CN113322321A - 一种乳腺癌基因检测试剂盒及其应用方法 - Google Patents

一种乳腺癌基因检测试剂盒及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域技术领域，具体涉及一种乳腺癌基因检测试剂盒及其应用方法。本发明公开了联合检测miR‑2053和LncRNA RP11‑624L4.1的表达水平在制备诊断乳腺癌的产品中的应用以及相关的检测试剂盒。另外，本发明还提供了miR‑2053和LncRNA RP11‑624L4.1在制备治疗乳腺癌的药物组合物的应用以及相关的药物组合物。本发明的试剂盒能够作为乳腺癌诊断的手段之一，具有检测快速方便、检测灵敏度高、特异度好、成本低，可以满足绝大多数肿瘤病人的检测需求，应用范围广。本发明的药物组合物对乳腺癌有较好的抑制作用，在乳腺癌治疗中具有重要的参考意义和现实意义。

Description

一种乳腺癌基因检测试剂盒及其应用方法
技术领域
本发明属于生物医药领域技术领域。更具体地属于分子生物学技术领域，涉及一种乳腺癌基因检测试剂盒及其应用方法。
背景技术
乳腺癌(breast cancer)是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。目前乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，女性乳腺癌发病率全国合计约为42.55/10万，城市约为51.91/10万，农村约为23.12/10万。乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题。乳腺癌早早期时临床无症状，隐匿阶段平均为12年，等到有明显症状时多已是中晚期。
进入21世纪后，随着现代生物技术突风猛进的发展，尤其是基因测序技术和基因组分析技术的成熟，科学家们发现大部分基因被转录为非编码RNA(non-coding RNA，ncRNAs)。非编码RNA根据RNA编码长度的不同分为两种，一种为长度小于200个核苷酸的RNA，主要有微小RNA(miRNAs)，小干扰RNA(siRNAs)等，其中，miRNAs是一种小的(约22个核苷酸)非编码RNA，在细胞增殖、分化、凋亡和癌变等多种生物学和病理过程中起着重要作用；miRNAs参与了肿瘤发展的各个阶段，表明miRNA的异常表达在肿瘤发展过程中对已知癌基因或抑癌基因的表达起着重要的调节作用。另外一种为长度超过200个核苷酸的长链非编码RNA(long non-codingRNA,LncRNA)，长链非编码RNA的长度一般在200-100000个核苷酸之间，位于细胞核或胞质内，按照其来源可分为Antisense LncRNA(反义长非编码RNA)，Intronic tran(内含子非编码RNA)，Long intergenc noncoding RNA(lincRNA)，Promoter-associated LncRNA(启动子相关LncRNA)，UTR associated LncRNA(非翻译区LncRNA)五种类型。长链非编码RNA具有mRNA相似的结构，经剪接，具有ployA尾巴以及启动子结构，其分化过程中有动态的表达以及不同的剪接方式，形成不同的LncRNA；LncRNA在表观遗传、转录及转录后水平上调控基因的表达，其参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，与人类疾病的发生、发展和防治有着密切的关系。
目前的研究表明，在乳腺癌的发生发展中，miRNA和LncRNA均有起到不同程度的作用，有可能都可以作为乳腺癌诊断和治疗的靶标。但是，仅检测miRNA或LncRNA，可能会存在一点的假阳性或假阴性的结果。
发明内容
本发明要解决的技术问题一是筛选合适可用于乳腺癌诊断或治疗的分子标志物，其中包含了miRNA和LncRNA；二是在此基础上，开发一种用于检测乳腺癌的基因试剂盒，克服现有技术中仅检测miRNA或LncRNA可能存在的假阳性或假阴性的问题。
因此，本发明的目的是提供一种乳腺癌的基因检测试剂盒以及应用。本发明另一目的是提供乳腺癌分子标志物在筛选治疗乳腺癌的候选药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一方面，本发明提供了一种乳腺癌基因检测试剂盒，所述的试剂盒包括检测miR-2053和LncRNA RP11-624L4.1表达水平的试剂。
优选地，本发明所述的试剂包括特异性识别miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的探针和特异性扩增miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的引物。
优选地，本发明所述的特异性识别miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的探针如下所示：miR-2053-Taqman-MGB：5’-FAM-tacctcaactgaattgcc-MGB-3’；LncRNA RP11-624L4.1-Taqman-MGB：5’-HEX-ctgtgtatactgctcagg-MGB-3’。
优选地，本发明所述的特异性扩增miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的引物如下所示：
miR-2053-F：5’-acactccagctggggtgttaattaaacctct-3’；
miR-2053-R：5’-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgaggtaaatag-3’；
LncRNA RP11-624L4.1-F：5’-tggggaaagggataggaggg-3’；
LncRNA RP11-624L4.1-R：5’-gtatgggattggggtgtgca3’。
优选地，本发明所述的PCR反应液还包括内参基因U6的特异性扩增引物和特异性探针，所述引物和探针的序列如下：
U6-F：5’-tgcgggtgctcgcttcggcagc-3’；
U6-R：5’-ccagtgcagggtccgaggt-3’；
U6-Taqman-MGB：5’-CY5-cctgcgcaa ggatgacacg-MGB-3’。
优选地，本发明所述的试剂盒的判定公式为Y＝0.0678*AmiR-2053+0.0851*BLncRNA RP11-624L4.1；其中，A miR-2053是miR-2053的表达量，BLncRNARP11-624L4.1是LncRNA RP11-624L4.1的表达量；当Y≥0.04时判断为阳性；当Y＜0.0399时判为阴性。
另一方面，本发明还提供了一种所述的miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1基因的用途，所述用途为用于制备治疗乳腺癌的药物组合物。
优选地，本发明所述药物组合物包括miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1基因的抑制剂。
优选地，本发明所述miR-2053基因的抑制剂为si-miR-2053，si-miR-2053的序列如SEQ ID NO.1所示；所述的LncRNARP11-624L4.1基因的抑制剂为si-LncRNA RP11-624L4.1，si-LncRNA RP11-624L4.1的序列如SEQ ID NO.2所示
本发明具有以下有益效果：
本发明通过生物信息学和现有的分子生物学的技术手段，筛选用于乳腺癌诊断和治疗的分子标志物，选择一种miRNA和一种LncRNA。我们从中选择miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1作为组合分子标记物(在乳腺癌中，miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1上调)。在此基础上，本发明提供了联合检测miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的表达水平在制备诊断乳腺癌的产品中的应用以及相关的检测试剂盒。本发明的试剂盒能够作为乳腺癌诊断的手段之一，具有检测快速方便、检测灵敏度高、特异度好、成本低，克服了单一指标的缺陷，可以满足绝大多数肿瘤病人的检测需求，应用范围广等。具体如下：
(1)本发明根据保守性特异序列设计并合成特异性引物及Taqman-MGB探针，采用荧光定量PCR方法快速灵敏地检测miRNAs和LncRNA，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，可实现对待测样本的快速、有效检测。(2)由于采用定量检测技术-Taqman-MGB荧光定量PCR(Real-time PCR)，该方法(Real-time PCR)具有单管封闭操作防污染、自动化程度高、特异性强、可实时监控等优点，有效地解决了传统方法只能终点检测的局限。(3)由于探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间上的位置更接近，实验灵敏度更高，特异性更强。(4)Taqman-MGB探针法荧光定量PCR方法简便、快速，整个过程(包括加样，只用加一次样即可检测2种指标)可在一个小时内完成，计算机自动报告结果，无需电泳及其他后续的工作，即方便了操作又减少了污染。
另外，本发明还提供了miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1在制备治疗乳腺癌的药物组合物的应用以及相关的药物组合物。本发明的药物组合物对乳腺癌有较好的抑制作用，在乳腺癌治疗中具有重要的参考意义和现实意义。
附图说明
图1乳腺癌组织和癌旁组织中miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1表达量分析结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明经过广泛而深入的研究，通过生物信息学技术和分子生物学技术，检测乳腺癌中miRNA和LncRNA的表达水平，发现其中具有明显表达差异的miRNA和LncRNA，探讨其与乳腺癌的发生之间的关系，从而为乳腺癌的检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明选择miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1作为组合分子标记物(在乳腺癌中，miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1上调)。进一步的实验证明，改变miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的表达水平可以影响乳腺癌的生长，提示miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1可以作为药物靶标用于乳腺癌的精准治疗。
“生物标志物”与“标志物”可以等同替代，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。在本发明中，术语“生物标志物”指代与乳腺癌相关联的基因、基因的片段或变体。
本发明的miR-2053、LncRNARP11-624L4.1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
本发明所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。
通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的表达。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种生物标志物的特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、mRNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。举例说明，本发明提供的试剂盒是基于qRT-PCR实验来源的，本发明不仅提供了一种检测miR-2053、LncRNARP11-624L4.1的引物，还提供了具体的检测方法，在此基础上，本发明提供了一种用于检测miR-2053、LncRNARP11-624L4.1表达水平的qRT-PCR检测试剂盒以及该试剂盒在诊断乳腺癌中的应用。
这样一种试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。所述生物样品可以是例如细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、细胞器、生物液体、血液样品、尿液样品或皮肤抑制剂和药物(组合物)。
基于发明人的发现，本发明还提供了一种miR-2053、LncRNARP11-624L4.1的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制miR-2053、LncRNARP11-624L4.1基因的功能性表达即可，举例来说，本发明的抑制剂可以是以miR-2053、LncRNARP11-624L4.1基因为靶序列、且能够抑制miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA微小RNA、反义核酸的构建物。这些抑制剂作为对于下调miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1有用的物质，可用于治疗乳腺癌。
作为本发明的一种优选方式，所述miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的抑制剂是一种miR-2053、LncRNARP11-624L4.1特异性的siRNA。如本文所用，能够达到抑制乳腺癌的发生和发展。
本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
本发明的药物组合物包括miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。在本发明的实施例中，本发明的药物组合物靶向抑制乳腺癌的发生和发展。另外，在本发明的另一实施例中，在裸鼠成瘤模型中，本发明的药物组合物具有良好的抑制乳腺癌发生和发展的作用。
当然，本发明的药物组合物还可与其他治疗乳腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1乳腺癌中miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的表达水平检测以及检测试剂盒的建立
1.收集30例乳腺癌病人组织和癌旁组织(距离肿瘤边缘5公分)。
2.RNA样品的制备：使用TRIZOL法提取组织总RNA
1)每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；2)将上述组织的Trizol裂解液转入EP管中，在试问15～30℃下放置5分钟；3)在上述EP管中，按照每1ml Trizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下(15～30℃)放置2～3分钟后，12000g(2～8℃)离心15分钟；4)去上层水相置于新EP管中，按照每1mlTrizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下(15～30℃)放置10分钟后，12000g(2～8℃)离心10分钟；5)弃上清，按照每1ml Trizol加1ml 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g(2～8℃)离心5分钟，弃上清；6)让沉淀的RNA在室温在自然干燥；7)用Rnase-free water溶解RNA沉淀；8)提取的RNA样本测定浓度和OD260/OD280的比值以控制样本质量，选择OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间的样本用于后续试验。
3.引物设计：根据的miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1序列，运用Primer Primer5.0软件进行引物和探针的设计。得到多对特异性引物和探针，经过比对筛选，最终分别确定一组最佳引物和MGB探针。具体如下：
miR-2053-F：5’-acactccagctggggtgttaattaaacctct-3’；
miR-2053-R：5’-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgaggtaaatag-3’；
LncRNA RP11-624L4.1-F：5’-tggggaaagggataggaggg-3’；
LncRNA RP11-624L4.1-R：5’-gtatgggattggggtgtgca3’；
miR-2053-Taqman-MGB：5’-FAM-tacctcaactgaattgcc-MGB-3’；
LncRNA RP11-624L4.1-Taqman-MGB：5’-HEX-ctgtgtatactgctcagg-MGB-3’；
U6-F：5’-tgcgggtgctcgcttcggcagc-3’；
U6-R：5’-ccagtgcagggtccgaggt-3’；
U6-Taqman-MGB：5’-CY5-cctgcgcaa ggatgacacg-MGB-3’。
由于TaqMan-MGB探针与传统的TaqMan-TAMRA探针比较具有以下优势：(1)提高TM值：平均15bases可提高18℃，这样可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列设计有很大的帮助，并且提高配对与非配对模板间的TM值差异。(2)提高信噪比：由于在探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间的位置更接近。所以荧光定量的实验结果更精确，分辨率更高。
4.荧光定量RT-PCR反应
使用One-Step PrimeScript RT-PCR Kit(宝生物工程大连有限公司，货号RR064A)进行荧光定量PCR反应液配制，具体如下：
试剂 使用量(μL)
miR-2053-F 0.5
miR-2053-R 0.5
miR-2053-Taqman-MGB 0.5
LncRNA RP11-624L4.1-F 0.5
LncRNA RP11-624L4.1-R 0.5
LncRNA RP11-624L4.1-Taqman-MGB 0.5
U6-F 0.5
U6-R 0.5
U6-Taqman-MGB 0.5
2×One Step RT-PCR Buffer 10
PrimeScript RT Enzyme Mix 1
模板 1
灭菌去离子水 补充到20
荧光定量PCR反应条件为：42℃5min，95℃10s，为第一步循环；95℃5s，60℃30s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
5.检测结果：具体结果见图1。从图中可以看出，miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1在乳腺癌中表达量显著上调。
6.使用上述方法对人乳腺癌细胞(MCF7)中的miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的表达量(2-ΔΔCT值)进行检测和分析，结果如下表所示：
项目 ΔCt值(目的miRNA Ct值-U6 Ct值)
miR-2053 5.67
LncRNA RP11-624L4.1 5.25
从表中可知，miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的表达量远远高于U6的表达量。
7.试剂盒判定标准
通过Logistic回归方程拟合两个指标发现，拟合后的灵敏度和特异性均高于单独指标。通过数据分析，得到判断公式(回归方程)为：
Y＝0.0678*A miR-2053+0.0851*BLncRNA RP11-624L4.1；
其中，A miR-2053是miR-2053的表达量，BLncRNA RP11-624L4.1是LncRNA RP11-624L4.1的表达量；
当Y≥0.04时判断为阳性；当Y＜0.0399时判为阴性。
实施例2试剂盒对临床样品的检测
采用实施例2的检测试剂盒，对30例乳腺癌病人及30例健康人血清中的miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的表达量(2-ΔΔCT值)进行检测。检测结果使用origin软件进行回归分析，其中miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1单个检测指标结果及miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的联合结果参见下表。
Figure BDA0003104105160000091
如上表所示，各指标及联合指标P值均<0.05，说明各检测指标均与乳腺癌预测显著相关。miR-2053/LncRNA RP11-624L4.1的联合预测准确率达到97.5％(ROC曲线下面积)，高于单个检测指标的预测率(均小于90％)。由回归分析得到采用本试剂盒进行联合检测验证，其敏感度为96％，特异性为98％，均高于单个指标，所有联合检测在乳腺癌中具有明显的优势。
实施例3：治疗乳腺癌的药物组合物制备与验证
从前述2个实施例中得出，联合检测miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的表达水平可以作为乳腺癌的诊断标志物，且在乳腺癌组织中，miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的表达水平显著上调。我们推测，使用miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的干扰物可能对乳腺癌有一定的治疗作为，从而为乳腺癌的靶向治疗提供一种新的可能和方向。鉴于此，我们设计并合成了si-miR-2053(具体序列见SEQ ID NO.1所示)、si-LncRNA RP11-624L4.1(具体序列见SEQ ID NO.2所示)。
使用裸鼠成瘤模型对相关药物进行验治疗验证，具体方案如下：NOD/SCID/IL2rγ(null)mice(NSG)(8week-old)(湖南斯莱克景达)。所有小鼠均皮下注射相应浓度为0.6×105的MCF7细胞。将相关药物组合物定点皮下注射至小鼠，实验分组如下：1)空白对照组，不注射药物组合；2)si-miR-2053组，注射si-miR-2053；3)si-LncRNA RP11-624L4.1组，注射si-LncRNA RP11-624L4.1；4)si-miR-2053+si-LncRNA RP11-624L4.1组，同时注射si-miR-2053和si-LncRNA RP11-624L4.1。实时测量和记录裸鼠移植瘤体积变化，用V＝A×B2/2(mm3)方程计算肿瘤体积，其中A为最大直径，B为垂直直径。当肿瘤体积达到1,000mm3时,处死小鼠，切除肿瘤并称重.。结果如下表所示：
Figure BDA0003104105160000101
从表中中可以看出，si-miR-2053+si-LncRNA RP11-624L4.1组的治疗效果最好，但所有治疗组均较空白对照组要好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序 列 表
<110> 成兆媚
<120> 一种乳腺癌基因检测试剂盒及其应用方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> si-miR-2053序列【人工序列(Artificial Sequence)】
<400> 1
cacaattaat ttggagata 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> si-LncRNA RP11-624L4.1序列【人工序列(Artificial Sequence)】
<400> 2
ttgggtctgg attcggcatt a 21

Claims (9)

1.一种乳腺癌基因检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括检测miR-2053和LncRNA RP11-624L4.1表达水平的试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂包括特异性识别miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的探针和特异性扩增miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性识别miR-2053、LncRNARP11-624L4.1的探针如下所示：
miR-2053-Taqman-MGB：5’-FAM-tacctcaactgaattgcc-MGB-3’；
LncRNA RP11-624L4.1-Taqman-MGB：5’-HEX-ctgtgtatactgctcagg-MGB-3’。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性扩增miR-2053、LncRNARP11-624L4.1的引物如下所示：
miR-2053-F：5’-acactccagctggggtgttaattaaacctct-3’；
miR-2053-R：5’-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgaggtaaatag-3’；
LncRNA RP11-624L4.1-F：5’-tggggaaagggataggaggg-3’；
LncRNA RP11-624L4.1-R：5’-gtatgggattggggtgtgca3’。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应液还包括内参基因U6的特异性扩增引物和特异性探针，所述引物和探针的序列如下：
U6-F：5’-tgcgggtgctcgcttcggcagc-3’；
U6-R：5’-ccagtgcagggtccgaggt-3’；
U6-Taqman-MGB：5’-CY5-cctgcgcaa ggatgacacg-MGB-3’。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的判定公式为Y＝0.0678*AmiR-2053+0.0851*BLncRNA RP11-624L4.1；其中，AmiR-2053是miR-2053的表达量，BLncRNA RP11-624L4.1是LncRNA RP11-624L4.1的表达量；当Y≥0.04时判断为阳性；当Y＜0.0399时判为阴性。
7.一种如权利要求1所述的miR-2053、LncRNA RP11-624L4.1基因的用途，其特征在于，用于制备治疗乳腺癌的药物组合物。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药物组合物包括miR-2053、LncRNARP11-624L4.1基因的抑制剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述miR-2053基因的抑制剂为si-miR-2053，si-miR-2053的序列如SEQ ID NO.1所示；所述的Lnc RNA RP11-624L4.1基因的抑制剂为si-LncRNA RP11-624L4.1，si-LncRNA RP11-624L4.1的序列如SEQ ID NO.2所示。
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