BRPI0817485A2 - OLIGÔMEROS, BEM COMO MÉTODO IN VITRO PARA REDUZIR A QUANTIDADE EFICAZ DE UM ALVO microRNA EM UMA CÉLULA - Google Patents

Abstract

oligômeros, bem como método in vitro para reduzir a quantidade eficaz de um alvo microrna em uma célula. a presente invenção refere-se a oligonucleotídeos muito curtos expressivamente modificados que visam e inibem micrornas in vivo, e o seu uso em medicamentos e composições farmacêuticas.

Description

. 1/198 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "OLIGÔME- ROS, BEM COMO MÉTODO /N VITRO PARA REDUZIR A QUANTIDADE EFICAZ DE UM ALVO microRNA EM UMA CÉLULA".

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a oligonucleotídeos muito curtos que visam e inibem microRNAs in vivo, e seu uso em medicamentos e com- posições farmacêuticas.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO MicroRNAs (mIRNAs) são uma classe abundante de RNAs en- —dógenos curtos que atuam como reguladores pós-transcricionais da expres- são gênica pelo pareamento de bases com seus mRNA alvo. São processa- i dos a partir de precursores maiores (aproximadamente 70 a 80 nucleotí- ia deos) semelhantes a grampo denominados pré-miRNAs pela enzima Dicer RNAse Ill. MicroRNAs montados em miRNPs denominados de complexos ribonucleoproteicos e reconhecem seus sítios alvo pela complementaridade antissenso que através disso medeiam a regulação para baixo de seus ge- nes alvo. A complementaridade quase perfeita ou perfeita entre miRNA e seu sítio alvo resulta na clivagem do mRNA alvo, ao passo que a comple- mentaridade limitada entre o microRNA e o sítio-alvo resulta na inibição tra- — ducionaldo gene alvo.

Um sumário do papel de microRNAs em doenças humanas, e a inibição de microRNAs usando oligonucleotídeos de fita simples são forneci- dos por WO2007/112754 e WO2007/112753, que são ambos por meio deste incorporados por referência em sua totalidade. WOZ2008046911, por meio deste incorporado por referência, fornece sequências de microRNA que es- tão associadas ao câncer. Numerosos microRNAs estão associados a fenó- tipos de doença e é, então, desejável fornecer substâncias capazes de mo- dular a disponibilidade de microRNAs in vivo. WOZ007/112754 e WO?2007/112753 revelam oligonucleotídeos curtos de fita simples que são vistos formar um dúplex forte com seu miRNA alvo. A SEQ ID NOs 1 a 45 são exemplos de oligonucleotídeos anti-microRNA como descrito em WOZ2007/112754 e WO2007/112753.

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PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS Este pedido de patente reivindica a prioridade sobre quatro pe- didos de patente: US 60/977497 depositado em 4 de outubro de 2007, US 60/979217 depositado em 11 de outubro de 2007, US 61/028062, deposita- doem12 de fevereiro de 2008, e EPO8104780, depositado em 17 de julho de 2008, todos os quais são por meio deste incorporados por referência. A- lém disso, refere-se e incorpora por referência WOZ2007/112754 e WO?2007/112753 que são pedidos de patente anteriores dos mesmos reque- rentes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é baseada na descoberta que o uso de oli- ' gonucleotídeos muito curtos que visam microRNAs e que têm uma alta pro- * porção de nucleotídeos de análogo nucleotídico, tais como nucleotídeos de LNA, é altamente eficaz na moderação da repressão de RNAs, tal como um mMRNA, por microRNAs visados in vivo.

A presente invenção fornece um oligômero, uma sequência con- tígua de 7, 8, 9 ou 10 unidades nucleotídicas de tamanho, para uso na redu- ção da quantidade eficaz de um microRNA alvo em uma célula ou um orga- nismo, em que pelo menos 70%, tal como pelo menos 80% das unidades —nucleotídicas do oligômero são selecionadas a partir do grupo consistindo de unidades de LNA e análogos nucleotídicos 2'substituídos.

A presente invenção fornece um oligômero, uma sequência con- tígua de 7, 8, 9 ou 10 unidades nucleotídicas de tamanho, para uso na redu- ção da quantidade eficaz de um microRNA alvo em uma célula ou um orga- nismo, em que pelo menos 70% das unidades nucleotídicas do oligômero são selecionados a partir do grupo consistindo de unidades de LNA e análo- gos nucleotídicos 2' substituídos, e em que pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70% das unidades nucleotídicas do oli- gômero são unidades de LNA.

A invenção fornece oligômeros entre 7 e 10 nucleotídeos de ta- manho compreendendo uma sequência nucleotídica contígua de um total de entre 7 a 10 nucleotídeos, tal como 7, 8, 9, unidades nucleotídicas, em que

E 3/198 pelo menos 50% das unidades nucleotídicas do oligômero são análogos nu- cleotídicos. A invenção fornece ainda um oligômero entre 7 a 10 nucleoti- deos de tamanho compreendendo uma sequência nucleotídica contígua de umtotalentre7e10 nucleotídeos, tal como 7, 8, 9, ou 10 unidades nucleotí- dicas, em que a sequência nucleotídica é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente encontrada em microRNA de mamífero ou viral, e em que pelo menos 50% das unidades nucleotídicas do oligômero são a- nálogos nucleotídicos.

A presente invenção fornece oligômeros de acordo com a inven- ção como um medicamento.

' A presente invenção fornece composições farmacêuticas com- U preendendo o oligêômero da invenção e um diluente, veículo, sal ou adjuvan- te farmaceuticamente aceitáveis.

A invenção fornece um conjugado compreendendo um oligôme- ro de acordo com a invenção, conjugado a pelo menos uma entidade não nucleotídica ou polinucleotídica, tal como um esterol, tal como colesterol.

A invenção fornece o uso de um oligêômero ou um conjugado de acordo com a invenção, para a produção de um medicamento para o trata- mento de uma doença ou distúrbio médico associado à presença ou à su- perexpressão de microRNA, tal como um ou mais dos microRNAs mencio- nados neste pedido.

A invenção fornece o tratamento de uma doença ou distúrbio médico associado à presença ou à superexpressão de microRNA, compre- endendo a etapa de administração de uma composição (tal como a compo- sição farmacêutica) compreendendo um oligôêômero ou conjugado de acordo com a invenção a um paciente que sofre ou provavelmente sofrerá da dita doença ou distúrbio médico.

A invenção fornece um método para redução da quantidade efi- cazde um microRNA alvo em uma célula ou organismo, compreendendo a administração do oligômero da invenção, ou composição (tal como uma composição farmacêutica) compreendendo o oligêmero ou conjugado de

' 4/198 acordo com a invenção à célula ou organismo.

A invenção fornece um método para redução da quantidade efi- caz de um microRNA alvo em uma célula ou organismo, compreendendo administração do oligôêômero ou conjugado ou composição farmacêutica de —acordocoma invenção à célula ou organismo.

A invenção fornece um método para desrepressão de um mRNA alvo (ou um ou mais RNAs) em uma célula ou organismo, compreendendo a administração de um oligômero ou conjugado de acordo com a invenção, ou uma composição compreendendo o dito oligômero ou conjugado, à dita célu- laou organismo. A invenção fornece o uso de um oligômero ou conjugado de a- Í cordo com a invenção, para inibição do microRNA em uma célula compre- - endendo o dito microRNA, tal como uma célula humana. O uso pode ser in vivo ou in vitro.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1. Apresentação esquemática de LNA-antimiRs de 8-mer MIR-21, miR-155 e miR-122, indicando as posições de direcionamento com LNA totalmente modificado e LNA-antimiR fosforotiolado. Posições de hibri- dização preferenciais para oligonucleotídeos de LNA 7mer, 8mer, 9mer e 10merem microRNA maduro também são indicadas.

Figura 2. Avaliação do antagonismo de miR-21 pelos LNA- antimiRs das SEQ ID f3205 e SEQ ID f63204 em células MCF-7 usando um ensaio sensor de luciferase. Células MCF-7 foram cotransfectadas com plasmídeos sensores de luciferase contendo um sítio-alvo de combinação perfeita para miR-21 ou um sítio-alvo de má combinação (.mm2) e LNA- antimiRs em concentrações diferentes. Após 24 horas, as células foram co- letadas e a atividade de luciferase, medida. São mostradas as médias das razões renilla/vagalume de três experimentos separados (barras = s.e.m), foram todos normalizados contra psiCHECK2 O nM (=controle).

Figura 3. Avaliação do antagonismo de miR-21 por LNA- antimiRs das SEQ ID 43205 e SEQ ID f3204 em células HeLa usando um ensaio sensor de luciferase. Células HeLa foram cotransfectadas com plas-

f 5/198 mídeos de sensor de luciferase contendo um sítio-alvo de combinação per- feita de miR-21 (mir-21) ou um sítio-alvo de má combinação (mm2) e LNA- antimiRs em concentrações diferentes. Após 24 horas, as células foram co- letadas e a atividade de luciferase medida. São mostradas as médias das razões renila/vagalume de três experimentos separados (barras = s.e.m), foram todos normalizados contra psiCHECK2 O nM (=controle).

Figura 4. Avaliação do antagonismo de miR-155 por LNA- antimiRs das SEQ ID *%3206 e SEQ ID 43207 em células RAW de camun- dongo tratadas com LPS usando um ensaio sensor de luciferase. Células RAW foram cotransfectadas com miR-155 e LNA-antimiRs diferentes em diferentes concentrações. Após 24 horas, as células foram coletadas e a Ú atividade de luciferase medida. São mostradas a média de renilla/vagalume, E foram todos normalizados contra psiCHECK2 O nM .

Figura 5. Avaliação do antagonismo de miR-122 por LNA- —antimiRs das SEQ ID f3208 e SEQ ID f4 em células HuH-7 usando um en- saio sensor de luciferase. Células HuH-7 foram cotransfectadas com um sensor de luciferase miR-122 contendo uma combinação perfeita de sítio- alvo de miR-122 e LNA-antimiRs diferentes em concentrações diferentes. Após 24 horas, as células foram coletadas e a atividade de luciferase, medi- da São mostradas as médias das razões renilla/vagalume de três experi- mentos separados (barras = s.e.m), onde todos foram normalizados contra psiCHECK2 O nM (=controle).

Figura 6. Apresentação esquemática de construtos repórter de luciferase miR-21.

Figura 7. Avaliação do antagonismo de miR-21 por um LNA- antimiR 8-mer (SEQ ID %3205) contra um LNA-antimiR 15-mer (SEQ ID 3204) em células PC3 usando um ensaio repórter de luciferase. Células PC3 foram cotransfectadas com plasmídeos repórter de luciferase contendo um sítio-alvo de combinação perfeita de miR-21 ou um sítio-alvo de má combinação e LNA-antimiRs em concentrações diferentes. Após 24 horas, as células foram coletadas e a atividade de luciferase, medida. São mostra- dos os valores médios (barras=s.e.m) de três experimentos independentes onde as razões renilla/vagalume foram normalizadas contra o vetor vazio O NM sem sítio-alvo (=controle). É mostrada também uma apresentação es- quemática da sequência de miR-21 e o desenho e a posição de LNA- antimiRs.

Nucleotídeos de LNA são indicados por elipses, e resíduos de DNA são indicados por barras.

Figura 8. Avaliação da especificidade do antagonismo de miR- 21 por um LNA-antimiR 8-mer em células HeLa usando um ensaio repórter de luciferase.

Células HeLa foram cotransfectadas com plasmídeos repórter de luciferase contendo um sítio-alvo de combinação perfeita ou mal combi- nadode miR-21e LNA-antimiRs (SEQ ID f3205) ou uma má combinação de oligo controle LNA 8-mer (SEQ ID *3218) em concentrações diferentes.

A- Ú pós 24 horas, as células foram coletadas e a atividade de luciferase foi me- Db dida.

São mostrados os valores médios (barras=s.e.m) para três experimen- tos independentes onde as razões renilla/vagalume foram normalizadas con- trao vetor vazio O nM sem o sítio-alvo (=controle). É mostrada também uma apresentação esquemática da sequência de miR-21 e o desenho e a posi- ção de LNA-antimiRs.

Más combinações são indicadas por elipses cheias.

Figura 9. Avaliação do menor comprimento possível de um LNA- antimiR totalmente LNA-modificado que medeia o antagonismo eficaz de miR-21. Células HeLa foram cotransfectadas com plasmídeos repórter de luciferase contendo um sítio-alvo de combinação perfeita ou de má combi- nação de miR-21 e LNA-antimiRs em concentrações diferentes (SEQ ID 3209 =6-mer e SEQ ID f3210=7-mer). Após 24 horas, as células foram co- letadas e a atividade de luciferase, medida.

São mostrados os valores mé- dios (barras=s.e.m) para três experimentos independentes onde as razões renilla/vagalume foram normalizadas contra o vetor vazio O nM sem o sítio- alvo (=controle). É mostrada também uma apresentação esquemática da sequência de miR-21 e o desenho e a posição de LNA-antimiRs.

Figura 10. Avaliação do comprimento de LNA-antimiRs total- mente LNA-substituídos antagonizando miR-21. Células Hela foram co- transfectadas com plasmídeos repórter de luciferase contendo um sítio-alvo de combinação perfeita ou de má combinação de miR-21 e LNA-antimiRs

: 7/198 em concentrações diferentes (SEQ ID f3211 =9-mer, SEQ ID f3212=10- mer, SEQ ID f3213=12-mer e SEQ ID f3214=14-mer). Após 24 horas, as células foram coletadas e a atividade de luciferase, medida.

São mostrados os valores médios (barras=s.e.m) para três experimentos independentes ondeas razões renillafvagalume foram normalizadas contra o vetor vazio O NM sem o sítio-alvo (=controle). É mostrada também uma apresentação es- quemática da sequência de miR-21 e o desenho e a posição de LNA- antimiRs.

Figura 11. Determinação da posição mais ideal de um LNA- antimiR 8-mer dentro da sequência de reconhecimento de miR-alvo.

Células HeLa foram cotransfectadas com plasmídeos repórter de luciferase contendo Í um sítio-alvo de combinação perfeita ou de má combinação de miR-21 e - LNA-antimiRs em concentrações diferentes.

Após 24 horas, as células foram coletadas e a atividade de luciferase, medida.

São mostrados os valores médios (barras=s.e.m) para três experimentos independentes onde as ra- zões renilla/vagalume foram normalizadas contra o vetor vazio O nM sem o sítio-alvo (=controle). É mostrada também uma apresentação esquemática da sequência de miR-21 e o desenho e a posição de LNA-antimiRs.

Figura 12. Validação da interação do Pdced4-3-UTR e miR-21 —peloLNA-antimiR 8-mer SEQ ID f13205. Células HelLa foram cotransfectadas com um plasmídeo repórter de luciferase contendo a parte 3UTR do gene Pdcd4 e LNA-antimiRs em concentrações diferentes (SEQ ID f3205 = 8 mer, combinação perfeita; SEQ ID f13218 = 8 mer, má combinação; SEQ ID 3204 = 15 mer, mistura de LNA/DNA; SEQ ID f3220 = 15 mer, lacunâme- ro). Após 24 horas, as células foram coletadas e a atividade de luciferase medida.

São mostradas as razões renilla/vagalume que foram normalizadas contra O nM.

É mostrada também uma apresentação esquemática da se- quência de miR-21 e o desenho e a posição de LNA-antimiRs.

Figura 13. Comparação de um LNA-antimiR 8-mer (SEQ ID tH3207) com um LNA-antimiR 15-mer (SEQ ID f3206) antagonizando miR- 155 em células RAW de camundongo.

Células RAW de camundongo foram cotransfectadas com plasmídeos repórter de luciferase contendo uma com-

f 8/198 binação perfeita de miR-155 e LNA-antimiRs diferentes em concentrações diferentes. Após 24 horas, as células foram coletadas e a atividade de lucife- rase medida. São mostrados os valores médios (barras=s.e.m) de três expe- rimentos independentes onde as razões renilla/vagalume foram normaliza- das contra o vetor vazio O nM sem o sítio-alvo de miR-155 (=controle). É mostrada também uma apresentação esquemática da sequência de miR-155 e o desenho e a posição de LNA-antimiRs.

Figura 14, Avaliação de c/EBPer LNA-antimiR (SEQ ID *%$3207) com um LNA-antimiR 15-mer (SEQ ID f3206) no antagonismo de miR-155 em células RAW de camundongo. Células RAW de camundongo foram co- transfectadas com plasmídeos repórter de luciferase contendo uma combi- i nação perfeita de miR-155 e após 20 horas, as células foram coletadas e - análise por western blot de extratos proteicos de células RAW foi realizada. As isoformas diferentes de c/EBP;g são indicadas, e as razões calculadas de acordocom c/EBP;g LIP e beta-tubulina são mostradas abaixo.

Figura 15. Antagonismo de miR-106b por LNA-antimiR LNA 8- mer totalmente modificado (SEQ ID f13221) ou por um mixâmero antimiR 15- mer (SEQ ID %3228). Células HeLa foram cotransfectadas com plasmídeos repórter de luciferase contendo uma combinação perfeita de miR-106b e LNA-antimiRs diferentes em concentrações diferentes. Após 24 horas, as células foram coletadas e a atividade de luciferase, medida. São mostrados os valores médios de quatro replicatas onde as razões renilla/vagalume fo- ram normalizadas contra o vetor vazio O nM sem o sítio-alvo de miRNA (controle). É mostrada também uma apresentação esquemática da se- —quênciade miR-106b e o desenho e a posição de LNA-antimiRs.

Figura 16. Antagonismo de miR-19b por LNA-antimiR LNA- to- talmente modificado 8-mer (SEQ ID 3222) e um mixâmero antimiR 15-mer (SEQ ID *3229). Células HeLa foram cotransfectadas com plasmídeos re- pórter de luciferase contendo uma combinação perfeita de miR-19a e dois —LNA-antimiRs em concentrações diferentes. Após 24 horas, as células foram coletadas e a atividade de luciferase medida. São mostrados os valores mé- dios de quatro experimentos em replicata, onde as razões renilla/vagalume f 9/198 foram normalizadas contra vetor vazio O nM sem um sítio-alvo de miR-19a controle). É mostrada também uma apresentação esquemática da se- quência de miR-19a e o desenho e a posição de LNA-antimiRs.

Figura 17. Apresentação esquemática mostrando as sequências —domiR-221humano maduro e de miR-222. É mostrado no quadrado a se- quência de semente (7-mer) que é conservada em ambas as sequências de MIRNA.

Figura 18. Direcionamento de uma família de microRNA que usa LNA-antimiR curto, totalmente LNA-substituído.

Células PC3 foram cotrans- fectadas com plasmídeos repórter de luciferase de miR-221 e miR-222 sepa- radamente ou em conjunto e com LNA-antimiRs diferentes em concentra- ções variadas.

Cotransfectando com LNA-antimiRs (15-mers) SEQ ID tt3223 : (contra miR-221) e SEQ ID f3224 (contra miR-222), a concentração total foi 2 nM (1 nM cada um), transfectando as células com SEQ ID f3225 (7-mer), as concentrações foram O, 1, 5, 10 ou 25 nM.

Após 24 horas, as células fo- ram coletadas e a atividade de luciferase medida.

São mostrados os valores médios (barras=s.e.m) de três experimentos independentes onde as razões renilla/vagalume foram normalizadas contra vetor vazio O nM sem um sítio- alvo de miRNA (=controle). É mostrada também uma apresentação esque- mática da sequência de miR-221/222 e o desenho e a posição de LNA- antimiRs.

Figura 19. Avaliação dos níveis proteicos de p27 como uma lei- tura funcional do antagonismo da família miR-221/222 pelo LNA-antimiR 7- mer SEQ ID f13225. Célutas PC3 foram transfectadas com o LNA-antimiR 7- mer&SEQ ID *3225 visando tanto miR-221 como miR-222 em concentrações variadas.

Após 24 horas, as células foram coletadas e os níveis proteicos foram medidos por um western blot São mostradas as razões de p27/tubulina.

Figura 20. Avaliação do antagonismo de miR-21 por um LNA- antimiR 8-mer (SEQ ID %3205) contra um LNA-antimiR 15-mer (SEQ ID 43204) e um 8-mer com 2 más combinações (SEQ ID f3218) em células HepG2 usando um ensaio repórter de luciferase.

Células HepG2 foram co-

r 10/198 transfectadas com o plasmídeo repórter de luciferase contendo um sítio-alvo de combinação perfeita de miR-21 e LNA-antimiRs em concentrações dife- rentes. Após 24 horas, as células foram coletadas e a atividade de lucifera- se, medida. São mostrados os valores médios (barras=s.e.m) de três expe- rimentos independentes onde as razões renilla/vagalume foram normaliza- das contra o vetor vazio O nM sem o sítio-alvo (=controle). É mostrada tam- bém uma apresentação esquemática da sequência de miR-21 e o desenho e a posição de LNA-antimiRs.

Figura 21. Validação de interação do 3'UTR de Pdcd4 e miR-21 pelo LNA-antimiR 8-mer SEQ ID f63205 contra o 15-mer (SEQ ID f3204) e um 8-mer com duas más combinações (SEQ ID 3218). Células HuH-7 fo- É ram cotransfectadas com um plasmídeo repórter de luciferase contendo par- R te do 3UTR do gene Pdcda4, pré-miR-21 (10 nM) e LNA-antimiRs em con- centrações diferentes. Após 24 horas, as células foram coletadas e a ativi- dade de luciferase, medida. São mostrados os valores médios (bar- ras=s.e.m) de três experimentos independentes onde as razões renil- la/vagalume foram normalizadas contra o vetor vazio O nM sem o sítio-alvo (=controle). É mostrada também uma apresentação esquemática da se- quência de miR-21 e o desenho e a posição de LNA-antimiRs.

Figura 22. Antagonismo de miR-21 por SEQ ID f3205 leva a ní- veis aumentados de níveis proteicos de Pded4. Células HeLa foram transfec- tadas com LNA-antimiR 5 nM SEQ ID t3205 (combinação perfeita), ou LNA Misturado (8mer) SEQ ID f3219 ou SEQ ID f3218 (má combinação 8-mer). Células foram coletadas após 24 horas e submetidas a Western blot com anticorpo para Pdcd4.

Figura 23. Os níveis de ALT e AST em camundongos tratados com SEQ ID f3205 (combinação perfeita) ou SEQ ID f13218 (controle de má combinação). Os camundongos foram sacrificados após 14 dias e após re- ceber 25 mg/kg em dias alternados.

Figura 24. Avaliação dos níveis proteicos de PU.1 como uma lei- tura funcional do antagonismo de miR-155 por LNA-antimiR curto (SEQ ID 3207). Células THP-1 foram cotransfectadas com pré-miR-155 (5 nmols) e oligonucleotídeos LNA diferentes (5 nM) e LPS a 100 ng/ml foi adicionado. Após 24 horas, as células foram coletadas e a análise por western blot dos extratos proteicos das células THP-1 foi realizada. PU.1 e tubulina são indi- cados.

Figura 25. Avaliação dos níveis proteicos de p27 como uma lei- tura funcional do antagonismo da família miR-221/222 pelo LNA-antimiR 7- mer SEQ ID f13225. Células PC3 foram transfectadas com o LNA-antimiR 7- mer SEQ ID t13225 visando tanto miR-221 como miR-222 e um LNA controle misturado em 5 e 25 nM. Após 24 horas, as células foram coletadas e os níveis proteicos foram medidos por um western blot. São mostradas as ra- zões de p27/tubulina.

] Figura 26. Silenciamento de miR-221/222 pelo LNA-antimiR 7- Ú mer SEQ ID *3225 (combinação perfeita) reduz a formação de colônia em ágar em baixa concentração de células PC3. Células PC3 foram transfecta- dascom25nM de LNA-antimiR 7-mer SEQ ID *%43225 visando tanto miR-221 como miR-222 ou um controle misturado 7-mer ((SEQ ID *%3231). Após 24 horas, as células foram coletadas e semeadas em ágar em baixa concentra- ção. Após 12 dias, as colônias foram contadas. O experimento foi feito em triplicata.

Figura 27. Visão geral da família let-7 humana, e de antagonis- tas testados. (superior) As sequências representam o mIRNA maduro de cada membro e a caixa representa nucleotídeos 2 a 16, as posições tipica- mente antagonizadas por LNA-antimiRs. Colunas à direita mostram o núme- ro de diferenças de nucleotídeo comparado com let-7a, dentro da semente (S: posição2 a3B8), semente estendida (ES; posição 2 a 9), e a sequência restante tipicamente visada por LNA-antimiRs (NE; posição 9 a 16), respec- tivamente. Nucleotídeos com cores invertidas estão alterados em compara- ção a let-7a. (inferior) Resumo de antagonistas testados contra a família let- 7, incluindo informação sobre desenho, comprimento e alvos perfeitamente complementares. Todos os compostos são totalmente fosforotiolados.

Figura 28. Avaliação do antagonismo de let-7 por seis LNA- antimiRs diferentes em células HuH-7 usando um ensaio sensor de lucifera-

t 12/198 se.

Células HuH-7 foram cotransfectadas com plasmídeos sensores de luci- ferase contendo uma 3'UTR parcial de HMGA2 (com quatro sítios de ligação a let-7), com ou sem precursor let-7a (barras cinzas e pretas, respectivamen- te), e com 6 LNA-antimiRs diferentes em concentrações crescentes.

Após 24 horas, as células foram coletadas e a atividade de luciferase, medida.

São mostradas as médias das razões renilla/vagalume de medidas em duplicata e desvios padrão de cada ensaio.

Dentro de cada grupo LNA-antimiR todas as proporções foram normalizadas pela média de poços não contendo de precursor let-7a (barras pretas). Figura 29. Resultados de luciferase de células Huh-7 transfec- tadas com plasmídeo sensor 3UTR de HMGA2, LNA-antimiRs SEQ ID ' 43226 (esquerdo) e SEQ ID t3227 (direito), e pré-miRs para let-7a (A), let- p 7D (B), let-7e (C) e let-7i (D). Barras cinzas indicam desrepressão-alvo após inclusão de pré-mis, ao passo que as barras controle pretas representam o nível equivalente sem adição de pré-miR.

Cada razão é baseada em medi- das em quadruplicata e foram normalizadas contra a média de poços não contendo precursor (barras pretas) dentro de cada grupo de tratamento.

Figura 30. Resultados de luciferase a partir de células Hela transfectadas com o plasmídeo sensor 3UTR de HMGAZ2 ou vetor controle, eLNA-antimiR SEQ ID f3227 em várias concentrações.

Cada razão é base- ada em medidas em quadruplicata normalizadas contra o vetor controle va- zio não tratado (O nM) (psi-CHECK-2; barras cinzas). Figura 31. Avaliação do antagonismo de miR-21 por 8mer (43205) em células HCT116 usando um ensaio sensor de luciferase.

Células HCT116foram cotransfectadas com plasmídeos sensores de luciferase con- tendo um sítio-alvo de miR-21 de combinação perfeita (barras cinzas) e LNA-antimiR e oligonucleotídeos controle em concentrações diferentes.

A- pós 24 horas, as células foram coletadas e a atividade de luciferase, medida.

É mostrado um exemplo típico de dois onde as razões renilla/vagalume fo- ram normalizadas contra o vetor vazio O nM (=barras negras). Figura 32. Silenciamento de miR-21 pelo LNA-antimiR 8-mer 3205 reduz a formação de colônia em ágar em baixa concentração em cé-

' 13/198 lulas PC3. Células PC3 foram transfectadas com 25 nM do LNA-antimiR 8- mer 3205 visando miR-21. Após 24 horas, as células foram coletadas e semeadas em ágar em baixa concentração. Após 12 dias, colônias foram contadas. É mostrado as médias de três experimentos separados, cada um realizado em triplicata, e normalizado contra controle O nM (isto é, transfec- ção mas sem LNA). p=0,01898 para f3205.

Figura 33. Silenciamento de miR-21 pelo LNA-antimiR 8-mer 3205 reduz a formação de colônia em ágar em baixa concentração em cé- lulas HepG2. Células HepG2 foram transfectadas com 25 nM do LNA- antimiR 8-mer 3205 visando miR-21. Após 24 horas, as células foram cole- tadas e semeadas em ágar em baixa concentração. Após 17 dias, as colô- nias foram contadas. É mostrado as médias de três replicatas de um expe- BR rimento (barras=SEM).

Figura 34. Fechamento de injúria na linhagem celular PC3 inva- siva de próstata humana após tratamento com %3205. (A) Células PC3 fo- ram transfectadas no dia 3 com LNA-antimiR e oligonucleotídeos controle a 25 nM, 43205 (8mer, combinação perfeita) e 43219 (8mer, má combinação) e no dia seguinte uma ranhura foi feita. Fotos foram tiradas após 24 horas para monitorar a migração. (B) A área em cada ponto de tempo foi medida como programa Image J e normalizada contra o respectivo ponto de tempo Oh.

Figura 35. Avaliação do comprimento de LNA-antimiRs total- mente LNA substituídos antagonizando miR-155. Células RAW foram co- transfectadas com plasmídeos repórter de luciferase contendo um sítio-alvo de combinação perfeita de miR-155 e com oligonucleotídeos LNA-antimiR em concentrações diferentes. Após 24 horas, as células foram coletadas e a atividade de luciferase, medida. São mostrados os valores médios (bar- ras=s.e.m) para três experimentos independentes onde as razões renil- la/vagalume foram normalizadas contra o vetor vazio O nM sem o sítio-alvo —(=vazio). É mostrada também uma apresentação esquemática da sequência de miR e o desenho e a posição de LNA-antimiRs.

Figura 36. A ligação de LNA-antimiR-21 5-FAM marcado

É 14/198 (43205) à proteina plasmática de camundongo. (A) % de composto LNA- antimiR-21 não ligado como uma função da concentração de oligonucleotíi- deo no plasma do camundongo. (B) Concentração de composto LNA- antimiR-21 43205 não ligado como uma função da concentração de 3205 noplasmado camundongo. Figura 37. Quantificação dos níveis de proteína Ras por análise por western blot. A. Imagem de gel mostrando as proteínas Ras e Tubulina (pa- drão interno) em amostras de pulmão e de rim tratadas (anti-let-7; 8-mer) contra não tratadas (solução salina). B. Quantificações dos níveis de proteí- na Ras no pulmão e rim, respectivamente, de camundongos tratados com : LNA-antimiR (barras pretas), normalizados contra solução salina controle B equivalentes (barras cinzas), usando tubulina como controle de carregamen- to igual. B. Silenciamento de miR-21 por 43205 leva a níveis aumentados dos níveis da proteína Pdcd4 in vivo. C. Camundongos foram injetados com solução salina ou LNA- antimiR (43205) 25 mg/kg por 14 dias em dias alternados, com um total de 5 doses. Camundongos foram sacrificados e proteína foi isolada do rim e submetida à análise por western blot com o anticorpo para Pdced4. A. Ima- gem do gel mostrando as proteínas Pded4 e Gapdh (padrão interno) em a- mostras de rim (M1, camundongo 1; M2, camundongo 2) tratadas (antimiR- 21; 8-mer) contra não tratadas (salina) . B. Quantificação dos níveis de pro- teina Pded4 nos rins de camundongos tratados com LNA-antimiR (barras cinzas escuras), normalizada contra a média de solução salina controle e- quivalentes (barras cinzas destacadas), usando Gapdh como controle de carregamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Oligonucleotídeos curtos que incorporam LNA são conhecidos na área de reagentes in vitro, (ver, por exemplo, WO2005/098029 e WO 2006/069584). Entretanto as moléculas desenhadas para uso diagnóstico ou reagente são muito diferentes no desenho do que aquelas para uso in vivo f 15/198 ou farmacêutico.

Por exemplo, os nucleotídeos terminais dos oligos reagen- tes são tipicamente não LNA, mas DNA, e as ligações internucleosídicas são tipicamente exceto fosforotioato, a ligação preferencial para uso nos oligonu- cleotídeos da presente invenção.

A invenção, por isso, fornece uma nova classede oligonucleotídeos (referida neste pedido como oligômeros) per si.

As seguintes modalidades referem-se a certas modalidades do oligômero da invenção, que podem ser usadas em uma composição farma- cêutica.

Aspectos que se referem ao oligômero também podem referir-se à sequência nucleotídica contígua, e vice-versa.

O Oligômero O oligêmero da invenção é um oligonucleotídeo de fita simples Ú que compreende análogos nucleotídicos, tais como LNA, que são parte, ou a F sequência nucleotídica contígua inteira do oligonucieotídeo.

A sequência nucleotídica do oligômero consiste em uma sequência nucleotídica contígua.

O termo "oligonucleotídeo" (ou simplesmente "oligo"), que é u- sado intercambiavelmente com o termo "oligômero" refere-se, no contexto da presente invenção, a uma molécula formada pela ligação covalente de dois ou mais nucleotídeos.

Quando usado no contexto do oligonucleotídeo da invenção (também referido como oligonucleotídeo de fita simples), o ter- mo "oligonucleotídeo" pode ter, em uma modalidade, por exemplo, ter entre 7 e 10 nucleotídeos, tal como em modalidades individuais, 7, 8, 9, ou 10. O termo 'nucleotídeo' refere-se a nucleotídeos, tais como DNA e RNA, e análogos nucleotídicos.

Deve ser reconhecido que, em alguns as- pectos, o termo nucleobase também pode ser usado para referir-se a um —nucleotídeo que pode ou não ocorrer naturalmente - neste aspecto, os ter- mos nucleobase e nucleotídeo podem ser usados intercambiavelmente nes- te pedido.

Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica contígua consiste em 7 análogos nucleotídicos.

Em algumas modalidades, a sequên- cia nucleotídica contígua consiste em 8 análogos nucleotídicos.

Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica contígua consiste em 9 análogos nu- cleotídicos.

Á 16/198 Em uma modalidade, pelo menos aproximadamente 50% dos nucleotídeos do oligômero são análogos nucleotídicos, tal como pelo menos aproximadamente 55%, tal como pelo menos aproximadamente 60%, ou pelo menos aproximadamente 65% ou pelo menos aproximadamente 70%, tal como pelo menos aproximadamente 75%, tal como pelo menos aproxi- madamente 80%, tal como pelo menos aproximadamente 85%, tal como pelo menos aproximadamente 90%, tal como pelo menos aproximadamente 95% ou, tal como 100%. Também será evidente que o oligonucleotíideo pode compreender uma sequência nucleotídica que consiste somente em análo- gos nucleotídicos.

Apropriadamente, o oligômero pode compreender pelo menos um monômero de LNA, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 monôme- ' ros de LNA.

Como descrito abaixo, a sequência nucleotídica contígua pode 4 consistir somente em unidades de LNA (incluindo grupos de ligação, tais como ligações de fosforoticoato), ou pode consistir em unidades de LNA e DNA, ou LNA e outros análogos nucleotídicos.

Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica contígua compreende ou um ou dois nucleotídeos de DNA, o restante dos nucleotídeos que são análogos nucleotídicos, tal como unidade de LNA.

Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica contígua consiste em 6 análogos nucleotídicos e um nucleotídeo de DNA único.

Em algumas modalidades, o nucleotídeo contíguo consiste em 7 análogos nu- cleotídicos e um nucleotídeo de DNA único.

Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica contígua consiste em 8 análogos nucleotídicos e um nucleotídeo de DNA único.

Em algumas modalidades, a sequência nucleotí- dica contígua consiste em 9 análogos nucleotídicos e um nucleotideo de DNA único.

Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica contígua consiste em 7 análogos nucleotídicos e dois nucleotídeos de DNA.

Em al- gumas modalidades, a sequência nucleotídica contígua consiste em 8 aná- logos nucleotídicos e dois nucleotídeos de DNA.

O oligêômero pode consistir na sequência nucleotídica contígua.

Em uma modalidade especialmente preferencial, todos os aná- logos nucleotídicos são LNA.

Em uma modalidade adicional preferencial,

, 17/198 todos os nucleotídeos do oligêmero são LNA. Em uma modalidade adicional preferencial, todos os nucleotídeos do oligômero são LNA e todos os grupos de ligação internucleosídica são fosfotioato.

Neste pedido, o termo "base nitrogenada" é destinado a cobrir purinas e pirimidinas, tais como as nucleobases de DNA A, C, Te G, as nu- cleobases de RNA A, C, U e G, bem como nucleobases não DNA/RNA, tais como 5-metilcitosina ("ºC), isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracila, 5- propiniluracila, 5-propinil-6-fluorouracila, 5-metiltiazoleuracila, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, 2,6-diaminopurina, 7-propino-7-deaza-adenina, 7- —propino-7-deazaguanina e 2-cloro-6-aminopurina, em particular MC. Será entendido que a seleção real de nucleobase não DNA/RNA dependerá da ' correspondência (ou combinação) do presente nucleotídeo na fita de mi- - CroRNA que o oligonucleotídeo é destinado a visar. Por exemplo, no caso de que o nucleotídeo correspondente é G será normalmente necessário sele- cionar uma nucleobase não DNA/RNA que é capaz de estabelecer ligações de hidrogênio a G. Neste caso específico, onde o nucleotídeo corresponden- te é G, um exemplo típico de uma nucleobase não DNA/RNA preferencial é Mec Deve ser reconhecido que o termo em 'uma modalidade' não ne- cessariamente deve ser limitado a referir-se a uma modalidade específica, mas pode referir-se a uma característica que pode estar presente em 'algu- mas modalidades", ou até mesmo uma característica genérica da invenção. Do mesmo modo, o uso do termo 'alguma modalidade' pode ser usado para descrever uma característica de uma modalidade específica, ou coleção de modalidades, oumesmo como uma característica genérica da invenção.

Os termos "correspondente a" e "corresponde a" referem-se à comparação entre a sequência nucleotídica do oligômero ou sequência nu- cleotídica contígua (uma primeira sequência) e a sequência nucleotídica contígua equivalente de uma sequência adicional selecionada de i) uma —subsequência do complemento reverso de ácido nucleico de microRNA-alvo (tal como um microRNA-alvo selecionado das SEQ ID 40 a SEQ ID 976, e/ou ii) a sequência de nucleotídeos fornecida neste pedido, tais como o

Á 18/198 grupo consistindo nas SEQ ID N. 977 a 1913, ou SEQ ID NO. 1914 a 2850, ou SEQ ID NO. 2851 a 3787. Os análogos nucleotídicos são comparados diretamente com seus nucleotídeos equivalentes ou correspondentes. Uma primeira sequência que corresponde a uma sequência adicional sob i) ou ii) tipicamente é idêntica àquela sequência sobre o comprimento da primeira sequência (tal como a sequência nucleotídica contígua).

Referindo-se ao comprimento de uma molécula de nucleotídeo como mencionado neste pedido, o comprimento equivale ao número de uni- dades de monômero, isto é, nucleotídeos, independentes quanto a se aque- las unidades de monômero são nucleotídeos ou análogos nucleotídicos. Com respeito a nucleotídeos ou nucleobases, os termos monômero e unida- : de são usados intercambiavelmente neste pedido. : Deve ser entendido que quando o termo "aproximadamente" é usado no contexto de valores específicos ou faixas de valores, a revelação deve ser lida para incluir o valor específico ou faixa mencionada.

Como usado neste pedido, "hibridização" significa ligação de hi- drogênio, que pode ser Watson-Crick, Hoogsteen, ligação de hidrogênio in- vertida de Hoogsteen, etc., entre bases nucleosídicas ou nucleotídicas com- plementares. As quatro nucleobases comumente encontradas em DNA são G,A,TeC das quais G pareia com C, e A pareia com T. Em RNA, o Té substituído por uracila (U), que então pareia com A. Os grupos químicos nas nucleobases que participam na formação dúplex padrão constituem a face de Watson-Crick. Hoogsteen mostrou um par de anos após que as nucleo- bases purínicas (G e A) além de sua face de Watson-Crick tem uma face de —Hoogsteen que pode ser reconhecida do exterior de um dúplex, e usada pa- ra ligar oligonucleotídeos pirimidínicos através da ligação de hidrogênio, por meio disso formando uma estrutura de hélice tripla.

No contexto da presente invenção "complementar" refere-se à capacidade de pareamento preciso entre duas sequências nucleotídicas en- tresi. Por exemplo, se um nucleotídeo em certa posição de um oligonucleo- tídeo é capaz de ligação de hidrogênio a um nucleotídeo na posição corres- pondente de DNA ou molécula de RNA, então considera-se que o oligonu-

' 19/198 cleotídeo e DNA ou RNA são complementares entre si naquela posição. Fi- tas de DNA ou RNA são consideradas complementares entre si quando um número suficiente de nucleotídeos no oligonucleotídeo pode formar ligações de hidrogênio com nucleotídeos correspondentes no DNA ou RNA-alvo para permitira formação de um complexo estável. Para ser estável in vitro ou in vivo, a sequência de um oligonucleotídeo não precisa ser 100% complemen- tar ao seu microRNA-alvo. Os termos "complementar" e "especificamente hibridizável" dessa forma implicam que o oligonucleotídeo se liga suficiente- mente forte e específico à molécula-alvo para fornecer a interferência dese- jada na função normal do alvo enquanto deixa a função de RNAs não alvo não afetada. Entretanto, em uma modalidade preferencial o termo comple- ; mentar deve significar 100% complementar ou totalmente complementar. ! Em um exemplo preferencial, o oligonucleotídeo da invenção é 100% complementar a uma sequência de miRNA, tal como uma sequência demicroRNA humano, ou uma das sequências de microRNA referidas neste pedido.

Em um exemplo preferencial, o oligonucleotíideo da invenção compreende uma sequência contígua, que é 100% complementar à região de semente da sequência de microRNA humano.

Preferencialmente, o termo "microRNA" ou "miRNA", no contexto da presente invenção, significa um oligonucleotídeo de RNA consistindo em entre 18 a 25 nucleotídeos de tamanho. Em termos funcionais, os miRNAs são moléculas de RNA endógeno tipicamente regulatórias.

Os termos "microRNA-alvo" ou "mIRNA-alvo" referem-se a mi- —croRNA com um papel biológico em doença humana, por exemplo, um miR- NA oncogênico regulado para cima ou um mIRNA supressor tumoral em câncer, por meio disso sendo um alvo de intervenção terapêutica da doença em questão.

Os termos "gene-alvo" ou "MRNA-alvo" referem-se a mRNA re- —gulatórios alvo de microRNAs, nos quais o dito "gene-alvo" ou "MRNA-alvo" são regulados pós-transcricionalmente por microRNA com base na comple- mentaridade quase perfeita ou perfeita entre o miRNA e seu sítio-alvo que resulta em clivagem de mRNA-alvo; ou complementaridade limitada, muitas vezes conferida a complementaridade entre a chamada sequência de se- mente (2 a 7 nucleotídeos de miRNA) e o sítio-alvo resultando em inibição traducional do MRNA-alvo.

No contexto da presente invenção, o oligonucleotídeo é a fita simples, isto refere-se à situação onde o oligonucleotídeo está na ausência de um oligonucleotídeo complementar - isto é, não é um complexo de oligo- nucleotídeo de fita dupla, tal como um siRNA. Em uma modalidade, a com- posição de acordo com a invenção não compreende um oligonucleotídeo adicional que tem uma região de complementaridade com o oligômero de 5 ou mais, tal como 6, 7, 8, 9, ou 10 nucleotídeos consecutivos, tal como oito : ou mais. N Comprimento Surpreendentemente encontra-se que tais 'antimiRs' curtos for- —necem uma inibição específica melhorada de microRNAs in vivo, conservan- do especificidade notável do microRNA-alvo. Foi encontrado que um benefíi- cio adicional é a capacidade de inibir vários microRNAs simultaneamente devido à conservação de sequências curtas homólogas entre espécies de MicroRNA - tais como as regiões de semente como descrito neste pedido. De acordo com a presente invenção, foi encontrado que é particularmente vantajoso ter oligonucleotídeos curtos de 7, 8, 9, 10 nucleotídeos, tal como 7, 8 ou 9 nucleotídeos. Sequências A sequência nucleotídica contígua é complementar (tal como 100% complementar - isto é, perfeitamente complementar) a uma região cor- respondente de sequência de microRNA de mamífero, humano ou viral (mIiRNA), preferencialmente uma sequência de miRNA humano ou viral. A sequência de microRNA pode ser apropriadamente microRNA maduro. Em algumas modalidades, microRNA pode ser um precursor de —microRNA. A sequência de microRNA humano pode ser selecionada a partir das SEQ ID Nos 1 a 558 como revelado em WOZ2008/046911, as quais são h 21/198 todas por meio deste e especificamente incorporadas por referência. Como descrito em WO2008/046911, estes microRNAs estão associados com cân- cer.

A sequência de microRNA viral, em algumas modalidades, pode ser selecionada a partir do grupo consistindo no vírus Herpes simplex 1, herpesvirus associado a sarcoma de Kaposi, vírus Epstein Barr e citomega- lovírus Humano.

Em uma modalidade, a sequência nucleotídica contígua é com- plementar (tal como 100% complementar) a uma região correspondente de uma sequência de miRNA selecionada a partir do grupo de miRNAs listados na tabela 1. A tabela 1 fornece oligôêômeros 7mer, 8mer e 9mer que visam ' microRNAs humanos e virais publicados em miRBase (Release 12.0 - ; http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/). Em algumas modalidades, os oligômeros de acordo com a in- venção podem consistir ou compreender uma sequência nucleotídica contí- gua que é complementar a uma sequência de microRNA correspondente selecionada a partir do grupo consistindo em miR-1, miR-10b, mIiR-17-3p, mMiR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, miR-93, miR-106a, MIR-106b, mIR-122, miR-133, miR-134, mIR-138, miR-155, mMIR-192, miR- 194, miR-221, miR-222, miR-375.

Por isso, em uma modalidade, o miRNA (isto é, miRNA-alvo) é selecionado a partir do grupo consistindo em miR-1, miR-10b, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, mIR-93, miR-106a, MIiR-106b, mIiR-122, miR-133, mIiR-134, miR-138, miR-155, MIR-192, miR- 194,miR-221, miR-222 e miR-375.

Em uma modalidade, o miRNA-alvo é membro do grupo miR 17 a 92, tal como miR 17, miR 106a, miR 106b, miR 18, miR 19a, miR 19b/1, miR 19b/2, miR20/93, miR92/1, miR92/2 e miR25.

Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma região correspondente à sequência de microRNA (MIRNA) selecionada a partir do grupo consistindo em miR-21, miR-155, MIR-221, mir-222 e mir-122.

f 22/198 Em algumas modalidades, o dito miRNA é selecionado a partir do grupo consistindo em miR-1, miR-10miR-29, miR-125b, miR-126, miR- 133, mIiR-141, miR-143, miR-200b, miR-206, miR-208, miR-302, miR-372, MIR-373, miR-375 e miR-520c/e.

Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma região correspondente de uma sequência de microR- NA (miRNA) presente no grupo miR 17 a 92, tal como microRNA seleciona- do a partir do grupo consistindo em miR-17-5p, miR-20a/b, miR-93, miR- 106a/b, miR-18a/b, miR-19a/b, miR-25, miR-92a, miR-363. Em uma modalidade, o miRNA (isto é, miRNA-alvo) é miR-21, tal como hsa-miR-21. Em uma modalidade, o miRNA (isto é, miRNA-alvo) é ] MIR-122, tal como hsa-miR-122. Em uma modalidade, o mIiRNA (isto é, ; MIRNA alvo) é miR-19b, tal como hsa-miR-19b.

Em uma modalidade, o MIRNA (isto é, mMiRNA-alvo) é miR-155, tal como hsa-miR-155. Em uma mo- dalidade, o MIRNA (isto é, MIRNA-alvo) é miR-375, tal como hsa-miR-375. Em uma modalidade, o miRNA (isto é, miRNA-alvo) é miR-375, tal como hsa-miR-106b.

Apropriadamente, a sequência nucleotídica contígua pode ser complementar a uma região correspondente de microRNA, tal como um hsa- —miR selecionado a partir do grupo consistindo em 19b, 21, 122, 155 e 375. A Região de Semente e Sementâmeros Os inventores encontraram que oligonucleotídeos curtos de fita simples cuidadosamente desenhados compreendendo ou consistindo em análogos nucleotídicos, tais como análogos nucleotídicos de alta afinidade, tais como unidades de ácido nucleico fechado (LNA), mostram silenciamento significante de microRNAs, resultando em níveis de microRNA reduzidos.

Foi encontrado que ligação estreita dos ditos oligonucleotídeos na chamada sequência de semente, tipicamente nucleotídeos de 2 a 8 ou 2 a 7, contando da extremidade 5', dos microRNAs-alvo foi importante.

O nucleotídeo 1 dos —microRNAs-alvo é uma base não pareada e é mais provavelmente escondi- do em uma bolsa de ligação na proteína Ago 2. Apesar de não desejar estar ligados a uma teoria específica, os presentes inventores consideram que i 23/198 pela seleção das sequências de região de semente, particularmente com oligonucleotídeos que compreendem LNA, preferencialmente as unidades de LNA na região que é complementar à região de semente, o dúplex entre MIRNA e oligonucleotídeo é particularmente eficaz no direcionamento de —miRNAs, evitando efeitos-alvo, e possivelmente fornecimento de uma carac- terística adicional que impede função de RISC dirigido a miRNA.

Os inventores encontraram que silenciamento de microRNA é ainda mais aumentado quando oligonucleotídeos de fita simples LNA modifi- cado não contêm um nucleotídeo na extremidade 3' correspondente a este —nucleotídeo 1 não pareado. Foi encontrado ainda que pelo menos duas uni- dades de LNA na extremidade 3' dos oligonucleotídeos de acordo com a ' presente invenção tornaram os ditos oligonucleotídeos altamente resistentes , à nuclease. Em uma modalidade, primeiro ou segundo nucleotídeo 3' do oli- gômero equivale a segundo nucleotídeo 5' da sequência de microRNA, e pode ser um análogo nucleotídico, tal como LNA.

Em uma modalidade, as unidades nucleotídicas 1 a 6 (inclusive) do oligômero como medido a partir da extremidade 3' da região do oligômero são complementares à sequência de região de semente de microRNA, e podem ser todos análogos nucleotídicos, tais como LNA.

Em uma modalidade, as unidades nucleotídicas 1 a 7 (inclusive) do oligômero como medido a partir da extremidade 3' da região do oligômero são complementares à sequência de região de semente de microRNA, e podem ser todos análogos nucleotídicos, tais como LNA.

Em uma modalidade, as unidades nucleotídicas 2 a 7 (inclusive) do oligômero como medido a partir da extremidade 3' da região do oligêômero são complementares à sequência de região de semente de microRNA, e podem ser todos análogos nucleotídicos, tais como LNA.

Em uma modalidade, o oligômero compreende pelo menos uma unidade de análogo nucleotídico, tal como pelo menos uma unidade de LNA, em uma posição que está dentro da região complementar à região de se- mente de miRNA. O oligômero pode, em uma modalidade, compreender en-

í 24/198 tre 1 e 6 ou entre 1 e 7 unidades de análogo nucleotídico, tal como entre 1 e 6 e 1 e 7 unidades de LNA, em uma posição que está dentro da região com- plementar à região de semente de miRNA.

Em uma modalidade, a sequência nucleotídica contígua consiste emou compreende uma sequência que é complementar (tal como 100% complementar) à sequência de semente do dito microRNA.

Em uma modalidade, a sequência nucleotídica contígua consiste em ou compreende uma sequência selecionada de qualquer uma das se- quências de sementâmero listadas na tabela 1.

Em uma modalidade, o nucleotídeo 3' do sementâmero forma a maioria dos nucleotídeos 3' da sequência nucleotídica contígua, em que a ] sequência nucleotídica contígua pode compreender, opcionalmente, um ou E: dois nucleotídeos adicionais 5' à sequência de sementâmero. Em uma modalidade, o oligômero não compreende um nucleotí- deo que corresponde ao primeiro nucleotídeo presente na sequência de mi- CroRNA contada a partir da extremidade 5".

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo de acordo com a inven- ção não compreende um nucleotídeo na extremidade 3' que corresponde ao primeiro nucleotídeo da extremidade 5' de microRNA-alvo.

Análogos nucleotídicos De acordo com a presente invenção, foi encontrado que é parti- cularmente vantajoso ter oligonucleotídeos curtos de 7, 8, 9, 10 nucleoti- deos, tal como 7, 8 ou 9 nucleotídeos, em que pelo menos 50%, tal como 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou, tal como 100% das unidades nucleotídicas do oligômero são (preferencialmente de alta afinida- de) análogos nucleotídicos, tais como uma unidade de nucleotídeo de Ácido Nucleico Fechado (LNA). Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção tem 7, 8 ou 9 nucleotídeos de tamanho, e compreende uma sequência nucleotídica contígua que é complementar a uma região de semente de microRNA hu- mano ou viral, e em que pelo menos 75%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos

" 25/198 95%, tal como 100% dos nucleotídeos são unidades nucleotídicas de Ácido Nucleico Fechado (LNA). Em tais oligômeros, em algumas modalidades, os grupos de li- gação são além de ligações fosfodiéster, tais que são ligações de fosforotio- ato.

Em uma modalidade, todas as unidades nucleotídicas da se- quência nucleotídica contígua são unidades nucleotídicas LNA.

Em uma modalidade, a sequência nucleotídica contígua com- preende ou consiste em 7, 8, 9 ou 10 unidades nucleotídicas preferencial- mente contíguas de LNA.

Em uma modalidade adicional preferencial, o oligonucleotídeo i da invenção tem 7, 8 ou 9 nucleotídeos de tamanho, e compreende uma se- - quência nucleotídica contígua que é complementar a uma região de semente de microRNA humano ou viral, e em que pelo menos 80% dos nucleotídeos sãoLNA,e em que pelo menos 80%, tal como 85%, tal como 90%, tal como 95%, tal como 100% das ligações internucleotídicas são ligações de fosforo- tioato.

Será reconhecido que a sequência nucleotídica contígua do oligômero (um sementâmero) pode estender-se além da região de semente.

Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção tem 7 nucleotídeos de tamanho, que são todos LNA.

Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção tem 8 nucleotídeos de tamanho, dos quais até 1 nucleotídeo pode ser exceto LNA.

Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção tem 9 nucleotí- deos de tamanho, dos quais até 1 ou 2 nucleotídeos podem ser exceto LNA.

Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção tem 10 nucleotí- deos de tamanho, dos quais 1, 2 ou 3 nucleotídeos podem ser exceto LNA.

Os nucleotídeos exceto LNA podem ser, por exemplo, DNA, ou análogos nucleotídicos 2' substituídos.

Análogos nucleotídicos de alta afinidade são análogos nucleotí- —dicos que resultam em oligonucleotídeos que têm uma estabilidade térmica de dúplex mais alta com um nucleotídeo de RNA complementar do que a afinidade de ligação de um nucleotídeo de DNA equivalente.

Isto pode ser f 26/198 determinado pela medida da Tr.

Em algumas modalidades, as unidades de análogo nucleotídico presentes na sequência nucleotídica contígua são selecionadas, opcional- mente independentemente, do grupo consistindo em unidades 2'-O-alquil- RNA, unidade 2-OMe-RNA, unidade 2'-amino-DNA, unidade 2'-fluoro-DNA, unidade de LNA, unidade de PNA, unidade de HNA, unidade de INA e uma unidade 2'MOE de RNA.

Em algumas modalidades, as unidades de análogo nucleotídico presentes na sequência nucleotídica contígua são selecionadas, opcional- mente independentemente, a partir do grupo consistindo em 2'-O-alquil- RNA, unidade 2'-OMe-RNA, unidade 2'-amino-DNA, unidade 2'-fluoro-DNA, unidade de LNA e uma unidade 2'MOE de RNA. Pp O termo 2'fluoro-DNA refere-se a um análogo de DNA com uma substituição para flúor na posição 2' (2'F). 2'fluoro-DNA é uma forma prefe- rencial do 2'fluoro-nucleotídeo.

Em algumas modalidades, o oligômero compreende pelo menos 4 unidades de análogo nucleotídico, tal como pelo menos 5 unidades de análogo nucleotídico, tal como pelo menos 6 unidades de análogo nucleotí- dico, tal como pelo menos 7 unidades de análogo nucleotídico, tal como pelo menos 8 unidades de análogo nucleotídico, tal! como pelo menos 9 unidades de análogo nucleotídico, tal como 10 unidades de análogo nucleotídico.

Em uma modalidade, o oligômero compreende pelo menos 3 u- nidades de LNA, tal como pelo menos 4 unidades de LNA, tal como pelo menos 5 unidades de LNA, tal como pelo menos 6 unidades de LNA, tal co- mo pelomenos 7 unidades de LNA, tal como pelo menos 8 unidades de LNA, tal como pelo menos 9 unidades de LNA, tal como 10 de LNA.

Em uma modalidade em que pelo menos um dos análogos nu- cleotídicos, tal como unidades de LNA, é citosina ou guanina, tal como entre 1 a 10 dos análogos nucleotídicos, tal como unidades de LNA, são citosina ou guanina,talcomo2,3,4,5,6,7,8,ou9dos análogos nucleotídicos, tal como unidades de LNA, são citosina ou guanina.

Em uma modalidade pelo menos dois dos análogos nucleotídi-

' 27/198 cos, tal como unidades de LNA são citosina ou guanina. Em uma modalida- de pelo menos três dos análogos nucleotídicos, tal como unidades de LNA são citosina ou guanina. Em uma modalidade pelo menos quatro dos análo- gos nucleotídicos, tal como unidades de LNA são citosina ou guanina. Em uma modalidade pelo menos cinco dos análogos nucleotídicos, tal como u- nidades de LNA são citosina ou guanina. Em uma modalidade pelo menos seis dos análogos nucleotídicos, tal como unidades de LNA são citosina ou guanina. Em uma modalidade pelo menos sete dos análogos nucleotídicos, tal como unidades de LNA são citosina ou guanina. Em uma modalidade pelomenos oito dos análogos nucleotídicos, tal como unidades de LNA são citosina ou guanina. ] Em uma modalidade preferencial, os análogos nucieotídicos têm . uma estabilidade térmica de dúplex mais alta de um nucleotídeo de RNA complementar do que a afinidade de ligação de um nucleotídeo de DNA e- quivalente ao dito nucleotíideo de RNA complementar.

Em uma modalidade, os análogos nucleotídicos conferem esta- bilidade sérica aumentada ao oligonucleotídeo de fita simples.

Enquanto as SEQ IDs específicas na listagem de sequência e a tabela 1 referem-se a oligômeros de monômeros de LNA com esqueleto fos- forotiocato (PS), será reconhecido que a invenção também engloba o uso de outros análogos e/ou ligações nucleotídicas, como uma alternativa para ou em combinação com LNA. Como tal, a sequência de nucleotídeos (bases) mostradas nas listagens de sequência pode ser de LNA, tal como LNA/PS, LNA ou pode ser de oligôêômeros contendo química de esqueleto alternativa, tal como química açúcar/ligação, conservando a mesma sequência de bases (A, T, Cou G).

Enquanto se contempla que outros análogos nucleotídicos, tais como nucleotídeos 2'-MOE de RNA ou 2'-fluoro, podem ser úteis nos oligô- meros de acordo com a invenção, é preferencial que oligômeros tenham uma alta proporção, tal como pelo menos 50%, de nucleotídeos de LNA. O análogo nucleotídico pode ser um análogo de DNA, tal como um análogo de DNA onde o grupo 2'-H é substituído com uma substituição além de -

f 28/198 OH(RNA) por exemplo pela substituição com -CH3, -O-CH2-CH2-0-CHs3, -O- CH2-CH27-CH2-NH72, -O-CH2-CH2-CH2-OH ou -F. O análogo nucleotídico pode ser análogo de RNA, tal como um análogo de RNA que foi modificado em seu grupo 2'-OH, por exemplo pela substituição com um grupo além de -H (DNA), por exemplo -O-CH3, -O-CH27-CH2-O0-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH>, -O- CH7-CH7-CH7-OH ou -F. Em uma modalidade, o análogo nucleotídico é "E- NA".

LNA Quando usados no presente contexto, os termos "unidade de LNA", "monômero de LNA", "resíduo de LNA", "unidade de ácido nucleico fechado", "monômero de ácido nucleico fechado" ou "resíduo de ácido nucle- S ico fechado", referem-se a um análogo nucleosídico bicíclico. Unidades de R LNA são descritas inter alia em WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475 e WO 03/095467. A unidade deLNA também pode ser definida com respeito à sua fórmula química. Des- sa forma, uma "unidade de LNA", como usado neste pedido, tem a estrutura química no Esquema 1 abaixo: Esquema 1

B = EX B Y — 1º Á XX ou SEA 1B em que X é selecionado a partir do grupo consistindo em O, S e NR", onde R" é H ou Ci4-alquila; Y é (-CH>),, onde r é um número inteiro de 1 a 4; e B é uma base nitrogenada. Em uma modalidade preferencial da invenção, r é 1 ou 2, em particular 1, isto é, uma unidade de LNA preferencial tem a estrutura química —noEsquema 2 abaixo: Esquema 2 O— 2º Á XX ou LES 2B

. 29/198 em que X e B são como definidos acima.

Em uma modalidade interessante, as unidades de LNA incorpo- radas nos oligonucleotídeos da invenção são independentemente seleciona- das a partir do grupo consistindo em unidades tio-LNA, unidades amino-LNA eunidades oxi-LNA.

Dessa forma, a unidade tio-LNA pode ter a estrutura química no Esquema 3 abaixo: Esquema 3 O— 3A —s ou RE em que B é como definido acima. - Ao Preferencialmente, a unidade tio-LNA está em sua forma beta-D, isto é, tem a estrutura em 3A acima.

Do mesmo modo, a unidade amino-LNA pode ter a estrutura química no Esquema 4 abaixo: Esquema 4

B H

EE RES 4a Á NR o, 4B em que B e R" são como definidos acima.

Preferencialmente, a unidade amino-LNA está em sua forma be- ta-D, isto é, tem a estrutura em 4A acima.

A unidade oxi-LNA pode ter a estrutura química no Esquema 5 abaixo: Esquema 5 o P o B E7 E 55 Á O ou 5B em que B é como definido acima.

Preferencialmente, a unidade oxi-LNA está em sua forma beta- D, isto é, tem a estrutura em 5A acima. Como indicado acima, B é uma base

[ 30/198 nitrogenada que pode ser de origem natural ou não natural. Exemplos espe- cíficos de bases nitrogenadas incluem adenina (A), citosina (C), 5- metilcitosina (ºC), isocitosina, pseudoisocitosina, guanina (G), timina (T), uracila — (U), S-bromouracila, S-propiniluracila, 5-propinil-6, 5- metiltiazoleuracila, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, 2,6- diaminopurina, 7-propino-7-deaza-adenina, 7-propino-7-deazaguanina e 2- cloro-B6-aminopurina. O termo "unidade tio-LNA" refere-se a uma unidade de LNA na qual X no Esquema 1 é S. Uma unidade tio-LNA pode estar tanto na forma beta-D como na forma alfa-L. Geralmente, a forma beta-D da unidade tio- LNA é preferencial. A forma beta-D e a forma alfa-L de uma unidade tio-LNA são mostradas no Esquema 3 como os compostos 3A e 3B, respectivamen- ' te. O termo "unidade amino-LNA" refere-se a uma unidade de LNA naqualXno Esquema 1 é NH ou NR", onde R" é hidrogênio ou C1,4-alquila. Uma unidade amino-LNA pode estar tanto na forma de beta-D como na for- ma de alfa-L. Geralmente, a forma beta-D da unidade amino-LNA é prefe- rencial. A forma beta-D e a forma alfa-L de uma unidade amino-LNA são mostradas no Esquema 4 como os compostos 4A e 4B, respectivamente.

O termo "unidade oxi-LNA" refere-se a uma unidade de LNA na qual X no Esquema 1 é O. Uma unidade oxi-LNA pode estar tanto na forma beta-D como na forma alfa-L. Geralmente, a forma beta-D da unidade oxi- LNA é preferencial. A forma beta-D e a forma alfa-L de uma unidade oxi-LNA são mostradas no Esquema 5 como os compostos 5A e 5B, respectivamen- te No presente contexto, o termo "C,.5-alquila" é destinado a signi- ficar uma cadeia de hidrocarboneto saturada linear ou ramificada em que as cadeias mais longas têm de um a seis átomos de carbono, tal como metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, pentila, isopentila, neopentila e hexila. Uma cadeia de hidrocarboneto ramificada é destinada a significar uma C,«-alquila substituída em qualquer carbono com uma cadeia de hidrocarboneto.

É 31/198 No presente contexto, o termo "C,,-alquila" é destinado a signi- ficar uma cadeia de hidrocarboneto saturada linear ou ramificada em que as cadeias mais longas têm de um a quatro átomos de carbono, tal como meti- la, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila e terc-butila. Uma cadeiade hidrocarboneto ramíficada é destinada a significar uma C,,-alquila substituída em qualquer carbono com uma cadeia de hidrocarboneto.

Quando usado neste pedido o termo "C,.5-alcóxi" é destinado a significar C1.5-alquilóxi, tal como metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi, n- butóxi, isobutóxi, sec-butóxi, terc-butóxi, pentóxi, isopentóxi, neopentóxi e hexóxi No presente contexto, o termo "C7.5-alquenila" é destinado a sig- [| nificar um grupo de hidrocarboneto linear ou ramificado tendo de dois a seis - átomos de carbono e contendo uma ou mais ligações duplas. Exemplos ilus- trativos de grupos C>.-alquenila incluem alila, homo-alila, vinita, crotila, bu- tenila, butadienila, pentenila, pentadienila, hexenila e hexadienila. A posição da insaturação (ligação dupla) pode estar em qualquer posição ao longo da cadeia de carbono.

No presente contexto o termo "C,.e-alquinila" é destinado a signi- ficar grupos de hidrocarboneto lineares ou ramíificados contendo de dois a seis átomos de carbono e contendo uma ou mais ligações triplas. Exemplos ilustrativos de grupos C>.5-alquinila incluem acetileno, propinila, butinila, pen- tinila e hexinila. A posição da insaturação (ligação tripla) pode estar em qualquer posição ao longo da cadeia de carbono. Mais de uma ligação pode ser insaturada tal que "C>.s-alquinila" seja um di-ino ou enedi-ino como é co- —nhecido pelo versado na técnica.

Referindo-se à substituição de uma unidade de DNA pela sua unidade de LNA correspondente no contexto da presente invenção, o termo "unidade de LNA correspondente" é destinado a significar que a unidade de DNA foi substituída por uma unidade de LNA contendo a mesma base nitro- genada que a unidade de DNA que foi substituída, por exemplo, a unidade de LNA correspondente de uma unidade de DNA contendo a base nitroge- nada também contém a base nitrogenada A. A exceção é que quando uma í 32/198 unidade de DNA contém a base C, a unidade de LNA correspondente pode conter a base C ou a base “ºC, preferencialmente “ºC.

Neste pedido, o termo "unidade não LNA" refere-se a um nucle- osídeo diferente de uma unidade de LNA, isto é, o termo "unidade não LNA" inclui uma unidade de DNA bem como uma unidade de RNA.

Uma unidade não LNA preferencial é uma unidade de DNA.

Os termos "unidade", "resíduo" e "monômero" são usados inter- cambiavelmente neste pedido.

O termo "pelo menos um" engloba um número inteiro maior que ouiguala1,talcomo 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 e similares.

Os termos "um" e "uma" como usados sobre um nucleotídeo, & agente, unidade de LNA, etc., são destinados a significar um ou mais.

Espe- cialmente, a expressão "um componente (tal como um nucleotídeo, um a- gente, uma unidade de LNA ou similares) selecionado a partir do grupo con- sistindo em..." é destinada a significar que um ou mais dos componentes citados podem ser selecionados.

Dessa forma, expressões como "um com- ponente selecionado a partir do grupo consistindo em A, B e C" são destina- das a incluir todas as combinações de A, Be C, isto é, A, B, C, A+B, A+C, B+CeA+BtC.

Ligações Internucleosídicas O termo "grupo de ligação internucleosídica" é destinado a signi- ficar um grupo capaz de ligar-se covalentemente em dois nucleotídeos, tal como entre unidades de DNA, entre unidades de DNA e análogos nucleoti- dicos, entre duas unidades não LNA, entre uma unidade não LNA e uma unidade de LNA, e entre duas unidades de LNA, etc.

Exemplos incluem gru- pos fosfato, fosfodiéster e grupos fosforotioato.

Em algumas modalidades, pelo menos uma, tal como todas as ligações internucleosídicas no oligômero é fosfodiéster.

Entretanto para o usoinvivo,as ligações de fosforotioato podem ser preferenciais.

Grupos típicos de ligação internucleosídica em oligonucleotídeos são grupos fosfato, mas estes podem ser substituídos por grupos de ligação

: 33/198 internucleosídica que se diferenciam de fosfato.

Em uma modalidade adicio- nal interessante da invenção, o oligonucleotídeo da invenção é modificado em sua estrutura de grupo de ligação internucleosídica, isto é, o oligonucleo- tídeo modificado compreende um grupo de ligação internucleosídica que se diferencia de fosfato.

Consequentemente, em uma modalidade preferencial, o oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção compreende pelo menos um grupo de ligação internucleosídica que se diferencia de fosfato.

Exemplos específicos de grupos de ligação internucleosídica que se diferenciam do fosfato (-O-P(0)2-0-) incluem -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(0)2-O-, - S-P(0,S)-O-, -S-P(S)-O-, -O-P(O0);-S-, -O-P(O,S)-S, -S-P(0);S-, -O- Ú PO(RP)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NR")-O-, -O- PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O- N PO(BH3)-O-, -O-PO(NHR")-O-,-O-P(O)2-NR"-, -NRÍ-P(0)2-O-, -NRÍI-CO-O-, -NRÍ-CO-NRH-/,-0-CO-O-, -O-CO-NR"-, -NRÍ-CO-CHz-, -O-CH3-CO-NR'L, - O-CHCH-NRI-, -CO-NR-CH2-, -CH-NRP-CO-,-0-CH2-CH2-S-, -S-CHz- CH7-O-, -S-CH7-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH3-CO-NRH-, -O-CH2-CH>-NR""- CO-, CH-NCH3-0-CH>2-, onde RP é hidrogênio ou C1,4-alquila.

Quando o grupo de ligação internucleosídica é modificado, o grupo de ligação internucleosídica é preferencialmente um grupo fosforotioa- to(-O-P(O,S)O-) Em uma modalidade preferencial, todos os grupos de ligação internucleosídica dos oligonucleotídeos de acordo com a presente invenção são fosforotioato.

A ligação internucleosídica pode ser a forma selecionada do grupo consistindo em: O-P(0)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(0)2-O-, - S-P(O0,S)O-, -S-P(S)-O-, -O-P(0)S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(0)-S-, -O- PO(R")-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH.CH2S-R)-O-, -O- PO(BH3)-O-, -O-PO(NHR*)-O-, -O-P(O)-NR"-, -NRÍ-P(0)2-0-, -NRE-CO-O-, -NR"-CO-NR""- e/ou ligação internucleosídica pode ser forma selecionada do grupo consistindo em: -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRE-CO-CH7-, -O-CH3-CO- —NRI, -O-CH3-CHa-NR'-, -CO-NRYI-CH2-, -CH-NRÍ-CO-, -O-CH2-CH72-S-, - S-CH7-CH7-O0-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH-CO-NRY-, -O-CH2- CH-NR"-CO-, -CHa-NCH3-0-CH7-, onde R" é selecionado a partir do hidro-

gênio e Ci,4-alquila.

Apropriadamente, em algumas modalidades, ligações internucleosídicas contendo enxofre (S) como fornecido acima podem ser preferenciais.

As ligações internucleosídicas podem ser independentemente selecionadas, ou todas serem as mesmas, tal como ligações fosforotioato.

Em uma modalidade, pelo menos 75%, tal como 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou todas as ligações internucleosídicas presentes entre as unidades nucleotídicas da sequência nucleotídica contígua são ligações internucleosí- dicas de fosforotioato.

Oligonucleotídeos micromir visando mais de um microRNA Em uma modalidade, a sequência nucleotídica contígua é com- plementar à sequência correspondente de pelo menos duas sequências Ú MiRNA tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 sequências de miRNA.

O uso de " uma base universal única pode permitir a um oligômero único da invenção visar dois microRNAs independentes os quais um ou ambos têm uma má combinação única na região que corresponde ao oligômero na posição onde o nucleotídeo universal é posicionado.

Em uma modalidade, a sequência nucleotídica contígua consiste em ou compreende uma sequência que é complementar à sequência de pe- lo menos duas sequências da região de semente de miRNA tal como 2, 3,4, 5,6,7,8,90u10 sequências da região de semente de miRNA.

Em uma modalidade, a sequência nucleotídica contígua é com- plementar à região correspondente tanto de miR-221 como de miR-222. Em uma modalidade, a sequência nucleotídica contígua é com- plementar à região correspondente de mais de um membro do grupo miR- 17-92-tal como dois ou mais ou todos de miR-17-5p, miR-20a/b, miR-93, mMiR-106a/b; ou dois ou mais ou todos de miR-25, miR-92a e miR-363. Em uma modalidade, a sequência nucleotídica contígua consiste em ou compreende uma sequência que é complementar a "GCTACAT3'. Desenho de Oligômero Em uma modalidade, o primeiro nucleotídeo do oligôêômero de acordo com a invenção, contando a partir da extremidade 3', é um análogo nucleotídico, tal como uma unidade de LNA.

Em uma modalidade, que pode ser a mesma ou diferente, o último nucleotídeo do oligômero de acordo com a invenção, contando a partir da extremidade 3', é um análogo nucleotídico, tal como uma unidade de LNA.

Em uma modalidade, o segundo nucleotídeo do oligêmero de acordo coma invenção, contando a partir da extremidade 3', é um análogo nucleotídico, tal como uma unidade de LNA.

Em uma modalidade, o nono e/ou décimo nucleotídeo do oligô- mero de acordo com a invenção, contando a partir da extremidade 3', é um análogo nucleotídico, tal como uma unidade de LNA.

Em uma modalidade, o nono nucleotídeo do oligôêômero de acor- do com a invenção, contando a partir da extremidade 3' é um análogo nucle- otídico, tal como uma unidade de LNA. - Em uma modalidade, o décimo nucleotídeo do oligôêômero de a- cordo com a invenção, contando a partir da extremidade 3' é um análogo —nucleotídico, tal como uma unidade de LNA.

Em uma modalidade, tanto o nono como o décimo nucleotídeo do oligômero de acordo com a invenção, calculados a partir da extremidade 3' são um análogo nucleotídico, tal como uma unidade de LNA.

Em uma modalidade, o oligômero de acordo com a invenção não compreende uma região de mais de 3 unidades nucleotídicas de DNA con- secutivas. Em uma modalidade, o oligômero de acordo com a invenção não compreende uma região de mais de 2 unidades nucleotídicas de DNA con- secutivas.

Em uma modalidade, o oligôêômero compreende pelo menos uma região composta de pelo menos duas unidades de análogo nucleotídico con- secutivas, tal como pelo menos duas unidades de LNA consecutivas.

Em uma modalidade, o oligômero compreende pelo menos uma região composta de pelo menos três unidades de análogo nucleotídico con- secutivas, tal como pelo menos três unidades de LNA consecutivas.

Outros Padrões de Análogos nucleotídicos, tal como LNA no Oligômero Enquanto se enfrenta que os oligôêômeros contendo pelo menos 6

LNA, tal como pelo menos 7 unidades nucleotídicas podem ser preferenci- ais, a descoberta que tais oligômeros curtos são altamente eficazes no dire- cionamento de microRNAs in vivo pode ser usada para preparar oligêômeros mais curtos da invenção compreendendo outros análogos nucleotídicos, tais como análogos nucleotídicos de alta afinidade.

De fato, a combinação de LNA com outros análogos nucleotídicos de alta afinidade é considerada co- mo parte da presente invenção.

Modificação de nucleotídeos nas posições 1 a 2, contando a par- tir da extremidade 3'. O nucleotídeo nas posições 1 e/ou 2 pode ser um aná- logo nucleotídico, tal como um análogo nucleotídico de alta afinidade, tal como LNA, ou análogo nucleotídico selecionado a partir do grupo consistin- do em unidade de 2'-O-alquil-RNA, unidade de 2'-OMe-RNA, unidade de 2'- - amino-DNA, unidade de 2'-fluoro-DNA, unidade de 2-MOE-RNA, unidade de LNA, unidade de PNA, unidade de HNA, unidade de INA.

Os dois nucleotí- deos3',porisso, podem ser Xx, XxX, XX ou xx, em que: Em uma modalidade, Xé LNA e x é DNA ou outro análogo nucleotídico, tal como um análogo nucleotídico 2' substituído selecionado a partir do grupo consistindo em unidade de 2'-O- alquil-RNA, unidade de 2'-OMe-RNA, unidade de 2'-amino-DNA, unidade de —2'-fluoro-DNA, LNA, e uma unidade de 2' MOE de RNA.

A dita unidade de não LNA (x), por isso, pode ser 2MOE RNA ou 2"'-fluoro-DNA.

Alternativa- mente X é um análogo nucleotídico, e x é DNA.

A modificação acima nos 2 nucleotídeos da extremidade 3' pode ser combinada com a modificação de nucleotídeos nas posições 3 a 8 con- tando a partir da extremidade 3', como descrito abaixo.

Neste aspecto, os nucleotídeos indicados como X e x podem ser o mesmo em todas as partes do oligômero.

Será observado que quando o oligôêômero tem somente 7 nu- cleotídeos de tamanho o 8º nucleotídeo a partir da contagem da extremidade 3' deve ser descartado.

Nas seguintes modalidades que se referem à modifi- cação de nucleotídeos nas posições 3 a 8, contando a partir da extremidade 3', as unidades de LNA, em uma modalidade, podem ser substituídas com outro análogo nucleotídico, tal como os mencionados neste pedido. "X", por isso, pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em unidade de 2'-O- alquil-RNA, unidade de 2:-OMe-RNA, unidade de 2'-amino-DNA, unidade de 2'-fluoro-DNA, unidade de 2-MOE-RNA, unidade de LNA, unidade de PNA, unidade de HNA, unidade de INA. "x" é preferencialmente DNA ou RNA, a- indamais preferencialmente DNA.

Entretanto, é preferencial que X seja LNA.

Em uma modalidade da invenção, os oligonucleotídeos da in- venção são modificados nas posições 3 a 8, contando a partir da extremida- de 3'. O desenho desta sequência pode ser definido pelo número presente de unidades de não LNA ou pelo número presente de unidades de LNA.

Em uma modalidade preferencial do primeiro, pelo menos um, tal como um dos nucleotídeos nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3', é Ú uma unidade de não LNA.

Em outra modalidade, pelo menos dois, tal como " dois, dos nucleotídeos nas posições três a oito, contando a partir da extre- midade 3', são unidades de não LNA.

Ainda em outra modalidade, pelo me- nostrês, tal como três, dos nucleotídeos nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3', são unidades de não LNA.

Ainda em outra modali- dade, pelo menos quatro, tal como quatro, dos nucleotídeos nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3', são unidades de não LNA.

Em uma modalidade adicional, pelo menos cinco, tal como cinco, dos nucle- otídeos nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3', são unidades de não LNA.

Ainda em uma modalidade adicional, os seis nucleo- tídeos nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3', são uni-

dades de não LNA.

Alternativamente definido, em uma modalidade, o oligonucleoti- —deo de acordo com a presente invenção compreende pelo menos três uni- dades de LNA nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3". Em uma modalidade da mesma, o oligonucleotídeo de acordo com a presen- te invenção compreende três unidades de LNA nas posições três a oito, con- tando a partir da extremidade 3'. O padrão de substituição dos nucleotídeos nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3', pode ser sele- cionado a partir do grupo consistindo em I0O000X, XXXXxXX, XXXXXx, XXXAXXA, XNIXIOX, XIOOXX, KICK, XXXXXKX, XXXXXA, XXAXAXA, KXXXXX,

AXXXXKA, IOOXXXK, XXXXXKA, XXXXXA, XXAXAXA, XAXAXX E XXÁXXX, EM que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de não LNA. Em uma modalidade preferencial, o padrão de substituição dos nucleotídeos nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3', é selecionado a partirdo grupo consistindo em XXXXxx, XXxXXXx, XXX00X, xXXXXx, xXXXxxX, AXAXXAX, XXKXXA, AXAXXKXX, IOOXXX, XAXAXXA, XXXXAX, XXXXAX, XXXXXX E XxXxXx, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de não LNA. Em uma modalidade mais preferencial, o padrão de substitui- ção dos nucleotídeos nas posições três a oito, contando a partir da extremi- dade3', é selecionado a partir do grupo consistindo em xX0000, xXX00X, DXAXXK, XKXKAXXA, XAXAXAXA, XXXXXX E XXXXXX, EM que "X" denota uma uni- É dade de LNA e "x" denota uma unidade de não LNA. Em uma modalidade, o p padrão de substituição dos nucleotídeos nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3', é xXxXxX ou XxXxXx, em que "X" denota uma uni- dadedeLNAe"x" denota uma unidade de não LNA. Em uma modalidade, o padrão de substituição dos nucleotídeos nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3', é xOXOXxX, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de não LNA. Em uma modalidade adicional, o oligonucleotídeo de acordo coma presente invenção compreende pelo menos quatro unidades de LNA nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3'. Em uma moda- lidade da mesma, o oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção compreende quatro unidades de LNA nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3'. O padrão de substituição dos nucleotídeos nas po- siçõestrêsa oito, contando a partir da extremidade 3', pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em XXXXXX, xXXXXX, xXXXxXX, xXXXxX, XAXAXXA, XAXXKXKXK, XAXAAXAX, KXKAXK, KXXAXXAX, XAIOOKXXK, XXXXXXK, KXXXXKXX, XXOOKXK, XXXxXx E XXXXxx, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de não LNA.

Ainda em uma modalidade adicional, o oligonucleotídeo de a- cordo com a presente invenção compreende pelo menos cinco unidades de LNA nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3'. Em uma modalidade da mesma, o oligonucleotídeo de acordo com a presente inven- ção compreende cinco unidades de LNA nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3'. O padrão de substituição dos nucleotídeos nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3', pode ser selecio- nado a partir do grupo consistindo em xXXXXX, XxXXXX, XXxXXX, KXXXAK, XXXXXX E XXXXXx, em que "X" denota uma unidade de LNA e "x" denota uma unidade de não LNA.

Preferencialmente, o oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção compreende uma ou duas unidades de LNA nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3'. Isto é considerado vantajoso para a estabilidade da A-hélice formada pelo dúplex oligo:microRNA, um dúplex ' similar ao dúplex RNA:RNA na estrutura. - Ainda em uma modalidade adicional, o oligonucleotídeo de a- cordo com a presente invenção compreende pelo menos seis unidades de LNA nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3'. Em uma modalidade da mesma, o oligonucleotídeo de acordo com a presente inven- ção compreende de três a seis unidades de LNA nas posições três a oito, contando a partir da extremidade 3', e ainda de nenhum a três outros análo- gos nucleotídicos de alta afinidade na mesma região, tal que a soma total de análogos nucleotídicos de alta afinidade (incluindo as unidades de LNA) so- be para seis na região de posições três a oito, contando a partir da extremi- dade 3'. Em algumas modalidades, tal como quando X é LNA, a dita uni- dade de não LNA (x) é outra unidade de análogo nucleotídico, tal como um — análogo nucleotídico 2' substituído selecionado a partir do grupo consistindo em unidade de 2'-O-alquil-RNA, unidade de 2-OMe-RNA, unidade de 2"- amino-DNA, unidade de 2'-fluoro-DNA, LNA, e uma unidade de 2MOE de RNA.

A dita unidadede não LNA (x), por isso, pode ser 2'MOE RNA ou 2"- fluoro-DNA.

Para oligômeros que têm 9 ou 10 nucleotídeos, o nucleotídeo nas posições 9 e/ou 10 pode ser um análogo nucleotídico, tal como um aná- logo nucleotídico de alta afinidade, tal como LNA, ou análogo nucleotídico selecionado a partir do grupo consistindo em unidade de 2'-O-alquil-RNA, unidade de 2-OMe-RNA, unidade de 2'-amino-DNA, unidade de 2'-fluoro- DNA, unidade de 2-MOE-RNA, unidade de LNA, unidade de PNA, unidade de HNA, unidade de INA. Os dois nucleotídeos 5', por isso, podem ser Xx, xX, XX ou xx, em que: em uma modalidade X é LNA e x é DNA ou outro análogo nucleotídico, tal como um análogo nucleotídico 2' substituído selecionado a partir do grupo consistindo em unidade de 2'-O0- alquil-RNA, unidade de 2:-OMe-RNA, unidade de 2'-amino-DNA, unidade de 2'-fluoro-DNA, LNA, e uma unidade de 2'MOE de RNA. A dita unidade de nãoLNA (x), por isso, pode ser 2'MOE RNA ou 2"'-fluoro-DNA. Alternativa- mente X é um análogo nucleotídico, e x é DNA. Ú A modificação acima nos 2 nucleotídeos 5' terminais pode ser - combinada com a modificação de nucleotídeos nas posições 3 a 8 contando a partir da extremidade 3' e/ou os 2 nucleotídeos 3' como descrito acima. Neste aspecto, os nucleotídeos indicados como X e x podem ser os mesmos em todas as partes do oligômero.

Em uma modalidade preferencial da invenção, o oligonucleoti- deo de acordo com a presente invenção contém uma unidade de LNA na extremidade 5'. Em outra modalidade preferencial, o oligonucleotídeo de a- cordo coma presente invenção contém uma unidade de LNA nas duas pri- meiras posições, contando a partir da extremidade 5".

Em uma modalidade, a invenção fornece ainda um oligômero como descrito no contexto da composição farmacêutica da invenção, ou pa- ra uso in vivo em um organismo, tal como um medicamento, em que o dito — oligômero (ou sequência nucleotídica contígua) compreende também i) pelo menos uma ligação fosforotioato e/ou ii) pelo menos uma unidade de LNA terminal 3', e/ou iii) pelo menos uma unidade de LNA terminal 5'.

O oligêmero, por isso, pode conter pelo menos uma ligação fos- foroticato, tal como todas as ligações que são fosforotioatos, e pelo menos uma unidade de LNA 3' terminal, e pelo menos uma unidade de LNA 5' ter- minal.

É preferencial para a maioria dos usos terapêuticos que o oligo- nucleotídeo seja totalmente fosforotiolado - uma exceção sendo para oligo- nucleotídeos terapêuticos para uso no SNC, tal como no cérebro ou coluna vertebral onde fosforotioação pode ser tóxica, e devido à ausência de nucle- ases, ligações fosfodiéster podem ser usadas, até entre unidades de DNA consecutivas.

Como mencionado neste pedido, em um outro aspecto do oligo- nucleotídeo de acordo com a invenção é que o segundo nucleotídeo 3' e/ou 9º e 10º (a partir da extremidade 3'), se presentes, também podem ser LNA.

Em uma modalidade, o oligômero compreende pelo menos cinco unidades de análogo nucleotídico, tal como pelo menos cinco unidades de Í LNA, nas posições que são complementares à região de semente de miRNA. E Em uma modalidade, a sequência nucleotídica do oligêmero que é complementar à sequência da região de semente de microRNA, é selecio- nada a partir do grupo consistindo em (X) xXXXXX, (X) XXXXXX, (X) KXAXXK, (K) XXXXXK, (À) XXXXxX E (XK) XXXXXx, em que "X" denota um análogo nucleotídico, tal como uma unidade de LNA, (X) denota um análogo nucleotídico opcional, tal como uma unidade de LNA, e "x" denota unidade nucleotídica de DNA ou RNA.

Em uma modalidade, o oligômero compreende seis ou sete uni- dades de análogo nucleotídico, tal como seis ou sete unidades de LNA, nas posições que são complementares à região de semente do miRNA.

Em uma modalidade, a sequência nucleotídica do oligêômero que é complementar à sequência da região de semente do microRNA, é selecio- nadaa partir do grupo consistindo em XXXXXX, XXXXXXX, XXxXXXXX, AXXXAXX, XXXXXAX, XXXXXXX E XXXXXXXx, EM que "X" denota um análo- go nucleotídico, tal como uma unidade de LNA, tal como uma unidade de LNA, e "x" denota unidade nucleotídica de DNA ou RNA.

Em uma modalidade, o motivo de dois nucleotídeos na posição 7 a8,contando a partir da extremidade 3' do oligômero é selecionado a partir do grupo consistindo em xx, XX, xX e Xx, em que "X" denota um análogo nucleotídico, tal como uma unidade de LNA, tal como uma unidade de LNA,

e "x" denota DNA ou unidade nucleotídica de RNA.

Em uma modalidade, o motivo de dois nucleotídeos na posição 7 a 8, contando a partir da extremidade 3' do oligômero é selecionado a partir do grupo consistindo em XX, xX e Xx, em que "X" denota um análogo nucle- otídico, tal como uma unidade de LNA, tal como uma unidade de LNA, e "x" denota DNA ou unidade nucleotídica de RNA.

Em uma modalidade, o oligômero compreende 12 nucleotídeos e em que o motivo de dois nucleotídeos na posição 11 a 12, contando a par- tir da extremidade 3' do oligômero é selecionado a partir do grupo consistin- doemxx, XX, xXeXx, em que "X" denota um análogo nucleotídico, tal co- mo uma unidade de LNA, tal como uma unidade de LNA, e "x" denota DNA ou unidade nucleotídica de RNA. - Em uma modalidade, o oligômero compreende 12 nucleotídeos e em que o motivo de dois nucleotídeos na posição 11 a 12, contando a par- tirda extremidade 3' do oligômero é selecionado a partir do grupo consistin- do em XX, xX e Xx, em que "X" denota um análogo nucleotídico, tal como uma unidade de LNA, tal como uma unidade de LNA, e "x" denota DNA ou unidade nucleotídica de RNA, tal como uma unidade de DNA. Em uma modalidade, o oligômero compreende uma unidade de análogo nucleotídico, tal como uma unidade de LNA, na extremidade 5".

Em uma modalidade, as unidades de análogo nucleotídico, tal como X, são independentemente formas selecionadas a partir do grupo con- sistindo em: unidade de 2'-O-alquil-RNA, unidade de 2-OMe-RNA, unidade de 2'-amino-DNA, unidade de 2'-fluoro-DNA, unidade de 2-MOE-RNA, uni- — dadedeLNA, unidade de PNA, unidade de HNA, unidade de INA.

Em uma modalidade, todos os nucleotídeos do oligômero da in- venção são unidades de análogo nucleotídico.

Em uma modalidade, as unidades de análogo nucleotídico, tal como X, são independentemente formas selecionadas a partir do grupo con- sistindo em: unidades de 2-OMe-RNA, unidades de 2'-fluoro-DNA, e unida- des de LNA.

Em uma modalidade, o dito oligômero compreende pelo menos uma unidade análoga de LNA e pelo menos uma unidade adicional de aná- logo nucleotídico exceto LNA. Em uma modalidade, a unidade ou unidades de análogo nucleo- tídico não LNA são independentemente selecionadas a partir de unidades de 2-OMeRNA e unidades de 2'-fluoro DNA. Em uma modalidade, o oligêômero consiste em pelo menos uma sequência XYX ou YXY, em que X é LNA e Y é uma unidade 2-OMe RNA e a unidade de 2'-fluoro DNA. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos do oligêômero consiste de unidades alternadas Xe Y.

Em uma modalidade, o oligômero compreende unidades alter- i nadas de LNA e de DNA (Xx) ou (XxX). Em uma modalidade, o oligêômero e compreende um motivo alternado de LNA seguido por 2 unidades de DNA (POX), xXx ou xxX.

Em uma modalidade, pelo menos uma das unidades de análogo nucleotídico de DNA ou não LNA é substituída com um nucleotídeo LNA em uma posição selecionada a partir das posições identificadas como unidades nucleotídicas de LNA em qualquer uma das modalidades mencionadas aci- ma. Em uma modalidade, "X" doa uma unidade de LNA.

Desenhos Adicionais para Oligômeros da invenção A tabela 1 abaixo fornece exemplos não restritivos de sequên- cias de microRNA curto que podem ser vantajosamente visadas com um oligonucleotídeo da presente invenção.

Os oligonucleotídeos de acordo com a invenção, tais como a- —queles revelados na tabela 1, em uma modalidade, podem ter uma sequên- cia de 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos LNA 5'-3' LLLLLLL(L(L)(LX(L), ou ter uma sequência de nucleotídeos da forma selecionada a partir do grupo consistin- do nos primeiros 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos dos seguintes motivos: LaLddL(L)(d)(A)(L)(A)(LIANLXL), LdL- — dLL(L)(A)AN(LIL)LNANLIL), LMLMML(L)(M)(M)(L)(MXL)(MXL(L), LML- MLL(L)(M)(M)(L)(L(L)(ML(L), LFLFFLILI(F(F(L(F)(L(F(LL), LFL- FLL(L(F(F(L(LDIL(F(LIL), e cada terceiro desenho tal como; Ld-

dLdd(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)'dLddLd(d)(L)(d)(d)(L)(Ad)(A)(L)(A)(A)(L), ddLddL(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)L)(d)(d), LM- MLMM(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M), MLM- MLM(MX(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L), MMLM-

MLIM)(M)(L(M(M)L)(M)(M)(L)(M)M), LF- FLFF(LIF(F(L(F(P(L(F(F(LF), FLF- FLF(F(LIF(F(LDIF(FL(F(PL), FFLFFLIF(F(L(F(FL(IF(FL(PP), e dLdLdL(d)(L)(d)(L)(dX(L)(d)(L)(d)(L)(d)e cada segundo desenho, tal como; LdLdLd (L)(d)(L)(d)(L)(Ad)(L)(AN(L)(AN(L), MLML-

ML(IMI(L(M(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M), LML- MLM(L)(M)(L)(MYX(L)(M)(L(M)(L(M)(L), FLFL- FLIFIL(FILIF(L(F(LF(LOE), e LELFLFL(FL(F(LF(LFLFL; - em que L = unidade de LNA, d = unidades de DNA, M = 2'MOE RNA, F = 2'Fluoro e resíduos entre parênteses são opcionais.

Composição Farmacêutica e Aplicação Médica A invenção fornece uma composição farmacêutica compreen- dendo o oligômero de acordo com a invenção, e um diluente, veículo, sal ou adjuvante farmaceuticamente aceitáveis.

A invenção fornece ainda o uso de um oligonucleotídeo de acor- docoma invenção, tal como aqueles que podem ser parte da composição farmacêutica, para a produção de um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio médico associado com a presença ou superexpressão (regulação para cima) de microRNA.

A invenção fornece ainda um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio médico associado com a presença ou superexpressão de microRNA, compreendendo a etapa de administração de uma composi- ção (tal como a composição farmacêutica) de acordo com a invenção a uma pessoa em necessidade de tratamento.

A invenção fornece ainda um método para reduzir a quantidade eficaz de um miRNA em uma célula ou um organismo, compreendendo ad- ministração de uma composição (tal como a composição farmacêutica) de acordo com a invenção ou um oligêmero de acordo com a invenção à célula ou organismo. Reduzir a quantidade eficaz neste contexto refere-se à redu- ção do mIRNA funcional presente na célula ou organismo. É reconhecido que os oligonucleotídeos preferenciais de acordo com a invenção podem nem sempre reduzir significativamente a quantidade real de miRNA na célula ou organismo já que tipicamente formam dúplices muito estáveis com seus MIRNAs-alvo. A redução da quantidade eficaz do miRNA em uma célula, em uma modalidade, pode ser medida pela detecção do nível da desrepressão do miRNA-alvo na célula.

A invenção fornece ainda um método para desrepressão de um mMRNA-alvo de um mIRNA em uma célula ou organismo, compreendendo administração de uma composição (tal como a composição farmacêutica) ou i um oligôêmero de acordo com a invenção à célula ou organismo.

A invenção fornece ainda o uso de um oligêmero entre 7 e 10 tal como 7, 8, 9, ou 10 nucleotídeos de tamanho, para a produção de um medi- camento para o tratamento de uma doença ou distúrbio médico associado com a presença ou superexpressão de microRNA.

Em uma modalidade a condição médica (ou doença) é hepatite C (HCV), e o miRNA é miR-122.

Em uma modalidade, a composição farmacêutica de acordo com L “20 ainvenção é para uso no tratamento de um distúrbio médico ou doença se- ' O lecionada a partir do grupo consistindo em: infecção por vírus de hepatite C e hipercolesterolemia e distúrbios relacionados, e cânceres.

Em uma modalidade o distúrbio médico ou doença é uma doen- ça do SNC, tal como uma doença do SNC onde se sabe que um ou mais —microRNAs são indicados.

No contexto de hipercolesterolemia distúrbios relacionados refe- rem-se a doenças, tais como aterosclerose ou hiperlipidemia. Exemplos adi- cionais de doenças relacionadas também incluem diferentes tipos de dese- quilíbrio de colesterol! HDL/LDL; dislipidemias, por exemplo, hiperlipidemia — combinada familiar (FCHL), hiperlipidemia adquirida, hipercolesterolemia resistente à estatina; doença de artéria coronária (CAD), doença cardíaca coronária (CHD), aterosclerose.

Em uma modalidade, a composição farmacêutica de acordo com a invenção compreende ainda um segundo ingrediente ativo independente que é um inibidor da via de construção de VLDL, ta! como um inibidor de ApoB, ou inibidor de MTP (tal como aqueles revelados em US 60/977.497, pormeio deste incorporado por referência).

A invenção fornece ainda um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio médico associado com a presença ou superexpressão de microRNA, compreendendo a etapa de administração de uma composi- ção (tal como a composição farmacêutica) compreendendo um oligêômero entre7e10tal como 7, 8,9 ou 10 nucleotídeos de tamanho, a uma pessoa em necessidade de tratamento. i A invenção fornece ainda um método para redução da quantida- À de eficaz de um mIRNA-alvo (isto é, miRNA 'disponível') em uma célula ou organismo, compreendendo administração de uma composição (tal como a composição farmacêutica) compreendendo um oligêmero entre 7 e 10 tal como 7, 8, 9, ou 10 nucleotídeos de tamanho, à célula ou organismo.

Deve ser reconhecido que "redução da quantidade eficaz" de um ou mais microRNAs em uma célula ou organismo, refere-se à inibição da função do microRNA na célula ou organismo. A célula é preferencialmente N 20 célulade mamífero ou uma célula humana que expressa microRNA ou mi- k: croRNAs.

A invenção fornece ainda um método para desrepressão de um MRNA-alvo de um MIRNA em uma célula ou um organismo, compreendendo um oligômero de 7 a 10 tal como 7, 8, 9, ou 10 nucleotídeos de tamanho, ou (ou uma composição compreendendo o dito oligonucleotídeo) à célula ou organismo.

Como mencionado acima, microRNAs estão relacionados a di- versas doenças. Por isso, um quarto aspecto da invenção refere-se ao uso de um oligonucleotídeo como definido neste pedido para a produção de um —medicamento para o tratamento de uma doença associada com a expressão de microRNAs selecionados a partir do grupo consistindo em atrofia muscu- lar espinhal, síndrome de Tourette, hepatite C, retardo mental do X frágil,

síndrome de DiGeorge e câncer, tal como em exemplo não limitante, leuce- mia linfocítica crônica, câncer de mama, câncer de pulmão e câncer de có- lon, em particular câncer.

Métodos de Síntese A invenção fornece ainda um método para a síntese de um oli- gômero direcionado contra um microRNA humano, tal como um oligêmero descrito neste pedido, o dito método compreendendo as etapas de: a. opcionalmente selecionar um primeiro nucleotídeo, contando a partir da extremidade 3', o qual é um análogo nucleotídico, tal como um —nucleotídeo LNA. b. opcionalmente selecionar um segundo nucleotídeo, contando a partir da extremidade 3', o qual é um análogo nucleotídico, tal como um P nucleotídeo LNA. c. seleção de uma região do oligômero que corresponde à região desemente do miRNA, em que a dita região é como definida neste pedido. d. seleção de um sétimo e opcionalmente um oitavo nucleotí- deos definidos neste pedido. e. opcionalmente selecionar um ou dois terminais 5' adicionais do oligôêômero como é definido neste pedido; “20 em que a síntese é realizada pela síntese sequencial das regi- . ões definidas nas etapas a a e, em que a dita síntese pode ser realizada em qualquer direção 3'-5' (a a f) ou 5'-3' (e a a), e em que o dito oligômero é complementar a uma sequência do miRNA-alvo.

A invenção fornece ainda um método para a preparação de um —oligômero (tal como um oligôêmero de acordo com a invenção), o dito método compreendendo as etapas de a) comparação das sequências de duas ou mais sequências de miRNA para identificar duas ou mais sequências de MIRNA que compreendem uma sequência nucleotídica contígua comum de pelo menos 7 nucleotídeos de tamanho, tal como 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos detamanho (isto é, uma sequência encontrada em ambos miRNAs não idên- ticos), b) preparação de uma sequência de oligêômero que consiste em ou compreende uma sequência nucleotídica contígua é complementar à dita sequência nucleotídica contígua comum, em que o dito oligômero é, como de acordo com o oligômero da invenção. Em um exemplo preferencial, a se- quência nucleotídica contígua comum consiste em ou compreende a região de semente de cada uma de duas ou mais ditas sequências de miRNA (que compreende uma sequência nucleotídica contígua comum de pelo menos 6 nucleotídeos de tamanho). Em uma modalidade, as regiões de semente dos dois ou mais miRNAs são idênticas. Apropriadamente, o oligômero consiste em ou compreende uma sequência de sementâmero de 7 ou 8 nucleotídeos de tamanho que compreende um sequência que é complementar aos ditos doisoumaismiRNAs. Este método pode ser usado em conjunto com a eta- pa c do método acima. Í O método da síntese do oligômero de acordo com a invenção - pode ser realizado usando síntese oligonucleotídica em fase sólida padrão. Em uma modalidade, método para a síntese de um oligôêômero vi- sado contra um microRNA humano, é realizado na direção 3' a5'aae.

Um aspecto adicional da invenção é um método para reduzir os níveis de microRNA-alvo pelo contato de microRNA-alvo a um oligonucleoti- deo como definido neste pedido, em que o oligonucleotídeo (i) é complemen- tar à sequência de microRNA-alvo (ii) não contém um nucleotídeo na extre- “ 20 midade3' que equivale ao primeiro nucleotídeo da extremidade 5' de mi- : croRNA-alvo.

Estabilidade do dúplex e Tr, Em uma modalidade, o oligômero da invenção é capaz de for- mar um dúplex com uma molécula de ácido nucleico de RNA de fita simples complementar (tipicamente aproximadamente do mesmo tamanho do dito oligonucleotídeo de fita simples) com ligações internucleosídicas fosfodiés- ter, em que o dúplex tem uma Tr, entre 30ºC e 70ºC ou 80ºC, tal como entre 30ºC e 60ºC ou 70ºC, ou entre 30ºC e 50ºC ou 60ºC. Em uma modalidade, a Tm é pelo menos 40ºC. Tr, pode ser determinada pela determinação da Tm do oligômero e um RNA-alvo complementar nas seguintes condições de tampão: NaCl a 100 mM, EDTA a 0,1mM, Na-fosfato a 10 mM, pH 7,0 (ver exemplos para um protocolo detalhado). Um análogo de alta afinidade pode ser definido como um análogo que, quando usado no oligômero da invenção, resulta em um aumento na Tr, do oligômero quando comparado com um oli- gômero idêntico que contém somente bases de DNA.

Conjugados Em uma modalidade, o dito oligômero é conjugado com um ou mais compostos não nucleotídicos (ou polinucleotídicos).

No contexto, o termo "conjugado" é destinado a indicar uma mo- lécula heterogênea formada pela ligação covalente ("conjugação") do oligô- mero como descrito neste pedido a uma ou mais porções não nucleotídicas, ou não polinucleotídicas. Exemplos de porções não nucleotídicas ou não polinucleotídicas incluem agentes macromoleculares, tais como proteínas, i cadeias de ácido graxo, resíduos de açúcar, glicoproteínas, polímeros ou - combinações dos mesmos. Tipicamente as proteínas podem ser anticorpos para uma proteína-alvo. Polímeros típicos podem ser polietilenoglicol.

Por isso, em várias modalidades, o oligômero da invenção pode compreender tanto uma região polinucleotídica que tipicamente consiste em uma sequência contígua de nucleotídeos, e uma região adicional não nucie- otídica. Quando referindo-se ao oligômero da invenção consistindo em uma sequência nucleotídica contígua, o composto pode compreender componen- “ 20 tesnãonucleotídicos, tais como um componente conjugado.

- Em várias modalidades da invenção, o composto oligomérico é ligado a ligantes/conjugados, que podem ser usados, por exemplo para au- mentar a entrada celular de compostos oligoméricos. WO2007/031091 for- nece ligantes e conjugados adequados, que são por meio deste incorpora- dos por referência.

A invenção também fornece um conjugado compreendendo o composto de acordo com a invenção como descrito neste pedido, e pelo menos uma porção não nucleotídica ou não polinucleotídica covalentemente ligada ao dito composto. Por isso, em várias modalidades onde o composto da invenção consiste em um ácido nucleico ou sequência nucleotídica espe- cificados, como neste pedido revelado, o composto também pode compre- ender pelo menos uma porção não nucleotídica ou não polinucleotídica (por exemplo, não compreendendo um ou mais nucleotídeos ou análogos nucleo- tídicos) covalentemente ligados ao dito composto.

Conjugação (a uma porção conjugada) pode aumentar a ativida- de, distribuição celular ou entrada celular do oligômero da invenção.

Tais porções incluem, mas não são limitadas a anticorpos, polipeptídeos, porções lipídicas, tais como uma porção de colesterol, ácido cólico, um tioéter, por exemplo, Hexil-s-tritiltiol, um tiocolesterol, uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecandiol ou undecila, fosfolipídeos, por exemplo, di- hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-o-hexadecil-rac-glicero-3-h-fosfonato de trieti- lamônio, uma poliamina ou uma cadeia de polietilenoglicol, um adamantano ácido acético, uma porção palmitila, uma porção octadecilamina ou hexila- ] mino-carbonil-oxicolesterol. . Os oligômeros da invenção também podem ser conjugados a substâncias fármaco ativas, por exemplo, aspirina, ibuprofeno, um fármaco desulfa, um antidiabético, um antibacteriano ou um antibiótico.

Em certas modalidades, a porção conjugada é um esterol, tal como colesterol.

Em várias modalidades, a porção conjugada compreende ou consiste em um polímero positivamente carregado, tal como peptídeos posi- “ 20 tivamente carregados, por exemplo, entre 1 a 50, tal como 2 a 20 tal como 3 a 10 resíduos de aminoácido de tamanho, e/ou óxido de polialquileno, tal como polietilglico! (PEG) ou polipropilenoglicol - ver WO 2008/034123, por meio deste incorporado por referência.

Apropriadamente, o polímero positi- vamente carregado, tal como um óxido de polialquileno, pode ser ligado ao — oligômero da invenção através de um ligador, tal como o ligador liberável descrito em WO 2008/034123. Por meio de exemplo, as seguintes porções conjugadas podem ser usadas em conjugados da invenção: ano A E 5"-OUGÔMERO-3' j a OAODAODSATTO 5'-OUGÔMERO-3'

Oligômeros ativados : O termo "oligômero ativado" como usado neste pedido, refere-se a um oligômero da invenção que é ligado covalentemente (isto é, funcionali- zado) a pelo menos uma porção funcional que permite a ligação covalente do oligômero a uma ou mais porções conjugadas, isto é, porções que não são elas mesmas ácidos nucleicos ou monômeros, para formar os conjuga- dos descritos neste pedido. Tipicamente, uma porção funcional compreende- rá um grupo químico que é capaz de ligar-se covalentemente ao oligômero através de, por exemplo, um grupo 3'-hidroxila ou o grupo NH2 exocíclico da base adenina, um espaçador que é preferencialmente hidrofílico e um grupo terminal que é capaz de ligação a uma porção conjugada (por exemplo, um grupo amino, sulfidrila ou hidroxila). Em algumas modalidades, este grupo : terminal não é protegido, por exemplo, é um grupo NH2. Em outras modali- dades, o grupo terminal é protegido, por exemplo, por qualquer grupo de proteção adequado, tal como aqueles descritos em "Protective Groups in Organic Synthesis" por Theodora W Greene e Peter G M Wuts, 3a edição (John Wiley & Sons, 1999). Exemplos de grupos de proteção hidroxilas ade- quados incluem ésteres, tais como éster acético, grupos aralquila, tais como benzila, difenilmetila, ou trifenilmetila e tetra-hidropiranila. Exemplos de gru- “ 20 pos amino protetores adequados incluem benzila, alfa-metilbenzila, difenil- 2 metila, trifenilmetila, benziloxicarbonila, terc-butoxicarbonila, e grupos acila, tais como tricloroacetila ou trifluoroacetila. Em algumas modalidades, a por- ção funcional é autoclivada. Em outras modalidades, a porção funcional é biodegradável. Ver por exemplo, Patente U.S. No. 7.087.229, que é incorpo- rada porreferência neste pedido em sua totalidade.

Em algumas modalidades, os oligômeros da invenção são fun- cionalizados na extremidade 5' a fim de permitir a ligação covalente da por- ção conjugada à extremidade 5' do oligômero. Em outras modalidades, os oligômeros da invenção podem ser funcionalizados na extremidade 3'. Ainda em outrasmodalidades, os oligômeros da invenção podem ser funcionaliza- dos ao longo do esqueleto ou na porção de base heterocíclica. Ainda em outras modalidades, os oligômeros da invenção podem ser funcionalizados em mais de uma posição independentemente selecionada a partir da extre- midade 5', da extremidade 3', do esqueleto e da base. Em algumas modalidades, os oligômeros ativados da invenção são sintetizados pela incorporação durante a síntese de um ou mais monô- meros que são ligados covalentemente a uma porção funcional. Em outras modalidades, os oligômeros ativados da invenção são sintetizados com mo- nômeros que não foram funcionalizados, e o oligômero é funcionalizado na finalização da síntese. Em algumas modalidades, os oligômeros são funcio- nalizados com um éster impedido contendo um ligador aminoalquila, em que a porção alquila tem a fórmula (CH2), em que w é um número inteiro vari- ando de 1 a 10, preferencialmente aproximadamente 6, em que a porção de ' alquila do grupo alquilamino pode ser cadeia linear ou cadeia ramificada, e - em que o grupo funcional é ligado ao oligômero através de um grupo éster (- O-C(O0)-(CH2). NH).

Em outras modalidades, os oligêmeros são funcionalizados com um éster impedido contendo um ligador (CH>),-sulfidrila (SH), em que w é um número inteiro variando de 1 a 10, preferencialmente aproximadamente 6, em que a porção alquila do grupo alquilamino pode ser cadeia linear ou cadeia ramíificada, e em que o grupo funcional ligado ao oligômero através “20 deumgrupo éster (-O-C(O)-(CH2).SH).

- Em algumas modalidades, oligonucleotídeos ativados por sulfi- drila são conjugados com porções poliméricas, tais como polietilenoglico! ou peptídeos (através da formação de uma ligação dissulfeto).

Oligômeros ativados contendo ésteres impedidos como descrito acima podem ser sintetizados por qualquer método conhecido na técnica, e em particular por métodos revelados na Publicação PCT No WO 2008/034122 e exemplos nesta, que é incorporado neste pedido por referên- cia em sua totalidade. Ainda em outras modalidades, os oligômeros da invenção são — funcionalizados pela introdução de grupos sulfidrila, amino ou hidroxila no oligômero por meio de um reagente funcionalizante substancialmente como descrito nas Patentes U.S. Nos. 4.962.029 e 4.914.210, isto é, um reagente substancialmente linear que tem uma fosforamidita em uma extremidade ligada através de uma cadeia espaçadora hidrofílica à extremidade oposta compreendendo um grupo sulfidrila, amino ou hidroxila protegidos ou des- protegidos. Tais reagentes principalmente reagem com grupos hidroxila do oligômero. Em algumas modalidades, tais oligômeros ativados têm um rea- gente funcionalizante ligado a um grupo 5'-hidroxila do oligômero. Em outras modalidades, os oligômeros ativados têm um reagente funcionalizante ligado a um grupo 3"-hidroxila. Ainda em outras modalidades, os oligêmeros ativa- dos da invenção têm um reagente funcionalizante ligado a um grupo hidroxi- lano esqueleto do oligômero. Ainda em modalidades adicionais, o oligêômero da invenção é funcionalizado com mais de um dos reagentes funcionalizan- i tes como descrito nas Patentes U.S. Nos. 4.962.029 e 4.914.210, incorpora- - do neste pedido por referência em sua totalidade. Métodos de síntese de tais reagentes funcionalizantes e sua incorporação em monômeros ou oligême- —rossão revelados nas Patentes U.S. Nos. 4.962.029 e 4.914.210.

Em algumas modalidades, o 5'-terminal de uma fase sólida liga- da ao oligômero é funcionalizado com uma dienil fosforamidita derivada, se- guido pela conjugação do oligômero desprotegido com, por exemplo, um aminoácido ou peptídeo através de uma reação de cicloadição de Diels- “20 Alder ' Em várias modalidades, a incorporação de monômeros contendo modificações de 2'-açúcar, tais como 2'-carbamato açúcar substituído ou açúcar 2'-(O-pentil-N-ftalimido)-desoxirribose no oligêmero facilita a ligação covalente de porções conjugadas aos açúcares do oligômero. Em outras modalidades, um oligômero com um ligador contendo amino na posição 2' de um ou mais monômeros é preparado usando um reagente tal como, por exemplo, 5'-dimetoxitritil-2'-O-(e-ftalimidilaminopentil)-2'-desoxiadenosina-3"- N N-di-isopropil-cianoetóxi fosforamidita. Ver, por exemplo, Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171. Ainda em modalidades adicionais, os oligômeros da invenção podem ter porções funcionais contendo amina no nucleotídeo, incluindo nos grupos amino purina N6, no exocíclico N2 da guanina, ou nas posições N4 ou 5 da citosina. Em várias modalidades, tal funcionalização pode ser alcan- - çada pelo uso de um reagente comercial que já é funcionalizado na síntese de oligômero.

Algumas porções funcionais estão comercialmente disponíveis, por exemplo, porções de ligação heterobifuncional e homobifuncional estão disponíveis em Pierce Co. (Rockford, IIl.). Outros grupos de ligação comer- cialmente disponíveis são reagentes 5'-Amino-Modifier C6 e 3'-Amino- Modifier, ambos disponíveis da Glen Research Corporation (Sterling, Va.). 58'-Amino-Modifier C6 está também disponível em ABI (Applied Biosystems Inc, Foster City, Calif.) como Aminolink-2, e 3-Amino-Modifier está também disponível em Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.). ] Terapia e composições farmacêuticas - formulação e admi- . nistração Como explicado inicialmente, os oligonucleotídeos da invenção constituirão fármacos adequados com propriedades melhoradas. O desenho de um fármaco potente e seguro requer o controle fino de vários parâmetros, tais como afinidade/especificidade, estabilidade em fluidos biológicos, entra- da celular, modo de ação, propriedades farmacocinéticas e toxicidade.

Consequentemente, em um aspecto adicional a presente inven- “ 20 çãorefere-sea uma composição farmacêutica compreendendo um oligonu- . cleotídeo de acordo com a invenção e um diluente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. O dito veículo preferencialmente é solução salina ou solução salina tamponada.

Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção para uso como um medicamento.

Como será entendido, a dosagem é dependente da severidade e responsividade do estado de doença a ser tratada, e o curso do tratamento que dura de vários dias a vários meses, ou até que uma cura seja efetuada ou uma diminuição do estado de doença seja alcançada. Esquemas ótimos de dosagem podem ser calculados a partir de medidas de acúmulo de fár- maco no corpo do paciente. Dosagens ótimas podem variar dependendo da potência relativa dos oligonucleotídeos individuais.

Geralmente pode ser es- timado com base em EC50s encontradas sendo eficazes em modelos ani- mais in vitro e in vivo.

Em geral, a dosagem é de 0,01 ug a 1 g por kg de pe- so corporal, e pode ser dada uma vez ou mais diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente, ou até uma vez a cada 2 a 10 anos ou pela infusão contínua de horas até vários meses.

As taxas de repetição para do- sagem podem ser estimadas com base em tempos de residência e concen- trações medidos do fármaco em fluidos ou tecidos corporais.

Após tratamen- to bem-sucedido, pode ser desejável fazer o paciente se submeter à terapia demanutenção para prevenir a recorrência do estado de doença.

Como indicado acima, a invenção também refere-se a uma composição farmacêutica, que compreende pelo menos um oligonucleotídeo . da invenção como um ingrediente ativo.

Deve ser entendido que a composi- ção farmacêutica de acordo com a invenção opcionalmente compreende um veículo farmacêutico, e que a composição farmacêutica opcionalmente com- preende compostos adicionais, tais como compostos quimioterápicos, com- postos anti-inflamatórios, compostos antivirais e/ou compostos imunomodu- ladores.

Os oligonucleotídeos da invenção podem ser usados "como são" “ 20 ounaforma da variedade de sais farmaceuticamente aceitáveis.

Como usa- . do neste pedido, o termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais que conservam a atividade biológica desejada dos oligonucleotídeos identificados neste pedido e exibem efeitos toxicológicos indesejados míni- mos.

Exemplos não limitantes de tais sais podem ser formados com aminoá- cido orgânicoe sais de adição de base formados com cátions metálicos, tais como zinco, cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, ní- quel, cádmio, sódio, potássio e similares, ou com um cátion formado de a- mônia, N,N-dibenziletileno-diamino, D-glicosamino, tetraetilamônio ou etile- nodiamina.

Em uma modalidade da invenção, o oligonucleotídeo pode estar na forma de um profármaco.

Oligonucleotídeos são por força, íons carrega- dos negativamente.

Devido à natureza lipofílica das membranas celulares, a entrada celular de oligonucleotídeos é reduzida comparada com equivalen- tes neutros ou lipofílicos. Este "impedimento" de polaridade pode ser evitado usando a abordagem de profármaco (ver, por exemplo, Crooke, R. M. (1998) em Crooke S. T., Antisense research and Application. Springer-Verlag, Ber- lin, Germany, vol. 131, pp 103-140). Agentes de ligação e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis podem compreender parte do fármaco formulado.

Exemplos de métodos de entrega para entrega dos agentes te- rapêuticos descritos neste pedido, bem como detalhes de formulações far- —macêuticas, sais, podem ser bem descritos em outro lugar por exemplo nos Pedidos de Patente Provisória U.S. 60/838.710 e 60/788.995, que são por S meio deste incorporados por referência, e pedidos de patente dinamarquesa, . PA 2006 00615 que também é por meio deste incorporado por referência. Composições farmacêuticas da presente invenção incluem, mas nãosão limitadas a soluções, emulsões, e formulações contendo lipossoma. Estas composições podem ser geradas de uma variedade de componentes que incluem, mas não são limitados a líquidos pré-formados, sólidos autoe- mulsionantes e semissólidos autoemulsionantes. Entrega do fármaco ao te- cido tumoral pode ser aumentada pela entrega mediada por veículo incluin- Á 20 do, mas não limitada a lipossomas catiônicos, ciclodextrinas, derivados de . porfirina, dendrímeros de cadeia ramificada, polímeros de polietilenimina, nanopartículas e microesferas (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54 (1):3- 27). As formulações farmacêuticas da presente invenção, que podem ser convenientemente apresentadas na forma de unidade de dosagem, podem ser preparadas de acordo com as técnicas convencionais bem-conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa do fornecimento em associação dos ingredientes ativos com veículo(s) ou excipiente(s) farma- cêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas trazendo uniforme e intimamente em associação, os ingredientes ativos com veículos líquidos ou carreadores finamente divididos ou ambos, e então, se necessário, forma- tando o produto. As composições da presente invenção podem ser formula- das em qualquer uma das muitas formas de dosagem possíveis tais como,

mas não limitadas a comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líqui- dos, géis macios e supositórios. As composições da presente invenção tam- bém podem ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não a- quosos ou variados. Suspensões aquosas podem conter ainda substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carbo- ximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrana. A suspensão também pode conter estabilizadores. Os compostos da invenção também podem ser con- jugados a substâncias de fármaco ativas, por exemplo, aspirina, ibuprofeno, um fármaco de sulfa, um antidiabético, um antibacteriano ou um antibiótico.

Em outra modalidade, as composições da invenção podem con- ter um ou mais compostos oligonucleotídicos, visados por primeiro microR- ' NA e um ou mais compostos oligonucleotídicos adicionais visados por um " segundo microRNA-alvo. Dois ou mais compostos combinados podem ser usados em conjunto ou sequencialmente.

Os compostos revelados neste pedido são úteis para diversas aplicações terapêuticas como indicado acima. Em geral, os métodos tera- pêuticos da invenção incluem administração de uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um oligonucleotídeo a um mamífero, particularmente um ser humano. Em certa modalidade, a presente invenção fornece composi- “ 20 çõesfarmacêuticas contendo (a) um ou mais compostos da invenção, e (b) - um ou mais agentes quimioterápicos. Quando usado com os compostos da invenção, tais reagentes quimioterápicos podem ser usados individualmente, sequencialmente, ou em combinação com um ou outros tais agentes quimio- terápicos ou em combinação com radioterapia. Todos os agentes quimiote- —rápicos conhecidos por um versado na técnica são aqui incorporados como tratamentos de combinação com o composto de acordo com a invenção. Outros agentes ativos, tais como fármacos anti-inflamatórios, incluindo mas não limitados a fármacos anti-inflamatórios não esteroidais e corticosteroi- des, fármacos antivirais, e fármacos imunomoduladores também podem ser — combinados em composições da invenção. Dois ou mais compostos combi- nados podem ser usados em conjunto ou sequencialmente.

Exemplos de indicações terapêuticas que podem ser tratadas pelas composições farmacêuticas da invenção: [mierorNa — [possiveis indicações médicas | sensibilização de gliomas a fármacos citotóxicos, hipertrofia cardíaca mMIR-141 linfoma e outros tipos de tumor : | de células endócrinas pancreáticas Imirtist — — — Jiterenciação de mioblastos, cistiniios avtaimines | mitos fimvasãoceiuare metástase de câncer demama h hepatocelular humano - O mRNA do gene supressor tumoral tropomisina 1 (TPM1) foi indicado como um alvo de miR-21. O mRNA de miotrofina (mtpn) foi indicado como um alvo de miR 375.

Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se ao uso de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção para a produção de um medicamento para o tratamento de uma doença selecionada a partir do grupo consistindo em: aterosclerose, hipercolesterolemia e hiperlipidemia; câncer, glioblastoma, câncer de mama, linfoma, câncer de pulmão; diabetes, distúrbios metabólicos; diferenciação de mioblastos; distúrbios imunes. A invenção refere-se ainda a oligonucleotídeos de acordo com a invenção para o uso no tratamento de uma doença selecionada a partir do grupo consistindo em: aterosclerose, hipercolesterolemia e hiperlipidemia; câncer, glioblastoma, câncer de mama, linfoma, câncer de pulmão; diabetes, distúrbios metabólicos; diferenciação de mioblastos; distúrbios imunes.

A invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo sofrendo de uma doença ou condição selecionada a partir do grupo consis- tindo em: aterosclerose, hipercolesterolemia e hiperlipidemia; câncer, glio- blastoma, câncer de mama, linfoma, câncer de pulmão; diabetes, distúrbios metabólicos; diferenciação de mioblastos; distúrbios imunes, o método com- preendendo a etapa de administração de um oligonucleotídeo ou composi- ção farmacêutica da invenção ao indivíduo em necessidade do mesmo. A invenção fornece ainda um kit compreendendo uma composi- p ção farmacêutica de acordo com a invenção, e um segundo ingrediente ativo independente que é um inibidor da via de construção de VLDL, tal como um inibidor de ApoB, ou inibidor de MTP. Câncer Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se ao uso de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção para a produção de um medicamento para o tratamento de câncer. Em outro aspecto, a pre- “ 20 senteinvenção refere-se a um método para tratamento de, ou profilaxia con- R tra, câncer, o dito método compreendendo administração de um oligonucleo- tídeo da invenção ou uma composição farmacêutica da invenção a um paci- ente em necessidade do mesmo. Tais cânceres podem incluir neoplasia linforreticular, leucemia linfoblástica, tumores cerebrais, tumores gástricos, plasmocitomas, mieloma múltiplo, leucemia, tumores de tecido conectivo, linfomas e tumores sólidos. No uso de um composto da invenção para a produção de um medicamento para o tratamento de câncer, o dito câncer pode estar apropri- adamente na forma de um tumor sólido. Analogamente, no método para tra- tamento de câncer revelado neste pedido, o dito câncer pode estar apropria- damente na forma de um tumor sólido. Além disso, o dito câncer é também apropriadamente um carci-

noma.

O carcinoma é tipicamente selecionado a partir do grupo consistindo em melanoma maligno, carcinoma celular basal, carcinoma ovariano, carci- noma de mama, câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma ce- lular renal, carcinoma de bexiga, câncer de bexiga superficial recorrente, carcinoma de estômago, carcinoma prostático, carcinoma pancreático, car- cinoma de pulmão, carcinoma cervical, displasia cervical, papilomatose de laringe, carcinoma de cólon, carcinoma colorretal e tumores carcinoides.

Mais tipicamente, o dito carcinoma é selecionado a partir do grupo consistin- do em melanoma maligno, câncer de pulmão de células não pequenas, car- —cinoma de mama, carcinoma de cólon e carcinoma celular renal.

O melano- ma maligno é tipicamente selecionado a partir do grupo consistindo em me- i lanoma de extensão superficial, melanoma nodular, melanoma lentigo ma- - ligna, melanoma acral, melanoma amelanótico e melanoma desmoplásico.

Alternativamente, o câncer pode ser apropriadamente um sar- coma.

O sarcoma está tipicamente na forma selecionada a partir do grupo consistindo em osteossarcoma, sarcoma de Ewing, condrossarcoma, histio- citoma fibroso maligno, fibrossarcoma e sarcoma de Kaposi.

Alternativamente, o câncer pode ser apropriadamente um glio- ma. “20 Uma modalidade adicional é direcionada ao uso de um oligonu- . cleotídeo de acordo com a invenção para a produção de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o dito medicamento compreende ainda um agente quimioterápico selecionado a partir do grupo consistindo em a- drenocorticosteroides, tais como prednisona, dexametasona ou decadron; altetamina (hexaleno, hexametilmelamina (HM)); amifostina (etiol); amino- glutetimida (citadren); ansacrina (M AMSA); anastrozol (arimidex); andróge- nos, tais como testosterona; asparaginase (elspar); bacilo calmette-guerin; bicalutamida (casodex); bleomicina (blenoxano); bussulfano (mileran); car- boplatina (paraplatina); carmustina (BCNU, BICNU); clorambucil (leukeran); —clorodeoxiadenosina (2-CDA, cladribina, leustatina); cisplatina (platinol); cito- sina arabinosídeo (citarabina); dacarbazina (DTIC); dactinomicina (actinomi- cina-D, cosmegen); daunorrubicina (cerubidina); docetaxel (taxotere); doxor-

rubicina (adriomicina); epirrubicina; estramustina (emcyt); estrogênios, tais como dietilstilbestrol (DES); etoposídeo (VP-16, VePesid, etopophos); fluda- rabina (fludara); flutamida (eulexin); 5-FUDR (floxuridina); 5-fluorouracila (5- FU); gencitabina (gemzar); goserelina (zodalex); herceptina (trastuzumab); hidroxiureia (hydrea); idarrubicina (idamicina); ifosfamida; IL-2 (proleucina, aldesleucina); interferon alfa (íntron A, roferon A); irinotecano (camptosar); leuprolídeo (lupron); levamisol (ergamisol); lomustina (CCNU); mecloratami- na (mustargen, mostarda nitrogenada); melfalano (alkeran); mercaptopurina (purinathol, 6-MP); metotrexato (mexate); mitomicina-C (mutamucina); mito- xantrona (novantrone); octreotídeo (sandostatina); pentoestatina (2- desoxicoformicina, nipent); plicamicina (mitramicina, mitracina); prorocarba- zina (matulano); estreptozocina; tamoxifina (nolvadex); taxol (paclitaxel); te- - niposídeo (vumon, VM-26); tiotepa; topotecano (hycamtin); tretinoína (vesa- noide, ácido todo trans retinoico); vinblastina (valban); vincristina (oncovin) e vinorrelbina (navelbine). Apropriadamente, o agente quimioterápico adicional é selecionado de taxanos, tais como Taxol, Paclitaxel ou Docetaxel.

Similarmente, a invenção é direcionada ainda ao uso de um oli- gonucleotídeo de acordo com a invenção para a produção de um medica- mento para o tratamento de câncer, em que o dito tratamento compreende i 20 aindaa administração de um agente quimioterápico adicional selecionado a ' partir do grupo consistindo em adrenocorticosteroides, tais como prednisona, dexametasona ou decadron; altretamina (hexaleno, hexametilmelamina (HM)); amifostina (etiol); aminoglutetimida (citadren); ansacrina (M AMSA); anastrozol (arimidex); andrógenos, tais como testosterona; asparaginase (elspar); bacilo calmette-guerin; bicalutamida (casodex); bleomicina (bleno- xano); bussulfano (mileran); carboplatina (paraplatina); carmustina (BCNU, BICNU); clorambucil (leukeran); clorodeoxiadenosina (2-CDA, cladribina, leustatina); cisplatina (platinol); citosina arabinosídeo (citarabina); dacarbazi- na (DTIC); dactinomicina (actinomicina-D, cosmegen); daunorrubicina (ceru- bidina); docetaxel (taxotere); doxorrubicina (adriomicina); epirrubicina; es- tramustina (emcyt); estrogênios, tais como dietilstilbestrol (DES); etoposídeo (VP-16, VePesid, etopophos); fludarabina (fludara); flutamida (eulexin); 5-

FUDR (floxuridina); 5-fluorouracila (5-FU); gencitabina (gemzar); goserelina (zodalex); herceptina (trastuzumab); hidroxiureia (hydrea); idarrubicina (ida- micina); ifosfamida; 11L-2 (proleucina, aldesleucina); interferon alfa (íntron A, roferon A); irinotecano (camptosar); leuprolídeo (lupron); levamiso! (ergami- sol); lomustina (CCNU); mecloratamina (mustargen, mostarda nitrogenada); melfalano (alkeran); mercaptopurina (purinathol, 6-MP); metotrexato (mexa- te); mitomicina-C (mutamucina); mitoxantrona (novantrone); octreotídeo (sandostatin); pentoestatina (2-desoxicoformicina, nipent); plicamicina (mi- tramicina, mitracina); prorocarbazina (matulano); estreptozocina; tamoxifina (nolvadex); taxol (paclitaxel); teniposídeo (vumon, VM-26); tiotepa; topoteca- no (hycamtin); tretinoína (vesanoide, ácido todo trans retinoico); vinblastina (valban); vincristina (oncovin) e vinorrelbina (navelbine). Apropriadamente, o : agente quimioterápico adicional é selecionado de taxanos, tais como Taxol, Paclitaxel ou Docetaxel.

Alternativamente afirmado, a invenção é direcionada ainda a um método para tratamento de câncer, o dito método compreendendo adminis- tração de um oligonucileotídeo da invenção ou uma composição farmacêuti- ca de acordo com a invenção a um paciente em necessidade do mesmo e compreendendo ainda administração de um agente quimioterápico adicional.

“20 Aditaadministração adicional pode ser tal que o agente quimioterápico adi- p cional é conjugado ao composto da invenção, está presente na composição farmacêutica, ou é administrado em uma formulação separada. Doenças infecciosas É contemplado que os compostos da invenção podem ser lar- gamente aplicáveis a uma ampla faixa de doenças infecciosas, tais como difteria, tétano, coqueluche, poliomielite, hepatite B, hepatite C, hemophilus influenza, sarampo, caxumba e rubéola.

Hsa-miR122 é indicado em infecção por hepatite C e como tais oligonucleotídeos de acordo com a invenção que visam miR-122 pode ser usado para tratar infecção por Hepatite C.

Consequentemente, ainda em outro aspecto, a presente inven- ção refere-se ao uso de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção para a produção de um medicamento para o tratamento de uma doença infeccio- sa, bem como um método para tratamento de uma doença infecciosa, o dito método compreendendo administração de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção aum paciente em necessidade do mesmo.

Em uma modalidade preferencial, a invenção fornece um trata- mento de combinação que fornece um oligômero anti-miR-122 em combina- ção com um inibidor de construção de VLDL, tal como um inibidor de apoB, ou de MTP.

Doenças inflamatórias A resposta inflamatória é um mecanismo essencial de defesa do organismo contra o ataque de agentes infecciosos, e também é implicado na . patogênese de muitas doenças agudas e crônicas, incluindo distúrbios auto- imunes. Apesar de serem necessários para lutar contra patógenos, os efei- tosde uma reação inflamatória podem ser devastadores. É, por isso, muitas vezes necessário restringir a sintomatologia da inflamação com o uso de fármacos anti-inflamatórios. A inflamação é um processo complexo normal- mente provocado por injúria tecidual que inclui a ativação de uma grande matriz de enzimas, o aumento em permeabilidade vascular e extravasamen- “ 20 todefluidossanguíneos, migração celular e liberação de mediadores quími- . cos, todos apontados para tanto destruir como reparar o tecido danificado.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção para a produção de um medicamento para o tratamento de uma doença inflamatória, bem como um — método para tratamento de uma doença inflamatória, o dito método compre- endendo administração de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção a um paciente em necessidade do mesmo.

Em uma modalidade preferencial da invenção, a doença inflama- tória é uma doença reumática e/ou doenças de tecido conectivo, tais como artrite reumatoide, lúpus sistêmico eritematoso (SLE) ou Lúpus, escleroder- ma, polimiosite, doença inflamatória intestinal, dermatomiosite, colite ulcera-

tiva, doença de Crohn, vasculite, artrite psoríatica, dermatite exfoliativa pso- ríatica, pênfigo vulgar e síndrome de Sjorgren, em particular doença inflama- tória intestinal e doença de Crohn.

Alternativamente, a doença inflamatória pode ser uma inflama- ção não reumática, como bursite, sinovite, capsulite, tendinite e/ou outras lesões inflamatórias de origem traumática e/ou esportiva.

Doenças metabólicas Uma doença metabólica é um distúrbio causado pelo acúmulo de produtos químicos produzidos naturalmente no corpo. Estas doenças são normalmente sérias, algumas até com risco de morte. Outras podem reduzir a velocidade de desenvolvimento físico ou causar retardo mental. A maior Í parte das crianças com estes distúrbios, no início, não mostram nenhum si- . nal óbvio da doença. Rastreamento próprio ao nascimento muitas vezes po- de descobrir estes problemas. Com diagnóstico e tratamento precoces, do- enças metabólicas muitas vezes podem ser controladas efetivamente.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção ou um conjugado do mesmo para a produção de um medicamento para o tratamento de uma do- ença metabólica, bem como a um método para tratamento de uma doença “ 20 metabólica, odito método compreendendo administração de um oligonucleo- R tídeo de acordo com a invenção ou um conjugado do mesmo, ou composi- ção farmacêutica de acordo com a invenção a um paciente em necessidade do mesmo.

Em uma modalidade preferencial da invenção, a doença meta- —bólicaé selecionada a partir do grupo consistindo em Amiloidose, Biotinida- se, OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man), Síndrome de Crigler Najjar, Diabetes, Fabry Support & Information Group, Distúrbios de Oxidação de Ácido graxo, Galactosemia, deficiência em glicose-6-fosfato Desidrogenase (G6PD), Acidúria glutárica, International Organization of Glutaric Acidemia, —Acidemia Glutárica Tipo |, Acidemia Glutárica Tipo Il, Acidemia Glutárica Ti- po 1, Acidemia Glutárica Tipo Il, F-HYPDRR - Hipofosfatemia Familiar, Ra- quitismo Resistente à Vitamina D, Doença de Krabbe, deficiência de hidroxi-

acil CoA 3 desidrogenase de cadeia longa (LCHAD), Grupo de Manosidose, Doença de Urina em Xarope de Bordo, distúrbios mitocondriais, Síndromes de Mucopolissacaridose: Niemann Pick, Acidemias orgânicas, PKU, doença de Pompe, Porfiria, Síndrome Metabólica, Hiperlipidemia e distúrbios de lipí- dio herdados, Trimetilaminúria: a síndrome de odor de peixe, e Distúrbios de ciclo de Ureia.

Distúrbios hepáticos Ainda em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção ou um conjugado do “mesmo para a produção de um medicamento para o tratamento de um dis- túrbio hepático, bem como um método para tratamento de um distúrbio he- pático, o dito método compreendendo administração de um oligonucleotídeo - de acordo com a invenção ou um conjugado do mesmo, ou composição far- macêutica de acordo com a invenção a um paciente em necessidade do mesmo.

Em uma modalidade preferencial da invenção, o distúrbio hepá- tico é selecionado a partir do grupo consistindo em Atresia Biliar, Síndrome de Alagille, Antitripsina Alfa 1, Tirosinemia, Hepatite Neonatal e Doença de Wilson.

“20 Outros usos + Os oligonucleotídeos da presente invenção podem ser utilizados como reagentes de pesquisa para diagnóstico, terapêutica e profilaxia. Em pesquisa, o oligonucleotídeo pode ser usado para inibir especificamente a síntese de genes-alvo em células e animais experimentais que por meio dis- so facilitam a análise funcional do alvo ou uma avaliação de sua utilidade como um alvo para intervenção terapêutica. Em diagnóstico, os oligonucleo- tídeos podem ser usados para detectar e quantificar expressão do alvo em célula e tecidos por Northern blotting, hibridização in-sifu ou técnicas simila- res. Para a terapêutica, um animal ou um ser humano, suspeito de ter uma doença ou distúrbio, que pode ser tratada pela modulação da expressão do alvo é tratado pela administração dos compostos oligonucieotídicos confor- me esta invenção. Além disso, são fornecidos métodos para tratamento de um animal particular, camundongo e rato, e tratamento de um ser humano, suspeito de ter ou ser propenso a uma doença ou condição, associada com a expressão do alvo pela administração de uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um ou mais dos compostos oligonucleotídicos ou composições da invenção.

Uso terapêutico de oligonucleotídeos visando miR-122a Demonstra-se que um LNA-antimiR, visando miR-122a reduz ní- veis de colesterol plasmáticos. Por isso, outro aspecto da invenção é o uso dos oligonucleotídeos descritos acima visando miR-122a como remédio.

Ainda outro aspecto da invenção é o uso dos oligonucleotídeos descritos acima visando miR-122a para a preparação de um medicamento Ú para o tratamento de níveis de colesterol plasmáticos aumentados (ou hiper- E colesterolemia e distúrbios relacionados). O versado apreciará que níveis de colesterol plasmáticos aumentados são indesejáveis já que aumenta o risco de várias condições, por exemplo, aterosclerose.

Ainda outro aspecto da invenção é o uso dos oligonucleotídeos descritos acima visando miR-122a para regular para cima os níveis de mR- NA de Nrdg3, Aldo A, Bckdk ou CD320.

MODALIDADES “20 As seguintes modalidades da presente invenção podem ser u- H sadas em combinação com as outras modalidades descritas neste pedido.

1. uma composição farmacêutica compreendendo um oligêmero entre 6 e 12 nucleotídeos de tamanho, em que o dito oligômero compreende uma sequência nucleotídica contígua de um total de entre 6 a 12 nucleotí- deos,talcomo6,7,8,9,10,11 ou 12 unidades nucleotídicas, em que pelo menos 50% das unidades de nucleobases do oligôêômero são unidades de análogo nucleotídico de alta afinidade, e um diluente, veículo, sal ou adju- vante farmaceuticamente aceitável.

2. a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 1, em que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma região correspondente da sequência de microRNA de mamífero, humana ou viral (MIRNA).

3. a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 2, em que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma região correspondente de uma sequência de miRNA selecionada a partir do grupo de miRNAs listado em qualquer uma das tabelas 3, 4 ou 5.

4. a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 2 ou 3, em que a sequência nucleotídica contígua consiste em ou compreende uma sequência que é complementar à sequência de semente do dito mi- croRNA.

5. a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 4, em que a sequência nucleotídica contígua consiste em ou compreende uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das Ê sequências listadas na tabela 3 ou 4. . 6. a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 4 ou 5, em que a nucleobase 3' do sementâmero forma a maioria das nucleoba- ses3 da sequência nucleotídica contígua, em que a sequência nucleotídica contígua pode compreender, opcionalmente, uma ou duas nucleobases 5' adicionais.

7. a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6, em que a dita sequência nucleotídica contígua não com- “20 preendeum nucleotídeo que corresponde ao primeiro nucleotídeo presente . na sequência de micro RNA contada a partir da extremidade 5".

8. a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a sequência nucleotídica contígua é complemen- tar a uma sequência nucleotídica presente correspondente em um miRNA selecionado a partir daqueles mostrados na tabela 3 ou 4 ou 5.

9. a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 8, em que o dito miRNA é selecionado a partir do grupo consistindo em miR-1, MiR-10b, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-122, miR-133, miR-134, miR-138, miR- 155,miR-192, miR-194, miR-221, miR-222 e miR-375.

10. a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,

85%, 90%, 95% ou todas as unidades de nucleobase da sequência nucleotí- dica contígua são unidades de análogo nucleotídico.

11. a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 10, em que as unidades de análogo nucleotídico são selecionadas a partir do grupo consistindo em unidade de 2'-O-alquil-RNA, unidade de 2-OMe-RNA, unidade de 2'-amino-DNA, unidade de 2'-fluoro-DNA, unidade de LNA, uni- dade de PNA, unidade de HNA, unidade de INA, e uma unidade de 2'MOE RNA.

12. a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 10 ou11,em que pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou todas as unidades de nucleobase da sequência nucleotídica contígua são : unidades de nucleobase de Ácido Nucleico Fechado (LNA). - 13. a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 12, em que todas as unidades de nucleobase da sequência nucleotídica contí- guasão unidades de nucleobase de LNA.

14. a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 13, em que a sequência nucleotídica contígua compre- ende ou consiste em 7, 8, 9 ou 10, preferencialmente unidades de nucleoba- se de LNA contíguas.

“20 15. a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma V das modalidades 1 a 14, em que o oligômero consiste em 7, 8, 9 ou 10 uni- dades de nucleobase contíguas e em que pelo menos 7 unidades de nucle- obase são unidades de análogo nucleotídico.

16. a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 15, emqueas unidades de análogo nucleotídico são unidades de nucleobase de Ácido Nucleico Fechado (LNA).

17. a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 15, em que as unidades de análogo nucleotídico na molécula consistem em uma mistura de unidades de LNA de pelo menos 50% e até 50% de outras unida- desde análogo nucleotídico.

18. a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, em que pelo menos 75%, tal como 80% ou 85% ou

90% ou 95% ou todas as ligações internucleosídicas presentes entre as uni- dades de nucleobase da sequência nucleotídica contígua são ligações inter- nucleosídicas de fosforotioato.

19. a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a18,em que o dito oligômero é conjugado com um ou mais compostos não nucleobase.

20. a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 19, em que a sequência nucleotídica contígua é com- plementar à sequência correspondente de pelo menos duas sequências de —miRNA tal como 2, 3,4,5,6,7,8,9 ou 10 sequências de miRNA.

21. a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma ” das modalidades 1 a 20, em que a sequência nucleotídica contígua consiste Ds em ou compreende uma sequência que é complementar à sequência de ' pelo menos duas sequências de região de semente de miRNA tal como 2, 3, 4,5,6,7,8,90uU10 sequências de região de semente de miRNA.

22. a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 20 ou 21, em que a sequência nucleotídica contígua é complementar à região correspondente tanto de miR-221 como de miR-222.

23. a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 22, “ 20 empquea sequência nucleotídica contígua consiste em ou compreende uma | sequência que é complementar a "GCUACAU3'.

24. a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 23, em que o oligômero é constituído como um profár- maco.

25. a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que a sequência nucleotídica contígua é com- plementar a uma região correspondente de has-miR-122.

26. a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 25, para uso no tratamento de um distúrbio médico ou doença selecionada a — partirdo grupo consistindo em: infecção por vírus de hepatite C e hipercoles- terolemia e distúrbios relacionados.

27. a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 25 ou 26, em que a composição compreende ainda um segundo ingrediente ativo independente que é um inibidor da via de construção de VLDL, tal co- mo um inibidor de ApoB, ou inibidor de MTP.

28. um conjunto compreendendo uma composição farmacêutica de acordo com a modalidade 25 ou 26, e um segundo ingrediente ativo in- dependente que é um inibidor da via de construção de VLDL, tal como um inibidor de ApoB, ou inibidor de MTP.

29. um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio médico associado com a presença ou superexpressão de microRNA, com- preendendo a etapa de administração da composição farmacêutica de acor- do com qualquer uma das modalidades 1 a 28 a um paciente que está so- ” frendo, ou é provável de sofrer da dita doença ou distúrbio médico. - 30. um oligômero, como definido de acordo com qualquer uma ' das modalidades 1 a 25.

31. um conjugado compreendendo o oligômero de acordo com a modalidade 30, e pelo menos um composto não nucleobase.

32. o uso de um oligômero ou um conjugado como definido em qualquer uma das modalidades 30 a 31, para a produção de um medicamen- to para o tratamento de uma doença ou distúrbio médico associado com a “ 20 presença ou superexpressão do microRNA.

N 33. um método para redução da quantidade, ou quantidade efi- caz, de um mIiRNA em uma célula, compreendendo administração de um oligêômero, um conjugado ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes à célula que está expressando oditomiRNA para redução da quantidade, ou quantidade eficaz do miRNA na célula.

34. um método para desrepressão de um mRNA cuja expressão é reprimida por um miRNA em uma célula compreendendo administração de um oligôêômero, um conjugado ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes à célula para a célula que expressou tanto o dito MRNA como o dito miRNA, a fim de desreprimir a ex- pressão do mMRNA.

Referências: Detalhes da referência são fornecidos nos docu- mentos de prioridade.

EXEMPLOS Síntese de Monômero de LNA e de oligonucleotídeo foi realizada usando a metodologia referida nos Exemplos 1 e 2 de WO2007/112754. À estabilidade do oligonucleotíideo de LNA no plasma humano ou de rato é realizada usando a metodologia referida no Exemplo 4 de WO2007/112754. O tratamento de células in vitro com oligonucleotídeo antissenso de LNA anti-miR (visando miR-122) é realizado usando a metodologia referida no Exemplo 6 de WOZ2007/112754. A análise da Inibição de Oligonucileotídeo da expressão de miR por PCR quantitativa específica para microRNA tanto em um modelo in vitro como em um in vivo é realizada usando a metodolo- - gia referida no Exemplo 7 de WO2007/112754. A avaliação da especificida- ' de do silenciamento de LNA antimir usando o perfil de expressão de microar- ranjo de miRNA é realizada usando a metodologia referida no Exemplo 8 de WO?2007/112754. A detecção de microRNAs por hibridização in situ é reali- zada usando a metodologia referida no Exemplo 9 de WOZ2007/112754. O Isolamento e a análise da expressão de mRNA (isolamento de RNA total e síntese de cDNA para análise de MRNA) tanto em um modelo in vitro como “ 20 eminvivosão realizados usando a metodologia referida no Exemplo 10 de . WO?2007/112754. Experimentos in vivo usando Oligômeros da invenção vi- sando microRNA 122 e análise subsequente é realizada usando os métodos revelados nos Exemplos 11 a 27 de WO2007/112754. Os exemplos mencio- nados. acima de WO2007/112754 são por meio deste especificamente incor- porados por referência. Exemplo 1: Desenho de oligonucleotídeos de LNA antimiR e temperaturas de fusão

Tabela 2 - Oligômeros usados nos exemplos e figuras. SEQNe é um identificador usado em todas as partes dos exemplos e figuras — a SEQ ID NO que é usada na listagem de sequência também é fornecida.

AI AE SEQ Nº bes o eaeerestaager | | besos == lemaeer | | besos — o aameecato | | bes a qaeema | | bee ds Jeane : besos 6 feneerae o ee er | o fee fe er | eee e ear besta = = fo — jeremmamer | | ess fl fereremaeer | | ema — fo Jeaeterearaeer | =| legais hs ereta | | ee o areerer ee so eaete | | : esa fe aeee mesa fa ame less — ba darem | less — a jacanceTaetacere | | bear 8 aero less ds fesegregeem | |

EE O SEQ Nº beso úÚbro mesaeemeo [| ==>ú&| ear bo femeer | esa a here lesasa fo fereere beaass ss feet || pesar da Tacsaeeraetaeero | lesse — las — jacsaaeraetaeere || Press fis fermeere ie ar Jet bear e meta | bes = 6 Jlegameetao | | lesaas — fm lenceamaecatra | = Mesas re fem bes — foro femea es o lamenta Letras maiúsculas e minúsculas denotam LNA e DNA, respectivamente. f Citosinas de LNA são preferencialmente metil-citosina/5'metil-citosina” Todas as ligações internucleosídicas são preferencialmente fosforotioato* Todo o LNA, por exemplo, pode ser beta-D-oxi LNA* *Usados nos exemplos específicos.

Exemplo 2: Modelo in vitro: Cultura celular O efeito de oligonucleotídeos LNA na expressão de ácido nuclei- Co alvo (quantidade) pode ser testado em qualquer um de uma variedade de tipos celulares contanto que o ácido nucleico alvo esteja presente em níveis mensuráveis.

O alvo pode ser expresso endogenamente ou pela transfecção transiente ou estável de um ácido nucleico que codifica o dito ácido nucleico.

O nível de expressão do ácido nucleico alvo pode ser rotineira- mente determinado usando, por exemplo, análise por Northern blot (incluin-

do Northern de microRNA), PCR Quantitativa (incluindo qPCR de microR- NA), ensaios de proteção de Ribonuclease. Os seguintes tipos celulares são fornecidos para fins ilustrativos, mas outros tipos celulares podem ser rotinei- ramente usados, contanto que o alvo seja expresso no tipo celular escolhido. As células foram cultivadas no meio apropriado como descrito abaixo e mantidas a 37ºC em umidade de 95 a 98% e CO; a 5%. As células foram rotineiramente passadas 2 a 3 vezes semanalmente. 15PC3: A linhagem celular de câncer de próstata humano 15PC3 foi gentilmente doada pelo Dr. F. Baas, Laboratório de Neurozintui- gen, AMC, Holanda e foi cultivada em DMEM (Sigma) + soro fetal bovino a 10% (FBS) + Glutamax | + gentamicina.

W PC3: A linhagem celular de câncer de próstata humano PC3 foi '" adquirida de ATCC e foi cultivada em F12 de Coon com glutamina (Gibco) + Ú FBS a 10% + gentamicina.

518A2: A linhagem celular de câncer de melanoma humano 518A2 foi gentilmente doada pelo Dr. B. Jansen, Seção de Oncologia Expe- rimental, Farmacologia Molecular, Departamento de Farmacologia Clínica, Universidade de Viena e foi cultivada em DMEM (Sigma) + soro fetal bovino a 10% (FBS) + Glutamax | + gentamicina.

HeLa: A linhagem celular de carcinoma cervical HeLa foi cultiva- . da em MEM (Sigma) contendo soro fetal bovino a 10% de gentamicina a 37ºC, umidade de 95% e CO; a 5%.

MPC-11: A linhagem celular de mieloma múltiplo murino MPC-11 foi adquirida de ATCC e mantida em DMEM com Glutamax 4 mM + Soro de Cavaloa10%.

DU-145: A linhagem celular de câncer de próstata humano DU- 145 foi adquirida de ATCC e mantida em RPMI com Glutamax + FBS a 10%. RCC4 +/-VHL: A linhagem celular de câncer renal humano RCC4 estavelmente transfectada com plasmídeo expressando VHL ou plasmídeo vazio foi adquirida de ECACC e mantida de acordo com as instru- ções dos fabricantesfabricantes.

786-0: A linhagem celular de carcinoma celular renal humano

786-0 foi adquirida de ATCC e mantida de acordo com as instruções dos fabricantes HUVEC: A linhagem de células endoteliais da veia de cordão umbilical humano HUVEC foi adquirida de Camcrex e mantida em meio EGM?2. K562: A linhagem celular de leucemia mielógena crônica huma- na K562 foi adquirida de ECACC e mantida em RPMI com Glutamax + FBS a 10%. U87MG: A linhagem celular de glioblastoma humano U87MG foi adquirida de ATCC e mantida de acordo com as instruções dos fabricantes. B16: A linhagem celular de melanoma murino B16 foi adquirida O de ATCC e mantida de acordo com as instruções dos fabricantes. . LNCap: A linhagem celular de câncer de próstata humana LN- í Cap foi adquirida de ATCC e mantida em RPMI com Glutamax + FBS a 10% Huh-7: Fígado humano, epitelial como cultivado em Eagles MEM com FBS a 10%, Glutamax | a 2 mM, aminoácidos não essenciais 1x, 25 ug/ml de Gentamicina 1428: (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM, Brauns- chwieg, Germany)): Linfoma de célula B humano mantido em RPMI 1640 “20 suplementadocomFBS a 10%, L-glutamina e antibióticos. . 11236: (Deutsche Sammlung fúr Mikroorganismen (DSM, Braunschwieg, Germany)): Linfoma de célula B humano mantido em RPMI 1640 suplementado com FBS a 10%, L-glutamina e antibióticos. Exemplo 3: Desenho de uma biblioteca de LNA antimiR para todas as sequências humanas de microRNA no banco de dados de mi- croRNA miRBase. A versão de miRBase usada foi a versão 12, como informado em Griffiths-Jones, S., Grocock, R.J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A.J.

2006. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomencilature. Nu- cleic Acids Res 34: D1I404, e disponível através de http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml. A Tabela 1 mostra sequências nucleotídicas 7, 8 e 9mer com-

preendendo a sequência de sementâmero (“seedmer)” de microRNA de a- cordo com o banco de dados de microRNA miRBase.

A sequência de se- mentâmero compreende o complemento reverso da região de semente de mMicroRNA.

Em algumas modalidades, o oligômero da invenção tem uma sequência nucleotídica contígua selecionada a partir das sequências 7mer, 8mer ou 9mer.

Com respeito às sequências 7mer, 82mer e 9mer, em algumas modalidades, todas as ligações internucleosídicas são fosforotioato.

As se- quências nucleotídicas 7mer, 8mer e 9mer podem consistir na sequência de análogos nucleotídicos como descrito neste pedido, tal como análogos nu- cleotídicos de LNA.

As citosinas de LNA podem ser metilcitosinas (5'metil-

citosina'). Em algumas modalidades, o LNA é beta-D-oxi-LNA. * Tabela 3 fornece uma lista de microRNAs agrupados naqueles - que podem ser visados pelos mesmos oligômeros sementâmero, tais como

Ú os 7, 8 ou 9mers fornecidos neste pedido (vide a tabela 1). | : hsa-miR-141, hsa-miR-200a

: |

Y : | 520a-3p, hsa-miR-520b, hsa-miR-5200-3p, hsa-miR-520d-3p

' Sp, hsa-miR-518€*, hsa-miR-518d-5p, hsa-miR-522*, hsa-miR-519a*

Us hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-548c-5p, hsa-miR-548d-5p

;

í Um LNA-antimiR 8-mer contra miR-21, miR-155 e miR-122 (de- signado aqui como micromiR) que é totalmente modificado por LNA e fosfo- rotiolatado (vide a figura 1 e a Tabela 6) foi construído.

Os presentes resul- tados a partir de experimentos repetidos em células MCF-7, HeLa, Raw e

Huh-7 usando um plasmídeo sensor de luciferase para miR-21, miR-155 e miR-122 demonstram que os LNA-antimiRs curtos totalmente modificados por LNA são altamente potentes em antagonizar microRNAs. [scan imierorna — eguence = re | os D araametr dB

[sean fmierorna segue = "Treo | Bro haeeatra = hs 6 mr — lceametescactoe ————bs = Be kacaerec le | Letras maiúsculas são unidades de LNA, tais como beta-D-oxi LNA. Letras minúsculas são unidades | de DNA. As ligações internucleosídicas são preferencialmente fosforotioato. Citosinas de LNA são todas preferencialmente metiladas/5-metilcitosina.

As temperaturas de fusão podem ser avaliadas em relação à sequência de microRNA madura, usando um oligonucleotídeo de microRNA . sintético (tipicamente consistindo em nucleotídeos de RNA com um esquele- " to fosfodiéster). Trms tipicamente medidas são mais altas do que Trns preditas f 5 usando oligômeros de LNA contra o RNA alvo.

Exemplo 4: Avaliação do antagonismo de miR-21 pelo LNA- antimiR SEQ ID Ne3205 em células MCF-7 usando um ensaio sensor de luciferase.

A fim de estimar a eficiência de um oligonucleotídeo LNA- —antimiR 8-mer totalmente modificado por LNA (SEQ ID Ne3205) no direcio- namento e antagonismo de miR-21, construtos sensores de luciferase foram feitos contendo um sítio alvo de combinação perfeita ao miR-21 maduro e - como controle, um sítio alvo com duas mutações na semente (figura 6). À fim de monitorar a inibição de microRNA 21, a linhagem celular de carcino- mademama MCF-7 foi transfectada com construtos de luciferase diferentes em conjunto com o antagonista de miR-21 SEQ ID Ne3205 em concentra- ções variadas em comparação com um LNA-antimiR 15-mer SEQ ID Ne3204 contra miR-21. Após 24 horas, a atividade de luciferase foi medida. Resultados: Como visto na Figura 2, o LNA-antimiR 8-mer novo totalmente modificado por LNA (SEQ ID Ne3205) mostra potência duas ve- zes mais alta comparada com a SEQ ID Ne3204, como mostrado pela des- repressão da atividade de luciferase. Pelo contrário, o construto sensor de controle miR-21 com duas más combinações na semente de miR-21 não mostrou desrepressão da atividade de luciferase de vagalume, por meio dis-

so demonstrando a especificidade do sensor miR-21 de combinação perfeita no monitoramento da atividade de miR-21 em células. A desrepressão da atividade de luciferase pelo LNA-antimiR 8-mer é claramente dose- dependente, o que não é visto com a SEQ ID Ne3204. Além disso, o novo 8- meré também muito mais potente em doses mais baixas do que SEQ ID Ne3204.

Para concluir, o LNA-antimiR 8-mer (SEQ ID Ne3205) mostra a potência significativamente melhorada na inibição de miR-21 in vitro compa- rado com o LNA-antimiR 15-mer SEQ ID Ne3204 visando miR-21.

Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de mama *. MCF-7 foi adquirida de ATCC (NeHTB-227TY). Células MCF-7 foram cultiva- - das em meio EMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glutamax E a 2 mM, NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamicina de Gentamicina.

Transfecção: 400.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 6 poços no dia antes da transfecção a fim de adquirir a confluência de 50 a 70% no dia seguinte. No dia da transfecção, células MCF-7 foram transfectadas com 0,8 ug miR-21combinação perfeita/psiCHECK2, miR-

21.mm2/psiCHECK?2 ou vetor psiCHECK2 vazio (SDS Promega) em conjun- “20 tocom1/yulde Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do " fabricante. Após 24 horas, as células foram coletadas para medições de luci- ferase.

Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e cole- tadas com raspadeira de células, após o que as células foram centrifugadas por5mina10.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e 50 ul de Tampão de Lise Passiva 1x (Promega) foram adicionados ao precipitado celular, a- pós o que as células foram postas em gelo por 30 min. As células lisadas foram centrifugadas a 10.000 rpm por 30 min após o que 20 ul foram transfe- ridos para uma placa de 96 poços e as medições de luciferase foram reali- —zadasde acordo com instruções do fabricante (Promega).

Exemplo 5: Avaliação do antagonismo de miR-21 pelo LNA- antimiR SEQ ID Nº3205 em células HeLa usando um ensaio sensor de luciferase.

Para avaliar ainda a eficiência do LNA-antimiR 8-mer totalmente modificado por LNA SEQ ID Ne3205 no direcionamento miR-21, a linhagem celular de carcinoma de cérvice HeLa também foi transfectada com os cons- trutos sensores de luciferase miR-21 anteriormente descritos ao lado da SEQ ID Ne3205 em concentrações variadas como descrito na seção acima (Figura 3).

Resultados: À SEQ ID No3205 mostra a desrepressão completa do construto sensor de luciferase miR-21 em células HeLa já em 5 nM com- parado coma SEQ ID Ne3204, que não mostrou desrepressão completa até a dose mais alta (50 nM). Além disso, o antagonismo de miR-21 pelo LNA- a antimiR SEQ 8-mer ID Ne3205 é dose-dependente. Para demonstrar a espe- - cificidade do ensaio sensor de luciferase miR-21, um sítio alvo de miR-21 S mal pareado (2 mal pareamentos na semente) também foi transfectado em células Hela, mas não mostrou desrepressão da atividade de luciferase de vagalume.

Para concluir, a SEQ ID Ne3205 totalmente modificada por LNA mostra potência significativamente melhorada na inibição in vitro de miR-21, tanto em células MCF-7 como HeLa comparada com o LNA-antimiR 15-mer “20 SEQIDNe3204. Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de cérvice humano HeLa foi adquirida de ECACC (Nº93021013). Células HeLa foram cultivadas em meio EMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glu- tamaxa2mM,NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamicina de Gentamicina.

Transfecção: 60.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 24 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 50 a 70% no dia seguinte. No dia da transfecção, células HeLa foram trans- fectadas com 0,2 ug de miR-21combinação perfeita/pbsiCHECK2, miR-

21.mMm2/psiCHECK?2 ou vetor psiCHECK2 vazio em conjunto com 0,7 ul de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. A- pós 24 horas, as células foram coletadas para medições de luciferase.

Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e 100 pl de Tampão de Lise Passiva 1x (Promega) foram adicionados a cada poço, após o que placas de 24 poços foram postas em um agitador orbital por 30 min.

As células foram coletadas e transferidas para um tubo eppendorf e centrifugadas em 10.000 rpm de 30 min após o que 10 ul foram transferidos para uma placa de 96 poços e medições de luciferase foram realizadas de acordo com instruções do fabricante (Promega). Exemplo 6: Avaliação do antagonismo de miR-155 pelo LNA- antimiR SEQ ID Ne3207 em células RAW de camundongo usando um ensaio sensor de luciferase.

Para perguntar se um LNA-antimiR 8-mer totalmente modificado - por LNA pode antagonizar efetivamente miR-155, um sítio alvo de combina- - ção perfeita de miR-155 foi clonado no mesmo vetor de luciferase (psi- Á CHECK2) e transfectado na linhagem celular leucêmica macrofágica mono- cítica de camundongo RAW.

Como os níveis endógenos de miR-155 são baixos na linhagem celular RAW, as células foram tratadas com LPS 100 ng/ml por 24 horas para induzir o acúmulo de miR-155. Resultados: As medições de luciferase mostraram que o LNA- antimiR 8-mer totalmente modificado por LNA SEQ ID Ne3207 visando miR- “ 20 155foisimilarmente eficaz em antagonizar miR-155 comparado com o LNA- . antimiR 15-mer SEQ ID Ne3206 (Figura 4). LNA-antimirs tanto mostraram uma desrepressão >50% do sensor de luciferase miR-155 na concentração 0,25 nM como inibiram miR-155 de uma maneira dose-dependente.

Conclusão: Estes dados apoiam ainda os resultados de anta- gonização de miR-21, como mostrado nos exemplos 1 e 2, demonstrando que LNA-antimiR 8-mer totalmente tiolado é altamente potente no direcio- namento de microRNA.

Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular leucêmica macrofágica —monocítica de camundongo RAW foi adquirida de ATCC (TIB-71). Células RAW foram cultivadas em meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glutamax a 4 mM e 25 ug/ml! de gentamicina de Gentamicina.

Transfecção: 500.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 6 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 50% no dia seguinte. No dia da transfecção, células MCF-7 foram transfec- tadas com 0,3 ug de miR-155 ou vetor psiCHECK2 vazio em conjunto com 4ulde Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabri- cante. Para induzir o acúmulo miR-155, LPS (100 ng/ml) foi adicionado às células RAW após incubação por 4 horas com os complexos de transfecção. Após mais 24 horas, as células foram coletadas para medições de lucifera- se. 10 Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e cole- tadas com raspadeira de células, após o que as células foram centrifugadas por 5 min em 2.500 rpm. O sobrenadante foi descartado e 50 ul de Tampão W de Lise Passiva 1x (Promega) foram adicionados ao precipitado celular, a- ' pós o que as células foram postas em gelo por 30 min. As células lisadas foram centrifugadas em 10.000 rpm por 30 min após o que 20 ul foram trans- feridos para uma placa de 96 poços e medições de luciferase foram realiza- das de acordo com instruções do fabricante (Promega). Exemplo 7: Avaliação do antagonismo de miR-122 pelo LNA- antimiR de SEQ ID Nº3208 em células HuH-7 usando um ensaio sensor “20 deluciferase.

. A potência do LNA-antimiR 8-mer totalmente modificado SEQ ID Ne3208 contra miR-122 foi avaliada na linhagem celular de hepatoma huma- no HuH-7. Células HuH-7 foram transfectadas com construto sensor de luci- ferase contendo um sítio alvo de combinação perfeita miR-122. Após 24 ho- ras, medições de luciferase foram realizadas (Figura 5). Resultados: O LNA-antimiR 8-mer totalmente modificado por LNA SEQ ID Ne3208 é mais potente do que LNA-antimiR 15-mer SEQ ID No4 em baixa concentração, como mostrado pela desrepressão do sensor de luciferase miR-122. Ambos LNA-antimiRs inibem miR-122 de uma manei- radose-dependente (Figura 5). Conclusão: O LNA-antimiR 8-mer totalmente modificado por LNA SEQ ID Ne3208 visando miR-122 mostra potência melhorada na inibi-

ção in vitro de miR-122. Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de hepatoma humano HuH-7 foi um presente gentil de R. Bartenschlager, Heidelberg. Células HuH-7 foram cultivadas em meio EMEM, suplementado com soro fetal bovi- no a 10%, Glutamax a 2 mM, NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamicina . Transfecção: 8.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 96 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 50 a 70% no dia seguinte. No dia da transfecção, células HuH-7 foram trans- fectadas com 57 ng de miR-122 ou vetor psiCHECK2 vazio em conjunto com 1 ul de Lipofectamine2000 (Invitrogen). Após 24 horas, as células foram co- & letadas para medições de luciferase. f Ensaio de luciferase: 50 ul de Tampão de Lise Passiva 1x (Pro- i mega) foram adicionados a cada poço, após o que a placa de 96 poços foi postaem um agitador orbital por 30 min. A cada poço, o sistema de análise Dual-luciferase Reporter (Promega) foi adicionado e medições de luciferase foram realizadas de acordo com instruções do fabricante (Promega). Exemplo 8. Avaliação do antagonismo de miR-21 pela com- paração de um LNA-antimiR 8-mer (SEQ ID Nºe3205) contra um 15-mer “ 20 (SEQIDNeºe3204)em células de carcinoma de próstata humano (PC3).

- Mostramos anteriormente (pedido de patente 1051), que um LNA-antimiR 8-mer que é totalmente modificado por LNA e fosforotiolado é capaz de desreprimir completamente os níveis de repórter de luciferase miR- 21 na linhagem celular de carcinoma de cérvice humano HeLa e em parte desreprimir os níveis repórter de luciferase miR-21 na linhagem celular de carcinoma de mama humano MCF-7. Depois estende-se esta abordagem de rastreamento à linhagem celular de câncer de próstata humano PC3. Para avaliar a eficiência dos diferentes oligonucleotídeos LNA-antimiR contra miR- 21, construtos repórter de luciferase foram gerados nos quais um sítio alvo de combinação perfeita do miR-21 maduro e um sítio alvo com duas más combinações na semente foram clonados na 3'UTR do gene de luciferase de Renilla (Figura 7). Para monitorar a inibição de miR-21, células PC3 foram transfectadas com diferentes construtos de luciferase em conjunto com o antagonista de miR-21 SEQ ID Ne3205 (8-mer) e para a comparação com o LNA-antimiR 15-mer de combinação perfeita SEQ ID Ne3204 em concentra- ções variadas.

Após 24 horas, a atividade de luciferase foi medida.

Resultados: Os experimentos repórter de luciferase mostraram uma desrepressão dose-dependente da atividade de repórter de luciferase MIiR-21 com o LNA-antimiR 15-mer contra miR-21 (SEQ ID Ne3204). Entre- tanto, a desrepressão completa do repórter de luciferase não foi obtida mesmo nas concentrações mais altas (Figura 7). Ao contrário, as células que foram transfectadas com o LNA-antimiR 8-mer totalmente LNA substituído mostraram desrepressão completa já em 1 nM, indicando potência significa- "” tivamente melhorada comparado com o LNA-antimiR 15-mer.

O repórter de E luciferase controle que abriga um sítio alvo de má combinação de miR-21 ' não foi afetado por nenhum LNA-antimiR, demonstrando alta especificidade deambosLNA-antimiRs.

Conclusão: O micromer é muito mais potente do que o LNA- antimiR 15-mer no direcionamento de miR-21 e mostrou por enquanto ser o mais potente em células de carcinoma de próstata.

Materiais e Métodos: “20 Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de próstata À humano PC3 foi adquirida de ECACC (Ne90112714). Células PC3 foram cul- tivadas em meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Gluta- max a 2 mM e 25 ug/ml de gentamicina . Transfecção: 100.000 células foram semeadas por poço em uma —placade 12 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 50% no dia seguinte.

No dia da transfecção, células PC3 foram transfecta- das com 0,3 ug de miR-21 ou vetor psiCHECK2 vazio em conjunto com 1,2 ul de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabrican- te.

Também foram transfectadas concentrações variadas de LNA-antimiRs. — Após 24 horas, as células foram coletadas para medições de luciferase.

Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e 250 pl de Tampão de Lise Passiva 1 x (Promega) foram adicionados aos poços.

As placas foram colocadas em um agitador por 30 min., após o que os lisa- dos celulares foram transferidos para tubos eppendorf.

O lisado celular foi centrifugado de 10 min em 2.500 rpm após o que 20 ul foram transferidos para uma placa de 96 poços e medições de luciferase foram realizadas de acordo com instruções do fabricante (Promega). Exemplo 9. Avaliação da especificidade do antagonismo de miR-21 por um LNA-antimiR 8-mer Para investigar a especificidade do presente LNA-antimiR curto visando miR-21, desenhou-se LNA-antimiR 8-mer controle com má combi- nação (SEQ ID Ne3218) contendo 2 más combinações na sequência de re- conhecimento de semente (vide a figura 8). Os construtos repórter de lucife- - rase descritos no exemplo 1 foram transfectados na linhagem celular de car- - cinoma de cérvice humana HeLa em conjunto com o oligo de má combina- Ú ção de LNA controle SEQ ID Ne3218 e sua eficácia foi comparada com o LNA-antimiR 8-mer (SEQ ID Ne3205) visando miR-21. Após 24 horas, a ati- vidade de luciferase foi medida.

Resultados: Como mostrado na Figura 8, a transfecção do LNA-antimiR 8-mer totalmente modificado por LNA em células HeLa resultou na desrepressão completa da luciferase miR-21 repórter já em 5 nM.

Ao con- “ 20 trário, quando as células foram transfectadas com o oligo controle de má g combinação de LNA 8-mer, combinado com os resultados obtidos com o mMiR-21 repórter de luciferase controle que tem duas más combinações na semente de miR-21, estes dados demonstram alta especificidade do LNA- antimiR 8-mer totalmente LNA-subsituído no direcionamento de miR-21 em células Hela.

Análise do banco de dados de sequência de microRNA miR- Base mostrou que a sequência de reconhecimento de miR-21, do LNA- antimiR SEQ ID Ne3205 é única para o microRNA 21. Entretanto, quando reduzido o comprimento do micromer para 7 nucleotídeos, não é específico somente para miR-21, uma vez que ath-miR-844, mmu-miR-590-3p e has- —miR-590-3p também são visados.

Conclusão: A troca de duas posições de nucleotídeo dentro do LNA-antimiR 8-mer com dois nucleotídeos mal combinados aboliu comple-

tamente a atividade antagonista do LNA-antimiR para miR-21.

Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de cérvice humana HeLa foi adquirida de ECACC (Nº93021013). Células HeLa foram cultivadas em meio EMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glu- tamax a 2 mM, NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamicina .

Transfecção: 60.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 24 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 50 a 70% no dia seguinte. No dia da transfecção, células HeLa foram trans- fectadas com 0,2 ug de miR-21combinação perfeita/pbsiCHECK2, miR-

21.mm2/psiCHECK2 ou vetor psiCHECK2 vazio em conjunto com 0,7 ul de " Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. í Também foram transfectadas concentrações variadas de LNA-antimiRs. A- i pós 24 horas, as células foram coletadas para medições de luciferase.

Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e 100 ul de Tampão de Lise Passiva 1 x (Promega) foram adicionados a cada po- ço, após o que placas de 24 poços foram postas em um agitador orbital por 30 min. As células foram coletadas e transferidas para um tubo eppendorf e centrifugadas em 10.000 rpm por 30 min após o que 10 ul foram transferidos “ 20 parauma placade 96 poçose medições de luciferase foram realizadas de p acordo com instruções do fabricante (Promega).

Exemplo 10. Avaliação do menor comprimento possível de um LNA-antimiR totalmente modificado por LNA que medeia o antago- nismo eficaz para miR-21.

Para investigar ainda os requerimentos de comprimento LNA- antimiR, desenhou-se um LNA-antimiR 7-mer e um 6-mer direcionados a miR-21, tanto oligonucleotídeos totalmente modificado por LNAs como fosfo- rotiolados. Os construtos repórter de luciferase miR-21 foram transfectados em células HeLa junto com LNA-antimiRs em concentrações variadas. Medi- ções de |luciferase foram realizadas após 24 horas.

Resultados: Como visto na Figura 9, o LNA-antimiR 7-mer me- deia a desrepressão do plasmídeo repórter de luciferase miR-21, mas em potência mais baixa comparada com o LNA-antimiR 8-mer (SEQ ID Ne3205). No entanto, uma tendência dose-dependente ainda pode ser observada. Ao contrário, o LNA-antimiR 6-mer não mostrou atividade inibitória. Conclusão: Para concluir, o menor comprimento possível de um —LNA-antimiR que é capaz de mediar a inibição miR-21 é 7 nucleotídeos. En- tretanto, o LNA-antimiR 7-mer é menos potente comparado com o LNA- antimiR 8-mer para miR-21. Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de cérvice humana HelLa foi adquirida de ECACC (Ne93021013). Células HeLa foram cultivadas em meio EMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glu- ” tamax a 2 mM, NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamicina . - Transfecção: 60.000 células foram semeadas por poço em uma Ú placa de 24 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 50a70% no dia seguinte. No dia da transfecção, células HeLa foram trans- fectadas com 0,2 ug de miR-21combinação perfeita/pbsiCHECK2, miR-

21.mMm2/psiCHECK2 ou vetor psiCHECK2 vazio em conjunto com 0,7 ul de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. Também foram transfectadas concentrações variadas de LNA-antimiRs. A- “ 20 pós24horas,as células foram coletadas para medições de luciferase. Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e 100 pl de Tampão de Lise Passiva 1 x (Promega) foram adicionados a cada po- ço, após o que as placas de 24 poços foram postas em um agitador orbital por 30 min. As células foram coletadas e transferidas para um tubo eppen- dorfe centrifugadas em 10.000 rpm por 30 min após qual 10 ul foram trans- feridos para uma placa de 96 poços e medições de luciferase foram realiza- das de acordo com instruções do fabricante (Promega). Exemplo 11. Avaliação do comprimento de LNA-antimiRs to- talmente LNA-substituídos antagonizando miR-21 A seguir, foi investigado o efeito do aumento do comprimento de um LNA-antimiRs totalmente LNA substituído 9-mer a um 14-mer no antago- nismo de miR-21 em células Hela. Os LNA-antimiRs resultantes foram transfectados em células Hela em conjunto (Figura 10) com construtos re- pórter de luciferase miR-21. Medições de luciferase foram realizadas após 24 horas. Resultados: LNA-antimiR 9-mer SEQ ID Ne3211 (9-mer) mos- troua desrepressão dose-dependente do repórter de luciferase miR-21 que não alcançou a desrepressão completa, como demonstrado para o LNA- antimiR 7-mer (SEQ ID Ne3210). Aumentar o comprimento de 10-mer para 14-mer (SEQ ID Ne3212, SEQ ID Ne3213 e SEQ ID Ne3214) reduziu a po- tência como mostrado pela desrepressão menos eficiente do repórter miR-

21. Conclusão: Como mostrado na Figura 10, o mais longo LNA- o antimiR totalmente modificado por LNA e fosforotiolado que ainda é capaz - de mediar a inibição de miR-21 é um LNA-antimiR 9-mer SEQ ID Ne3211. ' Entretanto, é claramente menos eficiente do que LNA-antimiRs 7-mer e 8- mer. Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de cérvice humana HeLa foi adquirida de ECACC (Neg93021013). Células HeLa foram cultivadas em meio EMEM, suplementado com soro fe- tal bovino a 10%, Glutamax a 2 MM, NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamicina . “20 Transfecção: 60.000 células foram semeadas por poço em uma . placa de 24 poços no dia antes da transfecção para alcançar a confluência de 50 a 70% no dia seguinte. No dia da transfecção, células HeLa foram transfectadas com 0,2 ug de miR-21combinação perfeita/psiCHECK2, miR-

21.mm2/psiCHECK?2 ou vetor controle de psiCHECK?2 vazio sem sítio alvo em conjunto com 0,7 ul de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. Também foram transfectadas concentrações varia- das de LNA-antimiRs. Após 24 horas, as células foram coletadas para medi- ções de luciferase. Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e 100 uldeTampão de Lise Passiva 1 x (Promega) foram adicionados a cada po- ço, após o que as placas de 24 poços foram postas em um agitador orbital por 30 min. As células foram coletadas e transferidas para um tubo eppen-

dorf e centrifugadas em 10.000 rpm por 30 min após qual 10 ul foram trans- feridos para uma placa de 96 poços e medições de luciferase foram realiza- das de acordo com instruções do fabricante (Promega).

Exemplo 12. Determinação posição ideal de um LNA-antimiR 8-merdentro da sequência de reconhecimento de miR alvo.

Os presentes experimentos mostraram que o LNA-antimiR to- talmente LNA- modificado fosforotiolado mais potente tem 8 nucleotídeos de tamanho. Para estimar posição ideal de um LNA-antimiR 8-mer dentro da sequência de reconhecimento miR alvo, desenhamos quatro LNA-antimiRs 8-mer diferentes totalmente modificado por LNAs recobertos através da se- quência miR-21 madura como mostrado na Figura 11. Os LNA-antimiRs dife- ” rentes foram cotransfectados em conjunto com construtos repórter de lucife- . rase miR-21 em células HeLa. Medições de luciferase foram realizadas após ' 24 horas.

Resultados: O único LNA-antimiR que mediou silenciamento e- ficiente de miR-21 como medido pelo repórter de luciferase foi SEQ ID Ne3205, que visa a região de semente de miR-21. Nenhuma SEQ ID Ne3215 que foi desenhada para cobrir a extremidade 3' da semente (direcionamento de semente de 50%) mostrou efeito, nem fez outros dois LNA-antimiRs SEQ “20 ID Ne32160ouSEQID Ne3217, que foram posicionados para visar a região : central e a extremidade 3' do miR-21 maduro, respectivamente.

Conclusão: O único LNA-antimiR 8-mer que mediou silencia- mento potente de miR-21 é aquele que visa a semente do miR-21.

Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de cérvice humana Hela foi adquirida de ECACC (Ne93021013). Células HelLa foram cultivadas em meio EMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glu- tamax a 2 mM, NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamicina .

Transfecção: 60.000 células foram semeadas por poço em uma —placade 24 poços no (dia antes da transfecção para alcançar a confluência de 50 a 70% no dia seguinte. No dia da transfecção, células HeLa foram transfectadas com 0,2 ug de miR-21combinação perfeita/psiCHECK2, miR-

21.mm2/psiCHECK2 ou vetor psiCHECK2 vazio em conjunto com 0,7 ul Li- pofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. Tam- bém foram transfectadas concentrações variadas de LNA-antimiRs. Após 24 horas, células foram coletadas para medições de luciferase.

Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e 100 pl de Tampão de Lise Passiva 1 x (Promega) foram adicionados a cada po- ço, após o que as placas de 24 poços foram postas em um agitador orbital por 30 min. As células foram coletadas e transferidas para um tubo eppen- dorf e centrifugadas em 10.000 rpm por 30 min após qual 10 ul foram trans- feridos para uma placa de 96 poços e medições de luciferase foram realiza- das de acordo com instruções do fabricante (Promega).

" Exemplo 13. Validação da interação do sítio alvo de miR-21 . no Pdcd4-3'-UTR e miR-21 usando o LNA-antimiR 8-mer SEQ ID Nº3205. ] A proteína supressora de tumor Pdcd4 inibe a transformação —neoplásica, promoção e progressão tumoral induzida por TPA. Além disso, foi mostrado que Pdced4 é regulada para cima na apoptose em resposta a diferentes indutores. Além disso, regulação para baixo de Pded4 em câncer de pulmão e colorretal também foi associada com um prognóstico pior para o paciente. Recentemente, Asangani et al e Frankel et al mostraram que 1 20 Pdcd4-3-UTR contém um sítio alvo para miR-21 conservado, e a transfec- A ção de células com um antimiR-21, resultou em um aumento na proteína Pdecd4. Por isso, foi construído um plasmídeo repórter de luciferase, abri- gando 313 nucleotídeos da região 3UTR de Pded4 que engloba o sítio alvo de miR-21 acima mencionado, que foi cotransfectado em conjunto com LNA- antimiRs diferentes em células HelLa. Os diferentes LNA-antimiRs foram; SEQ ID Ne3205 (8-mer, combinação perfeita) ou SEQ ID Ne3218 (8-mer, má combinação). Medições de luciferase foram realizadas após 24 horas. Resultados: Como mostrado na Figura 12, em células transfec- tadas com o Pded4 3'UTR repórter de luciferase e SEQ ID Ne3205, um au- mento na atividade de luciferase foi observado, indicando interação entre o 3 UTR de Pded4 e miR-21. Entretanto, transfectando as células com o com- posto de má combinação, SEQ ID Ne3218, nenhuma modificação na ativida-

de de luciferase foi observada, o que foi esperado uma vez que o composto não antagoniza miR-21. Comparando o LNA-antimiR 8-mer contra dois LNA- antimiRs maiores desenhados, o LNA-antimiR curto totalmente modificado por LNA e fosforotiolado foi significativamente mais potente, confirmando dadosde ensaio de luciferase prévios.

Conclusão: Estes dados concluem que SEQ ID Ne3205, que an- tagoniza miR-21, pode regular a interação entre 3'UTR de Pdcd4 e miR-21.

Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de cérvice humano HeLa foi adquirida de ECACC (Nº93021013). Células HeLa foram cultivadas em meio EMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glu- ” tamax a 2 mM, NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamicina .

" Transfecção: 60.000 células foram semeadas por poço em uma ' placa de 24 poços no dia antes da transfecção para alcançar a confluência de50a70% no dia seguinte. No dia da transfecção, as células HeLa foram transfectadas com 0,2 ug de Pded4-3 UTR/psiCHECK2 ou vetor psiCHECK2 vazio em conjunto com 0,7 ul de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. Concentrações variadas dos oligonucleotídeos LNA-antimiR também foram transfectadas. Após 24 horas, as células foram Á 20 coletadas para medições de luciferase.

- Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e 100 ul de Tampão de Lise Passiva 1 x (Promega) foram adicionados a cada po- ço, após o que as placas de 24 poços foram postas em um agitador orbital por 30 min. As células foram coletadas e transferidas para um tubo eppen- dorfe centrifugadas em 10.000 rpm por 30 min após qual 10 ul foram trans- feridos para uma placa de 96 poços e medições de luciferase foram realiza- das de acordo com instruções do fabricante (Promega).

Exemplo 14. Comparação de um LNA-antimiR 8-mer (SEQ ID Ne3207) com um LNA-antimiR 15-mer (SEQ ID Nºe3206) em antagonismo demiR-155em células RAW de camundongo.

Para perguntar se a presentepresente abordagem de uso de LNA-antimiRs curtos pode ser adaptada ao direcionamento de outros miR-

NAs foi desenhado um LNA-antimiR 8-mer totalmente modificado por LNA contra microRNA 155. Um sítio alvo de combinação perfeita de miR-155 foi clonado na 3'UTR do gene de luciferase no plasmídeo repórter psiCHECK2 e transfectado na linhagem celular de macrófago de camundongo RAW em conjunto com um LNA-antimiR 8-mer ou um 15-mer. Como os níveis endó- genos de miR-155 são baixos na linhagem celular RAW, as células foram tratadas com LPS 100 ng/ml por 24 horas para induzir o acúmulo de miR-

155. Após 24 horas, análise de luciferase foi realizada. Resultados: Medições de luciferase mostraram que o LNA- —antimiR 8-mer totalmente modificado por LNA SEQ ID Ne3207 visando miR- 155 foi similarmente eficaz em antagonizar miR-155 em comparação com o -» LNA-antimiR 15-mer SEQ ID Ne3206 (Figura 13). LNA-antimiRs tanto mos- . traram a desrepressão de > 50% do sensor de luciferase miR-155 na con- ' centração de 0,25 nM quanto inibiram miR-155 de uma maneira dose- dependente. Análise do banco de dados de sequência de microRNA miRBase mostrou que a sequência de reconhecimento de miR-155, do LNA-antimiR SEQ ID Ne3207 é única para o microRNA 155. Entretanto, quando reduzido o comprimento de LNA-antimiR para 7 nucleotídeos, não é específico so- : 20 mente para miR-155, mdv1I-mMIR-M4 e kshv-miR-K12-11 também são visa- y dos. Conclusão: Um LNA-antimiR 8-mer totalmente modificado por LNA e fosforotiolado é igualmente potente comparado com um LNA-antimiR 15-mer de um desenho de LNA/DNA misturado antagonizando miR-155. Dessa forma, presente abordagem de uso de LNA-antimiRs curtos pode ser prontamente adaptada ao direcionamento de outro miRNAs Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de macrófago de camun- dongo RAW 264.7 foi adquirida de ATCC (TIB-71). As células RAW foram cultivadas em meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glu- tamax a 4 MM e 25 ug/ml de gentamiícina . Transfecção: 500.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 6 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 50% no dia seguinte. No dia da transfecção, as células RAW 264.7 foram transfectadas com 0,3 ug de miR-155 psiCHECK2/pareamento perfeito ou vetor psiCHECK2 vazio em conjunto com 10 ul de Lipofectamine2000 (Invi- trogen) de acordo com instruções do fabricante. Também foram transfecta- das concentrações variadas de LNA-antimiRs. Para induzir o acúmulo de miR-155, LPS (100 ng/ml) foi adicionado às células RAW após incubação por 4 horas com os complexos de transfecção. Após mais 24 horas, as célu- las foram coletadas para medições de luciferase.

Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e cole- tadas com raspadeira de células, após o que as células foram centrifugadas (F por 5 min em 2.500 rpm. O sobrenadante foi descartado e 50 ul de Tampão fá de Lise Passiva 1 x (Promega) foram adicionados ao precipitado celular, a- Í pós o que as células foram postas em gelo por 30 min. As células lisadas foram centrifugadas em 10.000 rpm por 30 min após o que 20 ul foram trans- feridos para uma placa de 96 poços e medições de luciferase foram realiza- das de acordo com instruções do fabricante (Promega). Exemplo 15. Avaliação dos níveis de proteína c/EBPB como uma leitura funcional do antagonismo de miR-155 por LNA-antimiR cur- “20 to(SEQIDNe3207).

- Como uma leitura funcional do antagonismo de miR-155 por LNA-antimiR curto (SEQ ID Ne3207) determinamos os níveis proteicos de um novo miR-155 alvo, c/EBPB. A linhagem celular RAW de macrófago de camundongo foi transfectada em conjunto com um LNA-antimiR 8-mer (SEQ 1D Noº3207) ou um 15-mer (SEQ ID No3206) na ausência ou na presença de pré-miR-155. Como controles de má combinação do 15-mer, SEQ ID No4 foi usado, o qual visa miR-122 e para o 8-mer SEQ ID Ne3205 foi usado, que visa miR-21. Estes dois miRNAs controle não regulam os níveis de expres- são de c/EBPB. LPS foi usado para induzir o acúmulo miR-155 e as células foram coletadas após 16 horas com LPS. c/EBPB tem três isoformas; LIP, LAP e LAP* que foram detectadas pela análise por western blot e as mes- mas membranas foram remarcadas com beta-tubulina como controle de car-

regamento.

Resultados: Razões foram calculadas para c/EBPB LIP e beta- tubulina como indicado na Figura 14. As células RAW que foram transfecta- das com LNA-antimiR 15-mer e sem pré-miR-155 todas mostraram razões iguais c/EBPB LIP/beta-tubulina, devido à inibição de miR-155 aumentar os níveis de LIP c/EBPB (Figura 14, painel esquerdo). Em comparação, a trans- fecção de pré-miR-155 em células RAW resultou em níveis reduzidos de LIP de c/EBPB como esperado, se c/EBPB foi um alvo de miR-155, como mos- trado nas colunas com extratos proteicos de células RAW tratadas sem LNA ou com uma má combinação. Entretanto, os extratos proteicos de células RAW transfectadas com LNA-antimiR contra miR-155, mostraram um au- . mento dos níveis de LIP c/EBPB. Os mesmos experimentos também foram ' realizados com LNA-antimiR-155 8-mer (SEQ ID Ne3207) e como mostrado Ú na Figura 14 (painel direito), resultados comparáveis àqueles com LNA- antimiR 15-mer SEQ ID Ne3206 foram obtidos.

Conclusão: Antagonismo de miR-155 usando um LNA-antimiR 8-mer ou um 15-mer leva à desrepressão do alvo direto c/EBPB.

Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular RAW 264.7 de macrófago á 20 de camundongo foi adquirida de ATCC (TIB-71). Células RAW foram cultiva- NM das em meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glutamax a 4 MM e 25 ug/ml de gentamicina .

Transfecção: 500.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 6 poços no dia antes da transfecção para alcançar a confluência de 50% no dia seguinte. No dia da transfecção, células RAW 264.7 foram trans- fectadas com 5 nmols de pré-miR-155 (Ambion) e/ou LNA-antimiR a 5 nM em conjunto com 10 ul de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. Também foram transfectadas concentrações varia- das de LNA-antimiRs. Para induzir o acúmulo de miR-155, LPS (100 ng/ml) foi adicionado às células RAW após incubação por 4 horas com os comple- xos de transfecção. Após 16 horas, as células foram coletadas para extração proteica e análise por western blot.

Western blot: As células foram lavadas com PBS, tripsinizadas, transferidas para tubos eppendorf e 250 ul de tampão de lise (1XRIPA) foram adicionados. O lisado celular foi colocado no gelo por 20 min e centrifugado em 10.000 rpm por 10 minutos. A concentração proteica foi medida com Co- omassie Plus de acordo com instruções do fabricante e 80 ug foram carre- gados em um gel BIS-TRIS de 4 a 12%. A membrana foi incubada durante a noite a 4ºC com o anticorpo de camundongo monoclional primário C/EBPB (Santa Cruz) com uma concentração 1:100. As bandas imunorreativas foram visualizadas com ECL plus (Amersham). Exemplo 16. Antagonismo de miR-106b por LNA-antimiR 8- mer totalmente modificado por LNA (SEQ ID Ne3221) Mm Para confirmar que a presentepresente abordagem de uso de T LNA-antimiRs curtos pode ser adaptada ao direcionamento de outros miR- ' NAs foi desenhado um LNA-antimiR 8-mer totalmente modificado por LNA contramicro-RNA-106b. Um sítio alvo de combinação perfeita de miR-106b foi clonado na 3'UTR do gene de luciferase no vetor (psiCHECK2) e trans- fectado na linhagem celular de carcinoma de cérvice humano HeLa em con- junto com um LNA-antimiR curto (SEQ ID Ne3221) ou com um LNA-antimiR 15-mer (SEQ ID Ne3228) em concentrações variadas. Medições de lucifera- i 20 seforam realizadas após 24 horas.

o. Resultados: Transfecção do LNA-antimiR 8-mer SEQ ID Ne3221 contra miR-106b resultou na inibição dose-dependente de miR-106b como mostrado pela desrepressão do repórter de luciferase, que foi comple- tamente desreprimido na concentração de 1 nM de LNA-antimiR (Figura 15).

Resultados comparáveis foram obtidos usando o LNA-antimiR 15-mer SEQ ID Ne3228 demonstrando que um LNA-antimiR 8-mer é similarmente potente a um 15-mer. Conclusão: Direcionamento de miR-106b em células Hela mostra que um LNA-antimiR 8-mer totalmente modificado por LNA e fosforo- tiolado é igualmente potente comparado com um LNA-antimiR mixâmero LNA/DNA 15-mer. Materiais e Métodos:

Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de cérvice humana HeLa foi adquirida de ECACC (Ne93021013). Células HeLa foram cultivadas em meio EMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glu- tamax a 2 mM, NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamícina .

Transfecção: 5.200 células foram semeadas por poço em uma placa de 96 poços no dia antes da transfecção para alcançar a confluência de 50 a 70% no dia seguinte. No dia da transfecção, células HeLa foram transfectadas com 57 ng de miR-21combinação perfeita/psiCHECK2, miR-

21.mm2/psiCHECK?2 ou vetor psiCHECK2 vazio em conjunto com 0,14 ul de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. Também foram transfectadas concentrações variadas de LNA-antimiRs. A- YR pós 24 horas, células foram coletadas para medições de luciferase.

f Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e 30 ul Ô de Tampão de Lise Passiva 1 x (Promega) foram adicionados a cada poço, apóso que as placas de 24 poços foram postas em um agitador orbital por 30 min. As células foram coletadas e transferidas para tubos eppendorf e centrifugadas em 10.000 rpm por 30 min após o que medições de luciferase foram realizadas de acordo com instruções do fabricante (Promega). Exemplo 17. Antagonismo de miR-19a por LNA-antimiR 8- Ú 20 mertotalmente modificado por LNA (SEQ ID Nº3222) - Para confirmar ainda que a presente abordagem de uso de LNA- antimiRs curtos pode ser prontamente adaptada ao direcionamento de ou- tros miRNAs, foi desenhado um LNA-antimiR 8-mer totalmente modificado por LNA contra micro-RNA-19a. Um sítio alvo de combinação perfeita de —miR-19afoiclonado na 3'UTR do gene de luciferase no vetor psiCHECK2. O plasmídeo repórter foi transfectado na linhagem celular de carcinoma de cérvice humano Hela em conjunto com um LNA-antimiR curto (SEQ ID Ne3222) ou com um LNA-antimiR 15-mer (SEQ ID Ne3229) visando miR-19a em concentrações variadas. Medições de luciferase foram realizadas após 24horas.

Resultados: Como mostrado na Figura 16, a transfecção do LNA-antimiR 15-mer SEQ ID Ne3229 em HeLa eficientemente antagoniza miR-19a como demonstrado pela desrepressão completa na concentração de 1 nM de LNA-antimiR. Em comparação, a transfecção do LNA-antimiR 8- mer SEQ ID Ne3222 resultou no antagonismo de miR-19a eficaz já na con- centração de 0,5 nM, indicando que este LNA-antimiR 8-mer é pelo menos igualmente potente comparado com um LNA-antimiR 15-mer em células He- La.

Conclusão: O direcionamento de miR-19a em células HeLa mostra que um LNA-antimiR 8-mer totalmente modificado por LNA e fosforo- tiolado é pelo menos igualmente potente comparado com um LNA-antimiR 15-mermixâmero LNA/DNA. Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de "” carcinoma de cérvice humano HeLa foi adquirida de ECACC (Ne93021013). ' Células HeLa foram cultivadas em meio EMEM, suplementado com soro fe- ã tal bovino a 10%, Glutamax a 2 mM, NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamicina .

Transfecção: 5.200 células foram semeadas por poço em uma placa de 96 poços no dia antes da transfecção para alcançar a confluência de 50 a 70% no dia seguinte. No dia da transfecção, as células HeLa foram transfectadas com 57 ng de miR-21combinação perfeita/psiCHECK2, miR-

21.mm2/psiCHECK?2 ou vetor psiCHECK?2 vazio em conjunto com 0,14 ul de i 20 Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. " Também foram transfectadas concentrações variadas de LNA-antimiRs. A- pós 24 horas, células foram coletadas para medições de luciferase.

Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e 30 ul de Tampão de Lise Passiva 1 x (Promega) foram adicionados a cada poço, apóso que placas de 24 poços foram postas em um agitador orbital por 30 min. As células foram coletadas e transferidas para tubos eppendorf e centri- fugadas em 10.000 rpm por 30 min após o que as medições de luciferase foram realizadas de acordo com instruções do fabricante (Promega).

Exemplo 18. Direcionamento de uma família de microRNA usando LNA-antimiR curto, totalmente LNA-substituído.

A seguir, investigou-se se é possível visar uma família de mi- CroRNA que usa um LNA-antimiR 7-mer curto simples complementar à se-

quência de semente que é característica em todos os membros da família (vide a figura 17). Neste experimento, concentrou-se o foco em miR-221 e MIR-222 que são superexpressos em tumores sólidos de cólon, pâncreas, próstata e estômago. Também foi mostrado que miR-221 e miR-222 são mi- —croRNAs ainda mais significativamente regulados para cima em glioblastoma multiforme. Além disso, a superexpressão de miR-221 e miR-222 pode con- tribuir para o crescimento e progressão do carcinoma de próstata, pelo me- nos em parte pelo bloqueio da proteína supressora de tumor p27. Um sítio alvo de combinação perfeita tanto de miR-221 como de miR-222, respecti- vamente, foi clonado na 3UTR do gene de luciferase que resulta em dois construtos repórter. Estes construtos então foram transfectados separados o ou combinados na linhagem celular de carcinoma de próstata, PC3. Além do 7 7-mer, visando tanto miR-221 como miR-222, foi também cotransfectado um Í LNA-antimiR 15-mer (15mer) visando miR-221 (SEQ ID Ne3223) ou miR-222 (SEQID Ne3224), cada um transfectado separadamente ou em conjunto (vi- de a figura 18 à esquerda).

Resultados: Como mostrado na Figura 18, a transfecção de cé- lulas PC3 com LNA-antimiR SEQ ID Ne3223 contra miR-221 resultou na ini- bição eficiente de miR-221 na concentração de 1 nM de LNA-antimiR. Um Ú 20 efeito inibitório também é observado usando o plasmídeo repórter de lucife- - rase para miR-222 bem como cotransfectando tanto repórteres de luciferase de miR-221 como miR-222 simultaneamente em células PC3. Este efeito inibitório é ainda mais provável devido à sequência de semente compartilha- da entre miR-221 e miR-222. Similarmente, a transfecção de células PC3 como LNA-antimiR SEQ ID Ne3224 contra miR-222 resultou na inibição efi- ciente de miR-222 na concentração de 1 nM de LNA-antimiR como mostrado pela desrepressão completa do repórter de luciferase de miR-222. Um efeito inibitório também é observado usando o plasmídeo repórter de luciferase para miR-222 bem como cotransfectando tanto repórteres de luciferase de —miR-221 como de miR-222 simultaneamente em células PC3. Cotransfecção de compostos tanto de LNA-antimiR SEQ ID Ne3223 como de SEQ ID Noe3224 contra miR-221 e miR-222, respectivamente, (vide a figura 18 à es-

querda), resultou na inibição eficaz de ambos miRNAs como mostrado pela desrepressão completa de plasmídeos repórter de luciferase tanto quando separadamente transfectados como quando cotransfectados em células PC3. De maneira interessante, a transfecção de um LNA-antimiR 7-mer sim- ples totalmente modificado por LNA (SEQ ID Ne3225) visando a sequência de semente de miR-221 e miR-222 em células PC3 resultou no antagonismo eficiente, dose-dependente de miR-221 e miR-222 simultaneamente como mostrado pela desrepressão completa de plasmídeos repórter de luciferase tanto quando separadamente transfectado como quando cotransfectado em células PC3. Isto demonstra que um LNA-antimiR LNA-substituído simples, curto pode visar efetivamente sequências de semente por meio disso anta- a gonizando famílias inteiras de microRNA simultaneamente. Análise do banco ' de dados de sequência de microRNA miRBase mostrou que a sequência de i reconhecimento de semente miR-221/222, do LNA-antimiR SEQ ID Ne3225 é única para ambos os miRNAs.

Conclusão: Os presentes resultados demonstram que LNA permite o desenho e síntese de oligonucleotídeos LNA-antimiR curtos total- mente LNA-substituídos que podem visar efetivamente sequências de se- mente de microRNA por meio disso antagonizando famílias inteiras de mi- Ú 20 — croRNA simultaneamente. - Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular PC3 de carcinoma de prós- tata humano foi adquirida de ECACC (Nº90112714). Células PC3 foram cul- tivadas em meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Gluta- maxa2mMe25 ug/mlde gentamicina .

Transfecção: 100.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 12 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 50% no dia seguinte. No dia da transfecção, as células PC3 foram transfec- tadas com 0,3 ug do plasmídeo repórter de luciferase de miR-221 ou de miR-222 ou com o vetor psiCHECK2 vazio sem sítio alvo de miRNA como controle em conjunto com 1,2 ul de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acor- do com instruções do fabricante. Após 24 horas, as células foram coletadas para medições de luciferase.

Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e 250 ul de Tampão de Lise Passiva 1 x (Promega) foram adicionados aos poços.

As placas foram colocadas em um agitador por 30 min., após o que os lisa- dos celulares foram transferidos para tubos eppendorf.

O lisado celular foi centrifugado por 10 min em 2.500 rpm após o que 20 ul foram transferidos para uma placa de 96 poços e medições de luciferase foram realizadas de acordo com instruções do fabricante (Promega). Exemplo 19. Avaliação dos níveis proteicos de p27 como uma leitura funcional do antagonismo da família miR-221/222 pelo LNA- antimiR 7-mer SEQ ID Ne3225. a Trabalho prévio mostrou (le Sage et al. 2007, Galardi et al. 2007) : que miR-221 e miR-222 regulam pós-transcricionalmente a expressão do ] gene supressor de tumor p27, que está envolvido na regulação do ciclo celu- lar.

Nestes estudos, foi mostrado que a regulação para baixo de miR-221 e mMiR-222 aumentou os níveis de expressão de p27. Dessa forma, como uma leitura funcional do antagonismo da família miR-221/222 pelo LNA-antimiR 7-mer SEQ ID Ne3225 foram determinados os níveis proteicos de p27 após transfecção do LNA-antimiR SEQ ID Ne3225 em células PC3 em compara- “20 çãocom um controledemá combinação de LNA 8-mer.

Após 24 horas, as - células foram coletadas para análise por western blot (Figura 19). Resultados: Como mostrado na Figura 19, a transfecção do LNA-antimiR 7-mer SEQ ID Ne3225 visando a sequência de semente em MiR-221 e miR-222 resultou no aumento dose-dependente dos níveis protei- cos de p27 comparado com não transfectadas ou comparado com células PC3 transfectadas com controle de má combinação de LNA.

Estes resulta- dos claramente demonstram que LNA-antimiR 7-mer é capaz de antagonizar efetivamente a família miR-221/222 que leva à desrepressão do alvo direto p27 ao nível proteico.

Conclusão: Um LNA-antimiR 7-mer totalmente modificado por LNA visando a sequência de semente em família de miR-221/222 efetiva- mente antagonizou ambos miRNAs levando à desrepressão do alvo direto p27 ao nível proteico.

Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de PC3 de carcinoma de próstata humano foi adquirida de ECACC (Ne90112714). Células PC3 foram cultivadas em meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glu- tamax a 2 mM e 25 ug/ml de gentamicina . Transfecção: 250.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 6 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 50% no dia seguinte.

No dia da transfecção, as células PC3 foram transfec- tadas com LNA-antimiRs em concentrações variadas com Lipofectami- ne2000. As células foram coletadas após 24 horas de extração proteica e ” análise por western blot. 7 Westem blot: As células foram lavadas com PBS, tripsinizadas, transferidas para tubos eppendorf e 250 ul de tampão de lise (1XRIPA) foram adicionados.

O lisado celular foi colocado no gelo por 20 min, então centrifu- gado em 10.000 rpm por 10 minutos.

A concentração proteica foi medida com Coomassie Plus de acordo com instruções do fabricante e 100 ug foram carregados em um gel BIS-TRIS de 4 a 12%. A membrana foi incubada du- rante a noite a 4ºC com o anticorpo de camundongo monocional primário ] 20 para p27 (BD Biosciences) em uma diluição 1:1000. Bandas imunorreativas . foram visualizadas com ECL Plus (Amersham). Exemplo 20. Temperaturas de fusão de dúplices (Tn) de LNA-antimiRs.

Como mostrado na Tabela 5, os valores de Th, aumentam com o aumento do comprimento dos LNA-antimiRs curtos totalmente modificado (vide valores de T,, da SEQ ID Ne3205, SEQ ID Ne3209-3214 na Tabela 7). O efeito inibitório ideal foi alcançado com o LNA-antimiR 8-mer SEQ ID Nºe3205 contra miR-21, ao passo que a Tm muito baixa do SEQ 6-mer ID Ne32089 mais provavelmente não é suficiente para mediar o antagonismo do —miR-21 alvo.

Por outro lado, aumentar o comprimento além de um 10-mer (SEQ ID Ne3212) aumenta significativamente a Tr, reduzindo simultanea- mente a atividade inibitória como medido usando repórter luciferase miR-21,

que é ainda mais provável devido à alta propensão dos LNA-antimiRs total- mente modificados 12- e 14-mer de formar homodímeros.

Experimentos u- sando uma janela móvel de LNA-antimirs 8-mer totalmente modificado por LNA através da sequência de reconhecimento de mir-21 claramente de- monstram que além do valor de Tr adequada do LNA-antimiR, a região de semente é a mais crítica para a função do miRNA e, dessa forma, a região ideal a ser visada por um LNA-antimiR.

Tabela 5: Valores de Tn para LNA-antimiRs miR-21, medidos contra um oligonucleotíideo de RNA complementar (bp voo des mero Bo = emas ao | | amo mRaro 6 lsTmeers — f”m ==> oo dar o = rameors — so . mo mea o == lsTemmeeera so = leo mea o >> lscramacera ão ==> : es mea 2 >> lssereroataeera ss ===> ars mRaro e ==—úuUlemaoss do | so mar o == artes mo > “oo emo mRarco o sementes leo >) Conclusão: Os valores de Tr, junto com os dados experimen- tais obtidos com repórteres de luciferase mostram que o antagonismo poten- te por LNA-antimiR não é somente dependente da Tm mas também depende do posicionamento do LNA-antimiR dentro da sequência de reconhecimento de microRNA.

Materiais e Métodos: Medições de Tm: Os dúplices oligonucleotídeo:miR-21 RNA fo- ram diluídos a 3 uM em 500 ul de H7O sem RNase e misturados com 500 ul de tampão Tr 2x (NaCl 200 mM, EDTA 0,2 mM, Na-fosfato 20 mM, pH 7,0). A solução foi aquecida a 95ºC por 3 min e então permitida anelar à TA por min.

As temperaturas de fusão de dúplices (Tm) foram medidas em um

Espectrofotômetro Lambda 40 UV/VIS equipado com um programador de temperatura Peltier PTP6 usando o programa PE Templab (Perkin Elmer). À temperatura foi aumentada de 20ºC para 95ºC e então diminuida a 25ºC, registrando a absorção em 260 nm.

O primeiro derivado e os locais máximos tantodefusão como do anelamento foram usados para avaliar as temperatu- ras de fusão dos dúplices.

Exemplo 21. Avaliação do antagonismo de miR-21 pela comparação de um LNA-antimiR 8-mer (SEQ ID Ne3205) versus um 15- mer (SEQ ID Nº3204) na linhagem celular hepatocítica humana HepG2. Foi mostrado anteriormente neste pedido de patente, que um LNA-antimiR 8-mer que é totalmente modificado por LNA e fosforotiolado o efetivamente antagoniza miR-21 na linhagem celular de carcinoma de cérvi- ' ce humano HeLa, na linhagem celular de carcinoma de mama humano MCF- ' 7 e na linhagem celular de câncer de próstata humano PC3. Estendemos esta abordagem de rastreamento à linhagem celular de câncer hepatocelular ó humano HepG2. Para avaliar a eficiência do oligonucleotídeo LNA-antimiR - 8-mer contra miR-21, construtos repórter de luciferase foram gerados nos quais um sítio alvo de combinação perfeita do miR-21 maduro foi clonado na 3'UTR do gene de luciferase de Renilla.

A fim de monitorar a inibição de ' 20 miR-21,células HepG2 foram transfectadas com os construtos de luciferase . em conjunto com o antagonista miR-21 SEQ ID Ne3205 (8-mer) e para com- paração da especificidade com o LNA-antimiR 8-mer de má combinação (SEQ ID Ne3218) e para comparação da potência em conjunto com o 15-mer (SEQ ID Ne3204) em concentrações variadas.

Após 24 horas, atividade de luciferase foi medida.

Resultados: Os experimentos repórter de luciferase mostraram uma desrepressão dose-dependente da atividade repórter de luciferase miR- 21 com o LNA-antimiR 15-mer contra miR-21 (SEQ ID Ne3204). Entretanto, desrepressão completa do repórter de luciferase não foi obtida, até nas con- centrações mais altas (Figura 20). Ao contrário, as células que foram trans- fectadas com o LNA-antimiR 8-mer totalmente modificado por LNA (SEQ ID Ne3205) mostrou desrepressão completa já em 5 nM, indicando potência significativamente melhorada em comparação com o LNA-antimiR 15-mer. Comparando a especificidade do 8-mer de combinação perfeita e do 8-mer de má combinação, o LNA-antimiR de má combinação (SEQ ID Ne3218) não mostrou desrepressão em absoluto, demonstrando alta especificidade do — composto LNA-antimiR contra miR-21.

Conclusão: O LNA-antimiR 8-mer (SEQ ID Ne3205) é mais po- tente do que o 15-mer no direcionamento de miR-21 e o antagonismo de mMiR-21 pela SEQ ID Ne3205 é específico.

Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular HepG2 hepatocítica huma- na foi adquirida de ECACC (Ne85011430). Células HepG2 foram cultivadas o em meio EMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glutamax a 2 ' mM e 25 ug/ml de gentamicina . Á Transfecção: 650.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 6 poços e transfecção reversa foi realizada. Células HepG2 foram i transfectadas com 0,6 ug de miR-21 ou vetor psiCHECK2 vazio em conjunto - com 2,55 ul de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. Também foram transfectadas concentrações variadas de LNA- antimiRs. Após 24 horas, as células foram coletadas para medições de luci- ' 20 ferase. « Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e 300 pl de Tampão de Lise Passiva 1 x (Promega) foram adicionados aos poços. As placas foram colocadas em um agitador por 30 min., após o que os lisa- dos celulares foram transferidos para tubos eppendorf. O lisado celular foi centrifugado por 10 min em 2.500 rpm após o que 50 ul foram transferidos para uma placa de 96 poços e medições de luciferase foram realizadas de acordo com instruções do fabricante (Promega).

Exemplo 22. Validação da interação do miR-21 visando o sí- tio na 3SUTR de Pded4 e miR-21 usando LNA-antimiR 8-mer SEQ ID —Ne3205 na linhagem celular hepatocelular humana Huh-7.

A proteína supressora de tumor Pdeda4 inibe a promoção e pro- gressão tumoral. Além disso, regulação para baixo de Pded4 em câncer de pulmão e colorretal também foi associada com o pior prognóstico do pacien- te.

Recentemente, Asangani et al (Oncogene 2007) e Frankel et al (J Biol Chem 2008) mostraram que a 3'UTR de Pdced4 contém um sítio alvo de mMiR-21 conservado, e células transfectadas com um antimiR-21, resultaram em um aumento na proteina Pded4. Por isso, foi contruído um plasmídeo repórter de luciferase, abrigando 313 nucleotídeos da região 3UTR de Pded4 que engloba o sítio alvo de miR-21 acima mencionado, que foi co- transfectado em conjunto com LNA-antimiRs diferentes e pre-miR-21 (10 nM) em células Huh-7. Os LNA-antimiRs diferentes foram; SEQ ID Ne3205 (8-mer, combinação perfeita), SEQ ID Neo3218 (8-mer, má combinação) e SEQ ID Ne3204 (15-mer, mixâmero (“mixmer) DNA/LNA). Medições de luci- is ferase foram realizadas após 24 horas. fp Resultados: Como mostrado na Figura 21, células transfecta- : das com a 3'UTR de Pdcd4 repórter de luciferase e SEQ ID Ne3205, um au- mento na atividade de luciferase foi observado, indicando interação entre ' 3 UTR de Pded4 e miR-21. Entretanto, transfectando as células com o com- - posto de má combinação, SEQ ID Ne3218, nenhuma modificação na ativida- de de luciferase foi observada, o que foi esperado uma vez que o composto não antagoniza miR-21. Comparando o LNA-antimiR 8-mer com o LNA- í 20 —antimiR 15-mer (SEQ ID Ne3204), o LNA-antimiR curto totalmente modifica- : do por LNA e fosforotiolado foi significativamente mais potente, confirmando dados prévios.

Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de hepatoma humano Huh- 7 foium gentil presente de R.

Bartinschlager (Dept Mol Virology, University of Heidelberg). Células Huh-7 foram cultivadas em meio DMEM, suplemen- tado com soro fetal bovino a 10%, Glutamax a 2 mM, NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamiíicina . Transfecção: 11.000 células foram semeadas por poço em uma —placade 96 poços no dia antes da transfecção para alcançar a confluência de 50 a 70% no dia seguinte.

No dia da transfecção, células Huh-7 foram transfectadas com 20 ng de 3UTR de Pded4 /psiCHECK2 ou vetor psi-

CHECK2 vazio em conjunto com pré-miR-21 10 nM (Ambion) e 0,14 ul de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. Concentrações variadas dos oligonucleotídeos LNA-antimiR também foram transfectadas. Após 24 horas, as células foram coletadas para medições de luciferase.

Ensaio de luciferase: Células foram lavadas e 30 ul de Tampão de Lise Passiva 1 x (Promega) foram adicionados a cada poço, após o que as placas de 96 poços foram postas em um agitador orbital. Após 30 min., 50 ul de substrato de luciferase dissolvido no Tampão de Ensaio de Lucife- rase ll (Sistema de Ensaio Repórter Dual-Luciferase da Promega, CatNo E1910) foram adicionados aos poços com células lisadas e medições de P luciferase foram realizadas de acordo com instruções do fabricante (Prome- f ga). Exemplo 23. Avaliação dos níveis proteicos de Pded4 como uma leitura funcional do antagonismo de miR-21 pelo LNA-antimiR 8- ' mer (SEQ ID Ne3205).

- Além disso, também foram transfectadas células HeLa com SEQ ID Ne3205 (combinação perfeita), SEQ ID Ne3218 (má combinação), SEQ ID Ne3219 (mistura) e níveis proteicos de Pded4 analisados após 24 horas por Á 20 Western blot (Figura 22). Como mostrado, nos extratos proteicos de células . onde SEQ ID Ne3205 foi adicionado, os níveis proteicos de Pded4 aumenta- ram, devido ao antagonismo de mir-21 pela SEQ ID Ne3205 em contraste com os dois oligonucleotídeos controle de LNA.

Conclusão: O antagonismo de miR-21 usando um 8-mer (SEQ ID Neº3205) leva a desrepressão do alvo direto de Antagonismo de miR-21 Pdced4 Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de cérvice humano HeLa foi adquirida de ECACC (Ne93021013). Células HeLa foram cultivadas em meio EMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glu- tamax a 2 mM, NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamicina . Transfecção: 200.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 6 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 50 a 70% no dia seguinte. No dia da transfecção, células HeLa foram trans- fectadas com oligonucleotídeos LNA 5 nM e Lipofectamine2000 2,5 uG/ml (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Após 24 horas, célu- lasforam coletadas para a análise por western blot.

Western blot: Células foram lavadas com PBS, tripsinizadas, transferidas para tubos eppendorf e 50 ul de tampão de lise (1xRIPA) foram adicionados. O lisado celular foi colocado no gelo por 20 min e centrifugado em 10.000 rpm por 10 minutos. Quantidades iguais (15 ul de lisado celular) foram carregadas em um gel BIS-TRIS 4 a 12%. As proteínas foram transfe- ridas para uma membrana de nitrocelulose usando iBlot (Invitrogen) de a- E cordo com instruções de fabricantes. A membrana foi incubada durante a í noite a 4ºC com o anticorpo de soro de coelho para Pded4 purificado por | afinidade primária (Rockland) com uma concentração 1:2000. Como contro- le, anticorpos anti-betatubulina (Thermo Scientific) foram usados em uma Ú diluição 1:5000. Bandas imunorreativas foram visualizadas com ECL Plus , (Amersham).

Exemplo 24. Avaliação da hepatotoxicidade potencial do LNA-antimiR 8-mer de combinação perfeita SEQ ID Nº3205 e LNA con- i 20 troledemá combinação da SEQ ID Ne3218. - Cada composto foi injetado em camundongos fêmeas NMRI, em doses de 25 mg/kg, 5 mg/kg e 1 mg/kg, em dias alternados por 2 semanas. Os animais foram sacrificados e o soro foi coletado do sangue total para análises para AST e ALT. Como visto na Figura 23, os níveis de ALT e AST não estavam elevados para SEQ ID Ne3205 comparados com solução salina ou SEQ ID Ne3218 (controle de má combinação). Entretanto, um camundon- go mostrou níveis aumentados (marcação vermelha), uma vez que as amos- tras de soro foram contaminadas com células sanguíneas vermelhas, con- tendo níveis 6 a 8 vezes mais altos de ALT e AST comparados com o plas- ma Os camundongos que receberam 5 mg/kg e 1 mg/kg também foram analisados para níveis de ALT e AST e não mostraram modificação em comparação com animais controle tratados com solução salina (dados não mostrados). Materiais e Métodos: Desenho eNperimenfal er ipa CRIA ao a [bat o io LAR egintemoeero fe core jDOSagem- no. |IDno. -| camundongo '|posto “ pordia”. “ idose10mUkg. jAdm. 2 so Nac! 1 11-10 (10 iv 0,2,4,7,9 0,9% SEQ ID No 3205 2 1115 |5 2,5mgiml iv 0,2,4,7,9 25mg/kg SEQ ID Ne 3205 3 11620 |5 0,5mgiml iv 0,2,4,7,9 5mg/kg f SEQ ID Ne 3205 . 4 2125 |5 0,Img/ml iv 0,2,4,7,9 mg/kg 'SEQ ID Ne 3230 /2630 5 2,5mg/ml iv 0,2,4,7,9 y 25mg/kg 'SEQ ID Nº 3230 31-35 5 0,5mg/ml iv 0,2,4,7,9 º mg/kg Sacrifício: Os animais foram sacrificados por deslocamento cer- 5 vical Amostragem de soro para ALT/AST; Os animais foram anestesi- - ados com CO, a 70% - O; a 30% antes da coleta do sangue do seio retro- orbital.

O sangue foi coletado em frascos de Soro- Gel S-monovette.

As a- mostras de soro foram coletadas e armazenadas a partir de cada camun- —dongo individual.

As amostras de sangue foram armazenadas à temperatura ambiente por duas horas e após isso centrifugadas 10 min, 3000 rpm, à temperatura ambiente.

As frações séricas foram coletadas em tubos Eppen- dorf em gelo molhado.

Medições de ALT e AST; medições de ALT e AST foram realiza- das em placas de 96 poços usando reagentes ALT e AST de ABX Pentra (A11A01627-ALT, A11A01629-AST) de acordo com instruções do fabricante.

Em resumo, as amostras de soro foram diluídas 2,5 vezes com H7O e cada amostra foi analisada em duplicata.

Após adição de 50 ul da amostra diluída ou padrão (multical de ABX Pentra-A11A01652) a cada poço, a 37ºC, 200 ul da mistura de reagente AST ou ALT foram adicionados a cada poço. Medi- ções cinéticas foram realizadas por 5 min com um intervalo de 30s em 340 nm e 37ºC.

Exemplo 25. Avaliação dos níveis proteicos de PU.1 como uma leitura funcional do antagonismo de miR-155 por LNA-antimiR cur- to (SEQ ID Ne3207).

Foi mostrado anteriormente que o 8-mer (SEQ ID Ne3207) anta- gonizando miR-155 leva à desrepressão do c/EBPbeta alvo de miR-155 nas células RAW de macrófago de camundongo. Para verificar ainda a potência de SEQ ID Ne3207, foram determinados os níveis proteicos de outro alvo de Fr MiR-155, PU.1 Como uma leitura funcional do antagonismo de miR-155 por f LNA-antimiR curto (SEQ ID Ne3207) realizou-se Western blot. O antagonis- Í mo foi verificado na linhagem celular THP-1 monocítica humana que foi transfectada em conjunto com um LNA 8-mer de combinação perfeita (SEQ : ID Ne3207) ou um controle 8-mer na ausência ou na presença de pré-miR- .* 155. LPS foi usado para induzir o acúmulo de miR-155 e as células foram coletadas após 24 horas. Resultados: Células THP-1 que foram transfectadas com pré- í 20 miR-155 mostram uma redução nos níveis de PU.1 (Figura 24). Transfectar - as células com LNA totalmente modificado e fosforotiolado SEQ ID Ne3207 efetivamente antagoniza miR-155, levando a níveis inalterados da proteína PU.1. Em comparação, transfectando as células com um LNA 8-mer contro- le, os níveis de PU.1 diminuíram indicando que o antagonismo de miR-155 —peloLNA-antimiR SEQ ID Ne3207 é específico. Conclusão: O antagonismo de miR-155 usando um 8-mer leva à desrepressão do alvo direto PU.1 em células THP-1 humanas. Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular monocítica humana THP-1 foi adquirida de ECACC (Nºe88081201). Células THP-1 foram cultivadas em RPMI com L-glutamina, suplementado com soro fetal bovino a 10%. Transfecção: 200.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 12 poços no dia anterior. No dia da transfecção, as células THP-1 foram transfectadas com 5 nmols de pré-miR-155 (Ambion) e/ou LNA- antimiR 5 nM em conjunto com Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. LPS (100 ng/ml) foi adicionado às células após incubação por 4 horas com os complexos de transfecção. Após 24 horas, as células foram coletadas para extração proteica e análise por western blot. Westem blot: As células foram lavadas com PBS, tripsinizadas, transferidas para tubos eppendorf e 50 ul de tampão de lise (1XRIPA) foram adicionados. O lisado celular foi colocado no gelo por 20 min e centrifugado em10.000 rpm por 10 minutos. Quantidades iguais (15 ul de lisado celular) foram carregadas em um gel BIS-TRIS 4 a 12%. As proteínas foram transfe- ” ridas para uma membrana de nitrocelulose usando iBlot (Invitrogen) de a- ' cordo com instruções dos fabricantes a membrana foi incubada durante a ' noite a 4ºC com anticorpo monoclonal de coelho para PU.1 (Cell Signaling) com uma concentração 1:2000. Como carregamento igual, Tubulina (Thermo í Scientific) foi usada em uma diluição 1:5000. Bandas imunorreativas foram - visualizadas com ECL Plus (Amersham).

Exemplo 26. Avaliação dos níveis proteicos de p27 como uma leitura funcional de antagonismo da família miR-221/222 pelo LNA- ' 20 — antimiR7-mer SEQ ID Nº3225.

. Trabalho prévio mostrou (le Sage et al. 2007, Galardi et al. 2007) que miR-221 e miR-222 regulam pós-transcricionalmente a expressão do gene supressor de tumor p27, que está envolvido na regulação do ciclo celu- lar. Nestes estudos, foi mostrado que a regulação para baixo de miR-221 e miR-222 aumentou os níveis de expressão de p27. Dessa forma, como uma leitura funcional do antagonismo da família miR-221/222 pelo LNA-antimiR 7-mer SEQ ID Noe3225 foram determinados os níveis proteicos de p27 após transfecção do LNA-antimiR SEQ ID Ne3225 em células PC3.

Resultados: Como mostrado na Figura 25, a transfecção do —LNA-antimiR 7-mer SEQ ID Ne3225 visando a sequência de semente de mMIR-221 e miR-222 resultou no aumento dose-dependente dos níveis protei- cos de p27 em comparação com não as transfectadas ou comparado com as presentes células PC3 de controle disperso (“scrambled”)LNA transfectado. Estes resultados claramente demonstram que o LNA-antimiR 7-mer é capaz de antagonizar efetivamente a família miR-221/222 que leva à desrepressão do alvo direto p27 ao nível proteico em concentrações tão baixas como 5 nM Conclusão: Um LNA-antimiR 7-mer totalmente modificado por LNA visando a sequência de semente na família miR-221/222 à 5 nM pode antagonizar efetivamente ambos miRNAs levando à desrepressão do alvo direto p27 ao nível proteico.

Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de próstata - humano PC3 foi adquirida de ECACC (Nº90112714). Células PC3 foram cul- fg tivadas em meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Gluta- ' max a 2 mM e 25 ug/ml de gentamicina .

Transfecção: 250.000 células foram semeadas por poço em uma Ú placa de 6 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de - 50% no dia seguinte. No dia da transfecção, as células PC3 foram transfec- tadas com LNA-oligonucleotídeos em concentrações variadas (vide a figura 25) com Lipofectamine2000. As células foram coletadas após 24 horas de ' 20 extração proteica e análise por western blot.

. Westem blot: As células foram lavadas com PBS, tripsinizadas, transferidas para tubos eppendorf e 50 ul de tampão de lise (1XRIPA) foram adicionados. O lisado celular foi colocado no gelo por 20 min, então centrifu- gado em 10.000 rpm por 10 minutos. Quantidades iguais (15 ul de lisado celular) foram carregadas em um gel BIS-TRIS 4 a 12%. As proteinas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando iBlot (Invitrogen) de acordo com instruções dos fabricantes. A membrana foi incubada durante a noite a 4ºC com o anticorpo de camundongo monocional primário para p27 (BD Biosciences) em uma diluição 1:1000. Como controle de carregamento, —Tubulina (Thermo Scientific) foi usada em uma diluição 1:5000. Bandas imu- norreativas foram visualizadas com ECL Plus (Amersham).

Exemplo 27. Silenciamento de miR-221/222 pelo LNA-

antimiR 7-mer SEQ ID Nº3225 reduz a formação de colônia de células PC3 Uma marca da transformação celular é a capacidade das células tumorais crescerem de um modo independente da ancoragem no meio se- — missólido. Por isso, realizou-se o ensaio de ágar em baixa concentração que é um ensaio fenotípico que é relevante para câncer, dado que mede a redu- ção de células tumorais. Transfectou-se SEQ ID Ne3225 (combinação perfei- ta) e SEQ ID Ne3231 (misturado) em células PC3, e após 24 horas, células plaqueadas em ágar em baixa concentração. Colônias foram contadas após 12dias. Mostrou-se na Figura 26 que a inibição de miR-221 e miR-222 pela SEQ ID Ne3225 pode reduzir a quantidade de colônias que crescem no ágar |» em baixa concentração comparado com o LNA-antimiR controle misturado, ' indicando a redução das células tumorais. ] Conclusão: O 7-mer (SEQ ID Ne3225) visando a família de miR- 221/222 reduz o número de colônias no ágar em baixa concentração, indi- Í cando interrupção da proliferação de células PC3. - Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de próstata humano PC3 foi adquirida de ECACC (Nº90112714). As células PC3 foram ' 20 cultivadas em meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glu- - tamax a 2 mM e 25 ug/ml de gentamicina .

Transfecção: 250.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 6 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 50% no dia seguinte. No dia da transfecção, as células PC3 foram transfec- tadas com 25 nM de oligonucleotídeos LNA diferentes com Lipofectami- ne2000.

Crescimento clonogênico em ágar em baixa concentração: 2,5x10º células PC3 foram semeadas em ágar a 0,35% sobre uma camada base contendo ágar a 0,5%. Células foram plaqueadas 24 horas após trans- fecção. As placas foram incubadas a 37ºC, CO», a 5% em uma incubadora umidificada por 12 dias e marcadas com cristal violeta 0,005% por 1 h, após o que as células foram contadas. O ensaio foi realizado em triplicata.

Exemplo 28: Avaliação do antagonismo de let-7 por LNA- antimiRs 6-9-mer em células Huh-7 transfectadas com precursor miR- NA let-7a, e um ensaio sensor de luciferase.

Para avaliar a eficiência de oligonucleotídeos 6-9-mer totalmente modificado por LNAs no direcionamento e antagonismo de miRNAs família da let-7, um construto sensor de luciferase foi feito, contendo aproximada- mente 800 bp da 3UTR de HMGA?2. A sequência clonada no vetor contém quatro dos sete sítios de ligação de let-7 funcionais (sítios 2 a 5), como ante- riormente demonstrado por Mayr et al. (Science, 2007) e Lee e Dutta (Genes Dev, 2007). A fim de monitorar a inibição de let-7, a linhagem celular de car- cinoma hepatocelular Huh-7 (com baixos a não existentes níveis de let 7 en- * dógenos) foi transfectada com o construto sensor de luciferase, com o miR- ' NA precursor let-7a, e com os 6-9 mer antagonistas de let 7 SEQ ID i Ne3232,-3233,-3227,-3234,-3235; vide a figura 27) em concentrações cres- centes.

Os LNA-antimiRs 6-9-mer foram comparados com a SEQ ID Ne3226, Í um 15-mer contra let-7a como um controle positivo.

Após 24 horas, a ativi- . dade de luciferase foi medida.

Resultados: Como visto na Figura 28, LNA-antimiRs totalmente modificado por LNAs 8- e 9-mer (SEQ ID Ne3227, SEQ ID Ne3234 e SEQ ID ' 20 — Ne3235) mostram potências similares na desrepressão de let-7 no ensaio . sensor de luciferase, como o controle positivo SEQ 15-mer ID Ne3226. À desrepressão alvo total destes compostos altamente potentes é alcançada já em 1 a 5 nM, ao passo que o 7-mer SEQ ID Ne3233 precisa estar presente em concentrações ligeiramente mais altas (10 nM) para gerar o mesmo efei- to.

Entretanto, o 6-mer SEQ ID Ne3232 não mostra efeito mesmo em altas concentrações como 50 nM.

A desrepressão da atividade de luciferase pelos LNA-antimiRs 7-, 9- e 15-mer é dose-dependente, que é particularmente cla- ro no caso da SEQ ID Ne3233 ligeiramente menos potente.

Conclusão: Para concluir, os LNA-antimiRs 8- 9-mer (SEQ ID —Ne3227, SEQ ID Ne3234, e SEQ ID Nº3235) mostram potências de antago- nista iguais na inibição in vitro de let-7a em comparação com o LNA-antimiR 15-mer SEQ ID Ne3226 visando let-7a.

Um efeito potente, embora em con-

centrações ligeiramente mais altas também é visto para o 7-mer SEQ ID Nºe3233, ao passo que um 6-mer não tem efeito nas concentrações testadas.

Materiais e Métodos: Linhagem celular: À linhagem celular de carcinoma hepatocelu- lar Huh-7 foi um gentil presente de R.

Bartinschlager (Dept Mol Virology, U- niversity of Heidelberg). Células Huh-7 foram cultivadas em meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glutamax a 2 mM, NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamicina . Transfecção: 8.000 células foram semeadas por poço em uma —placade 96 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 60 a 80% no dia seguinte.

No dia da transfecção, células Huh-7 em cada ” poço foram transfectadas com 20 ng de plasmídeo 3UTR de HM- ' GA2/psiCHECK2, miRNA precursor let-7a (Dharmacon; concentração final 10 nM), LNA-antimiRs SEQ ID Ne3232, -3233, -3227, -3234, -3235, -3226; concentrações finais O a 50 nM) em conjunto com 0,17 ul de Lipofectami- ne2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante.

Após 24 horas, - células foram coletadas para medições de luciferase.

Ensaio de luciferase: Os meios de crescimento foram descarta- dos e 30 ul do Tampão de Lise Passiva 1x (Promega) foram adicionados a Ú 20 cada poço.

Após 15 a 30 minutos de incubação em um agitador orbital, me- - dições de luciferase de renilla e vagalume foram realizadas de acordo com instruções do fabricante (Promega). Exemplo 29: Avaliação do antagonismo da família let-7 intei- ro por LNA-antimiRs 8- e 15-mer em células Huh-7 transfectadas com um ensaio sensor de luciferase.

Para avaliar a eficiência de um oligonucleotídeo 8-mer totalmen- te modificado por LNA antagonizando a família de miRNAs let 7 inteira, o mesmo construto sensor de luciferase descrito no exemplo prévio foi usado.

Novamente, células Huh-7 (com baixos a não existentes níveis de let-7 en- —dógeno) foram transfectadas com o construto sensor, com um dos represen- tantes precursores da família let-7a, let-7d, let-7e, ou let-7i, e com o antago- nista SEQ ID Ne3227 em concentrações crescentes.

O LNA-antimiR 8-mer foi comparado com a SEQ ID Ne3226, um 15-mer contra let-7a como um controle positivo e potente.

Após 24 horas, a atividade de luciferase foi me- dida.

Resultados: Como visto na Figura 29, os LNA-antimiRs 8-mer totalmente modificado por LNAs (SEQ ID Ne3227) mostram potências simila- res na desrepressão de vários let7 alvos no ensaio sensor de luciferase, co- mo o controle positivo SEQ 15-mer ID Ne3226. A desrepressão alvo quase total do 8-mer é alcançada já em 0,5 a 1 nM, exceto no caso com o premiR let-7e (figura29C), no qual somente 7 de 8 nucleotídeos de SEQ ID Ne3227 hibridizam ao alvo.

Entretanto, apesar da má combinação terminal neste ca- so, SEQ ID Ne3227 gera a desrepressão alvo total em 5 nM.

O controle posi- ” tivo 15-mer mostra potente antagonismo de todos os precursores e fornece a ' desrepressão quase total em 0,5 nM.

A desrepressão da atividade de lucife- rase tanto pelos LNA-antimiRs 8- como pelo 15-mer é claramente dose- dependente, como visto nos quatro painéis (figura 29A-D). Í Conclusão: Para concluir, o LNA-antimiR 8-mer (SEQ ID - No3227), é um antagonista potente contra quatro membros representantes da família let-7 in vitro, e dessa forma provavelmente contra a família inteira.

Em comparação com um antagonista controle positivo 15-mer, SEQ ID —No3226,0o 8-mer é igualmente potente para três dos quatro alvos, e ligeira- - mente menos potente para o quarto alvo, let-7e, explicado por uma má com- binação terminal neste caso.

Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma hepatocelu- lar Huh-7 foi um gentil presente de R.

Bartinschlager (Dept Mol Virology, U- niversity of Heidelberg). Células Huh-7 foram cultivadas em meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glutamax a 2 mM, NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamicina . Transfecção: 8.000 células foram semeadas por poço em uma —placade 96 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 60 a 80% no dia seguinte.

No dia da transfecção, células Huh-7 em cada poço foram transfectadas com 20 ng de plasmídeo 3UTR DE HM-

GA2/psiCHECK2, com miRNA precursor let-7a, -7d, -7e, ou -7i (Dharmacon; concentração final 10 nM), e com LNA-antimiRs SEQ ID Ne3227 e SEQ ID No3226; concentrações finais O a 50 nM) em conjunto com 0,17 ul de Lipo- fectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. Após 24 horas, as células foram coletadas para medições de luciferase.

Ensaio de luciferase: O meio de crescimento foi descartado e 30 pl de Tampão de Lise Passiva 1x (Promega) foram adicionados a cada poço. Após 15 a 30 minutos de incubação em um agitador orbital, medições de luciferase de renilla e de vagalume foram realizadas de acordo com instru- çõesdo fabricante (Promega).

Exemplo 30. Avaliação do antagonismo de let-7 endógeno » por SEQ ID Ne3227, LNA-antimiRs 8-mer, em células HeLa transfectadas MV com um ensaio sensor de luciferase.

' Para determinar a eficiência de um oligonucleotídeo 8-mer to- talmente modificado por LNA no direcionamento e antagonismo de let-7 en- ] dógenos, o mesmo construto sensor de luciferase descrito nos dois exem- - plos prévios, foi cotransfectado com SEQ ID Ne3227 na linhagem celular de câncer cervical HeLa (que expressa níveis moderados a altos de let-7 como determinado por Q-PCR; dados não mostrados). O vetor psiCHECK-2 vazio ' 20 foiincluído como um controle negativo.

- Resultados: Como visto na Figura 30, o LNA-antimiR 8-mer to- talmente modificado por LNA de SEQ ID Neº3227 mostra potente antagonis- mo de let-7 endógeno, e fornece a desrepressão total do alvo em concentra- ções de 5 a 10 nM. A desrepressão da atividade de luciferase é dose- — dependente, começando aproximadamente em 1 nM e alcançando um platô em aproximadamente 10 nM.

Conclusão: Para concluir o LNA-antimiR 8-mer (SEQ ID Ne3227), é um antagonista potente contra let-7 endógeno também in vitro, e dessa forma fornece evidência definida que famílias de miRNA inteiras po- dem ser visadas com sucesso por antagonistas curtos e totalmente modifi- cado por LNAs.

Materiais e Métodos:

Linhagem celular: A linhagem celular de câncer cervical HeLa foi adquirida de ATCC (NeCCL-2"M), Células HeLa foram cultivadas em meio Eagle MEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glutamax a 2 mM, NEAA 1x e 25 ug/ml de gentamicina .

Transfecção: 8.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 96 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 50 a 70% no dia seguinte. No dia da transfecção, células HeLa em cada po- ço foram cotransfectadas com 20 ng de plasmídeo 3UTR DE HM- GA2/psiCHECK2 ou psiCHECK-2 (vetor vazio), e com LNA-antimiR SEQ ID —No3227 (concentrações finais O a 50 nM,) em conjunto com 0,17 ul de Lipo- fectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. Após 24 . horas, as células foram coletadas para medições de luciferase. 7 Ensaio de luciferase: Os meios de crescimento foram descarta- ' dos e 30 ul de Tampão de Lise Passiva 1x (Promega) foram adicionados a cada poço. Após 15 a 30 minutos de incubação em um agitador orbital, me- i dições de luciferase de renilla e de vagalume foram realizadas de acordo - com instruções do fabricante (Promega). Exemplo 31. Avaliação do antagonismo de miR-21 por um | LNA-antimiR-21 8-mer (Nº3205) contra um 8-mer (Nº3219) misturado ao ] 20 LNA controle na linhagem celular de carcinoma de cólon humano - HCT116.

Mostrou-se anteriormente neste pedido de patente, que um LNA- antimiR 8-mer que é totalmente modificado por LNA e fosforotiolado efetiva- mente antagoniza miR-21 na linhagem celular de carcinoma de cérvice hu- mano HelLa,na linhagem celular de carcinoma de mama humano MCF-7, na linhagem celular de câncer de próstata humano PC3 e na linhagem celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2. Estende-se esta abordagem de rastreamento para a linhagem celular de carcinoma de cólon humano HCT116. Para avaliar a eficiência do oligonucleotídeo LNA-antimiR 8-mer —contramiR-21, construtos repórter de luciferase foram gerados nos quais um sítio alvo de combinação perfeita do miR-21 maduro foi clonado na 3UTR do gene de luciferase de Renilla. Para monitorar a inibição de miR-21, células

HCT116 foram transfectadas com os construtos de luciferase em conjunto com o antagonista de miR-21 Ne3205 (8-mer) e para a comparação da es- pecificidade com o LNA 8-mer misturado controle (Nº3219). Após 24 horas, a atividade de luciferase foi medida. Resultados: Experimentos repórter de luciferase mostraram uma desrepressão dose-dependente da atividade repórter de luciferase miR- 21 com o LNA-antimiR 8-mer contra miR-21 (Ne3205) e desrepressão com- pleta foi obtida em 5 nM (Figura 31). Comparando a especificidade do 8-mer de combinação perfeita e o 8-mer controle misturado, o LNA-antimiR contro- le misturado (Ne3219) não mostrou desrepressão em absoluto, demonstran- do alta especificidade do composto de LNA-antimiR contra miR-21. a Conclusão: O 8-mer (Nº3205) é potente no direcionamento de ' MiR-21 e o antagonismo de miR-21 por Nº3205 é específico. À Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de cólon humano HCT116 foi adquirida de ATCC (CCL-247). Células HCT116 foram - cultivadas no meio RPMI, suplementado com soro fetal bovino a 10% e 25 ug/ml de gentamicina . Transfecção: 110.000 células foram semeadas por poço em uma ] 20 placa de 12 poços e a transfecção foi realizada. Células HCT116 foram - transfectadas com 0,3 ug de plasmídeo sensor de luciferase miR-21 ou vetor psiCHECK2 vazio em conjunto com 1,2 ul de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. Também foram transfectadas con- centrações variadas de LNA-antimiRs. Após 24 horas, células foram coleta- das paramedições de luciferase.

Ensaio de luciferase: Células foram lavadas com PBS e 250 ul de Tampão de Lise Passiva 1 x (Promega) foram adicionados aos poços. As placas foram colocadas em um agitador por 30 min., após o que os lisados celulares foram transferidos para tubos eppendorf. O lisado celular foi centri- fugado por 10 min em 2.500 rpm após o que 50 ul foram transferidos para uma placa de 96 poços e medições de luciferase foram realizadas de acordo com instruções do fabricante (Promega).

Exemplo 32. Silenciamento de miR-21 pelo LNA-antimiR 8- mer Nº3205 reduz a formação de colônia de células PC3. Uma marca da transformação celular é a capacidade das células tumorais de crescer de um modo independente de ancoragem no meio se- miíissólido.

Por isso, realizou-se o ensaio de ágar em baixa concentração que é um ensaio fenotípico que é relevante para câncer, dado que mede a redu- ção de células tumorais.

Transfectou-se Ne3205 (LNA-antimiR-21 de combi- nação perfeita) e Ne3219 (LNA controle misturado) em células PC3, e após 24 horas, as células foram plaqueadas no ágar em baixa concentração.

Co- lônias foram contadas após 12 dias.

Mostrou-se na Figura 32 que a inibição de miR-21 por Ne3205 pode reduzir a quantidade de colônias que crescem " em ágar em baixa concentração em comparação com o controle LNA contro- . le misturado tratado ou não tratado (transfectado, mas sem LNA), demons- Ú trando a redução de células tumorais.

Conclusão: O 8-mer (Ne3205) visando a família miR-21 reduz o [ número de colônias em ágar em baixa concentração, indicando a interrupção - da proliferação de células PC3. Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de próstata “ 20 humano de PC3 foiadquirida de ECACC (Neg0112714). Células PC3 foram - cultivadas em meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Glu- tamax a 2 mM e 25 ug/ml de gentamicina . Transfecção: 250.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 6 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 50% no dia seguinte.

No dia da transfecção, as células PC3 foram transfec- tadas com 25 nM de oligonucleotídeos LNA diferentes com Lipofectami- ne2000. Crescimento clonogênico em ágar em baixa concentração: 2,5x10? células PC3 foram semeadas em ágar a 0,35% sobre uma camada —basalcontendo ágar a 0,5%. Células foram plaqueadas 24 horas após trans- fecção.

As placas foram incubadas a 37ºC, CO, 5% em uma incubadora u- midificada por 12 dias e marcadas com cristal violeta a 0,005% por 1 h, após o que as células foram contadas. O ensaio foi realizado em triplicata. Exemplo 33. Silenciamento de miR-21 pelo LNA-antimiR 8- mer Nº3205 reduz a formação de colônia de células HepG2. miR-21 é superexpresso na linhagem celular de carcinoma he- patocelular humano HepG2 e mostrou-se anteriormente a capacidade de regular a atividade de luciferase de um plasmídeo de sensor miR-21 com No3205 nestas células. Células HepG2 foram transfectadas com Ne3205 e Ne3219 (8-mer misturado), e após 24 horas plaqueadas em ágar em baixa concentração. As colônias foram contadas após 17 dias com um microscó- pio.

Resultados: Mostrou-se na Figura 33 que a inibição de miR-21 por Ne3205 pode reduzir a quantidade de colônias que crescem em ágar em ! baixa concentração, indicando que a interrupção da proliferação ocorreu. Além disso, o nosso controle 8-mer misturado, Nº3219, não teve efeito signi- ficante sobre o número de colônias.

Conclusão: O 8-mer (Nº3205) visando miR-21 reduz o número , de colônias no ágar em baixa concentração, indicando a interrupção da proli- feração de células HepG2. Materiais e Métodos: Linhagem celula: A linhagem celular hepatocítica humana HepG?2 foi adquirida de ECACC (Ne85011430). Células HepG2 foram culti- vadas em meio EMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Gluta- max a 2 mM e 25 ug/ml de gentamicina .

Transfecção: 650.000 células foram semeadas por poço em uma —placade6 poços e a transfecção reversa foi realizada. Células HepG2 foram transfectadas com 0,6 ug de plasmídeo miR-21 sensor de luciferase ou vetor psiCHECK2 vazio em conjunto com 2,55 ul de Lipofectamine2000 (Invitro- gen) de acordo com instruções do fabricante. Também foram transfectadas concentrações variadas de LNA-antimiRs e oligonucleotídeos controle. Após 24 horas, as células foram coletadas para medições de luciferase.

Crescimento clonogênico em ágar semi-sólido (“soft Agar”): 2,0x10º células HepG2 foram semeadas em ágar 0,35% sobre uma camada basal contendo ágar 0,5%. Células foram plaqueadas 24 horas após trans- fecção. As placas foram incubadas a 37ºC, CO; 5% em uma incubadora u- midificada por 17 dias e marcadas com cristal violeta 0,005% por 1 h, após o que as células foram contadas. O ensaio foi realizado em triplicata. Exemplo 34. Silenciamento de miR-21 pelo LNA-antimiR 8- mer Nº3205 inibe a migração celular em células PC3.

A migração celular pode ser monitorada pela realização de um ensaio de cura de injúria (=ensaio de cicatrização (“scratch assay”)) onde uma "ranhura" é feita em uma monocamada celular, e as imagens são cap- turadas no começo e regularmente durante a migração celular. Comparando as imagens, a quantificação da taxa de migração das células pode ser de- . terminada. Isto foi feito na linhagem celular de câncer de próstata humano . PC3. As células foram semeadas, e no dia 3, as células foram transfectadas, e no dia seguinte, quando a confluência de 100% foi alcançada, uma ranhu- ra (=injúria) foi feita. Quando a ranhura foi feita, as fotos foram tiradas para i documentar a injúria inicial. Posteriormente a área do fechamento de injúria , é medida em pontos de tempo diferentes com o programa gratuito Image J. Como mostrado na Figura 34A, células PC3 foram tratadas com 25 nM Ne3205 (miR-21 combinação perfeita), o controle Ne3219 ou não transfecta- das. Os quadros foram tomados após 24 horas, e a área foi calculada para o fechamento de injúria no respectivo ponto do tempo. O fechamento de injúria das células não transfectadas e do controle, Ne3219, foi mais rápido compa- rando com o presente LNA-antimiR contra miR-21, Ne3205, indicando que Ne3205 inibe miR-21 e impede as células de migrar (Figura 34B).

Conclusão: O 8-mer (Ne3205) visando miR-21 inibe a migração celular de células PC3 em comparação com células controle transfectadas e não transfectadas.

Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de carcinoma de próstata humano PC3 foi adquirida de ECACC (Ne90112714). Células PC3 foram cul- tivadas em meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Gluta- max a 2 mM e 25 ug/ml de gentamicina .

Ensaio de ranhura: 150.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 6 poços três dias antes da transfecção para adquirir a con- fluência de 100% no dia seguinte. 24 horas após transfecção, uma ranhura foi feita na monocamada celular com uma ponteira de 200 ul. As fotos foram tomadasem0Oh e 24 horas após usando uma câmera digital ligada a um microscópio. O programa Image J foi usado para determinar o fechamento da injúria.

Exemplo 35. Avaliação do comprimento de LNA-antimiRs to- talmente LNA-substituídos que antagoniza miR-155. Mostrou-se anteriormente uma avaliação do comprimento de MiR-21 em relação a LNA-antimiRs totalmente LNA-substituídos, e mostrou- . se que os LNA-antimiRs mais potentes têm 7-, 8- ou 9 nucleotídeos de ta- . manho. O mesmo experimento foi repetido com miR-155. Um sítio alvo de Ú combinação perfeita de miR-155 foi clonado na 3'UTR do gene de luciferase no plasmídeo repórter psiCHECK2 e transfectado na linhagem celular de : macrófago de camundongo RAW em conjunto com LNA-antimiRs totalmente - LNA-substituídos de comprimentos diferentes. Como os níveis endógenos de miR-155 são baixos na linhagem celular RAW, as células foram tratadas com LPS 100 ng/ml por 24 horas para induzir o acúmulo de miR-155. Após ' 20 24 horas, a análise de luciferase foi realizada.

. Resultados: Como mostrado na Figura 35, os LNA-antimiRs mais potentes são Ne3207 (8 nucleotídeos) e Ne3241 (9 nucleotídeos), al- cançando uma desrepressão quase de 80% em concentração de LNA de somente 0,25 nM. O 6-mer (Ne3244) não mostra desrepressão significante.

O aumento do comprimento para 12-mer a 14-mer (Ne3242 e Ne3243) redu- ziu a potência como mostrado pela desrepressão menos eficiente do repór- ter miR-155.

Conclusão: Os LNA-antimiRs mais potentes totalmente LNA- substituídos que visam miR-155 foram 8- e 9-mer (Ne3207 e Ne3241).

Materiais e Métodos: Linhagem celular: A linhagem celular de macrófago de camun- dongo RAW 264.7 foi adquirida de ATCC (TIB-71). Células RAW foram culti-

vadas em meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, Gluta- max 4 mM e 25 ug/ml de gentamicina . Transfecção: 500.000 células foram semeadas por poço em uma placa de 6 poços no dia antes da transfecção para adquirir a confluência de 50% nodia seguinte.

No dia da transfecção, células RAW 264.7 foram trans- fectadas com 0,3 ug de miR-155 combinação perfeita/psiCHECK2 ou vetor psiCHECK?2 vazio em conjunto com 10 ul de Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante.

Também foram transfectadas con- centrações variadas de LNA-antimiRs.

Para induzir o acúmulo de miR-155, LPS (100 ng/ml) foi adicionado às células RAW após incubação por 4 horas com os complexos de transfecção.

Após mais 24 horas, as células foram . coletadas para medições de luciferase. ' Ensaio de luciferase: As células foram lavadas com PBS e cole- tadas com raspadeira de células, após o que as células foram centrifugadas por5minem 2.500 rpm.

O sobrenadante foi descartado e 50 ul de Tampão de Lise Passiva 1 x (Promega) foram adicionados ao precipitado celular, a- . pós o que as células foram postas no gelo de 30 min.

As células lisadas fo- ram centrifugadas em 10.000 rpm por 30 min após o que 20 ul foram trans- feridos para uma placa de 96 poços e medições de luciferase foram realiza- dasde acordo com instruções do fabricante (Promega). - Exemplo 36. Proteína plasmática que se liga a 8-mer total- mente LNA-substituído Nº3205 visando miR-21 (LNA-antimiR-21). As proteínas plasmáticas são não saturadas com Ne3205 nas concentrações plasmáticas no experimento mostrado na Figura 36A.

Em uma larga faixa de concentrações de Ne3205 no plasma a ligação proteica é aproximadamente 95% a LNA-antimiR-21 Ne3205 na Figura 36B.

Nas con- centrações de Ne3205 de 50,1 uM (174 ug/mL) a capacidade de ligação de proteínas plasmáticas ao Ne3205 marcado com FAM não foi saturada.

Materiais e Métodos: Plasma de camundongo (100 uL) foi do- —pado com Ne3205 marcado com FAM nasa concentrações de 0,167, 1,67, 5,01, 10,02, 16,7, 25,05 e 50,1 UM.

As soluções foram incubadas a 37ºC por 30 minutos.

As soluções foram transferidas para um filtro Microcon Ultracel

YM-30 (celulose regenerada 30.000 MWCO). Os filtros foram girados por 20 minutos em 2000g e à temperatura ambiente em uma microcentrífuga.

O filtrado foi diluído 5, 10 e 20 vezes e 100 ul. de amostras foram transferidas para uma placa de microtítulo (Poliestireno Preto NUNC-237108). A fluores- cênciafoidetectada usando um leitor de elisa FLUOstar Optima com a exci- tação em 458 nm e emissão em 520 nm.

A quantidade dos Nº3205 não liga- dos marcados com FAM foi calculada a partir de uma curva padrão derivada do plasma filtrado dopado marcado com FAM Ne3205 em 12 concentrações diferentes (0,45 a 1000 nM). Os números foram corrigidos com o número de recuperação estabelecido a partir de experimentos de filtração com concen- trações de Nºe3205 0,167, 1,67, 5,01, 10,02, 16,7, 25,05 e 50,1 UM em plas- ” ma filtrado.

A recuperação dos Nºe3205 marcados com FAM foi 86%. . Exemplo 37. Estudo de autoradiografia de corpo inteiro ] quantitativa em camundongos fêmeas pigmentados após administra- ção intravenosa única de LNA-antimiR-21 Ne3205 marcado com *S. í A fim de determinar a biodistribuição de um LNA-antimiR curto - totalmente modificado por LNA (Ne3205, 8-mer) uma distribuição de tecido corporal inteiro do composto radioativamente marcado foi feita em camun- dongos.

Ne3205 marcado com *S, foi dosado a camundongos com uma ' 20 administração intravenosa única e os camundongos foram sacrificados em . pontos do tempo diferentes, variando de 5 min a 21 dias.

Tabela 6(i)) Concentrações teciduais individuais (pg de Ne3205/g de tecido) após uma administração intravenosa única de Ne3205 marcado com *ºS em camundongos fêmeas pigmentados.

As figuras são valores médios de três medidas de cada tecido e razão.

O coeficiente de variação (CV) é geralmente aproximadamente 10%. oligo Ne3205/g de tecido /horas lee a creio a gg oligo Ne3205/g de tecido |horas Iorduramarom sa Me. gasta fra og a amo e os bw : Loko de j| a a vo do e he | : lost ds hs he | [ancas sh | | GE E lelsaar — —— 6 : RR TR IMescuo esquerdas ag Be bao he e ma bo bw | me db he B oh lóadoaro — has has | | ka “hs he |] | o ea | das Tabela 6(ii) Razões de tecido para fígado após administração in-

travenosa única Ne3205 marcado com **S em camundongos pigmentados fêmeas.

EO Elebihhbbht] Sobrev. (h) 10,088 0,25 1h 4h 24h 48h 96h 504 lómão le = las fios dose lorr foz doas loss fot Jor | - ERERehebhh ã Óssea 0,03 0,11 0,55 0,10 0,03 0,07 0,03 " eh be ' marrom 0038 003 OO

SMNNNNNANA í ca 0,75 0,57 0,29 0,12 0,07 0,12 0,08 0,10 0,07 eee : cardíaco 0,86 0,71 0,31 0,22 0,10 0,21 0,15 012 loórexrena [223 f19r doza Jon Joor domo loco Jooo lomo | ' ligado —lagr 1594 dsas los lsst Jass [35% 22 fomo | lrumão — 100 fnoo froo fon fon fnoo Íroo froo 1100 | liníonodo [112 fog Joss Jooa Joca loca Jows Jomar Jow | loviio —Joso Joss joso Jos foto lots loco fon om | bl hd teh tária 0,42 037 jo 0,18 0,12 017 0,12 0,15 bbb var 0,57 0,54 0,28 0,11 015 0,16 0,12 0,10 0,08 az om om fm fas fas fe ds ls hoc Pel.igm Jogo Jor lot loca Jon loos looa lona loos | Immo Joss foge Jo Jor foz dose Joss foz log | e MNA de 032 031 |jol4 oo 0,08 /O05 0,02 lua = Jos fr loss foz lors Jose foto foz Jos | leo — fanos anus Tomo [sa om Joso foir lots Joos | ldieadooholoss las loss loso logo loor lozgr Jots Joos | . Conclusões: Ne3205 mostra depuração da radioatividade do Í sangue com meia-vida de eliminação de 8 a 10 horas.

Altos níveis de radioa- p tividade foram registrados no córtex renal, linfa, fígado, medula óssea, baço, ovário e útero.

O nível mais alto de radioatividade foi registrado no córtex N 5 renal mostrando níveis cinco vezes mais altos do que aquele do fígado para Ne3205. Uma forte retenção da radioatividade foi notada no córtex renal, lin-

' fa, fígado, medula óssea e baço para LNA-antimiR-21 Ne3205. Materiais e Métodos:

. Administração de dose: Todos os camundongos foram pesados antes da administração.

A nove camundongos fêmeas foram dados 10 : mg/kg de *$S-Noe3205 intravenosamente em uma veia de cauda.

O volume dado a cada animal foi 10 mL/kg da formulação de teste.

A atividade especí- fica 75,7 uCiumg.

Camundongos individuais foram mortos 5 min, 15 min, 1 hora, 4 horas, 24 horas, 2 dias, 4 dias, 7 dias e 21 dias após administração de Ne3205. Autoradiografia de corpo inteiro: Os camundongos foram aneste- siados por sevoflurano, e então imediatamente imergidos em heptano, res- friado com gelo seco a -80ºC, ABR-SOP-0130. As carcaças congeladas fo- ram introduzidas em um gel de carboximetilcelulose aquosa (CMC), conge- lada em etanol, resfriado com gelo seco (-80ºC) e seccionadas sagitalmente paraa autorradiografia de corpo inteiro, de acordo com o método padrão, ABR-SOP-0131. De cada animal, seções de 20 um foram cortadas em ní- veis diferentes com um criomicrótomo (Leica CM 3600) a uma temperatura de aproximadamente -20ºC. As seções obtidas foram pegas na fita (Minne- sota Mining and Manufacturing Co., N. 810) e numeradas consecutivamente com tinta radioativa. Após serem congeladas a vácuo a -20ºC por aproxima- damente 24 horas, as seções selecionadas foram cobertas por uma camada finade folhade mylar, e postas em placas de visualização (Fuji, Japan). À exposição foi realizada em cassetes de luz limitada em uma caixa de prote- ção de chumbo a -20ºC, para proteger as placas de imagem da radiação ambiental. Após exposição, as placas de visualização foram lidas oticamente em um tamanho de pixel de 50 um e analisadas por radioluminografia usan- doum sistema de análise de bioimagem (Bas 2500, Fuji, Japan), e descrito em ABR-SOP-0214. Uma solução de teste padrão solúvel em água de ra- ” dioatividade de **S foi misturada com o sangue toral e usada para a produ- ] ção de uma escala de calibração, ABR-SOP-0251. Entretanto, os padrões ] sanguíneos diferentes foram dissolvidos em 500 ul Soluene-35. 4,5 mL de Ultima Gold então foram adicionados às amostras dissolvidas. Como *S e Í *'C têm espectros de energia muito similares, um *C-programa padrão - (Packard 2200CA) foi usado quando a radioatividade das amostras de san- gue diferentes foi ajustada. Cálculos farmacocinéticos: A radioatividade de *º*S medida em Ú 20 sangue total e tecidos foi expressa como nCi/g tecido e racalculada como - equiv nmol/g de tecido para avaliação farmacocinética. Os parâmetros far- macocinéticos Crmax t2 e AUC foram determinados para o sangue total e tecidos pela análise não compartimental usando WinNonlin Professional (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA). Após administração intra- venosa, a concentração foi extrapolada de volta a zero e expressa como (Co). A constante de taxa de eliminação A foi estimada pela análise de re- gressão linear da inclinação terminal da curva logarítmica concentração plasmática-tempo. A meia-vida de eliminação, ti, foi calculada usando a equação, t12 = In2/A. Os últimos três pontos de tempo acima de LOQ foram usados nos cálculos de meia-vida de eliminação, se não afirmado de outra maneira.

Exemplo 38. Avaliação da inibição de let-7 in vivo por um

LNA-antimiR 8-mer, como determinado através da quantificação da pro- teina Ras em pulmão e rim de camundongo A fim de investigar a possibilidade de antagonizar a família let-7 abundantemente expressa in vivo, camundongos foram intravenosamente (iv) injetados com um antagonista LNA-antimiR 8-mer ou com salina. Para medir o efeito do tratamento, proteínas foram isoladas de pulmões e rins. Como se mostrou anteriormente que a família de proteínas Ras (N-Ras, K- Ras e H-Ras), em particular N-Ras e K-Ras, é regulada (reprimida) pela fa- mília let-7 por Johnson et al. (Cell, 2005), o objetivo foi analisar se estes let-7 alvos podem ser *desreprimidos in vivo.

Resultados: Como visto na Figura 37, os níveis da proteína Ras desreprimidos potentemente por LNA-antimiR 8-mer nos rins de camundon- gos tratados, normalizados contra controles em solução salina. A regulação Ú para cima neste órgão foi mais do que 3 vezes, mostrando um claro efeito in vivo. Nos pulmões, entretanto, somente uma desrepressão mínima de Ras (1,2 vezes) foi observada (figura1B), sugerindo que quantidades insuficien- . tes de LNA-antimiR tenham sido introduzidas neste órgão a fim inibir suas quantidades maciças de let-7, como anteriormente descrito por Johnson et al. (Cancer Research, 2007). i 20 Conclusão: LNA-antimiR 8-mer mostra que um claro efeito na regulação do mIRNA let-7 alvo in vivo, como avaliado com base nos níveis de proteína Ras em camundongos tratados vs. controle. Ao passo que o e- feito parece ser menor em pulmões, os níveis de Ras no rim mostram uma regulação para cima substancial sob tratamento com antimiRs.

Materiais e Métodos: Animais e dosagem: Camundongos C57BL/6 fêmeas foram tratados com 10 mg/kg de LNA-antimiR ou solução salina por três dias consecutivos (0, 1, e 2) e sacrificados no dia 4. As amos- tras de tecido de pulmões e rins foram instantaneamente congeladas e ar- mazenadas a -80ºC até o processamento adicional.

Análise por western blot: Proteínas do pulmão e rim a partir de camundongos tratados com LNA-antimiR e solução salina foram separadas em NuPAGE Bis Tris 4 a 12% (Invitrogen), usando 100 ug por amostra. As

: 131/198 proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando iBlot (Invitrogen) de acordo com instruções do fabricante. Bloqueio, diluição e detecção de anticorpo foram realizados de acordo com as especificações do fabricante. Para a detecção de Ras, anticorpo primário de coelho anti-Ras (SC3339, Santa Cruz Biotechnology) e um anticorpo secundário suíno anti- coelho conjugado a HRP (PO0399, Dako) foi usados, e para a detecção de tubulina, um anticorpo primário para alfa tubulina (MS-581-P1, Neomarkers) e um secundário de cabra anticamundongo conjugado a HRP (PO0447, Dako) foram usados. Exemplo 40. Avaliação da eficácia in vivo do LNA-antimiR 8- mer (Nº3205) visando miR-21, como determinado pela regulação para ás cima da proteína Pdcd4 em rim de camundongo. ' Mostrou-se que um LNA-antimiR 8-mer que é totalmente modifi- cado por LNA antagoniza miR-21 e tem a capacidade de regular os níveis de proteína Pded4 alvo de miR-21 in vitro. Por isso, injetou-se o LNA-antimiR em camundongos para determinar os efeitos do LNA-antimiR in vivo. Os - camundongos receberam 25 mg/kg de Ne3205 por injeção i.v. em dias alter- nados por 14 dias (um total de 5 doses). Os camundongos foram sacrifica- dos no dia 14, o rim foi removido, e a proteína foi isolada. A fim de determi- “20 nara regulação alvo, análise por western blot foi realizada.

. Resultados: Como mostrado na Figura 37, tratamento dos ca- mundongos com Ne3205 mostrou níveis de proteína Pdeda4 significativamen- te aumentados comparando com o controle em solução salina. Enquanto Pdcd4 normalizado versus razão Gapdh foi consistente em ambas as amos- tras com solução salina, regulação para cima da proteína nos dois camun- dongos tratados com LNA-antimiR (camundongos Nºe32059 foram medidos para 3,3 e 6,3 vezes, respectivamente, demonstrando um efeito farmacológi- co in vivo do LNA-antimiR 8-mer Ne3205.

Conclusão: LNA-antimiR 8-mer Ne3205 totalmente modificado —porLNA antagoniza miR-21 in vivo, como demonstrado através da sua ca- pacidade de desreprimir níveis de Pded4 no rim de camundongo (regulados para cima), um alvo de miR-21 validado.

Materiais e Métodos: Animais e dosagem: Camundongos C57BL/6 fêmeas com média de peso corporal de 20 g na primeira dosagem foram usados em todos os experimentos e receberam dieta alimentar regular (Altromin n. 1324, Broga- arden, Gentofte, Denmark). As substâncias foram formuladas em solução salina fisiológica (NaCl 0,9%). Os animais foram dosados com LNA-antimiR ou salina (NaC! 0,9%), recebendo uma injeção de 25 mg/kg em dias alterna- dos por 14 dias, um total de 5 doses. Os animais foram sacrificados no dia

14.

Análise por western blot: 80 ug de tecido de rim de camundon- gos tratados com solução salina ou com LNA foram separados em NuPAGE E Bis Tris 4 a 12% (Invitrogen). As proteínas foram transferidas para uma : membrana de nitrocelulose usando iBlot (Invitrogen) de acordo com instru- Í ções do fabricante. A membrana foi incubada com o anticorpo para Pded4 (Bethyl Laboratories), seguida pelo anticorpo suíno anticoelho conjugado a i HRP (Dako). Como controle de carregamento igual, GAPDH (Abcam) foi u- - sado, seguido pelo anticorpo suíno anticamundongo conjugado a HRP. As membranas foram visualizadas por quimioluminescência (ECL, Amersham).

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[gu bomeacmaana pe focos 1913 [CAGCTGGG po Jonas 3787 K12-9*

Claims (50)

REIVINDICAÇÕES

1. Oligôêômero de 7 a 10 unidades nucleotídicas de tamanho, ca- racterizado pelo fato de que compreende uma sequência contigua de 7 a 10 unidades nucleotídicas de tamanho, em que pelo menos 70% das unidades —nucleotídicas do oligêômero são unidades nucleotídicas de Ácido Nucleico Fechado (LNA), em que o oligômero compreende pelo menos uma ligação fosforotioato.

2. Oligômero de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe- lo fato de que pelo menos 75% das ligações internucleosídicas presentes entreas unidades nucleotídicas da sequência nucleotídica contígua são liga- ções internucleosídicas fosforotioato. f

3. Oligôêômero de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe- ' lo fato de que todas as ligações internucleosídicas presentes entre as unida- des nucleotídicas da sequência nucleotídica contígua são ligações internu- . 15 —cleosídicas fosforoticato.

4. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 É a 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma unidade LNA na extre- midade 3' e uma unidade LNA na extremidade 5.

5. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a4, caracterizado pelo fato de que todas as unidades nucleotídicas da se- quência nucleotídica contígua são unidades nucleotídicas LNA.

6. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência nucleotídica contígua.

7. Oligêômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua com- preende uma sequência que é complementar a uma sequência semente de mamíferos, humanos ou sequência viral de microRNA.

8. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em um miRNA selecionado do grupo consistindo em ebv-miR-BHRF1-2, hsa-

MIR-140, ebv-miR-BART15, ebv-miR-BART8-5p, ebv-miR-BART11-5p, hsa- mMiR-561, hsa-miR-511, hsa-miR-511, hsa-miR-501, hsa-miR-204, hsa-miR- 211, hsa-miR-579, hsa-miR-609, hsa-miR-567, hsa-miR-409-3p, hsa-miR- 584, kshv-miR-K12-6-3p, hsa-miR-657, hsa-miR-451, hsa-miR-223, hsa- miR-145, hsa-miR-582, hsa-miR-137, hsa-miR-218, hsa-miR-218, hsa-miR- 520f, hsa-miR-135a, hsa-miR-135a, hsa-miR-135b, hsa-miR-532, hsa-miR- 188, hsa-miR-422b, hsa-miR-422a, homv-miR-US25-2-3p, ebv-miR-BARTS9, ebv-miR-BART13, hsa-miR-376a*, hsa-miR-586, hsa-miR-136, hsa-miR-660, hsa-miR-23a, hsa-miR-23b, ebv-miR-BART19, hsa-miR-453, hsa-miR-382, hsa-miR-578, hsa-miR-581, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-122a, hsa-miR-199a, hsa-miR-199a, hsa-miR-199b, hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-649, f hsa-miR-190, hsa-miR-1, hsa-miR-206, hsa-miR-1, hsa-miR-613, hsa-miR-9, . hsa-miR-9, hsa-miR-9, hsa-miR-509, hsa-miR-522, hsa-miR-423, hsa-miR- 553, hsa-miR-210, hsa-miR-662, hsa-miR-196a, hsa-miR-196a, hsa-miR- D 15 196b, ebv-miR-BART3-5p, hsa-miR-633, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-17-3p, hsa-miR-34b, hsa-miR-575, hsa-miR-139, hsa-miR-27a, hsa- : mMiR-27b, hsa-miR-142-5p, ebv-miR-BART2, hsa-miR-630, hsa-miR-187, hsa-miR-626, hemv-miR-US25-2-5p, hsa-miR-627, hsa-miR-642, hsa-miR- 93, hsa-miR-302a, hsa-miR-302b, hsa-miR-302c, hsa-miR-302d, hsa-miR- 372, hsa-miR-373, hsa-miR-520e, hsa-miR-520a, hsa-miR-526b*, hsa-miR- 520b, hsa-miR-520c, hsa-miR-520d, hsa-miR-155, kshv-miR-K12-11, ebv- MIR-BART14-3p, hsa-miR-565, hsa-miR-645, hsa-miR-191*, hsa-miR-523, hsa-miR-518f, hsa-miR-518e, hsa-miR-518a, hsa-miR-518a, hsa-miR-556, hsa-miR-28, hsa-miR-646, kshv-miR-K12-9*, hsa-miR-516-3p, hsa-miR-516- 3p, hsa-miR-516-3p, hsa-miR-516-3p, hsa-miR-483, hsa-miR-515-3p, hsa- MiR-515-3p, hsa-miR-566, hsa-miR-614, hsa-miR-18a*, hsa-miR-328, hsa- MiR-769-5p, hsa-miR-500, hsa-miR-606, hsa-miR-345, hsa-miR-151, hsa- MIR-499, hsa-miR-521, hsa-miR-521, hsa-miR-603, hsa-miR-146a, hsa-miR- 146b, hsa-miR-549, hsa-miR-154, hsa-miR-21, hsa-miR-590, hsa-miR-656, hsa-miR-643, kshv-miR-K12-9, hsa-miR-202, hsa-miR-144, hsa-miR-202”, hsa-miR-448, ebv-miR-BARTA, hsa-miR-433, hsa-miR-542-5p, hsa-miR-651, hsa-miR-620, hsa-miR-31, hsa-miR-205, hsa-miR-598, hsa-miR-517b, hsa-

MIR-217, hsa-miR-103, hsa-miR-103, hsa-miR-107, hsa-miR-338, hsa-miR- Í 767-5p, hsa-miR-493-5p, hsa-miR-221, hsa-miR-222, hsa-miR-489, hsa- mMiR-641, hsa-miR-302c*, hsa-miR-494, hsa-miR-380-3p, hsa-miR-576, hsa- miR-580, hsa-miR-186, ebv-miR-BART8-3p, hsa-miR-539, hsa-miR-607, k- —shv-miR-K12-10b, kshv-miR-K12-10a, hsa-miR-636, hsa-miR-362, hsa-miR- 623, hsa-miR-33, hsa-miR-33b, hsa-miR-595, hsa-miR-138, hsa-miR-138, hsa-miR-552, hsa-miR-302a*, ebv-miR-BART1-5p, ebv-miR-BART16, hsa- mMiR-34a, hsa-miR-34c, hsa-miR-449, hsa-miR-449b, hsa-miR-128a, hsa- MIiR-128b, hsa-miR-573, hsa-miR-520g, hsa-miR-520h, ebv-miR-BHRF 1-2, hsa-miR-622, hsa-miR-594, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-370, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-320, hsa-miR-504, hsa-miR-492, hsa-miR-200b, . hsa-miR-200c, hsa-miR-429, hsa-miR-134, hsa-miR-141, hsa-miR-200a, " hsa-miR-548a, hsa-miR-548a, hsa-miR-548a, hsa-miR-591, hsa-miR-496, hsa-miR-569, hsa-miR-768-3p, hsa-miR-203, hsa-miR-571, hsa-miR-147, : 15 ebv-miR-BART12, hsa-miR-608, hsa-miR-331, hsa-miR-631, hsa-miR-490, hsa-miR-432*, hemv-miR-UL70-3p, hemv-miR-US4, hsa-miR-299-3p, hsa- Í MiR-326, hsa-miR-661, hsa-miR-637, hsa-miR-663, hsa-miR-602, hsa-miR- 564, hsa-miR-95, hsa-miR-768-5p, hsa-miR-658, hsa-miR-583, hsa-miR-510, ebv-miR-BART20-5p, hsa-miR-214, kshv-miR-K12-1, hsa-miR-513, hsa-miR- i 20 513, ebv-miR-BART20-3p, hsa-miR-375, ebv-miR-BART1I8, hsa-miR-638, hsa-miR-450, hsa-miR-450, hsa-miR-604, kshv-miR-K12-8, hsa-miR-503, hsa-miR-126, ebv-miR-BART1-3p, hsa-miR-220, homv-miR-UL 112, hsa-miR- 208, kshv-miR-K12-2, hsa-let-7a, hsa-let-7a, hsa-let-7a, hsa-let-7b, hsa-let- Tc, hsa-let-7d, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-let-7f, hsa-miR-98, hsa-let-7g, hsa- let7i, hsa-miR-325, hsa-miR-199a*, hsa-miR-199a*, hsa-miR-601, hsa-miR- 384, eby-miR-BART7, hsa-miR-153, hsa-miR-153, hsa-miR-526b, hsa-miR- 125b, hsa-miR-125a, hsa-miR-125b, hsa-miR-432, hsa-miR-765, hsa-miR- 526c, hsa-miR-526c, hsa-miR-526c, hsa-miR-518f*, hsa-miR-526a, hsa-miR- 526a, hsa-miR-526a, hsa-miR-526c, hsa-miR-526a, hsa-miR-526c, hsa-miR- 526c, hsa-miR-368, hsa-miR-520a*, hsa-miR-525, hsa-miR-24, hsa-miR-24, hsa-miR-600, hsa-miR-542-3p, hsa-miR-194, hsa-miR-194, hsa-miR-421, hsa-miR-570, hsa-miR-555, hsa-miR-381, hsa-miR-527, hsa-miR-527, hsa-

mMIiR-527, hsa-miR-524*, hsa-miR-659, kshv-miR-K12-3, hsa-miR-219, hsa- MIR-219, hsa-miR-599, hsa-miR-339, ebv-miR-BART6-5p, kshv-miR-K12-3*, hsa-miR-493-3p, hsa-miR-212, hsa-miR-132, homv-miR-UL70-5p, hsa-miR- 340, hsa-miR-452*, hsa-miR-801, hsa-miR-149, hsa-miR-484, hsa-miR-572, hemv-miR-US25-1, hsa-miR-337, hemv-miR-UL148D, hsa-miR-668, hsa- MIR-454-5p, hsa-miR-769-3p, ebv-miR-BART6-3p, hsa-miR-548c, hsa-miR- 129, hsa-miR-129, hsa-miR-431, hsa-miR-502, hemv-miR-US33, hsa-miR- 648, hsa-miR-18a, hsa-miR-18b, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a, hsa-miR- 106a, hsa-miR-106b, hsa-miR-20b, hsa-miR-519d, hsa-miR-632, hsa-miR- 647, hsa-miR-639, hsa-miR-558, hsa-miR-596, ebv-miR-BART17-3p, kshv- mMIR-K12-5, hsa-miR-105, hsa-miR-105, hsa-miR-644, hsa-miR-635, hsa- 1 MIR-654, hsa-miR-560, hsa-miR-652, hsa-miR-525“, hsa-miR-524, hsa-miR- ' 518b, hsa-miR-518c, hsa-miR-518d, hsa-miR-562, hemv-miR-UL22A, hsa- MIiR-335, hsa-miR-512-5p, hsa-miR-512-5p, kshv-miR-K12-6-5p, hsa-miR- B 15 766, hsa-miR-498, hemv-miR-US5-1, hsa-miR-617, hsa-miR-554, hsa-miR- 127, hsa-miR-455, hsa-miR-519e, hsa-miR-346, hsa-miR-22, hsa-miR-324- S 3p, hsa-miR-193a, hsa-miR-193b, kshv-miR-K12-12, hsa-miR-371, hsa-miR- 615, hsa-miR-671, hsa-miR-133a, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR- 629, hsa-miR-324-5p, hsa-miR-605, hsa-miR-365, hsa-miR-365, hsa-miR- 296, hsa-miR409-5p, hsa-miR412, hsa-miR-329, hsa-miR-329, ebv-miR- BART10, hsa-miR-548b, hsa-miR-548d, hsa-miR-548d, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-550, hsa-miR-550, hsa-miR-200a*, hsa-miR-486, hsa-miR-487b, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-101, hsa-miR-101, hsa-miR-189, ebv-miR- BART14-5p, hsa-miR-154*, hsa-miR487a, hsa-miR-369-3p, kshv-miR-K12- 43p, hsa-miR-380-5p, hsa-miR-563, hsa-miR-758, hsa-miR-378, hsa-miR- 611, ebv-miR-BART17-5p, hsa-miR-369-5p, hsa-miR-379, hsa-miR-411, hsa-miR-7, hsa-miR-7, hsa-miR-7, hsa-miR-597, hsa-miR-224, hsa-miR-507, hsa-miR-557, hsa-miR-25, hsa-miR-32, hsa-miR-92, hsa-miR-92, hsa-miR- 363, hsa-miR-367, hsa-miR-92b, hsa-miR-96, hsa-miR-183, hsa-miR-506, hsa-miR-588, hsa-miR-197, ebv-miR-BART3-3p, hsa-miR-514, hsa-miR-514, hsa-miR-514, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-342, ebv-miR-BART11-3p, hsa-miR- 505, hsa-miR-302b*, hsa-miR-410, kshv-miR-K12-4-5p, hsa-miR-495, hsa-

mMIR-126*, hsa-miR-323, hsa-miR-508, hsa-miR-585, hsa-miR-99a, hsa-miR- i 100, hsa-miR-99b, hsa-miR-26a, hsa-miR-26b, hsa-miR-26a, hsa-miR-182", hsa-miR-618, hsa-miR-9*, hsa-miR-9*, hsa-miR-9*, hsa-miR-192, hsa-miR- 215, hoemv-miR-US5-2, hsa-miR-488, hsa-miR-587, hsa-miR-374, ebv-miR- BARTS5S, ebvmiR-BHRF1-1, hsa-miR-143, hsa-miR-363*,hsa-miR-518c”, hsa-miR-516-5p, hsa-miR-516-5p, hsa-miR-619, hsa-miR-491, ebv-miR- BHRF1-3, hsa-miR-184, hsv1-miR-H1, hsa-miR-181a*, hsa-miR-517*, hsa- mMIR-517*, hsa-miR-517*, hsa-miR-376a, hsa-miR-376b, hsa-miR-376a, hsa- mMiR-185, hsa-miR-361, hsa-miR-383, hsa-miR-198, homv-miR-UL22A”, hsa- miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-181c, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa- mIiR-181d, hsa-miR-592, hsa-miR-216, hsa-miR-767-3p, hsa-miR-574, hsa- ' MIR452, hsa-miR-517a, hsa-miR-517c, hsa-miR-148a, hsa-miR-152, hsa- . MiR-148b, hsa-miR-519c, hsa-miR-519b, hsa-miR-519a, hsa-miR-519a, hsa- MIR-544, hsa-miR-612, hsa-miR-650, hsa-miR-124a, hsa-miR-124a, hsa- . 15 miR-124a, hsa-miR-621, hsa-miR-15a, hsa-miR-16, hsa-miR-16, hsa-miR- 15b, hsa-miR-195, hsa-miR-424, hsa-miR-497, hsa-miR-634, hsa-miR-330, Í hsa-miR-640, kshv-miR-K12-7, hsa-miR-551a, hsa-miR-551b, hsa-miR-624, hsa-miR-593, hsa-miR-29a, hsa-miR-29b, hsa-miR-29b, hsa-miR-29c, hsa- MIR-485-3p, hsa-miR-655, hsa-miR-377, hsa-miR-802, hsa-miR-589, hsa- miR-30a-5p, hsa-miR-30c, hsa-miR-30d, hsa-miR-30b, hsa-miR-30c, hsa- miR-30e-5p, hsa-miR-653, hsa-miR-628, hsa-miR-559, hsa-miR-610, hsa- mMiR-568, hemv-miR-UL36, hsa-miR-625, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-191, hsa-miR-130a, hsa-miR-301, hsa-miR-130b, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-182, hsa-miR-545, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-519e*, hsa-miR-515-5p, hsa-miR- 150, hsa-miR-577, hsa-miR-19a, hsa-miR-19b, hsa-miR-19b, hsa-miR- 520d*, hsa-miR-373*, e hsa-miR-616.

9. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em um miRNA selecionado do grupo consistindo em miR-1, miR-10b, miR-17- 3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, mIiR-21, miR-34a, miR-93, miR- 106a, miR-106b, miR-122, miR-133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192,

MIR-194, miR-221, miR-222, e miR-375.

10. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em — hsa-miR-33 ou hsa-miR-33b.

11. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-9 ou hsa-miR-9*.

12. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é y complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em . hsa-miR-10a ou hsa-miR-10b.

13. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 p 15 a7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em ' hsa-miR-20a ou hsa-miR-20b.

14. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-19a or hsa-miR-19b.

15. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-106a.

16. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-155.

17. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-21.

Í 18. Oligôêmero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-122a.

19. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-208.

20. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é - complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em . hsa-miR499.

21. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 . 15 a7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em À hsa-miR-15.

22. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-195.

23. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR451.

24. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-29.

25. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-92.

26. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-143.

27. Oligôêômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-145.

28. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é . complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em 7 hsa-miR-199.

29. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 . 15 a7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em ' hsa-miR-206.

30. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-378.

31. Oligôêômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-375.

32. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa- miR-138.

33. Oligôêômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa- miR-34a.

34. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-27a.

35. Oligêmero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-182.

36. Oligôêmero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é , complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em ' hsa-miR-183.

37. Oligôêômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 . 15 a7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em h hsa-miR-96.

38. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é Í 20 complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-338.

39. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-30.

40. Oligôêmero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-133.

41. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-17.

42. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua é complementar a uma sequência nucleotídica correspondente presente em hsa-miR-24.

43. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua consis- te em ou compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em AAAAGAT, ARACCAC, ARACCGT, ARSACTGT, AAACTTT, AAAGACA, AA- — AGGAT, AMAGGGA, AAATGAA, AACACCC, AACATAC, AACATTC, AAC- CATA, AACCATC, AACCTGC, AACGGTT, AACTGAC, AACTGGA, A- ' ACTGTA, AAGCAAT, AAGCACA, AAGCACT, AAGCCAT, AAGGCAT, A- ' AGGGAT, AAGTCCA, AAGTGGA, AAGTGTT, AAGTTAC, AATCTAC, A- ATGCAT, AATGGAG, AATGGGT, AATGTGA, ACAAAAC, ACAACCT, A- B 15 CAACTT, ACAAGAA, ACACAAG, ACACTAC, ACACTCC, ACACTGG, A- CAGGGT, ACAGGTT, ACATATC, ACATTCC, ACCAAAG, ACCAATC, AC- S CATTT, ACCGAGC, ACCGTTT, ACGCAC, ACGTGGG, ACTACCT, AC- TAGGT, ACTATTA, ACTGAAA, ACTGCAG, ACTGCCT, ACTGGCT, ACTG- TAG, ACTGTGA, ACTTTAT, AGAAAAT, AGAATAC, AGACACG, AGA- — CAGC,AGACCGC, AGACTCA, AGAGGGA, AGCACTT, AGCATTA, AG- CATTT, AGCCAGC, AGCCTAG, AGCGCAG, AGCGCGT, AGCGCTT, AGCTCAT, AGCTCCT, AGCTGCT, AGCTGGG, AGGAAGC, AGGAGTG, AGGCACT, AGGCGCC, AGGCGTT, AGGGCAG, AGGGCCA, AGGTCTC, AGGTGCA, AGTAGTT, AGTCAGC, AGTCTAG, AGTCTTA, AGTGCGT, AGTGTGT, AGTTCTC, AGTTGTC, ATAACCT, ATAAGCT, ATAATAT, ATA- CAAG, ATACCCA, ATACCTC, ATACTGT, ATAGGAA, ATATGCA, AT- CAGGT, ATCATGA, ATCCCCG, ATCCTAA, ATCTCCA, ATCTTGC, ATGA- AGG, ATGACGT, ATGCACG, ATGCAGT, ATGCTGC, ATGCTGG, ATGGTGC, ATGTACA, ATGTAGC, ATGTCAC, ATGTCTT, ATGTTAA, —ATGTTTC, ATTACAT, ATTAGAA, ATTCTCA, ATTCTTT, ATTGTGA, ATTTCTC, ATTTGAA, CAACACC, CAACACT, CAAGCAC, CAAGGAT, CA- AGGGA, CAATGCA, CACACTT, CACCAGC, CACCTGT, CACGTTT, CAC-

TAAG, CACTCTA, CACTGCC, CACTGTG, CACTTCA, CACTTTG, CAGA- É ATT, CAGACTG, CAGATGG, CAGCACT, CAGCAGG, CAGCCTC, CAGCTTT, CAGGGTC, CAGGTCC, CAGTATT, CAGTCAC, CAGTGTT, CAGTTTT, CATGGTC, CATGTAA, CATTAAC, CATTGTG, CATTTCA,

—CCAACTC, CCACACA, CCACAGG, CCACCCC, CCAGGGG, CCAGGTC, CCAGGTT, CCATCCA, CCATCCC, CCATGTC, CCCACAT, CCCAGAG, CCCAGGC, CCCCCAG, CCCCGCOC, CcestT GT, CEGTGCC, CCGTTGA, CCTCCAA, CCTCCGC, CCETCTTT, CCTGAGT, CCTGCTA, CCETGCTG, CCTGTAA, CCTGTGA, CCTTCAT, CGAACAA, CGAACTT, CGATCCC,

CGCAAAA, CGCAGCC, CGCGCCT, CGCTGCT, CGGTACG, CGGTGCT, CGGTGTG, CGTCACT, CGTCTTA, CTACAGT, CTACCTC, CTACTAG, E CTACTGT, CTAGACC, CTAGGAA, CTATGAT, CTATGCA, CTCAAGA, CT- 1 CAGGG, CTCCAAG, CTCCTCC, CTCTAGA, CTCTATG, CTCTGGA, CT- GAGCC, CTGTAAG, CTGTCAC, CTGTTAC, CTGTTGA, CTGTTTT, CT- V 15 TACCC, CTTGTAT, CTTTGCA, CTTTGTA, GAACCAA, GAATGTG, GACA- ATC, GACACAA, GACAGGG, GACCAAC, GACCGCG, GACCTTC,

i GACTGTT, GAGACGC, GAGACGG, GAGACTG, GAGCAAT, GAGCCAG, GAGCCTG, GAGCGGA, GAGCGGT, GAGCTGG, GAGGACG, GAGTGAC, GATAGGG, GATCCCA, GATCCCC, GATTTTT, GCAAAAA, GCAAGAC,

| 20 —GCAAGGA, GCACAAT, GCACACT, GCACCTT, GCACTTT, GCAGACA, GCAGCCA, GCAGCGA, GCAGCTC, GCAGGCT, GCATACA, GCATCCT, GCATTTG, GCCACAC, GCCCAAG, GCCCACC, GCGCACG, GCGCCAT, GCGCCTT, GCGCTTT, GCTACTT, GCTAGTT, GCTCTTG, GCTGAGT, GCTGCTG, GCTGGAG, GCTTGAA, GCTTGTC, GGAAGTC, GGACTAG,

GGATCCG, GGCACAT, GGCACTT, GGCAGAC, GGCAGCT, GGCAGTG, GGCCAGT, GGCCTGG, GGCGGCA, GGCTCGG, GGCTTCC, GGGACCA, GGGAGAA, GGGATGC, GGGATTT, GGGCATT, GGGGCCC, GGTAACC, GGTGAAG, GGTGTGT, GGTTATG, GGTTCTT, GGTTTIT, GTAAACC, GTAAGAC, GTAAGAT, GTACAGG, GTACGAT, GTACTGG, GTACTGT,

—GTAGGCA, GTAGGGT, GTATGAT, GTATTAT, GTATTCT, GTCAACC, GT- CACAA, GTCAGGA, GTCCTCG, GTCCTCT, GTCGATC, GTCTACC, GTC- TACT, GTCTTCC, GTGACAC, GTGACTT, GTGCAAA, GTGCAAT, GTGC-

CAA, GTGCCAT, GTGCCTT, GTGGCCA, GTGGTGA, GTGGTGC, GTGT- i CAA, GTGTCAT, GTGTGAG, GTGTGCG, GTGTTGA, GTTAAAG, GTTA- TAT, GTTTAGC, GTTTGTT, TAATAAT, TAATGTG, TACAATC, TACGCCC, TACGGGT, TACTTGA, TAGAACC, TAGAGTT, TAGCTTT, TAGGTCA, TATCATA, TATCTGG, TATGGAA, TATTATA, TCACCTT, TCAGGTT, TCATCTC, TCCACCC, TCECAGAG, TCECAGAT, TOCAGGT, TCCCCAC, TCCCGTT, TCCGTCC, TCCTTCC, TOEGATGG, TCETAGAG, TCTATGA, TCTCTCC, TCTGATA, TCTGATC, TCTGGAC, TCTGGTG, TGAATGT, TGACACA, TGAGATT, TGAGCAG, TGAGCGT, TGCAAAC, TGCACGA, TGCACTG, TGCACTT, TGCAGAA, TGCCCAG, TGCCTCC, TGCCTTA, TGCTAGC, TGCTGCT, TGCTGGT, TGCTTTG, TGGATCA, TGGGATC, r TGGGTCG, TGGTACT, TGEGTGCC, TGEGTGCT, TGTATGA, TGTATTA, ' TGTGTGA, TGTTACT, TGITCTG, TGTTTAC, TGTTTCA, TTACTAG, TTACTTT, TTAGCTC, TTATACA, TTCAACG, TTCCCCC, TTCCCGA, TTCCGTT, TTIGCACT, TTGCCAA, TTGCTGA, TTGGAGA, TTGGGAG, TT- Í TATCT, TITGCAC, TITGTAG, e TITTGAG.

Ú

44. Oligôêômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência nucleotídica contígua consis- te em ou compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em — AAAACCAC, AMAAGACA, AAACACCC, AAACCATA, AAACCATC, AA- ACTGAC, ASACTGGA, ARAGCCAT, ARATGGAG, AACAAAAC, AACA- ACTT, AACACAAG, AACACTAC, AACACTGG, AACATATC, AACATTCC, AACCAAAG, AACCATTT, AACGTGGG, AACTACCT, AACTGGCT, AAGA- CACG, AAGCACTT, AAGCATTA, AAGCGCAG, AAGCGCGT, AAGCGCTT, AAGGAAGC, AAGGCACT, AAGTCTTA, AAGTGCGT, AATAAGCT, AAT- GAAGG, AATGCTGC, AATGTAGC, AATTAGAA, AATTCTIT, AATTTCTC, ACAACACC, ACAACACT, ACAATGCA, ACACCAGC, ACACTGCC, ACA- GAATT, ACAGCACT, ACAGTATT, ACAGTGTT, ACATTTCA, ACCACAGG, ACCACCCC, ACCCAGGC, ACCGTGCC, ACGAACAA, ACGGTACG, —ACGGTGTG, ACTACAGT, ACTACCTC, ACTACTGT, ACTATGAT, AC- TATGCA, ACTCCAAG, ACTGAGCC, AGAATGTG, AGACCTTC, A- GACTGTT, AGAGCAAT, AGATCCCA, AGATTTTT, AGCAAGGA, AG-

CACTTT, AGCAGACA, AGCAGCTC, AGCATTTG, AGCCACAC, | AGCGCCTT, AGCEGCTTT, AGCTACTT, AGGACTAG, AGGCACAT, AGG-

CACTT, AGGCCAGT, AGGCTCGG, AGGTGAAG, AGGTGTGT, AGGTTCTT, AGTAAGAC, AGTACAGG, AGTACTGT, AGTAGGCA, AG-

—TATTCT, AGICAGGA, AGTCTACC, AGTCTTCC, AGTGACAC, AGT- GACTT, AGTGCAAT, AGTGCCAA, AGTGCCAT, AGTGGTGC, AGTGTCA- A, AGTIGTTGA, ATACGCCC, ATAGGTCA, ATCAGGTT, ATCCACCC, ATC- TAGAG, ATGAATGT, ATGAGCAG, ATGAGCGT, ATGCACGA, ATG- CACTG, ATGCACTT, ATGCAGAA, ATGGGATC, ATGGGTCG,

ATGGTGCT, ATGTATTA, ATGTTTAC, ATTCCCGA, ATTCCGTT, ATTG- CACT, ATTGCCAA, ATTTGCAC, ATTTTGAG, CAAAAGAT, CAAACTGT,

. CAAAGGAT, CAAAGGGA, CAAATGAA, CAACATTC, CAACTGTA, CAAG- . CACA, CAAGGCAT, CAAGGGAT, CAAGTCCA, CAAGTGGA, CAAGTTAC, CAATGCAT, CAATGGGT, CAATGTGA, CACAAGAA, CACACTCC, CA- CAGGTT, CACCGTTT, CACGCACA, CACTAGGT, CACTGCAG, CACTGCCT, CACTGTAG, CACTGTGA, CAGAAAAT, CAGAATAC, CAGA- Á CAGC, CAGACCGC, CAGCACTT, CAGCATTT, CAGCCTAG, CAGCTGCT, CAGCTGGG, CAGGCGCC, CAGGCGTT, CAGGTGCA, CAGTAGTT, CAGTCTAG, CAGTGTGT, CAGTTCTC, CATACAAG, CATAGGAA, CA-

—TATGCA, CATCAGGT, CATCATGA, CATCTTGC, CATGGTGC, CATGTA- CA, CATGTTAA, CATTCTCA, CCAAGGAT, CCACGTTT, CCACTAAG, CCACTCTA, CCAGATGG, CCAGCAGG, CCAGCCTC, CCAGCTIT, CCAGGGTC, CCAGTCAC, CCAGTTTT, CCATGGTC, CCATGTAA, CC- CAGGGG, CCCATCCC, CCCEGTTGA, CCCTCCGC, CCCETGTGA, CCG-

CAGCC, CCGCTGCT, CCGTCACT, CCTACCTC, CCTACTAG, CCTA- GACC, CCTCAAGA, CCTCTAGA, CCTCTATG, CCTCTGGA, CCTTGTAT, CCTTTGCA, CCTTTGTA, CGAGACGC, CGAGCGGA, CGAGTGAC, CGATCCCC, CGCAAAAA, CGCAGCGA, CGGATCCG, CGTAGGGT, CGTCCTCT, CGTGCAAA, CGTGCAAT, CGTGTCAT, CTACAATC,

—CTACGGGT, CTAGAACC, CTAGCTTT, CTATCATA, CTATGGAA, CTC- CAGAG, CTCCAGAT, CTCCGTCC, CTCTATGA, CTCTGGAC, CTGAGATT, CTGCAAAC, CTGCCCAG, CTGCCTCC, CTGGATCA, CTGGTACT,

CTGGTGCC, CTTACTAG, CTTCAACG, CTTTGTAG, GAAACCGT, GAA- CATAC, GAACCTGC, GAAGCACT, GAAGTGTT, GAATCTAC, GACAACCT, GACCGAGC, GACTGAAA, GAGACTCA, GAGAGGGA, GAGCCAGC, GAGCTCAT, GAGCTCCT, GAGGAGTG, GAGGGCCA, GAGGTCTC,

—GAGTCAGC, GATAACCT, GATAAGCT, GATCCCCG, GATGACGT, GATGCACG, GATGCAGT, GATGCTGG, GATGTAGC, GATGTCAC, GATTGTGA, GATTTGAA, GCAAGCAC, GCAAGGGA, GCAATGCA, GCA- CACTT, GCACTTTG, GCAGACTG, GCAGGTCC, GCAGTATT, GCATTGTG, GCCAACTC, GCCAGGTC, GCCATCCA, GCCCAGAG,

GCCCCCAG, GCCCCGCC, GCECeGtTGT, GCETGCTA, GCCTGCTG, GCCTTCAT, GCGAACTT, GCGATCCC, GCGGTGCT, GCTGTTAC,

” GCTGTTTT, GCTTACCC, GGACAATC, GGACAGGG, GGACCAAC, hi GGAGCCAG, GGAGCTGG, GGAGGACG, GGCACAAT, GGCACTTT, GG- CAGGCT, GGCATACA, GGCATCCT, GGCCCACC, GGCGCACG, GGCGCCAT, GGCTAGTT, GGCTGAGT, GGCTGGAG, GGCTTGAA, í GGCTTGTC, GGGAAGTC, GGGCAGAC, GGGCAGTG, GGGCCAGT, GGGCTTCC, GGGGACCA, GGGGATGC, GGGGCATT, GGGGGCCC, GGGTAACC, GGTAAACC, GGTAAGAT, GGTACTGG, GGTCAACC, GGT- CACAA, GGTCCTCG, GGTCGATC, GGTCTACT, GGTGCAAA,

GGTGCCTT, GGTGGTGA, GGTGTGCG, GGTTTAGC, GTAATAAT, GTA- ATGTG, GTAGAGTT, GTATTATA, GTCCAGGT, GTCCTTCC, GTCGATGG, GTGCACTG, GTGCCTTA, GTGCTGCT, GTGCTGGT, GTGCTTTIG, GTGGGTCG, GTGTATGA, GTTGGGAG, GTTTTGAG, TAAACTTT, TA- ACGGTT, TAAGCAAT, TAAGTCCA, TACAGGGT, TACATTCC, TACCA-

ATC, TACTATTA, TACTTTAT, TAGCATTA, TAGGGCAG, TAGTTGTC, TA- TAATAT, TATACCCA, TATACCTC, TATACTGT, TATCCTAA, TATCTCCA, TATGTCTT, TATGTTTC, TATTACAT, TCACCTGT, TCACTGTG, TCACTT- CA, TCATTAAC, TCCACACA, TCCAGGTT, TCCATGTC, TCCCACAT, TCCTCCAA, TCECTCOTTT, TCECTGAGT, TCECTGTAA, TOEGCAAAA,

—TCGCGCCT, TEGTCTTA, TCETAGGAA, TCTCAGGG, TCTOCTCC, TCTG- TAAG, TCTGTCAC, TCTGTTGA, TGAACCAA, TGACACAA, TGACCGCG, TGAGACGG, TGAGACTG, TGAGCCTG, TGAGCGGT, TGATAGGG, TG-

. CAAGAC, TGCACACT, TGCACCTT, TGCAGCCA, TGCCCAAG, TGCTCTTG, TGCTGCTG, TEGCAGCT, TGEGCCTGG, TGEGCGGCA, TGG- GAGAA, TGGGATTT, TGGTTATG, TGGTTTTT, TGTACGAT, TGTATGAT, TGTATTAT, TGTCAACC, TGTGCAAT, TGTGGCCA, TGTGTGAG, TGTTA- —AAG,TGTTATAT, TGTTIGTT, TTACTTGA, TTATCTGG, TTCACCTT, TT- CATCTC, TTCCCCAC, TTCCCGTT, TTCTCTCC, TTCTGATA, TTICTGATC, TTCTGGTG, TTIGAATGT, TGACACA, TIGCTAGC,TTGCTGCT, TTIGTGT- GA, TTIGTTACT, TIGTTCTG, TIGTTTCA, TITACTTT, TITAGCTC, TITTA- TACA, TTITCCCCC, TTTGCTGA, TTITGGAGA, e TITTATCT.

45. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência nucleotídica ” contígua de 7 nucleotídeos LNA, em que todas as ligações internucleosídi- Ú cas são ligações fosforotioato.

46. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ad44, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência nucleotídica : contígua de 8 nucleotídeos LNA, em que todas as ligações internucleosídi- S cas são ligações fosforotioato.

47. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência nucleotídica contígua de 9 nucleotídeos LNA, em que todas as ligações internucleosídi- cas são ligações fosforotioato.

48. Oligôêômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência nucleotídica contígua de 10 nucleotídeos LNA, em que todas as ligações internucleosídi- cassão ligações fosforoticato.

49. Oligômero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 48, caracterizado pelo fato de que é usado como medicamento.

50. Método in vitro para reduzir a quantidade eficaz de um alvo MicroRNA em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende admi- nistrar uma composição compreendendo o oligômero, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 48, de forma a reduzir a uma quantida- de eficaz de microRNA em uma célula.