腺苷、假尿嘧啶、吡啶-2-酮、吡啶-4-酮、Q核苷(quesosine)、苏氨酸衍生物、尿苷-5-氧乙酸、怀丁苷(wybutosine)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、黄嘌呤(xathanine)、β-D-半乳糖基Q核苷、β-D-甘露糖基Q核苷、2,2-二甲基鸟苷、15-卤代胞嘧啶、15-卤代尿嘧啶、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2-氨基腺嘌呤、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、2-硫代胞嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿苷、3-脱氮腺嘌呤等、3-脱氮鸟嘌呤、3-甲基尿嘧啶、3-甲基胞苷、3-硝基吡咯、4-乙酰胞苷、4-硫代尿嘧啶、4-硫代尿苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5-羧甲基氨基甲基尿苷、5-卤素取代的尿嘧啶或胞嘧啶、5-卤代尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基乙基尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基氧基尿苷、5-硝基吲哚、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟苷、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-巯基腺嘌呤或鸟嘌呤等。
可以用于本发明的方法和组合物中的其它示例性的修饰的核苷碱基包括、但不限于：修饰的核苷碱基，包括三环嘧啶诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-夹诸如被取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4、5-b]吲哚-2-酮)、吡啶吲哚胞苷(H-吡啶并[3’,2’:4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。修饰的核苷碱基还可以包括，其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环(例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮)替换的那些核苷碱基。
核苷碱基的其它示例性例子包括在下述文献中公开的那些：美国专利号3,687,808；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering,第858-859页,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990；Englisch et al,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613；和Sanghvi,Y.S.,Chapter15,Antisense Research and Applications,第289-302页,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,ed.,CRC Press,1993。在某些实施方案中，特定核苷碱基可用于增加本发明的寡聚体的结合亲和力，所述核苷碱基例如，5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶，以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经证实，5-甲基胞嘧啶取代会使核酸双螺旋稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,eds.,Antisense Research and Applications,CRCPress,Boca Raton,1993,第276-278页)，并且是目前优选的碱基取代，甚至更具体地，当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
在特定的示例性实施方案中，可以使用多环或杂环化合物作为本发明的寡聚体中的核苷碱基。公开了这些化合物的示例性美国专利包括、但不限于：美国专利号3,687,808，以及美国专利号4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,434,257、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121,5,596,091、5,614,617、5,645,985、5,646,269、5,750,692、5,830,653、5,763,588、6,005,096、6,007,992和5,681,941，和美国专利申请公开20030158403，6,028,183，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。
在特定的示例性实施方案中，本发明的寡聚体包含一个或多个修饰的核苷碱基。在某些实施方案中，所有核苷碱基都是修饰的，且在其它某些实施方案中，没有一个核苷碱基是修饰的。在不同的实施方案中，所述寡聚体包含约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%的修饰的核苷碱基。
在一个实施方案中，本发明的寡聚体包含一个或多个稳定基团(其通常连接至寡聚体的一个或两个末端)以增强例如核酸酶稳定性的性能。示例性的稳定基团包括帽结构。本文中使用的术语“帽结构”或“末端帽部分”是指，已经掺入在寡核苷酸的任一个或两个末端处的化学修饰。这些末端修饰可以保护具有末端核酸分子的寡聚体免于外切核酸酶降解，且可以帮助在细胞内的递送和/或定位。所述帽可以存在于5’-端处(5’-帽)或3’-端处(3’-帽)，或者可以存在于两端上。
在非限制性例子中，5’-帽包括：反向脱碱基残基(部分)、4’,5’-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃型赤藓糖基)核苷酸、4’-硫代核苷酸、碳环核苷酸；1,5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；苏式-呋喃型戊糖基核苷酸；无环的3’,4’-断裂核苷酸；无环的3,4-二羟基丁基核苷酸；无环的3,5-二羟基戊基核苷酸、3’-3’-反向核苷酸部分；3’-3’-反向脱碱基部分；3’-2’-反向核苷酸部分；3’-2’-反向脱碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；3’-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；磷酸氨基己酯；3’-磷酸酯；3’-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥连或非桥连甲基膦酸酯部分。
在另一个非限制性例子中，本发明的3’-帽结构包括：4’,5’-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃型赤藓糖基)核苷酸；4’-硫代核苷酸、碳环核苷酸；磷酸-5’-氨基-烷基酯；磷酸-1,3-二氨基-2-丙酯、磷酸-3-氨基丙酯；磷酸-6-氨基己酯；磷酸-1,2-氨基十二烷基酯；磷酸羟丙酯；1,5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏式-呋喃型戊糖基核苷酸；无环的3’,4’-断裂核苷酸；3,4-二羟基丁基核苷酸；3,5-二羟基戊基核苷酸、5’-5’-反向核苷酸部分；5’-5’-反向脱碱基部分；5-氨基磷酸酯；5’-硫代磷酸酯；1,4-丁二醇磷酸酯；5’-氨基；桥连和/或非桥连5’-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯、桥连或非桥连甲基膦酸酯和5’-巯基部分。
2.修饰的糖
本发明部分地涵盖，寡聚体可以包含一个或多个含有修饰的糖和/或具有取代基的修饰的或未修饰的核苷和核苷酸。本发明的包含一个或多个糖修饰或取代基的寡聚体可以具有增加的对核酸酶的抗性、增加的与靶核酸的结合亲和力和其它有益的生物学特性。
在特定的示例性实施方案中，修饰的糖包括、但不限于：碳环的或无环的糖；在其2’、3’或4’位置中的一个或多个位置处具有取代基的糖；具有替代糖的一个或多个氢原子的取代基的糖；和在糖的任意2个其它原子之间具有键的糖。
在优选实施方案中，本发明的寡聚体包含一个或多个在2’位置处被修饰的糖，或在糖任意2个原子之间具有桥连(使得糖为二环)的那些糖。在特定的示例性实施方案中，适合用于本发明的寡聚体中的糖修饰或取代基包括、但不限于包含选自以下的糖取代基的化合物：OH；F；O-、S-、或N-烷基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是被取代的或未被取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性的修饰包括、但不限于：OH、卤素、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基、O-烷基-O-烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、被取代的甲硅烷基、烷氧基烷氧基、二甲基氨基氧乙氧基、烯丙基和O-烯丙基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是被取代的或未被取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。
在某些示例性实施方案中，优选的糖修饰选自：2-甲氧基乙氧基(也被称作2’-O-甲氧基乙基、2’-MOE或2’-OCH2CH2OCH3)、2’-O-甲基(2’-O-CH3)、2’-氟(2’-F)或具有将4’碳原子连接至2’碳原子的桥连基的二环糖修饰的核苷，其中实例桥连基包括-CH2-O-、-(CH2)2-O-或-CH2-N(R)-O，其中R是H或C1-C12烷基。
2’-MOE修饰的糖提供增加的核酸酶抗性和非常高的与核苷酸/核苷的结合亲和力。2’-MOE取代的增加的结合亲和力可以比类似的2’修饰(诸如O-甲基、O-丙基和O-氨基丙基)大许多。包含一个或多个2’-MOE修饰或取代基的寡聚体还已经被用作基因表达的体内反义抑制剂(Martin,P.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504;Altmann et al,Chimia,1996,50,168-176;Altmann et al,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637；和Altmannet al,Nucleosides Nucleotides,1997,16,917-926)。
2’-糖取代基可以是在阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置。一种2’-阿拉伯糖修饰是2’-F。类似的修饰还可以发生在寡聚体上的其它位置处，特别是3’末端核苷或2’-5’连接的寡核苷酸的糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡聚体也可以具有糖模拟物，诸如替代呋喃型戊糖基糖的环丁基部分。描述了这样的修饰的糖结构的制备的示例性美国专利包括、但不限于：美国专利号4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633、5,792,747和5,700,920，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。
在其它特定实施方案中，本发明部分地涵盖了这样的糖修饰：它们是二环的，由此锁定糖构象几何形状。二环糖修饰为本文涵盖的寡聚体赋予增加的对核酸酶的抗性、增加的与靶核酸的结合亲和力和其它有益的生物学性质。
在一个示例性实施方案中，修饰的二环糖部分包含4’-CH2-O-2’桥，例如，锁核酸。本文中使用的术语“锁核酸”(LNA)是指构象上受限制的含有亚甲基桥的寡核苷酸类似物，所述亚甲基桥连接具有4′-C的核糖的2′-O(参见，Singh et al,Chem.Commun.,1998,4:455-456)。LNA寡核苷酸含有一个或多个核苷酸结构单元，其中一个额外的如上面所指出的亚甲基桥将核糖部分固定在C3’-内(β-D-LNA)或C2’-内(α-L-LNA)构象。
LNA和LNA类似物表现出非常高的与互补DNA和RNA的双螺旋热稳定性、对3’-外切核酸酶降解的稳定性、和良好的可溶性性能。已经描述了腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的LNA类似物的合成、它们的寡聚化和核酸识别性能(参见Koshkin et al,Tetrahedron,1998,54:3607-3630)。错配序列的研究表明，LNA遵循沃森-克里克碱基配对规则，通常与对应的未修饰的参照链相比具有提高的选择性。已经描述了含有LNA的反义寡核苷酸(Wahlestedt et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97:5633-5638)，它们是有效的和无毒的。另外，LNA/DNA共聚物不容易在血清和细胞提取物中降解。
LNA会与互补DNA或RNA或与互补LNA以高热亲和力形成双螺旋。通过非常稳定的LNA:LNA双螺旋的形成，已经突出了LNA介导的杂交的普适性(Koshkin et al,J.Am.Chem.Soc.,1998,120:13252-13253)。经证实，LNA:LNA杂交是最热稳定的核酸型双螺旋系统，并在双螺旋水平确立了LNA的RNA模仿特性。3个LNA单体(T或A)的引入导致DNA互补物的显著增加的解链温度。
已经描述了2’-氨基-LNA(Singh et al,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)和2’-甲基氨基-LNA的合成，并报道了它们与互补RNA和DNA链的双螺旋的热稳定性。还已经描述了硫代磷酸酯-LNA和2’-硫代-LNA的制备(Kumar et al,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8:2219-2222)。
其它修饰的二环糖部分包括木糖类似物(参见，例如，美国专利申请公开号:2003/0082807)。二环糖修饰的核苷的其它示例性实施方案包括、但不限于：4’-(CH2)2-O-2’(美国专利申请公开号:US2002/0147332和2003/0207841；美国专利号6,268,490和6,670,461)。
在特定的示例性实施方案中，本发明的寡聚体的每个核苷碱基包含修饰的或被取代的糖。在某些实施方案中，所述寡聚体包含这样的核苷酸/核苷：其具有约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%的修饰的或被取代的糖。
在一个示例性实施方案中，本发明的抗-miRNA分子包含一个或多个核苷酸/核苷，所述核苷酸/核苷具有选自2’-MOE、4’-CH2-O-2’和4’-(CH2)2-O-2’的修饰的糖或取代基。抗-miRNA分子可以在各处包含相同的修饰的糖或取代基，或修饰的糖或取代基的组合，但不限于此。
3.核苷酸间键/核苷间键
本发明部分地涵盖，寡聚体可以包含一个或多个修饰的核苷酸间键和/或核苷间键。本发明的包含一个或多个修饰的核苷酸间键和/或核苷间键的寡聚体可以具有增加的对核酸酶的抗性、增加的与靶核酸的结合亲和力和其它有益的生物学特性。本文中使用的术语“修饰的核苷酸间键”是指在它们的核苷间主链中包含磷原子的核苷之间的键。本文中使用的术语“修饰的核苷间键”是指在它们的核苷间主链中缺乏磷原子的核苷之间的键。
在特定的示例性实施方案中，5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%的核苷酸间键和/或核苷间键可以如本文讨论地被修饰。
在某些示例性实施方案中，寡聚体包含修饰的(即，非天然存在的)核苷间键，其经常由于可取的性能而被优于天然存在的形式进行选择，所述性能例如：增强的细胞摄取、增强的对其它寡核苷酸或核酸靶标的亲和力、和增加的对核酸酶的抗性。
在一个示例性实施方案中，寡聚体包含一个或多个硫代磷酸核苷酸间键。其它示例性修饰的核苷酸间键包括，例如，手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、膦酸甲酯和其它膦酸烷基酯(包括膦酸-3’-亚烷基酯、膦酸-5’-亚烷基酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括氨基磷酸-3’-氨基酯和氨基磷酸氨基烷基酯)、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、具有正常3’-5’键的硒代磷酸酯和硼烷磷酸酯、这些的2’-5’连接的类似物，和具有反向极性的那些，其中一个或多个核苷酸间键是3’-3’、5’-5’或2’-2’键。
教导核苷酸间键的制备的示例性美国专利包括、但不限于：美国专利号3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,194,599、5,565,555、5,527,899、5,721,218、5,672,6975,625,050、5,489,677和5,602,240，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。
在特定的示例性实施方案中，本发明的寡聚体包含一个或多个不含有磷原子的修饰的核苷间键。
其中不含有磷原子的示例性的修饰的核苷间键具有这样的主链，其包括短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键。其它修饰的核苷间键包括：吗啉代键(部分地从核苷的糖部分形成)；硅氧烷键；硫化物、亚砜和砜键；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基键；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基键；核乙酰基(riboacetyl)键；含烯烃的键；磺酸酯(sulfanate)键；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基键；磺酸酯和磺酰胺键；酰胺键；和具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其它键。
教导了上述不含磷的寡核苷的制备的示例性美国专利包括、但不限于：美国专利号5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437、5,792,608、5,646,269和5,677,439，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，本发明的抗-miRNA包含选自以下的一个或多个修饰的核苷酸间键/核苷间键：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、膦酸烷基酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯、吗啉代、硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、甲酰基、硫代甲酰基、亚甲基甲酰基、核乙酰基、含烯烃的主链、氨基磺酸酯、亚甲基亚氨基、亚甲基肼基、磺酸酯、磺酰胺或酰胺。
在一个优选实施方案中，所述修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
4.模拟物
寡聚体还可以包括寡核苷酸模拟物。本文中使用的术语“模拟物”是指这样的寡聚体：其中仅呋喃糖环或者呋喃糖环和核苷酸间键二者被新的基团替换，仅呋喃糖环被例如吗啉代环替换在本领域中也被称作糖替代物。为了与适当的靶核酸杂交，维持杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分。
寡核苷酸模拟物可以包括寡聚体诸如肽核酸(PNA)和环己烯基核酸(被称作CeNA,参见Wang et al,J.Am.Chem.Soc.,2000,122,8595-8602)。
教导了寡核苷酸模拟物的制备的示例性美国专利包括、但不限于：美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。
另一类寡核苷酸模拟物被称作膦酰基单酯核酸，并在主链中并入磷基。据报道，这类寡核苷酸模拟物在抑制基因表达领域中具有有用的物理和生物学和药理学性能(反义寡核苷酸、核酶、有义寡核苷酸和形成三螺旋的寡核苷酸)。已经报道了另一种寡核苷酸模拟物，其中呋喃糖基环已经被环丁基部分替代。
5.缀合物
本发明部分地涵盖了包含至少一个MGB和一个或多个共价连接的缀合物部分的寡聚体。本文中使用的术语“缀合物部分”是指亲脂分子，包括、但不限于亲脂部分例如，胆固醇、脂质、磷脂、叶酸盐、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚体的药效动力学性能的基团和增强寡聚体的药代动力学性能的基团。
缀合物部分可以经由如本文别处所述的接头共价连接至寡聚体的一个或多个寡聚单元，或者经由官能团(例如，伯羟基或仲羟基)直接地共价连接至寡聚体的一个或多个寡聚单元。在不同的实施方案中，一个或多个相同的或不同的缀合物部分可以与寡聚体共价连接。所述缀合物部分可以缀合至寡聚体的5’末端和/或3’末端，和/或缀合至寡聚体的内部寡聚单元。在优选实施方案中，缀合物部分缀合至寡聚体的3’末端处的一个或多个碱基。
在特定的示例性实施方案中，适合用于本发明的寡聚体中的缀合物部分包括、但不限于：脂质部分诸如胆固醇部分(Letsinger et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556)，胆酸(Manoharan et al,Bioorg.Afied Chem.Let.,1994,4,1053-1060)，硫醚，例如，己基-5-三苯甲基硫醇(Manoharan et al,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306-309;Manoharan etal,Bioorg.Med Chem.Let.,1993,3,2765-2770)，硫代胆固醇(Oberhauseret al,Nucl.Acids Res.,1992,20,533-538)，脂肪族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al,EMBO J.,1991,10,1111-1118;Kabanov et al,FEBS Lett.,1990,259,327-330;Svinarchuk et al,Biochimie,1993,75,49-54)，磷脂，例如，双-十六烷基-消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵(Manoharan et al,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654;Shea et al,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)，多胺或聚乙二醇链(Manoharan et al,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)，或金刚烷乙酸(Manoharan et al,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654)，棕榈基部分(Mishra et al,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)，或十八烷胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分(Crooke et al,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937。
在某些示例性实施方案中，所述寡聚体缀合至亲脂部分。
示例性亲脂部分包括、但不限于：脂质、胆固醇、油烯基、视黄基、胆甾醇基残基、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。
在一个实施方案中，所述亲脂部分是胆固醇。
6.小沟结合部分
本发明部分地涵盖了这样的寡聚体：其包含一个或多个相同的或不同的缀合至寡聚体的小沟结合部分(MGB)，如本文别处所述。在文献中已经描述了多种合适的小沟结合剂。参见，例如，Wemmer,D.E.,andDervan P.B.,Current Opinion in Structural Biology,7:355361(1997);Walker,W.L.,Kopka,J.L.和Goodsell,D.S.,Biopolymers,44:323334(1997);Zimmer,C and Wahnert,U.Prog.Biophys.Molec.Bio.47:31112(1986)；和Reddy,B.S.P.,Dondhi,S.M.,and Lown,J.W.,Pharmacol.Therap.,84:1111(1999)。不希望受限于任何特定理论，与没有缀合或连接至MGB的寡聚体相比，与一个或多个MGB缀合的寡聚体使寡核苷酸的活性、细胞分布、组织分布和/或器官分布、或细胞摄取、组织摄取或器官摄取，与靶核酸的杂交亲和力，与靶核酸的杂交特异性，细胞摄取，对核酸酶的抗性大幅增加，并且大幅降低治疗毒性。
本文中使用的短语“增强药效动力学性能的基团”是指这样的MGB：其改善核进入，和/或增加寡聚体和靶核酸(例如，mRNA、pri-miRNA)之间的序列特异性杂交的强度和特异性。本文中使用的短语“增强药代动力学性能的基团”是指这样的MGB：其改善在细胞、组织和/或器官分布中、在期望的亚细胞区室中的寡聚体摄取、代谢或排泄。
MGB可以缀合至寡聚体的5’-末端和/或3’-末端，和/或缀合至寡聚体的一个或多个内部寡聚体单元，只要所述寡聚体的期望功能不受损害即可。在一个实施方案中，本文中使用的术语“期望功能”是指寡聚体的减少一种或多种RNA在多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)细胞类型、组织或器官中的表达的能力。
在一个特定实施方案中，本发明涵盖的寡聚体包含：缀合至所述寡聚体的5’-末端的MGB、缀合至所述寡聚体的3’-末端的MGB、和缀合至所述寡聚体的内部单元的一个或多个MGB。在某些实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个MGB可以缀合至寡聚体。在另一个实施方案中，所述寡聚体的约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%的寡聚单元缀合至MGB。
在一个优选实施方案中，MGB缀合至所述寡聚体的5’-末端。在另一个优选实施方案中，MGB缀合至所述寡聚体的3’-末端。在另一个优选实施方案中，MGB缀合至所述寡聚体的5’-末端，且相同类型或不同类型的MGB缀合至所述寡聚体的3’-末端。
在特定的示例性实施方案中，可以缀合至寡聚体的MGB包括、但不限于：天然存在的化合物诸如纺锤菌素、偏端霉素和Lexitropsin、光神霉素、色霉素A3、橄榄霉素、安曲霉素、西伯里亚霉素、以及其它有关的抗生素和合成的衍生物。某些双季铵杂环化合物、二芳基脒诸如潘他米丁(pentamidine)、脒和三氮脒(berenil)、CC-1065和有关的吡咯并吲哚和吲哚多肽、Hoechst33258、4’-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)以及许多由天然存在的或合成的氨基酸组成的寡肽是小沟结合剂化合物。
在优选的示例性实施方案中，可以缀合至寡聚体的MGB选自：纺锤菌素、偏端霉素和Lexitropsin、光神霉素、色霉素A3、橄榄霉素、安曲霉素和西伯里亚霉素。
在特别优选的实施方案中，MGB部分包括1,2-二氢-(3H)-吡咯并[3,2-e]吲哚-7-羧酸酯(DPI)、N-3-氨甲酰基1,2-二氢-(3H)-吡咯并[3,2-e]吲哚-7-羧酸酯(CDPI)的多聚体和N-甲基吡咯-4-羧基-2-酰胺(MPC)的多聚体。特别优选的MGB部分包含DPI(1-10)、CDPI(1-10)和MPC(1-10)。在一个更优选实施方案中，所述MGB包含CDPI(1-3)或MPC(1-3)。在某个优选实施方案中，MGB包含CDPI3或CDPI4。
描述了MGB的代表性美国专利包括、但不限于：美国专利号:5,801,155、6,084,102、6,312,894、6,492,346和7,205,105，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。
7.接头
本发明部分地涵盖了这样的寡聚体：其包含与寡聚体缀合的一个或多个相同的或不同的功能部分，例如，MGB、胆固醇。功能部分可以直接地或经由接头或连接基团共价连接至寡聚体的不同位置。本文中使用的术语“接头”和“连接基团”及其等同术语是指这样的分子：其用于将寡聚体的某些部分共价连接至功能部分，例如，MGB、胆固醇。通常，连接基团可以包括线性的或无环的部分、环状部分、芳族环或它们的组合。
在一个特定的示例性实施方案中，连接基团可以具有约1至约200个主链原子、约1至约100个主链原子、约1至约50个主链原子、约1至约30个主链原子或约1至约15个主链原子。本文中使用的术语“主链原子”仅指在寡聚体和功能部分之间以连续的线性连接在一起的那些原子，包括所有环原子，但是不包括任何侧链原子或基团。在一个实施方案中，主链原子选自C、O、N、S、P和Si。
在一个示例性实施方案中，连接基团可以是具有约3-100个选自C、O、N、S、P和Si的主链原子的二价或三价接头。在其它示例性实施方案中，接头包含支链脂肪族链、杂烷基链、一个或多个被取代的环结构或它们的组合。接头通常具有用于实现连接的官能团。用于将分子共价结合至接头的官能团的示例性例子包括、但不限于：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、磷酸根、鏻离子、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在优选的示例性实施方案中，连接基团包含选自下述的分子式：–O(CH2)6NH–、–P(=O)(OH)O(CH2)6NH–；–OCH2CH(OH)CH2NHCOCH2CH2NH–、–HN(CH2)5CO–；–P(=O)(OH)O(CH2)4NH–；–P(=O)(OH)(OCH2CH2)6OP(=O)(OH)O(CH2)6NH–；–(CH2)5OP(=O)(OH)–和羟基{[5-(羟基甲基)-1-甲基吡咯烷-3-基]氧基}氧代鏻。
在特别优选的实施方案中，连接基团包含选自下述的分子式：羟基{[5-(羟基甲基)-1-甲基吡咯烷-3-基]氧基}氧代鏻；–P(=O)(OH)O(CH2)4NH–；–P(=O)(OH)(OCH2CH2)6OP(=O)(OH)O(CH2)6NH–；和–P(=O)(OH)O(CH2)6NH–。
在某些优选实施方案中，连接基团包含分子式–P(=O)(OH)O(CH2)6NH–。
描述了适用于通过接头将MGB和其它功能部分连接至寡聚体的方法的示例性美国专利包括、但不限于美国专利号：5,512,677、5,419,966、5,696,251、5,585,481、5,801,155、5,942,610和5,736,626。
J.组合物和制剂
根据本发明使用的寡聚体可以通过众所周知的体外固相寡核苷酸合成技术来方便地和常规地制备。用于这类合成的设备由几个销售商出售，包括、例如，Applied Biosystems(Foster City,Calif.)。可以额外地或可选择地使用本领域中已知的用于这类合成的任意其它装置。
如下面详细描述的，通过例如混合、包封、缀合或以其它方式与其它分子、分子结构或化合物的混合物结合，可以将本发明的包含寡聚体的组合物专门配制为例如脂质体、乳剂、微乳剂和受体靶向分子。配制的组合物适合以固体或液体形式给予需要治疗的受试者，包括适合于以下的那些：(1)口服给药，例如，灌服剂(水性或非水性溶液或悬浮液)，片剂，例如，用于含服、舌下、和全身吸收的那些，丸剂，粉剂，颗粒剂，用于应用至舌的糊剂；(2)胃肠外给药，例如，通过皮下的、肌肉内的、全身性的(例如，静脉内的、动脉内的、血管内的)或硬膜外的注射，例如，作为无菌溶液或悬浮液，或缓释制剂；(3)局部施用，例如，作为乳膏剂、软膏剂、或应用于皮肤的控释贴剂或喷雾剂；(4)阴道内地或直肠内地，例如，作为阴道栓剂、乳膏剂或泡沫；(5)舌下地；(6)经眼地；(7)透皮地；或(8)经鼻地，作为吸入剂或气雾剂。
本文中使用的术语“有效量”是指这样的寡聚体的量：其在必要的剂量和时间段，可有效地实现期望的治疗或预防结果。有效量包括治疗有效量和预防有效量(预防量)。有效量可以随多种因素变化，诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及一种或多种阻遏物和/或活化剂在个体中引起期望的应答的能力。
如别处公开的，寡聚体的“治疗有效量”也是这样的量：其中寡聚体的任何有毒或有害作用被治疗有益效果超过。术语“治疗有效量”包括这样的量：其可有效地减少、抑制、预防或治疗与哺乳动物(例如，需要治疗的受试者)的一种或多种细胞、组织或器官中的增加的RNA活性和/或表达有关的疾病、障碍或病症。例如，寡聚体的治疗有效量可以是这样的量：其足以造成与给予所述寡聚体之前观察到的器官功能相比，器官功能或疾病症状改善的生理学指标(例如，肝功能、肺功能、肾功能)的5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或100%改善。在其中被治疗的受试者患有癌症的特定实施方案中，肿瘤体积、转移灶或循环癌细胞的下降会适当地指示治疗有效量。
“预防有效量”是指这样的寡聚体的量：其在必要的剂量和时间段，可有效地实现期望的预防结果。通常，但并非必然，由于在疾病之前或疾病的早期在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量小于治疗有效量。
本文中使用的术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的物质、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、生产助剂(例如，润滑剂、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)，或这样的溶剂包封材料：其参与将主体化合物从一个器官或身体的一部分运输或转运至另一个器官或身体的一部分。每种载体必须是“可接受的”，其含义是，与制剂的其它成分相容，且不会不利地影响待治疗的受试者。可充当药学上可接受的载体的物质的一些例子包括：(1)糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉类，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)黄芪胶粉末；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)药学上可接受的细胞培养基；和(23)在药物制剂中采用的其它无毒的相容物质。
也涵盖了含有本发明的寡聚体的水性组合物的制备。通常，将这样的组合物制备为注射剂，作为液体溶液或悬浮液；还可以制备固体形式，其适合在注射之前溶解或悬浮在液体中。
某些实施方案包括“药学上可接受的盐”，包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等(参见，例如，Bergeet al,J.Pharm.Sci.1977;66:1-19)。其它例子包括碱加成盐诸如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，与氨、或者与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺反应而制备。代表性的碱金属或碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性的有机胺包括：乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(参见，例如，Berge et al，同上)。
在另一个实施方案中，在产生治疗效果所需的单次剂量形式中的活性成分(例如，寡聚体)的量是约0.1%活性成分、约1%活性成分、约5%活性成分、约10%活性成分、约15%活性成分、约20%活性成分、约25%活性成分、约30%活性成分、约35%活性成分、约40%活性成分、约45%活性成分、约50%活性成分、约55%活性成分、约60%活性成分、约65%活性成分、约70%活性成分、约75%活性成分、约80%活性成分、约85%活性成分、约90%活性成分或约95%活性成分或更多，包括这些值的所有范围。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含选自下述的赋形剂和本发明的化合物：环糊精和衍生物、纤维素、脂质体、乳剂、微乳剂、胶束形成剂(例如，胆汁酸)，以及聚合载体(例如，聚酯和聚酸酐)。在某些实施方案中，前述的组合物提供口服生物可利用的本发明的寡聚体。
对于吸入给药，可以使用增压包或喷雾器和合适的推进剂，例如，但不限于，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳，以气溶胶喷雾的形式方便地递送根据本发明使用的寡聚体。在增压气雾剂的情况下，通过提供阀来递送计量的量可以控制剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器的胶囊和筒(例如，明胶)，其含有化合物和合适粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
适于口服给药的本发明组合物可以呈胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味成分，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、粉剂、颗粒剂的形式，或者作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或者作为水包油或油包水液体乳剂，或者作为酏剂或糖浆剂，或者作为软锭剂(使用惰性基质，诸如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为口腔洗剂等，每种含有预定量的本发明化合物作为活性成分。本发明的组合物还可以作为丸剂、药糖剂或糊剂来给药。
在适于口服给药的本发明组合物的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、颗粒剂、锭剂等)中，将所述活性成分与一种或多种药学上可接受的载体(诸如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或下述物质中的任一种混合：(1)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如季铵化合物和表面活性剂，诸如泊洛沙姆和月桂基硫酸钠；(7)润湿剂，例如，鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子型表面活性剂；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、硬脂酸锌、硬脂酸钠、硬脂酸、及其混合物；(10)着色剂；和(11)控释剂诸如交聚维酮或乙基纤维素。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述药物组合物还可以包含缓冲剂。类似类型的固体组合物还可以用作软和硬壳明胶胶囊中的填充剂，并使用诸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugars)以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂。
使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉羟乙酸钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂，可以制备压制的片剂。
本发明化合物的口服给药液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂。除活性成分以外，所述液体剂型可以含有本领域中常用的惰性稀释剂，例如，水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(具体地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、及其混合物。
除惰性稀释剂以外，口服组合物还可以包含佐剂诸如润湿剂、乳化和助悬剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除活性化合物以外，悬浮液还可以含有助悬剂，例如，乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、氢氧化铝氧化物、皂粘土、琼脂和黄芪胶、及其混合物。
本发明的用于直肠或阴道给药的组合物可以呈现为栓剂，其可以如下制备：将一种或多种本发明的化合物与一种或多种合适的无刺激性的赋形剂或载体混合，所述赋形剂或载体包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐，并且所述栓剂在室温为固体，但在体温为液体，并且因此将在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。
适于阴道给药的本发明的组合物还包括阴道栓剂、卫生栓、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂，其含有本领域已知为适合的载体。
用于局部或透皮给予本文提供的组合物的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。除本发明的活性化合物以外，所述软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂还可以含有赋形剂，诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、皂粘土、硅酸、滑石粉和氧化锌、或其混合物。
除本发明的化合物以外，粉剂和喷雾剂还可以含有赋形剂诸如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或者这些物质的混合物。喷雾剂可以另外含有常规推进剂，诸如氯氟烃和挥发性的未被取代的烃，诸如丁烷和丙烷。
透皮贴剂具有下述额外的优点：其提供本发明的组合物向身体的受控递送。还可以使用吸收增强剂来增加所述试剂透过皮肤的流量。
在本发明的范围内也涵盖眼用制剂、眼软膏剂、粉剂、溶液等。
适于胃肠外给药的本发明组合物包含药学上可接受的无菌的等渗的水性或非水性溶液、分散体、脂质体、悬浮液或乳剂，或在即将使用前可复原为无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂，其可以含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使所述制剂与预期受体的血液等渗的溶质或者助悬剂或增稠剂。
通过形成主体化合物在可生物降解的聚合物(诸如聚丙交酯-聚乙醇酸交酯)中的微胶囊基体，制备可注射的贮库形式。其它可生物降解的聚合物的例子包括聚(原酸酯)以和聚(酸酐)。
在某些实施方案中，可以利用微乳化技术来提高疏水的(水不溶性的)抗-miRNA分子(Dordunoo et al,Drug Development and IndustrialPharmacy.1991;17(12),1685-1713)和REV5901(Sheen,P.C,et al,JPharm Sci80(7),712-714,1991)的生物利用度。
本文中使用的短语“胃肠外给药”和“胃肠外地给予”是指除了肠内和局部给药以外的，通常通过注射进行的给药模式，并且包括、但不限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下的、椎管内和胸骨内注射和输注。
本文中使用的术语“全身性给药”、“全身性地给予”、“周围给药”和“周围地给予”是指，除了直接进入中枢神经系统以外的化合物、药物或其它物质的给药，使得其进入患者的系统中，并因此发生代谢和其它类似的过程，例如，皮下给药。
一般而言，包含本文所述的寡聚体的组合物的合适每日剂量是这样的寡聚体的量：其是有效地产生治疗效果的最低剂量。可以在单一组合物中或在多种组合物中分开地或同时地进行寡聚体给药。可以在大致相同的时间给予几种单位剂型。使用的剂量可以由医师或有资格的医学专业人员确定，并取决于期望的治疗效果、治疗的给药途径和持续时间以及患者的状况。
术语“剂量”包括、但不限于有效剂量，例如，急性剂量、亚急性剂量、和慢性或连续剂量。
术语一种或多种活性剂的“急性剂量”或“急性给药”是指，在主治医师考虑到患者的年龄和一般健康情况而确定的会在患者中引起相对立即的期望反应的剂量水平，根据需要按计划给予患者活性剂。
“亚急性剂量”是这样的活性剂剂量：其水平低于由主治医师确定为如上所述的急性剂量所需的水平。可以根据需要，或以慢性或持续的给药方案给予患者亚急性剂量。
术语活性剂的“慢性剂量”或“连续给药”是指，持续地逐日按计划给予患者活性剂。
有效剂量通常取决于上述因素。通常，受试者的口服的、鼻的、静脉内的、脑室内的、皮下的和吸入的寡聚体剂量是每天在下述范围内：约0.000001至约1000mg/千克，约0.000005至约950mg/千克，约0.00001至约850mg/千克，约0.00005至约750mg/千克，约0.0001至约500mg/千克，约0.0005至约250mg/千克，约0.001至约100mg/千克，约0.001至约50mg/千克，约0.001至约25mg/千克，约0.001至约10mg/千克，约0.001至约1mg/千克，约0.005至约100mg/千克，约0.005至约50mg/千克，约0.005至约25mg/千克，约0.005至约10mg/千克，约0.005至约1mg/千克，约0.01至约100mg/千克，约0.01至约500mg/千克，约0.01至约250mg/千克，约0.01至约100mg/千克，约1至约100mg/千克，约1至约50mg/千克，约1至约25mg/千克，约1至约20mg/千克，约10至约100mg/千克，约10至约50mg/千克，约10至约25mg/千克体重；或约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg或约100mg/千克体重/天。
在另一个实施方案中，以约0.25-3g/千克、约0.5-2.5g/千克、约1-2g/千克、约1.25-1.75g/千克或约1.5g/千克体重/天的剂量，将寡聚体通过静脉内、口服、通过吸入、经鼻或胃肠外给予受试者。
在特定实施方案中，以约10g/千克、约0.25g/千克、约0.50g/千克、约0.75g/千克、约1.0g/千克、约1.25g/千克、约1.50g/千克、约1.75g/千克、或约2.00g/千克体重/天的剂量，将寡聚体通过口服、通过吸入、经鼻或胃肠外(例如，静脉内)给予受试者。
在其它有关的实施方案中，以约0.01μg-1mg/千克、约0.1-100μg/千克或约1-10μg/千克的剂量或之间的任意浓度增量，将寡聚体通过口服、通过吸入、经鼻或胃肠外(例如，静脉内)给予受试者。例如，在特定实施方案中，以约1μg/千克、约2μg/千克、约3μg/千克、约4μg/千克、约5μg/千克、约6μg/千克、约7μg/千克、约8μg/千克、约9μg/千克或约10μg/千克的剂量，将寡聚体通过口服、经鼻或胃肠外给予受试者。
在特定实施方案中，以约0.005μg/千克、约0.01μg/千克、约1.0μg/千克、约10μg/千克、约50μg/千克、约100μg/千克、约250μg/千克、约500μg/千克或约1000μg/千克的剂量，将寡聚体通过口服、通过吸入、经鼻或胃肠外(例如，静脉内)给予受试者。
可以在1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、5、年、10年或更久的跨度内，给予组合物1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次或更多次。
此外，本发明的相同或不同组合物的多次给药可以在如上所述的延长的时间段内多次给予。
在特定实施方案中，组合物的递送频率是每天1次、每天2次、每天3次、每天4次、每2天1次或每周1次或任何之间的频率。
在特定实施方案中，组合物的连续递送持续时间为在30秒至24小时，30秒至12小时，30秒至8小时，30秒至6小时，30秒至4小时，30秒至2小时，30秒至1小时，30秒至30分钟，30秒至15分钟，30秒至10分钟，30秒至5分钟，30秒至2分钟，30秒至1分钟，或任何之间的时间段。
在例如下述文献中描述的技术人员已知的配制组合物的其它方法，特此通过引用并入相关部分中：Physicians Desk Reference,第62版.Oradell,NJ:Medical Economics Co.,2008;Goodman&Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics,第十一版.McGraw-Hill,2005;Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版.Baltimore,MD:Lippincott Williams&Wilkins,2000；和The Merck Index,第十四版.Whitehouse Station,NJ:Merck Research Laboratories,2006。
K.使用方法
本发明一般地提供了比现有疗法更安全、更高效和更有力的改进的寡聚体。本发明另外提供了具有对细胞、组织和/或器官的惊人的和意外的增加的生物分布的寡聚体。因此，提供了本发明的寡聚体用于治疗特征为增加的基因表达和增加的miRNA表达和/或活性或与其有关的疾病、障碍和病症的用途。
1.抑制RNA表达和/或活性的方法
在一个特定的示例性实施方案中，本发明部分地提供了抑制RNA的表达和/或活性的方法，所述方法包括：使靶RNA与寡聚体接触，所述寡聚体会与所述靶标杂交。不希望受限于任何特定理论，本发明部分地涵盖了，寡聚体与靶RNA序列的杂交可以抑制RNA的表达和/或活性。
2.治疗方法
如上面所指出的，本发明的寡聚体可用于许多临床场合，例如，患者罹患特征为一种或多种特定RNA的表达增加的病症或疾病的情况。在患者需要治疗特征为不同细胞、组织和/或器官中表达的一种或多种RNA的表达增加的病症或疾病的临床场合，本发明的寡聚体是特别有用的。
在不同的实施方案中，本发明部分地涵盖了治疗患有全身性疾病、障碍或病症的受试者的方法，所述全身性疾病、障碍或病症的特征为一种或多种细胞、组织和/或器官中的一种或多种RNA的活性增加。
本文中使用的术语“受试者”包括、但不限于：生物体；哺乳动物，包括、例如，人、非人灵长类动物(例如，狒狒、猩猩、猴)、小鼠、猪、牛、山羊、狗、猫、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、马、猴、绵羊或其它非人哺乳动物；非哺乳动物，包括、例如，非哺乳动物的脊椎动物，诸如禽类(例如，鸡或鸭)或鱼类，和非哺乳动物的无脊椎动物。在优选实施方案中，所述受试者是人。
典型的受试者包括患有下述病症或处于患有下述病症的风险中的那些受试者：肿瘤介导的血管生成、癌症、炎症、纤维化疾病、自身免疫疾病和丙型肝炎感染介导的疾病、动脉粥样硬化、高胆固醇血症和高脂血症；癌症、胶质母细胞瘤、乳腺癌、淋巴瘤、肺癌；糖尿病、代谢障碍；成肌细胞分化；免疫障碍。在特定实施方案中，使用本发明的组合物和方法可以治疗的疾病、障碍和病症包括：特征为一种或多种细胞类型、组织类型和/或器官中的一种或多种RNA的活性增加的任何疾病过程。因此，可以治疗任何患病的细胞、组织或器官，其中所述疾病的特征为一种或多种RNA的活性增加。
适合治疗的疾病、障碍和病症的特定示例性例子包括：癌症、动脉粥样硬化、高胆固醇血症和高脂血症、传染性疾病、糖尿病、代谢障碍、免疫和自身免疫障碍、炎性疾病、器官疾病、中枢神经系统(CNS)疾病和纤维化疾病。
在不同的实施方案中，当提及寡聚体活性时，术语“增强”、“增加”、“刺激”、“推进”、“促进”、“加强”是指，与缺少MGB的抗-miRNA分子或对照分子/组合物引起的应答相比，包含至少一个MGB的抗-miRNA分子在细胞中产生或引起更大幅度的生理学应答(即，下游效应)的能力。可测量的生理学应答可以包括，例如，2种或更多种RNA靶序列(例如，基因)的基因表达增加，细胞、组织或器官进入增加，指示器官功能改善的生理学标志物增加，细胞毒性剂对癌细胞的细胞杀伤活性增加，肿瘤细胞细胞凋亡增加，癌症相关症状的改善，和从本领域的理解和本文中的描述显而易见的其它应答。“增加的”或“增强的”量通常是由包含MGB的寡聚体产生的“统计上显著的”量，且可以包括这样的增加：其是由缺少MGB部分的寡聚体或对照组合物产生的量的1.1倍、1.2倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括在其间且大于1的所有整数和小数，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)。
本文中使用的术语“miRNA靶基因”是指在转录、转录后或翻译水平受miRNA调节的基因。
术语“减轻(reduce)”、“抑制(suppresses)”、“降低(decreases)”、“抑制(inhibits)”、“抑制(represses)”、“降低(lowers)”、“减弱(abates)”、或“减少(lessens)”通常是指包含至少一个MGB的寡聚体在RNA表达和/或活性或相关疾病或病症的症状方面引起相关的、但是更小幅度的生理学或细胞应答的能力，如根据诊断领域的常规技术测得的，所述相关疾病或病症与增加的RNA表达或活性有关(例如，癌症、肝炎、免疫障碍、代谢疾病、传染性疾病、心血管疾病、纤维化疾病)。“降低的”或“减少的”应答可以是，与未缀合或连接至MGB的寡聚体或对照组合物产生的应答相比，由包含MGB的寡聚体产生的应答的“统计上显著的”降低的或减少的量，且可以包括1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%降低，包括之间的所有整数。
本文中使用的术语“治疗”是指本文中描述的治疗性或预防性措施。“治疗”的方法包括，将寡聚体(例如，包含至少一个MGB)给予受试者，以便抑制、预防、逆转(治愈)、延迟、减轻特征为RNA表达或活性增加的疾病、障碍或病症的严重程度，减缓所述疾病、障碍或病症的进展，或改善所述疾病、障碍或病症的一种或多种症状。在一个实施方案中，治疗的目标可以是，改善生活质量和延长受试者的存活期超过在没有这种治疗的情况下的预期值。在一个特定实施方案中，治疗的功效范围为从症状改善至与RNA的增加有关的疾病、障碍或病症的完全逆转或治愈，如本文别处所讨论的。在非限制性的例子中，可以如下测量治疗的功效及其进展：按照本领域中的常规实践，进行器官功能试验，并监测要治疗的特定疾病、障碍或病症的生理学指标。
在特定的示例性实施方案中，本发明部分地涵盖了治疗患有疾病、障碍或病症的受试者的方法，所述疾病、障碍或病症与在2种或更多种细胞类型、组织类型或器官中表达的一种或多种RNA的活性增加有关，所述方法包括下述步骤：鉴别一种或多种RNA，所述RNA在2种或更多种细胞类型、组织类型或器官中表达，并在患病的或受影响的细胞、组织或器官(例如，靶细胞、组织、器官)中具有活性，以及给予能与所述靶RNA杂交的寡聚体。在优选实施方案中，所述寡聚体包含一个或多个MGB部分。
本文中使用的术语“受影响的细胞、组织或器官”或“患病的细胞、组织或器官”是指作为治疗的对象的细胞、组织或器官。受影响的或患病的细胞、组织或器官包含一种或多种RNA的活性。使用本发明的寡聚体和本文所述的方法，可以靶向受影响的或患病的细胞、组织或器官进行治疗。
本文中使用的术语“正常的细胞、组织或器官”或“未受影响的细胞、组织或器官”是指这样的细胞、组织或器官：其不具有与一种或多种寡聚体的活性有关的疾病、障碍或病症。在特定实施方案中，将正常的细胞、组织或器官用于对比目的以确定基线，从所述基线来测量RNA表达影响细胞、组织或器官或使其患病的程度。
3.测量RNA表达和活性
在特定实施方案中，本发明提供了治疗受疾病、障碍或病症影响的受试者的方法，所述疾病、障碍或病症与一种或多种细胞、组织或器官中的一种或多种RNA的表达和/或活性增加有关。本领域普通技术人员会认识到，增加的miRNA活性与已知或疑似的miRNA靶标的表达减少有关。使用本领域已知的技术，可以测量miRNA活性和已知或疑似的miRNA靶标的基因/蛋白表达。
例如，通过以下可以定量RNA活性和/或已知或疑似的RNA靶标的表达水平：例如，Northern印迹分析、竞争性的聚合酶链式反应(PCR)或定量实时PCR。可以对总的细胞RNA或聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法是本领域众所周知的。Northern印迹分析在本领域中也是常规的。使用商购可得的ABI
Figure BDA0000383241560000711
7600、7700或7900序列检测系统(Sequence Detection System)(可得自PE-Applied Biosystems,Foster City,Calif.)，并根据生产商的说明书使用，可以方便地完成定量实时PCR。
可以定量地测量RNA活性和/或已知或疑似的RNA靶标的表达水平的其它示例性方法包括：DNA阵列或微阵列(Brazma and Vilo,FEBS Lett.,2000,480,17-24;Celis,et al,FEBS Lett.,2000,480,2-16)、SAGE(基因表达的系列分析)(Madden,et al,Drug Discov.Today,2000,5,415-425)、READS(消化的cDNA的限制性酶扩增)(Prashar and Weissman,MethodsEnzymol.,1999,303,258-72)、TOGA(全基因表达分析)(Sutcliffe,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,1976-81)、蛋白质阵列和蛋白组学(Celis,et al,FEBS Lett.,2000,480,2-16;Jungblut,et al,Electrophoresis,1999,20,2100-10)、表达序列标签(EST)测序(Celis,et al,FEBS Lett.,2000,480,2-16;Larsson,et al,J.Biotechnol.,2000,80,143-57)、减法RNA指纹法(SuRF)(Fuchs,et al,Anal.Biochem.,2000,286,91-98;Larson,et al,Cytometry,2000,41,203-208)、减法克隆、差异展示(DD)(Jurecic andBelmont,Curr.Opin.Microbiol.,2000,3,316-21)和质谱法(To,Comb.Chem.High Throughput Screen,2000,3,235-41)。
在特定实施方案中，使用体外萤光素酶报告基因测定，可以评估RNA表达。在一个非限制性实例中，使用DUAL-
Figure BDA0000383241560000721
Reporter Anssay(Promega,Madison,Wis.)，其中萤光素酶活性被正常的RNA表达抑制(即，与其互补序列结合)，可以在体外评价被设计成抑制特定RNA的寡聚体的活性。另外，被设计成抑制一种或多种细胞类型、组织或器官中的一种或多种特定miRNA的寡聚体会阻止靶miRNA与其萤光素酶报告基因中的互补序列结合，从而促进萤光素酶活性。使用目标miRNA序列，可以工程改造萤光素酶报告基因。
另外，可以在蛋白水平定量RNA活性和/或已知靶标的表达水平。另外，可以以本领域众所周知的多种方式，定量miRNA的下游靶标的蛋白水平，所述方式诸如免疫沉淀、Western印迹分析(免疫印迹法)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量蛋白测定、蛋白活性测定(例如，半胱天冬酶活性测定)、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光激活细胞分选术(FACS)。针对靶标的抗体可以从多种来源诸如MSRS抗体目录(Aerie Corporation,Birmingham,Mich.)鉴别和得到，或者可以经由本领域众所周知的常规单克隆或多克隆抗体制备方法来制备。
4.疾病、障碍和病症
与未缀合一个或多个MGB或缺少MGB的寡聚体相比，本发明的寡聚体具有增加的生物分布。本发明的寡聚体技术的某些实施方案不限于任何特定细胞类型。本发明的寡聚体技术的特定实施方案可用于在多种细胞类型中实现广泛的组织分布。因此，可以为任意数目的不同细胞类型、组织或器官(例如，1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种或所有需要递送所述寡聚体的细胞类型、组织和/或器官)定制本发明的寡聚体。
与本文公开的方法和组合物一起使用的示例性细胞包括、但不限于：癌细胞、免疫细胞、上皮细胞、内皮细胞、中胚层细胞和间质细胞、骨细胞、造血细胞、皮肤细胞、毛细胞、眼细胞、神经细胞、神经胶质细胞、肌细胞(例如，骨骼、心脏、平滑肌细胞)、脑膜细胞、乳房细胞、肝细胞、肾细胞、胰腺细胞、胃细胞、肠细胞、结肠细胞、前列腺细胞、子宫颈细胞、阴道细胞。
与本文公开的方法和组合物一起使用的示例性组织包括、但不限于：中胚层组织、结缔组织、平滑肌组织、横纹肌组织、心肌组织、骨组织、骨髓组织、骨海绵组织、软骨组织、脂肪组织、内胚层组织、肺组织、血管组织、胰腺组织、肝组织、胰管组织、脾组织、胸腺组织、扁桃体组织、派伊尔斑组织、淋巴结组织、甲状腺组织、内皮组织、血细胞、膀胱组织、肾组织、消化道组织、食管组织、胃组织、小肠组织、大肠组织、子宫组织、睾丸组织、卵巢组织、前列腺组织、内分泌组织、肠系膜组织和脐带的组织、外胚层组织、表皮组织、真皮组织、眼组织和神经系统组织。
与本文公开的方法和组合物一起使用的示例性器官包括、但不限于：膀胱、骨、脑、乳房、软骨、子宫颈、结肠、角膜、眼、神经组织、神经胶质、食管、输卵管、心脏、胰腺、肠、胆囊、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、甲状旁腺、松果腺、垂体、前列腺、脊髓、脾、骨骼肌、皮肤、平滑肌、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫和阴道。
适合治疗的疾病、障碍和病症的特定示例性例子包括：肿瘤介导的血管生成、癌症、动脉粥样硬化、高胆固醇血症和高脂血症、传染性疾病、糖尿病、代谢障碍、免疫和自身免疫障碍、炎性疾病、器官疾病、中枢神经系统(CNS)疾病和纤维化疾病。
使用本文的方法和组合物可以治疗的示例性癌症包括、但不限于：淋巴网状内皮细胞瘤形成、成淋巴细胞性白血病、脑肿瘤、胃肿瘤、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、结缔组织肿瘤、淋巴瘤和实体瘤。
可以治疗的其它合适的癌症包括、但不限于：癌，例如，恶性黑素瘤、基底细胞癌、卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、复发性浅表膀胱癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、宫颈癌、宫颈发育不良、喉乳头状瘤病、结肠癌、结肠直肠癌、类癌瘤；肉瘤，例如，骨肉瘤、尤因肉瘤、软骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、纤维肉瘤和卡波西氏肉瘤；和胶质母细胞瘤。
在某些实施方案中，当治疗癌症时，一种或多种辅助疗法或药剂可以与本发明的寡聚体联合给予。所述辅助疗法可以与所述寡聚体共同给予(在相同或不同的组合物中，并在相同或不同的给予部位)。还可以在给予所述寡聚体之前或之后给予所述辅助疗法。
示例性辅助疗法包括、但不限于，肾上腺皮质类固醇，诸如泼尼松、地塞米松或地卡特隆；六甲蜜胺(克瘤灵、六甲三聚氰胺(HMM))；氨磷汀(阿密磷定)；氨鲁米特(氨鲁米特)；安吖啶(M-AMSA)；阿那曲唑(瑞宁得)；雄激素，诸如睾酮；门冬酰胺酶(优适宝)；卡介苗；比卡鲁胺(康士得)；博来霉素(硫酸博来霉素)；白消安(马利兰)；卡铂(伯尔定)；卡莫司汀(BCNU、BiCNU)；苯丁酸氮芥(留可然)；2-氯脱氧腺苷(2-CDA、克拉屈滨、克拉立平)；顺铂(顺氯氨铂)；胞嘧啶阿糖胞苷(阿糖胞苷)；达卡巴嗪(DTIC)；更生霉素(放线菌素-D、更生霉素)；柔红霉素(红卫霉素)；多西他赛(泰索帝)；多柔比星(阿霉素)；表柔比星；雌莫司汀(emcyt)；雌激素，诸如己烯雌酚(DES)；依托泊苷(VP-16、VePesid、凡毕复)；氟达拉滨(福达华)；氟他米特(氟他胺)；5-FUDR(氟尿苷)；5-氟尿嘧啶(5-FU)；吉西他滨(健择)；戈舍瑞林(zodalex)；赫赛汀(曲妥珠单抗)；羟基脲(羟基脲)；伊达比星(依达比星)；异环磷酰胺；IL-2(阿地白介素、阿地白介素)；干扰素α(甘乐能、罗荛愫)；伊立替康(盐酸伊立替康和山梨醇注射剂)；亮丙瑞林(醋酸亮丙瑞林)；左旋咪唑(左旋咪唑片)；洛莫司汀(CCNU)；氮芥(氮芥、氮芥)；美法仑(爱克兰)；巯嘌呤(巯基嘌呤、6-MP)；甲氨蝶呤(甲氨蝶呤钠)；丝裂霉素-C(突变霉素)；米托蒽醌(诺肖林)；奥曲肽(善宁)；喷司他丁(2-脱氧助间型霉素、喷司他丁粉针剂)；普利霉素(光神霉素、mithracin)；丙卡巴肼(甲苯肼)；链佐星；三苯氧胺(诺瓦得士)；泰素(紫杉醇)；替尼泊苷(卫萌、VM-26)；塞替派；托泊替康(和美新)；维A酸(维A酸胶囊剂、全反式维甲酸)；长春碱(valban)；长春新碱(安可平)和长春瑞滨(诺维本)。适当地，进一步的化学治疗剂选自紫杉烷类诸如泰素、紫杉醇或多西他赛。
使用本文的方法和组合物可以治疗的示例性感染性疾病包括、但不限于：HIV感染、CMV感染、HSV感染、白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感嗜血杆菌、麻疹、腮腺炎和风疹。
使用本文的方法和组合物可以治疗的示例性炎性疾病包括、但不限于：类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)或狼疮、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、硬皮病、多肌炎、炎性肠病、皮肌炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、脉管炎、银屑病关节炎、银屑病性剥脱性皮炎、寻常型天疱疮和舍格伦综合征，特别是炎性肠病、克罗恩氏病、滑囊炎、滑膜炎、囊炎、腱炎和/或创伤性和/或运动性起源的其它炎症性病变。
使用本文的方法和组合物可以治疗的示例性代谢疾病(由在体内天然产生的化学物质的积累造成的病症)包括、但不限于：克里格勒-纳贾尔综合征、糖尿病、脂肪酸氧化障碍、半乳糖血症、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)缺乏、戊二酸尿症、戊二酸血症I型、戊二酸血症II型、F-HYPDRR-家族性低磷血症、抗维生素D佝偻病、克拉伯病、长链3羟酰辅酶A脱氢酶缺乏(LCHAD)、甘露糖苷贮积症、枫糖尿病、线粒体疾病、粘多糖贮积综合征：尼-皮二氏综合征(Niemann Pick)、有机酸血症、苯丙酮尿症(PKU)、庞皮病、卟啉病、代谢综合征、高脂血症和遗传性脂质障碍、三甲基胺尿症:臭鱼综合征和尿素循环障碍。
使用本文的方法和组合物可以治疗的示例性神经系统疾病、障碍和病症包括、但不限于：脊髓损伤；头损伤或外科手术；病毒感染；神经变性疾病，例如，艾滋病痴呆复合征；脱髓鞘疾病，例如，多发性硬化和急性横贯性脊髓炎；锥体束外和小脑障碍，例如，皮质脊髓系统的损伤；基底神经节的障碍或小脑障碍；运动机能亢进的运动障碍，例如，亨廷顿舞蹈病和老年性舞蹈病；药物诱发的运动障碍，例如，由阻断中枢神经系统(CNS)多巴胺受体的药物诱发的运动障碍；运动机能减退的运动障碍，例如帕金森病；进行性核上性麻痹；小脑的结构性损伤；脊髓小脑变性，例如，脊髓性共济失调、弗里德赖希氏共济失调、小脑皮质变性、多系统变性病(Mencel、Dejerine Thomas、Shi-Drager和Machado-Joseph)，全身性障碍，例如，雷弗素姆病、无β脂蛋白血症、共济失调、毛细管扩张；和线粒体多系统障碍；脱髓鞘芯障碍，例如，多发性硬化,急性横贯性脊髓炎；和运动单位障碍，例如，神经源性肌萎缩(前角细胞变性，例如，肌萎缩性侧索硬化,婴儿型脊髓性肌萎缩和青少年脊髓性肌萎缩)；阿尔茨海默氏病；中年的唐氏综合征；弥散性露易小体疾病；露易小体型的老年性痴呆；韦-科二氏综合征；慢性酒精中毒；克雅病；亚急性硬化性全脑炎，Hallerrorden-Spatz病；和拳击员痴呆。
使用本文的方法和组合物可以治疗的示例性纤维增生性疾病包括、但不限于：硬皮病(包括硬斑病、泛发性硬斑病或线状硬皮病)、肾纤维化(包括肾小球硬化、肾小管间质性纤维化、进行性肾疾病或糖尿病肾病)、心脏纤维化(例如，心肌纤维化)、肺纤维化(例如，肾小球硬化症肺纤维化、特发性肺纤维化、硅沉着病、石棉肺、间质性肺病、间质性纤维化肺病和化学疗法/辐射诱导的肺纤维化)、肝纤维化(包括肝硬化)、口部纤维化、心内膜心肌纤维化症、三角肌纤维化、胰腺炎、炎性肠病、克罗恩氏病、结节性筋膜炎、嗜酸性粒细胞性筋膜炎、以纤维组织对正常肌肉组织的不同程度的替换为特征的一般纤维化综合征、腹膜后纤维化、肝纤维化、肝硬化、慢性肾衰竭；骨髓纤维化(骨髓纤维化)、药物诱发的麦角中毒、李弗劳明综合征中的胶质母细胞瘤、散发的胶质母细胞瘤、髓性白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性综合征、妇科癌症、汉森病、胶原性结肠炎、急性纤维化、系统性硬化症、以及由组织或器官移植物或移植物排斥引起的纤维化。
miRNA靶标和适合用本发明组合物治疗的对应疾病、障碍和病症的示例性例子包括、但不限于：miR-1，心律失常；miR-21，胶质母细胞瘤，乳腺癌，肝细胞癌，结直肠癌，神经胶质瘤对细胞毒性药物的致敏，和心脏肥大；miR-21，miR-200b，对化学疗法和miR-141的调节的应答，和胆管上皮癌生长；miR-122，高胆固醇血症、丙型肝炎感染和血色素沉着症；miR-19b，淋巴瘤和其它肿瘤类型；miR-26a，人干细胞的成骨细胞分化；miR-155，淋巴瘤、胰腺肿瘤发展、以及乳腺癌和肺癌；miR-203，银屑病；miR-375，糖尿病、代谢障碍和葡萄糖诱导的胰腺内分泌细胞的胰岛素分泌；miR-181，成肌细胞分化和自体免疫障碍，miR-10b，乳腺癌细胞侵袭和转移；miR-125b-1，乳房、肺、卵巢和宫颈癌；miR-221和miR-222，前列腺癌、人甲状腺乳头状癌和人肝细胞癌；miRNA-372和-373，睾丸生殖细胞肿瘤；miR-142，B-细胞白血病；miR-17-19b，B-细胞淋巴瘤、肺癌和肝细胞癌。
在上文或下文中引用的所有出版物、专利和专利申请特此通过引用整体并入。
本文中使用的术语”约”或”大约”是指这样的时间段、数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度：其相对于参照时间段、数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变动至多30%、25%、20%、25%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在特定实施方案中，术语”约”或”大约”当在数值前面时是指该值±15%、10%、5%或1%的范围。
在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数所指，除非上下文另外清楚地指示并非如此。
贯穿本说明书，除非上下文另外要求，否则词语“包含”、“含有”和“包括”应理解为暗指包括所述的步骤或元素、或者步骤或元素的集合，但是不排除任意其它步骤或元件、或者步骤或元件的集合。“由......组成”是指包括且限于在短语“由(......组成)”后面的对象。因而，短语“由......组成”指示，列出的元素是必需的或强制性的，并且不可存在其它元素。“基本上由......组成”是指，包括在该短语后面列出的任意元素，且限于不干扰或有助于在本公开内容中关于列出的元素详细说明的活性或作用的其它元素。因而，短语“基本上由......组成”指示，列出的元素是必需的或强制性的，但其它元素是任选的，且可以存在或不存在，这取决于它们是否影响列出的元素的活性或作用。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过具体说明和实例对前述发明进行了比较详细的描述，但是本领域普通技术人员在考虑本发明的教导后会容易地明白，可以对其做出某些变化和改进，而不偏离所附权利要求书的精神或范围。下述实施例仅仅作为具体说明而不是作为限制来提供。本领域技术人员会容易地认识到，可以改变或改进多种非关键参数以产生基本上类似的结果。
实施例
实施例1
抗-MIRNA的定量全身放射自显影术(QWBA)分析
在静脉给予雄性CD-1小鼠单次剂量的14C标记的抗-miRNA以后，进行定量全身放射自显影术(QWBA)分析，以比较缀合的抗-miRNA(例如，MI-01453(SEQ ID NO:2)和MI-01454(SEQ ID NO:3))与未缀合的抗-miRNA(例如，MI-01452(SEQ ID NO:1))的组织分布和浓度参数。MI-01452、MI-01453和MI-01454是针对miR-21的抗-miRNA，参见表2。
表2:抗-miRNA
为了阐明这些抗-miRNA的序列组成，小写字母“m”指示在糖上掺入2′-OMe。“*”指示掺入硫代磷酸酯键(PS)来替代磷酸二酯键。L1是接头，且具有下述组成：“-P(=O)(OH)O(CH2)6NH-”。
方法
1.动物实验
研究的所有存活(in-life)部分在Xenometrics,LLC进行(研究编号XPK10-323)；下面简要描述了该方案的方法。为QWBA分析，使用30只成年雄性CD-1小鼠(3组，每组10只小鼠，每组选择7只小鼠用于QWBA)。每组通过尾静脉注射接受单次静脉内给予的在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的抗-miRNA。剂量给予信息总结在下表中：
Figure BDA0000383241560000782
在给药后0.167、0.5、1、2、4、8和24小时(h)和3、7和14天，在每个时间点将每组中的2只小鼠安乐死。将动物深度麻醉，然后通过在己烷/干冰浴中冷冻进行安乐死。
2.全身放射自显影术
将每只冷冻的小鼠尸体埋入2%羧甲纤维素基质中，并于大约-20℃下维持在切片机座(Leica CM3600Cryomacrocut,Nussloch,德国；或Vibratome9800,St.Louis,MO)上固定。在切片之前，将3份质量控制标准品(QC)放入冷冻块中，并按照QPS SOP用于切片厚度质量控制，所述质量控制标准品是补充了一种浓度(大约0.05μCi/g)的[14C]葡萄糖的血浆。在矢面切出大约40μm厚的切片，并捕获在胶带(Scotch Tape No.8210,3MLtd.,St.Paul,MN,USA)上。收集切片，以包括下述组织、器官和生物流体：脂肪(褐色和白色)、肾上腺、胆汁(在胆管中)、血液(心脏)、脑(大脑、小脑、髓质)、骨、骨髓、盲肠(和内容物)、附睾、眼(葡萄膜和晶状体)、副泪腺、心脏、肾(肾皮质和髓质)、大肠(和内容物)、肝、肺、淋巴结、胰腺、垂体、前列腺、唾液腺、精囊、骨骼肌、皮肤、胃(胃粘膜和内容物)、小肠(和内容物)、脾、脊髓、睾丸、胸腺、甲状腺和膀胱(和内容物)。
通过在冷冻切片机中在–20℃下升华至少48h，使切片干燥。将一组切片放置在纸板衬垫上，用保鲜膜覆盖，并与校准标准品(以在大约0.0007至7.410μCi/g的10种不同浓度与血液一起混合的14C-葡萄糖)一起暴露于14C-敏感的磷光体成像板(Fuji Biomedical,Stamford,CT)。在铜衬铅安全室内，将成像板和切片放入不透光的曝光盒中，在室温保持4-天曝光时段。使用Typhoon9410TM图像获取系统(GE Healthcare/Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA,USA)，扫描成像板，并将得到的图像存储在专用的QPS计算机服务器上。使用MCIDTM图像分析软件(6.0或7.0版,InterfocusImaging,Inc.,Linton,Cambridge,UK)，通过图像密度测定法进行定量，并从综合响应(MDC/mm2)和14C-校准标准品的标称浓度构建出标准曲线。
将放射性浓度表示为μCi/g，并使用每种给予的测试物的比活([14C]MI-01452为0.01976μCi/μg，[14C]MI-01453为0.01911μCi/μg，或[14C]MI-01454为0.01552μCi/μg)，将其转化成MI-01452、MI-01453和MI-01454的每克样品的μg当量(μg当量/g)。将定量下限(LLOQ)应用于数据。将[14C]-放射性的浓度表示为MI-01452、MI-01453或MI-01454的每克样品的μg当量(μg当量/g)。将低于校正曲线上的最低标准的组织浓度值记为低于可计量限度(BQL)；并将QWBA分析过程中在放射自显影图像上没有观察到的组织记为未取样(NS)，并视为BQL。
3.标准计算
使用加权1阶多项式线性方程式，产生响应曲线(1/MDC/mm2)。拟合优度的数字估测值由相对误差给出，其中接受≤0.250的每个校准标准品的相对误差的绝对值。
标准曲线计算：
响应(MDC/mm2)=a1x浓度(密度-标准，以μCi/g为单位)+a0
其中：
密度-标准=浓度，以μCi/g为单位
MDC/mm2=分子动态计数/组织面积
a1=斜率
a0=y-截距
根据下式，使用标准曲线计算每种标准品的相对误差：
Figure BDA0000383241560000801
然后根据下式，计算各个样品浓度：
Figure BDA0000383241560000802
MI-01452
LLOQ和定量上限(ULOQ)基于校正曲线中使用的最低(0.000706μCi/g)和最高(7.41040495μCi/g)标准。对于本研究，LLOQ为0.036μg当量/g组织。ULOQ为375.02μg当量/g组织：
Figure BDA0000383241560000803
Figure BDA0000383241560000811
MI-01453
LLOQ和定量上限(ULOQ)基于校正曲线中使用的最低(0.000706μCi/g)和最高(7.41040495μCi/g)标准。对于本研究，LLOQ为0.037μg当量/g组织。ULOQ为387.776μg当量/g组织：
Figure BDA0000383241560000813
MI-01454
LLOQ和定量上限(ULOQ)基于校正曲线中使用的最低(0.000706μCi/g)和最高(7.41040495μCi/g)标准。对于本研究，LLOQ为0.045μg当量/g组织。ULOQ为477.475μg当量/g组织：
Figure BDA0000383241560000814
Figure BDA0000383241560000815
结果和讨论
显示组织中的放射性分布模式的全身放射自显影图如图1-21所示，组织分布图如图22-24所示，在静脉内给予[14C]MI-01452、[14C]MI-01453或[14C]MI-01454以后，小鼠组织中的药物产生的放射性的浓度如图25-27所示。
1.[14C]MI-01452
对于大多数组织(18个测量组织中的10个)，在给药后0.167h时观察到最大浓度(Cmax)的药物产生的放射性。在肾皮质(246.955μg当量/g，4h)和肾髓质(30.229μg当量/g，1h)中观察到在Cmax时的最高放射性浓度。在其它组织中的浓度明显更低。在脑(<0.200μg当量/g)和精囊(<1.250μg当量/g)中测量到最低组织浓度。在给药后24h，大多数组织浓度下降，但是保持高于定量下限([14C]MI01452:0.036μg当量/g)。MI-01452的生物分布指示，未缀合的miRNA主要局限于肾，且肾排泄是主要消除途径。在本研究结束时(给药后24h)，没有完全消除。
2.[14C]MI-01453
对于大多数组织(18个测量组织中的13个)，在给药后0.167h时观察到最大浓度(Cmax)的药物产生的放射性。在多种组织中发现了高浓度的MI-01453。在Cmax时的最高放射性浓度是在下述组织中：肾皮质(264.311μg当量/g，4h)，肝(84.055μg当量/g，8h)，心脏血液(63.084μg当量/g，0.167h)，和肾髓质(39.816μg当量/g，0.167h)，肺(34.535μg当量/g，0.167h)，以及唾液腺(30.158μg当量/g，0.167h)。定性地，膀胱内容物、骨髓和一些淋巴组织也显示出具有高浓度。在脑和精囊中测得最低组织浓度。MI-01453的生物分布指示，缀合的抗-miRNA广泛地分布在组织中，并且肾排泄是主要消除途径。在第一个取样时间点(0.167h)以后，大多数组织具有更低的浓度；但是，在以后的时间点至24h的时间点，大多数组织中的浓度保持在类似的浓度。在本研究结束时(给药后24h)，没有完全消除。
3.[14C]MI-01454
对于大多数组织(18个测量组织中的8个)，在给药后0.167h时观察到最大浓度(Cmax)的药物产生的放射性。在多种组织中发现了高浓度的MI-01454。在Cmax时的最高放射性浓度是在下述组织中：肾皮质(132.984μg当量/g，2h)，心脏血液(121.526μg当量/g，0.167h)，肝(108.003μg当量/g，8h)，肺(83.163μg当量/g，0.5h)，肾上腺(81.489μg当量/g，0.5h)，脾(73.378μg当量/g，24h)，甲状腺(65.594μg当量/g，0.167h)，肾髓质(49.403μg当量/g，h)，唾液腺(33.153μg当量/g，0.167h)，和血液(121.526μg当量/g)。定性地，膀胱内容物、骨髓和一些淋巴组织也显示出具有高浓度。在脑(<2.500μg当量/g)和精囊(<2.000μg当量/g)中测得最低组织浓度。MI-01454的生物分布指示，缀合的抗-miRNA广泛地分布在组织中，并且肾排泄是主要消除途径。在第一个取样时间点(0.167h)以后，大多数组织具有更低的浓度；但是，在以后的时间点至24h的时间点，大多数组织中的浓度保持在类似的浓度。在本研究结束时(给药后24h)，没有完全消除。
结论
缀合的抗-miRNA的生物分布令人惊讶地和意外地优于未缀合的抗-miRNA的有限分布。对于缀合的抗-miRNA，例如，MI-01453和MI-01454，在整个研究期间，高浓度的药物产生的放射性广泛分布于组织，尽管对于大多数组织而言是在不同的浓度。相比而言，未缀合的抗-miRNA(例如，MI-01452)的放射性没有广泛分布：未缀合的抗-miRNA主要在肾中检测到，尽管也在肝脏中检测到一些信号。因此，本发明的缀合的miRNA是有利的，因为它们是广泛地生物可利用的；因而，解决了抗-miRNA治疗剂的全身性给予所遇到的有限生物利用度的问题。
缩写
下面是本文中使用的缩写和它们的含义的列表：%CV=变动系数；BQL=低于可计量限度；Cmax=观察到的最大浓度；Ci=居里；LLOQ=定量下限；LSC=液体闪烁计数；MCID=微型计算机成像装置系统；MDC=分子动态计数；和ULOQ=定量上限。
考虑到上面的详细描述，可以对实施方案做出这些和其它变化。一般而言，在下述权利要求中，使用的术语不应当解释成将权利要求限制为在说明书和权利要求书中公开的特定实施方案，而是应当解释为包括所有可能的实施方案以及这样的权利要求所具有的等同方案的整个范围。因此，本公开内容没有限制权利要求。
Figure IDA0000383241620000011

Claims (48)

1.将寡聚体提供给多种细胞类型、组织或器官的方法，所述方法包括，给予受试者包含一个或多个小沟结合部分(MGB)的寡聚体。
2.将寡聚体给予多种细胞类型、组织或器官的方法，所述方法包括，给予受试者包含一个或多个MGB的寡聚体。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体是单链的。
4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体是双链的。
5.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体选自：抗-miRNA、siRNA、shRNA、piRNA模拟物和miRNA模拟物。
6.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体经胃肠外给予。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述胃肠外给予选自：静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内和胸骨内注射和输注。
8.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体经静脉内给予。
9.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述多种细胞类型选自：癌细胞、免疫细胞、上皮细胞、内皮细胞、中胚层细胞和间质细胞、骨细胞、造血细胞、皮肤细胞、毛细胞、眼细胞、神经细胞、神经胶质细胞、肌细胞、脑膜细胞、乳房细胞、肝细胞、肾细胞、胰腺细胞、胃细胞、肠细胞、结肠细胞、前列腺细胞、子宫颈细胞和阴道细胞。
10.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述多种组织选自：中胚层组织、结缔组织、平滑肌组织、横纹肌组织、心肌组织、骨组织、骨髓组织、骨海绵组织、软骨组织、脂肪组织、内胚层组织、肺组织、血管组织、胰腺组织、肝组织、胰管组织、脾组织、胸腺组织、扁桃体组织、派伊尔斑组织、淋巴结组织、甲状腺组织、内皮组织、血细胞、膀胱组织、肾组织、消化道组织、食管组织、胃组织、小肠组织、大肠组织、子宫组织、睾丸组织、卵巢组织、前列腺组织、内分泌组织、肠系膜组织和脐带的组织、外胚层组织、表皮组织、真皮组织、眼组织和神经系统组织。
11.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述多种器官选自：膀胱、骨、脑、乳房、软骨、子宫颈、结肠、角膜、眼、神经组织、神经胶质、食管、输卵管、心脏、胰腺、肠、胆囊、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、甲状旁腺、松果腺、垂体、前列腺、脊髓、脾、骨骼肌、皮肤、平滑肌、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫和阴道。
12.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体能与pre-mRNA杂交。
13.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体能与靶miRNA杂交。
14.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述抗-miRNA分子能与pre-mRNA杂交。
15.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体能与靶pri-miRNA杂交。
16.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述一个或多个MGB中的至少一个与所述寡聚体的5′末端或3′末端缀合。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述一个或多个MGB中的至少一个用接头与所述寡聚体缀合。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述接头包含约10个至约100个原子的链，所述原子选自：C、O、N、S和P。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述接头选自：
a)–P(=O)(OH)O(CH2)6NH-；
b)–P(=O)(OH)O(CH2)4NH-；
c)–P(=O)(OH)(OCH2CH2)6OP(=O)(OH)O(CH2)6NH-；
d)羟基{[5-(羟基甲基)-1-甲基吡咯烷-3-基]氧基}氧代鏻；和
e)–(CH2)5OP(=O)(OH)-。
20.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述一个或多个MGB中的至少一个选自：纺锤菌素、偏端霉素和Lexitropsin、光神霉素、色霉素A3、橄榄霉素、安曲霉素、西伯里亚霉素、1,2-二氢-3H-吡咯并[3,2-e)吲哚-7-羧酸(DPI)(1-10)、N3氨甲酰基1,2-二氢-3H-吡咯并[3,2-e)吲哚-7-羧酸(CDPI)(1-10)和N-甲基吡咯-4-羧基-2-酰胺(MPC)(1-10)。
21.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述一个或多个MGB中的至少一个是CDPI3或CDPI4。
22.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述一个或多个MGB中的至少一个是CDPI3。
23.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体包含6-100个核苷酸。
24.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体包含10-50个核苷酸。
25.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体包含15-23个核苷酸。
26.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体包含与靶RNA序列具有至少70%互补性的核苷酸序列。
27.如权利要求20所述的方法，其中所述核苷酸选自：脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和修饰的核苷酸。
28.如权利要求22所述的方法，其中所述修饰的核苷酸包含选自下述的碱基：5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-烷基腺嘌呤、6-烷基鸟嘌呤、2-烷基腺嘌呤、2-烷基鸟嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、5-炔基尿嘧啶、5-炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、吩噁嗪胞苷、吩噻嗪胞苷、G-夹、咔唑胞苷、吡啶吲哚胞苷、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶、2-吡啶酮、2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
29.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体包含至少一个修饰的核苷间键。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述至少一个修饰的核苷间键选自：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、膦酸烷基酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯、吗啉代、硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、甲酰基、硫代甲酰基、亚甲基甲酰基、核乙酰基、含烯烃的主链、氨基磺酸酯、亚甲基亚氨基、亚甲基肼基、磺酸酯、磺酰胺或酰胺。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述至少一个修饰的核苷间键是硫代磷酸酯键。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述寡聚体的所有核苷间键都是硫代磷酸酯键。
33.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体包含至少一个2’修饰的糖部分。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述至少一个2’修饰的糖部分选自：OH、卤素、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基、O-烷基-O-烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、被取代的甲硅烷基、烷氧基烷氧基、二甲基氨基氧乙氧基、烯丙基和O-烯丙基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是被取代的或未被取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述至少一个2’修饰的糖部分是2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-MOE)糖部分。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述至少一个2’修饰的糖部分包含2’-O,4’-C亚甲基桥。
37.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡聚体包含至少一个或多个含有3’亲脂基团的碱基。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述3’亲脂基团选自：胆固醇、胆汁酸和脂肪酸。
39.减少一种或多种细胞、组织或器官中的RNA表达的方法，所述方法包括给予受试者包含一个或多个MGB的寡聚体，其中所述受试者的一种或多种细胞、组织或器官中的所述RNA表达与另一个给予不包含MGB的寡聚体的受试者中的所述RNA表达相比减少。
40.降低一种或多种细胞、组织或器官中的miRNA的miRNA活性的方法，所述方法包括给予受试者包含一个或多个MGB的抗-miRNA分子，其中所述受试者的一种或多种细胞、组织或器官中的所述miRNA活性与另一个给予不包含MGB的抗-miRNA分子的受试者中的所述miRNA活性相比降低。
41.治疗患有疾病、障碍或病症的受试者的方法，所述疾病、障碍或病症与多种细胞类型、组织或器官中的一种或多种RNA的表达增加有关，所述方法包括：
a)鉴别多种细胞类型、组织或器官中的一种或多种RNA，所述RNA在患病的细胞、组织或器官中的RNA表达与所述一种或多种RNA在正常细胞中的RNA表达相比增加；和
b)给予包含一个或多个MGB的寡聚体，所述寡聚体能与一种或多种RNA杂交。
42.治疗患有疾病、障碍或病症的受试者的方法，所述疾病、障碍或病症与多种细胞类型、组织或器官中一种或多种miRNA的活性增加有关，所述方法包括：
a)鉴别多种细胞类型、组织或器官中的一种或多种miRNA，所述miRNA在患病的细胞、组织或器官中的miRNA活性与在所述一种或多种miRNA在正常细胞中的miRNA活性相比增加；和
b)给予包含寡聚体和一个或多个MGB的抗-miRNA分子，所述抗-miRNA分子能与所述一种或多种miRNA杂交。
43.如权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症选自：肿瘤介导的血管生成、癌症、炎症、纤维化疾病、自身免疫疾病和丙型肝炎感染介导的疾病。
44.如权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症选自：肺癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、宫颈癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、骨肉瘤、中枢神经系统的癌症、结肠癌、结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、乳头状肾细胞癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌和头颈癌以及黑素瘤。
45.如权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症选自：自身免疫性甲状腺疾病(包括格雷夫斯氏病和桥本甲状腺炎)、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、舍格伦综合征、免疫血小板减少性紫癜(ITP)、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、银屑病、硬皮病和炎性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)。
46.如权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是丙型肝炎感染或丙型肝炎感染介导的疾病。
47.如权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症选自：新血管形成、中风、缺血和心肌梗塞。
48.如权利要求42所述的方法，其中所述miRNA选自：hsa-let-7a-1;hsa-let-7a-2;hsa-let-7a-3;hsa-let-7b;hsa-let-7c;hsa-let-7d;hsa-let-7e;hsa-let-7f-1;hsa-let-7f-2;hsa-let-7g;hsa-let-7i;hsa-mir-100;hsa-mir-101-1;hsa-mir-101-2;hsa-mir-103-1;hsa-mir-103-1-as;hsa-mir-103-2;hsa-mir-103-2-as;hsa-mir-105-1;hsa-mir-105-2;hsa-mir-106a;hsa-mir-106b;hsa-mir-107;hsa-mir-10a;hsa-mir-10b;hsa-mir-1-1;hsa-mir-1178;hsa-mir-1179;hsa-mir-1180;hsa-mir-1181;hsa-mir-1182;hsa-mir-1183;hsa-mir-1184-1;hsa-mir-1184-2;hsa-mir-1184-3;hsa-mir-1185-1;hsa-mir-1185-2;hsa-mir-1193;hsa-mir-1197;hsa-mir-1-2;hsa-mir-1200;hsa-mir-1202;hsa-mir-1203;hsa-mir-1204;hsa-mir-1205;hsa-mir-1206;hsa-mir-1207;hsa-mir-1208;hsa-mir-122;hsa-mir-1224;hsa-mir-1225;hsa-mir-1226;hsa-mir-1227;hsa-mir-1228;hsa-mir-1229;hsa-mir-1231;hsa-mir-1233-1;hsa-mir-1233-2;hsa-mir-1234;hsa-mir-1236;hsa-mir-1237;hsa-mir-1238;hsa-mir-124-1;hsa-mir-124-2;hsa-mir-1243;hsa-mir-124-3;hsa-mir-1244-1;hsa-mir-1244-2;hsa-mir-1244-3;hsa-mir-1245;hsa-mir-1246;hsa-mir-1247;hsa-mir-1248;hsa-mir-1249;hsa-mir-1250;hsa-mir-1251;hsa-mir-1252;hsa-mir-1253;hsa-mir-1254;hsa-mir-1255a;hsa-mir-1255b-1;hsa-mir-1255b-2;hsa-mir-1256;hsa-mir-1257;hsa-mir-1258;hsa-mir-125a;hsa-mir-125b-1;hsa-mir-125b-2;hsa-mir-126;hsa-mir-1260;hsa-mir-1260b;hsa-mir-1261;hsa-mir-1262;hsa-mir-1263;hsa-mir-1264;hsa-mir-1265;hsa-mir-1266;hsa-mir-1267;hsa-mir-1268;hsa-mir-1269;hsa-mir-127;hsa-mir-1270-1;hsa-mir-1270-2;hsa-mir-1271;hsa-mir-1272;hsa-mir-1273;hsa-mir-1273c;hsa-mir-1273d;hsa-mir-1274a;hsa-mir-1274b;hsa-mir-1275;hsa-mir-1276;hsa-mir-1277;hsa-mir-1278;hsa-mir-1279;hsa-mir-1280;hsa-mir-1281;hsa-mir-128-1;hsa-mir-1282;hsa-mir-128-2;hsa-mir-1283-1;hsa-mir-1283-2;hsa-mir-1284;hsa-mir-1285-1;hsa-mir-1285-2;hsa-mir-1286;hsa-mir-1287;hsa-mir-1288;hsa-mir-1289-1;hsa-mir-1289-2;hsa-mir-1290;hsa-mir-1291;hsa-mir-129-1;hsa-mir-1292;hsa-mir-129-2;hsa-mir-1293;hsa-mir-1294;hsa-mir-1295;hsa-mir-1296;hsa-mir-1297;hsa-mir-1298;hsa-mir-1299;hsa-mir-1301;hsa-mir-1302-1;hsa-mir-1302-10;hsa-mir-1302-11;hsa-mir-1302-2;hsa-mir-1302-3;hsa-mir-1302-4;hsa-mir-1302-5;hsa-mir-1302-6;hsa-mir-1302-7;hsa-mir-1302-8;hsa-mir-1302-9;hsa-mir-1303;hsa-mir-1304;hsa-mir-1305;hsa-mir-1306;hsa-mir-1307;hsa-mir-130a;hsa-mir-130b;hsa-mir-132;hsa-mir-1321;hsa-mir-1322;hsa-mir-1323;hsa-mir-1324;hsa-mir-133a-1;hsa-mir-133a-2;hsa-mir-133b;hsa-mir-134;hsa-mir-135a-1;hsa-mir-135a-2;hsa-mir-135b;hsa-mir-136;hsa-mir-137;hsa-mir-138-1;hsa-mir-138-2;hsa-mir-139;hsa-mir-140;hsa-mir-141;hsa-mir-142;hsa-mir-143;hsa-mir-144;hsa-mir-145;hsa-mir-1468;hsa-mir-1469;hsa-mir-146a;hsa-mir-146b;hsa-mir-147;hsa-mir-1470;hsa-mir-1471;hsa-mir-147b;hsa-mir-148a;hsa-mir-148b;hsa-mir-149;hsa-mir-150;hsa-mir-151;hsa-mir-152;hsa-mir-153-1;hsa-mir-153-2;hsa-mir-1537;hsa-mir-1538;hsa-mir-1539;hsa-mir-154;hsa-mir-155;hsa-mir-15a;hsa-mir-15b;hsa-mir-16-1;hsa-mir-16-2;hsa-mir-17;hsa-mir-181a-1;hsa-mir-181a-2;hsa-mir-181b-1;hsa-mir-181b-2;hsa-mir-181c;hsa-mir-181d;hsa-mir-182;hsa-mir-1825;hsa-mir-1827;hsa-mir-183;hsa-mir-184;hsa-mir-185;hsa-mir-186;hsa-mir-187;hsa-mir-188;hsa-mir-18a;hsa-mir-18b;hsa-mir-190;hsa-mir-1908;hsa-mir-1909;hsa-mir-190b;hsa-mir-191;hsa-mir-1910;hsa-mir-1911;hsa-mir-1912;hsa-mir-1913;hsa-mir-1914;hsa-mir-1915;hsa-mir-192;hsa-mir-193a;hsa-mir-193b;hsa-mir-194-1;hsa-mir-194-2;hsa-mir-195;hsa-mir-196a-1;hsa-mir-196a-2;hsa-mir-196b;hsa-mir-197;hsa-mir-1972-1;hsa-mir-1972-2;hsa-mir-1973;hsa-mir-1976;hsa-mir-198;hsa-mir-199a-1;hsa-mir-199a-2;hsa-mir-199b;hsa-mir-19a;hsa-mir-19b-1;hsa-mir-19b-2;hsa-mir-200a;hsa-mir-200b;hsa-mir-200c;hsa-mir-202;hsa-mir-203;hsa-mir-204;hsa-mir-205;hsa-mir-2052;hsa-mir-2053;hsa-mir-2054;hsa-mir-206;hsa-mir-208a;hsa-mir-208b;hsa-mir-20a;hsa-mir-20b;hsa-mir-21;hsa-mir-210;hsa-mir-211;hsa-mir-2110;hsa-mir-2113;hsa-mir-2114;hsa-mir-2115;hsa-mir-2116;hsa-mir-2117;hsa-mir-212;hsa-mir-214;hsa-mir-215;hsa-mir-216a;hsa-mir-216b;hsa-mir-217;hsa-mir-218-1;hsa-mir-218-2;hsa-mir-219-1;hsa-mir-219-2;hsa-mir-22;hsa-mir-221;hsa-mir-222;hsa-mir-223;hsa-mir-224;hsa-mir-2276;hsa-mir-2277;hsa-mir-2278;hsa-mir-2355;hsa-mir-23a;hsa-mir-23b;hsa-mir-23c;hsa-mir-24-1;hsa-mir-24-2;hsa-mir-25;hsa-mir-26a-1;hsa-mir-26a-2;hsa-mir-26b;hsa-mir-27a;hsa-mir-27b;hsa-mir-28;hsa-mir-2861;hsa-mir-2909;hsa-mir-296;hsa-mir-297;hsa-mir-298;hsa-mir-299;hsa-mir-29a;hsa-mir-29b-1;hsa-mir-29b-2;hsa-mir-29c;hsa-mir-300;hsa-mir-301a;hsa-mir-301b;hsa-mir-302a;hsa-mir-302b;hsa-mir-302c;hsa-mir-302d;hsa-mir-302e;hsa-mir-302f;hsa-mir-3065;hsa-mir-3074;hsa-mir-30a;hsa-mir-30b;hsa-mir-30c-1;hsa-mir-30c-2;hsa-mir-30d;hsa-mir-30e;hsa-mir-31;hsa-mir-3115;hsa-mir-3116-1;hsa-mir-3116-2;hsa-mir-3117;hsa-mir-3118-1;hsa-mir-3118-2;hsa-mir-3118-3;hsa-mir-3118-4;hsa-mir-3118-5;hsa-mir-3118-6;hsa-mir-3119-1;hsa-mir-3119-2;hsa-mir-3120;hsa-mir-3121;hsa-mir-3122;hsa-mir-3123;hsa-mir-3124;hsa-mir-3125;hsa-mir-3126;hsa-mir-3127;hsa-mir-3128;hsa-mir-3129;hsa-mir-3130-1;hsa-mir-3130-2;hsa-mir-3131;hsa-mir-3132;hsa-mir-3133;hsa-mir-3134;hsa-mir-3135;hsa-mir-3136;hsa-mir-3137;hsa-mir-3138;hsa-mir-3139;hsa-mir-3140;hsa-mir-3141;hsa-mir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