WO2017110687A1 - ｍｉＲＮＡにより肺癌の原因を特定する方法、マーカー、検出キット、及び治療薬をスクリーニングするための方法 - Google Patents

ｍｉＲＮＡにより肺癌の原因を特定する方法、マーカー、検出キット、及び治療薬をスクリーニングするための方法 Download PDF

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asbestos
mirna
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石川　雄一
マハムット ヤセン
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公益財団法人がん研究会
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to miRNA that identifies the cause of lung cancer.
  • a method for identifying whether the cause of lung cancer is asbestos exposure, smoking, or both are related by detecting miRNA that increases or decreases in lung cancer caused by asbestos exposure or smoking, And a marker for identifying the cause.
  • the present invention also relates to a method for detecting lung cancer due to asbestos exposure and smoking by detecting these miRNAs, and a kit for detection.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for lung cancer using these miRNA sequences and a screening method for a therapeutic agent for lung cancer.
  • Lung cancer is the most deadly malignant tumor in Japan. According to materials from the National Cancer Center Cancer Control Information Center, 72,764 people died in 2013, 52,054 men and 20,680 women, and the number of deaths in 2014 was It is estimated to reach 76,500 people. Lung cancer has been the top malignant tumor since 1998. Lung cancer is a major cause of death from malignant tumors not only in Japan but also in Europe and the United States. Epidemiological studies have shown that lung cancer is closely related to smoking, but asbestos exposure has also become a major problem in recent years.
  • lung cancer is a tumor that is unlikely to become a so-called “index cancer” in which the occurrence of cancer suggests a specific carcinogenic factor because of its large number and variety of causes.
  • Smoking is the largest cause of known lung cancer.
  • Lung cancer caused by smoking is mainly squamous cell carcinoma, small cell carcinoma, and large cell carcinoma, and adenocarcinoma is said to be relatively unrelated.
  • cancers caused by asbestos exposure are said to have no histological characteristics, and the determination of histology is not an indicator of asbestos exposure.
  • Asbestos is an important inhalable carcinogen in lung cancer, as is tobacco.
  • the asbestos relief system is required to accurately extract lung cancer caused by asbestos.
  • the laborious work of quantitatively ascertaining the amount of asbestos bodies and asbestos fibers in the lungs by light or electron microscopy is performed.
  • asbestos includes serpentinite chrysotile and amphibole crocidolite and amosite, and it is known that there is a difference in carcinogenicity. Chrysotile is said to be digested in the lungs and may disappear, and it is thought that it is difficult to make asbestos bodies. That is, just because there is no asbestos body in the lung, it cannot be said that it is not necessarily asbestos lung cancer. For this reason, quantification with a microscope is time-consuming and has a problem that accurate determination cannot be made.
  • miRNA Micro RNA
  • the human genome is thought to encode over 1000 miRNAs.
  • the miRNA binds partially to the target mRNA in a complementary manner, destabilizes the target mRNA and suppresses protein production by suppressing translation. Since miRNA generally binds to a plurality of target RNAs in a partially complementary manner and controls transcription, it controls by controlling a plurality of different mRNA amounts simultaneously.
  • Non-patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 2
  • Patent Documents 1 to 4 all disclose miRNA capable of detecting lung cancer, but are intended for lung cancer in general.
  • Patent Document 5 discloses a method for classifying lung cancer into squamous cell carcinoma, non-squamous cell non-small cell carcinoma, carcinoid lung cancer, and small cell carcinoma.
  • Patent Document 6 discloses a method relating to prognosis prediction and the like of small cell cancer.
  • Non-Patent Document 2 reports related miRNAs in lung cancer involving asbestos.
  • Patent Documents 1 to 6 all disclose miRNAs related to lung cancer, but they do not analyze miRNAs correlated with the cause of carcinogenesis.
  • the number of cases of lung cancer used to extract asbestos-related miRNA is 7 and the number of cases of lung cancer without asbestos exposure is very small.
  • miRNA which has fluctuated in lung cancer patients exposed to high asbestos has been reported, lung cancer caused only by asbestos has not been extracted and analyzed.
  • since lung cancer develops due to many causes other than asbestos just because of high exposure to asbestos does not necessarily mean lung cancer caused only by asbestos. In particular, the effects of smoking, which is said to be the biggest cause of lung cancer, cannot be ignored.
  • the object of the present invention is to identify a cause of lung cancer, in particular, miRNA that changes due to smoking and asbestos, and to provide a method for identifying the cause of lung cancer using the miRNA and a kit for identifying the cause. It is another object of the present invention to not only identify the cause of lung cancer, but also to provide a new therapeutic drug screening method and therapeutic drug using the miRNA as an index.
  • the present invention relates to a method for identifying the cause of lung cancer, a marker, a kit, and a method for screening a drug for treating lung cancer as described below.
  • the marker according to (3) or (4) which is a marker for detecting whether the cause of the lung cancer correlates with the amount of asbestos deposited, and the miRNA comprises miR-431, miR-378b, a cause of lung cancer characterized by being at least one of miR-92a, miR-320c, miR-1973, miR-4257, miR-574-5p, miR-765, miR-3648, miR-513b A marker to identify.
  • the marker according to (3) or (4) which is a marker for detecting whether the cause of the lung cancer is due to asbestos exposure in a non-smoker, and the miRNA is miR-1471, miR-3137 , MiR-3651, miR-4257, miR-92a, miR-99b, a marker for identifying the cause of lung cancer, (7)
  • the marker according to (3) or (4) which is a marker for detecting whether the cause of the lung cancer is due to asbestos exposure in a heavy smoker, and the miRNA is miR-320c, miR-378b A marker for identifying the cause of lung cancer, characterized by being at least one of miR574-5p.
  • a probe for measuring at least one of miR-92a, miR-320c, miR-1973, miR-4257, miR-574-5p, miR-765, miR-3648, miR-513b, and detection A kit for identifying the cause of lung cancer, comprising a necessary reagent.
  • the cause of the lung cancer is a kit for detecting involvement of smoking in an asbestos-exposed group, and the miRNA is miR-1972, miR-3137.
  • a probe for measuring at least one of miR-3648, miR-513a-5p, miR-513b, miR-99a, miR-99b, and a reagent necessary for detection comprising: A kit for identifying the cause.
  • a method for screening a drug for treating lung cancer comprising miR-431, miR-378b, miR-92a, miR-320c, miR-1973, miR-4257, miR-574-5p, miR- 765, miR-3648, miR-513b, miR-1471, miR-3137, miR-3651, miR-99b, miR-1972, miR-513a-5p, miR-99a
  • miRNA By using miRNA described in detail below, it is possible to identify the cause of carcinogenesis, whether the cause of lung cancer is asbestos exposure, smoking exposure, or both. In addition, by finding a novel marker highly correlated with carcinogenesis, it becomes possible to provide a new test method, test kit, and drug screening method. Furthermore, it is possible to prepare a medicine using the miRNA sequence.
  • miRNAs that correlate with asbestos, smoking, or both are specified using an array.
  • the miRNA specified in the present invention when used as an individual patient test, it can be analyzed by quantitative RT-PCR.
  • the analysis method can be performed by a generally used method such as a method disclosed in Non-Patent Document 3. Since quantitative RT-PCR has high sensitivity, the cause of lung cancer can be identified more accurately.
  • a biological sample derived from a cancer patient uses miRNA extracted from a section material prepared by embedding formalin-fixed paraffin (FFPE), but does not fix a cancer tissue collected by surgery or an endoscope.
  • FFPE formalin-fixed paraffin
  • fresh frozen tissue may be used.
  • R 0.76 to 0.90 for 200 to 300 miRNAs that are expressed above a certain level. It is confirmed that a correlation is obtained. Therefore, the cause of carcinogenesis can be identified using either FFPE material or fresh frozen tissue.
  • miRNAs correlated with asbestos, smoking, or both identified in the present invention are hsa-miR-1471, hsa-miR-3137, hsa-miR-3651, hsa-miR-4257, hsa.
  • hsa-miR-99b (miRNA group characterizing the presence or absence of asbestos in non-smokers), hsa-miR-320c, hsa-miR-378b, hsa-miR-574-5p (asbestos in heavy smokers) MiRNA group characterized by presence or absence), hsa-miR-1972, hsa-miR-3137, hsa-miR-3648, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-513b, hsa-miR-99a, hsa-miR-99b (Use of smoking in asbestos deposition group By analyzing the changes in miRNA or precursor thereof s) characterizing, asbestos responsible for the development of lung cancer, and / or smoking can identify whether involved.
  • “hsa” that specifies human miRNA may be omitted, but all are human miRNA
  • miRNA used for the test one type of miRNA may be used alone in each group, or two or more types may be used in combination. However, the use of two or more types in combination improves the accuracy of the test. Can do.
  • a nucleic acid molecule that suppresses the function of miRNA that is increased by the onset of cancer can be designed and used as a therapeutic agent.
  • a therapeutic effect can be expected by supplementing miRNAs with decreased expression, such as miRNA supplements for let-7, which is being developed for lung cancer. Therefore, by developing an antagonist of miRNA that increases with the onset of cancer, or by using miRNA that decreases as a supplement, a drug that directly targets miRNA can be developed.
  • the present invention also relates to a screening method for candidate compounds for treating lung cancer caused by asbestos or smoking.
  • a candidate compound for a therapeutic agent can be added to a culture solution of cultured cells, and screening can be performed using the above-described miRNA that increases or decreases as a result of asbestos exposure and smoking.
  • the cell line any cell can be used as long as it can detect the miRNA that is changed in the present invention.
  • a cell line derived from lung tissue for example, a cell line derived from a smoker's lung adenocarcinoma A549 can be used.
  • Asbestos Burden represents the amount of asbestos deposited (AB) in terms of the number of asbestos bodies per dry lung weight.
  • Smoking Index indicates a value calculated by (number of cigarettes smoked per day) ⁇ (year of smoking).
  • AB_012 represents the number of asbestos bodies: 0: no asbestos bodies, 1: 0 ⁇ AB ⁇ 5000, 2: AB ⁇ 5000.
  • SI_012 represents a smoking index, 0: non-smoking, 1: 0 ⁇ SI ⁇ 400, 2: SI ⁇ 400.
  • AB 0 was 53 cases
  • the classification of patients based on the amount of asbestos deposited and the smoking index was performed by examining the threshold values of 110 patient samples in advance.
  • a group of AB ⁇ 5000 and a group of AB ⁇ 5000 it was suggested that miRNAs characterized by a group with a lot of asbestos deposition and a group with a little asbestos could be extracted, and that both groups could be classified.
  • ADC is adenocarcinoma
  • SCLC small cell lung cancer
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • SCC is squamous cell carcinoma (squamous cell carcinoma) carcinoma).
  • FFPE material For the tumor FFPE material, a pathologist manually collected a tumor tissue under a stereomicroscope from a section sliced to 8 ⁇ m and stained with hematoxylin, and extracted total RNA using miRNeasy FFPE Kit (QIAGEN). .
  • the extracted RNA had a high peak at 23-26 nt by electrophoresis, and it was confirmed that a sufficient amount of miRNA was contained.
  • the RNA integrity number (RIN value) was generally good at 2.1 to 2.6.
  • miRNA analysis was performed using total RNA extracted by the above method from FFPE tissues of all 202 cases. miRNA was analyzed using Agilent miRNA Microarray V16.0. This microarray carries 1368 miRNA probes. Of these, there were 1223 human miRNA (hsa miR) probes.
  • AB 0 is 53 cases, 0 ⁇ AB ⁇ 5000 is 38 cases, and AB ⁇ 5000 is 111 cases.
  • SI 0 is 49 cases, 0 ⁇ SI ⁇ 400 is 24 cases, and SI ⁇ 400 is 129 cases.
  • the exposure to carcinogenic factors in the target cases is a group of cases with a very wide distribution from zero asbestos deposition to occupational exposure and smoking from non-smokers to heavy smokers.
  • the analysis target of the mixed exposure is narrowed down to cases satisfying occupational exposure level asbestos deposition (AB ⁇ 5000) and heavy smoking (SI ⁇ 400).
  • Table 3 shows the number of cases when occupational exposure to asbestos is divided according to the presence or absence of heavy smoking (composition of occupational exposure and heavy smoking group), and when each group is combined. The breakdown of the number of people (combinations) is shown. When analyzing mixed exposure of asbestos and smoking, the analysis was performed using the classification of patient cases shown in Table 3.
  • FC indicates the Fold Change which is the ratio of signal values
  • ([1] vs [0]) in the Regulation column is [1] (0 ⁇ AB ⁇ 5000) and [0] (asbestos body).
  • ([2] vs [0]) is a comparison between [2] (AB ⁇ 5000) and [0] (no asbestos body)
  • ([2] vs [1]) is [ 2] represents a comparison between (AB ⁇ 5000) and [1] (0 ⁇ AB ⁇ 5000).
  • up up-regulation and the expression level is increased
  • down is down-regulation and indicates a decrease in the expression level.
  • chr indicates the position of the miRNA on the chromosome.
  • Example 3 [Verification of miRNA obtained in Training Set related to asbestos exposure in Validation Set] As shown in Example 1, 14 cases (Table 5, FC [2] vs [0]) satisfying the condition of FC> 1.5 related to asbestos exposure (AB ⁇ 5000) were found. However, regarding 21 miRNAs extracted as FC> 1.4 with slightly relaxed conditions, it was examined whether the tendency in Training Set (up regulation or down regulation) was reproduced in Validation Set. Table 8 shows the target 21 miRNAs and their statistical values in the Validation Set.
  • miR-320c has a p value of 0.0864 and is a miRNA in the boundary region, which may be effective. These nine miRNAs were extracted as having a significant correlation with the amount of asbestos deposited in the training set, and further, a significant correlation was also found in the validation set. Therefore, the amount of asbestos deposition can be estimated by using these miRNAs.
  • Example 4 [In relation to smoking, validation of miRNA obtained by Training Set in Validation Set] As in Example 3, the correlation in Validation Set was tested by single regression analysis using 8 miRNAs extracted by analysis in Training Set and significantly changed in expression in the smoking group. As a result, as shown in Table 9, none of the validation sets became significant at the level of p ⁇ 0.05.
  • Example 5 [Analysis of mixed exposure to asbestos and smoking] In order to analyze the mixed exposure of asbestos and tobacco, four groups using 149 cases shown in Table 3 were constructed. There are 98 training sets and 51 validation sets. Table 10 shows the number of cases composing the Training Set.
  • miRNAs that characterize asbestos exposure in non-smokers 6 of miR-1471, miR-3137, miR-3651, miR-4257, miR-92a, miR-99b were significantly correlated or borderline . Of the eight miRNAs that characterize asbestos exposure in heavy smokers, three of miR-320c, miR-378b, and miR574-5p were significant or borderline. On the other hand, as for smoking, none of the three miRNAs that characterize smoking in the group without asbestos deposition were significant in Validation Set.
  • miR-1471, miR-3137, miR-3651, and miR-4257 are statistically significant as miRNAs that characterize the presence or absence of asbestos in non-smokers because the p-value is less than 0.05. It is. Moreover, miR-92a and miR-99b are miRNAs in the border region having a p value of 0.05 or more and less than 0.1, and may be effective as miRNAs that characterize the presence or absence of asbestos in non-smokers. Moreover, since miR-574-5p has a p value of less than 0.05, it is statistically significant as a miRNA that characterizes the presence or absence of asbestos in heavy smokers.
  • miR-320c and miR-378b are miRNAs in the border region having a p value of 0.05 or more and less than 0.1, and may be effective as miRNAs that characterize the presence or absence of asbestos in heavy smokers. Furthermore, miR-3137, miR-3648, miR-513a-5p, and miR-513b are statistically significant as miRNAs that characterize the presence or absence of smoking in the asbestos deposition group because the p-value is less than 0.05. . miR-1972, miR-99a, and miR-99b are miRNAs having a p value of 0.05 or more and less than 0.1, and may be effective as miRNAs that characterize the presence or absence of smoking in the asbestos deposition group. .
  • miRNAs that are significant at p ⁇ 0.05 or are likely to be borderline and effective miRNAs that characterize asbestos exposure in non-smoking: miR-1471, miR-3137, miR -3651, miR-4257, miR-92a, miRNA characterizing asbestos exposure in heavy smoking: miR-320c, miR-574-5p, miRNA characterizing smoking in the asbestos exposed group: miR-31972, miR-3648, miR- For 513a-5p, miR-513b
  • the case distribution and regression curve in Validation Set are shown in FIG.
  • the slope of the regression curve is relatively large, and it is clear that the change in the expression of these miRNAs can be used as a marker instead of asbestos body measurement. Therefore, by using these miRNAs as markers, patients to whom the asbestos rescue system can be applied can be accurately identified.
  • miRNAs are also new lung cancer markers, there is a possibility that drug screening using these miRNAs as an index, or miRNA itself can be used as a therapeutic agent for lung cancer.

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Abstract

２０２の肺癌症例からアスベスト、喫煙と相関の高いｍｉＲＮＡを抽出し、各群を特徴付けることのできるｍｉＲＮＡを得た。これにより、肺癌の原因と相関のあるマーカーを提供することができる。

Description

ｍｉＲＮＡにより肺癌の原因を特定する方法、マーカー、検出キット、及び治療薬をスクリーニングするための方法
　本発明は、肺癌の原因を特定するｍｉＲＮＡに関する。特に、アスベスト暴露、喫煙による肺癌において、増加・減少するｍｉＲＮＡを検出することにより、肺癌の原因がアスベスト暴露であるか、喫煙によるものであるか、あるいは両者が関連しているかを特定する方法、及び原因を特定するためのマーカーに関する。また、これらｍｉＲＮＡを検出することにより、アスベスト暴露、喫煙による肺癌を検出する方法、及び検出するためのキットに関する。さらに、これらｍｉＲＮＡ配列を利用した肺癌の治療薬、及び肺癌治療薬のスクリーニング方法に関する。
　肺癌は、日本で最も死亡者数の多い悪性腫瘍である。国立がん研究センターがん対策情報センターの資料によれば、２０１３年では男性５２，０５４人、女性２０，６８０人の計７２，７６４人が死亡しており、２０１４年の死亡者数は、７６，５００人に達すると推定されている。肺癌は、１９９８年以来、死亡率がトップの悪性腫瘍となっている。また、肺癌は、日本だけではなく欧米でも悪性腫瘍による死亡の主要な原因となっている。疫学的調査から肺癌は喫煙との関係が深いことが知られているが、アスベスト（石綿）暴露も近年大きな問題となっている。
　アスベストは繊維状の鉱物で、電気伝導の面でも熱伝導の面でも絶縁性が高く、第二次大戦以前から耐火用の材料として広く用いられてきた。アスベストが発癌性を有することは既に２０世紀の初めから知られていた。しかし、その健康被害について社会的に認識されたのは最近になってからである。病理学的には、アスベスト関連の悪性腫瘍として、悪性中皮腫と肺癌がよく知られている。発生数は肺癌のほうがやや多く、職業的な曝露者を対象とした疫学調査では、肺癌：悪性中皮腫＝２：１ないし３：２程度といわれている。このように、２種類の悪性腫瘍がアスベスト暴露により発生し、数は肺癌の方がやや多いと推定されている。しかし、アスベストが悪性中皮腫を引き起こすことは知られているものの、アスベストが原因とされる肺癌はさほど注目されていない。
　その理由としては、肺癌は数が多いうえに、喫煙をはじめ、粉塵、放射線、大気汚染、体質、高齢化など多くの原因で発症し、アスベストに起因する肺癌は一部にすぎないと考えられているからである。したがって、肺癌は、その数の多さ、原因の多様さから、癌の発生が特定の発癌因子を示唆する、いわゆる「指標癌」にはなりにくい腫瘍である。
　判明している肺癌の原因としては、喫煙が最大のものである。喫煙による肺癌は主として扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌であり、腺癌は比較的関係が薄いといわれている。一方、アスベスト暴露により発生する癌は組織学的特徴はないと言われており、組織型の判定は、アスベスト暴露の指標とはならない。
　アスベストもタバコと同様に肺癌における重要な吸入性発癌物質である。また、日本では、石綿救済制度においてもアスベストが原因となっている肺癌を正確に抽出することが求められている。現状では、肺内のアスベスト小体やアスベスト繊維の量を光顕的あるいは電顕的に定量するという非常に手間のかかる作業を行っている。
　加えて、アスベストには、蛇紋岩系のクリソタイルと角閃石系のクロシドライトやアモサイトがあり、その発癌性に差のあることが知られている。クリソタイルは肺内で消化されて消失することもあると言われ、石綿小体を作りにくいとも考えられている。すなわち、肺内にアスベスト小体がないからといって必ずしも、アスベスト肺癌でないとは言い切れない。そのため、顕微鏡による定量は手間がかかるうえに、正確な判断ができないという問題も抱えていた。
　喫煙やアスベストに限らず、多様な肺癌の原因と相関する遺伝子の変化を明らかにすることができれば、肺癌の早期診断に役立てることができるだけでなはなく、予防や治療に役立てることができる。
　マイクロＲＮＡ（以下、ｍｉＲＮＡと記載する。）は２０～２５塩基程度の一本鎖ＲＮＡ分子であり、真核生物において遺伝子の転写後発現調節に関与する。ヒトゲノムには１０００以上のｍｉＲＮＡがコードされていると考えられている。ｍｉＲＮＡは、その標的ｍＲＮＡに対して部分相補的に結合し、標的ｍＲＮＡを不安定化するとともに翻訳抑制を行なうことでタンパク質産生を抑制する。ｍｉＲＮＡは一般的に複数の標的ＲＮＡに対して部分相補的に結合し転写を制御することから、複数の異なるｍＲＮＡ量を同時に抑制して制御する。
　ｍｉＲＮＡが介する転写抑制は、発生、細胞増殖、細胞分化、アポトーシス、代謝といった広範なプロセスの制御を担うことが明らかにされてきている。さらに、ｍｉＲＮＡは、癌、感染症、生活習慣病等、様々な疾患に関与していることが報告されている。中でも、細胞の癌化に深く関与していることが知られている（非特許文献１）。また、肺癌においても、癌化に相関の高いｍｉＲＮＡが存在することがすでに報告されている（特許文献１～６、非特許文献２）。
　特許文献１～４はいずれも肺癌を検出可能なｍｉＲＮＡが開示されているが、肺癌全般を対象としている。特許文献５は肺癌を扁平上皮細胞癌、非扁平上皮非小細胞癌、カルチノイド肺癌、小細胞癌に分類する方法が開示されている。特許文献６は、小細胞癌の予後予測等に関する方法が開示されている。非特許文献２には、アスベストが関与する肺癌において関連のあるｍｉＲＮＡが報告されている。
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特表２００９－５３１０１８号公報 特表２０１１－５０５１４３号公報 特表２０１１－５１６０４６号公報 特表２０１３－５０２９３１号公報 特表２０１４－５０９５２２号公報 国際公開第２０１１／１２５２４５号
　しかしながら、上記特許文献１～６は、いずれも肺癌に関連するｍｉＲＮＡを開示しているが発癌の原因と相関するｍｉＲＮＡを解析したものではない。また、非特許文献２は、アスベスト関連ｍｉＲＮＡを抽出するのに用いた肺癌の例数が７例、アスベスト暴露のない肺癌６例と、非常に例数が少ない。また、アスベスト高暴露の肺癌患者において変動しているｍｉＲＮＡを報告しているが、アスベストにのみ起因している肺癌を抽出して解析したものではない。前述のように、肺癌はアスベスト以外にも多くの原因で発症することから、アスベスト高暴露であるからといって、アスベストのみに起因する肺癌とは限らない。特に肺癌の最大の原因と言われている喫煙の影響を無視することはできない。
　本発明は、肺癌の原因、特に喫煙とアスベストにより変化するｍｉＲＮＡを同定し、当該ｍｉＲＮＡによって、肺癌の原因を特定する方法、及び特定するためのキットを提供することを課題とする。また、肺癌の原因を特定するだけではなく、当該ｍｉＲＮＡを指標として新しい治療薬のスクリーニング方法や治療薬を提供することを課題とする。
　本発明は、以下に示す肺癌の原因を特定する方法、マーカー、キット、及び肺癌を治療するための薬剤をスクリーニングする方法に関する。
（１）被験者から得られた試料中のｍｉＲＮＡ量を測定し、ｍｉＲ－４３１，ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－１９７３、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ｂ、ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－９９ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－１９７２、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ａの少なくともいずれか１つを解析することによって、肺癌の原因を特定することを特徴とする方法。
（２）（１）に記載の肺癌の原因を特定する方法であって、肺癌の原因がアスベスト暴露、及び／又は喫煙であることを特徴とする方法。
（３）ｍｉＲ－４３１、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－１９７３、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ｂ、ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－９９ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－１９７２、ｍｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ａの少なくともいずれか１つであることを特徴とする肺癌の原因を特定するためのマーカー。
（４）（３）記載のマーカーであって、肺癌の原因がアスベスト暴露、及び／又は喫煙であることを特徴とする肺癌の原因を特定するためのマーカー。
（５）（３）又は（４）記載のマーカーであって、前記肺癌の原因がアスベスト沈着量と相関するかを検出するためのマーカーであり、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－４３１、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－１９７３、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ｂの少なくともいずれか１つであることを特徴とする肺癌の原因を特定するためのマーカー。
（６）（３）又は（４）記載のマーカーであって、前記肺癌の原因が非喫煙者におけるアスベスト暴露によるかを検出するためのマーカーであり、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－９９ｂの少なくともいずれか１つであることを特徴とする肺癌の原因を特定するためのマーカー。
（７）（３）又は（４）記載のマーカーであって、前記肺癌の原因が重喫煙者におけるアスベスト暴露によるかを検出するためのマーカーであり、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ５７４－５ｐの少なくともいずれか１つであることを特徴とする肺癌の原因を特定するためのマーカー。
（８）（３）又は（４）記載のマーカーであって、前記肺癌の原因がアスベスト暴露群で喫煙の関与を検出するためのマーカーであり、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１９７２、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－５１３ｂ、ｍｉＲ－９９ａ、ｍｉＲ－９９ｂの少なくともいずれか１つであることを特徴とする肺癌の原因を特定するためのマーカー。
（９）ｍｉＲ－４３１、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－１９７３、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ｂ、ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－９９ｂ、ｍｉＲ－１９７２、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ａの少なくともいずれか１つを測定するためのプローブ、及び検出に必要な試薬を含むことを特徴とする肺癌の原因を特定するためのキット。
（１０）（９）記載のキットであって、前記肺癌の原因がアスベスト暴露、及び／又は喫煙であることを特徴とする肺癌の原因を特定するためのキット。
（１１）（９）又は（１０）に記載のキットであって、前記肺癌の原因がアスベスト沈着量と相関するかを検出するためのキットであり、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－４３１、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－１９７３、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ｂの少なくともいずれか１つを測定するためのプローブ、及び検出に必要な試薬を含むことを特徴とする肺癌の原因を特定するためのキット。
（１２）（９）又は（１０）に記載のキットであって、前記肺癌の原因が非喫煙者におけるアスベスト暴露によるかを検出するためのキットであり、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－９９ｂの少なくともいずれか１つを測定するためのプローブ、及び検出に必要な試薬を含むことを特徴とする肺癌の原因を特定するためのキット。
（１３）（９）又は（１０）に記載のキットであって、前記肺癌の原因が重喫煙者におけるアスベスト暴露によるかを検出するためのキットであり、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－５７４－５ｐの少なくともいずれか１つを測定するためのプローブ、及び検出に必要な試薬を含むことを特徴とする肺癌の原因を特定するためのキット。
（１４）（９）又は（１０）に記載のキットであって、前記肺癌の原因がアスベスト暴露群で喫煙の関与を検出するためのキットであり、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１９７２、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－５１３ｂ、ｍｉＲ－９９ａ、ｍｉＲ－９９ｂの少なくともいずれか１つを測定するためのプローブ、及び検出に必要な試薬を含むことを特徴とする肺癌の原因を特定するためのキット。
（１５）肺癌を治療するための薬剤をスクリーニングする方法であって、ｍｉＲ－４３１、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－１９７３、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ｂ、ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－９９ｂ、ｍｉＲ－１９７２、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ａの少なくともいずれか１つの発現量の増減を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
　以下で詳細に説明するｍｉＲＮＡを用いることによって、肺癌の原因がアスベスト暴露であるか、喫煙暴露であるか、あるいはその両者であるか、発癌の原因を同定することできる。また、発癌と相関の高い新規のマーカーを見出したことによって、新しい検査方法、検査キット、医薬のスクリーニング方法を提供することが可能となる。さらに、当該ｍｉＲＮＡを配列を利用した医薬を調整することも可能となる。
アスベスト、喫煙の混合暴露において、有意に暴露と相関が確認されたｍｉＲＮＡの症例分布と回帰曲線。
　以下に示す実施例ではアレイを用いて、アスベスト、喫煙、あるいはこれら両者と相関するｍｉＲＮＡを特定している。しかし、本発明で特定されたｍｉＲＮＡを個々の患者の検査として用いる場合には、定量的ＲＴ-ＰＣＲによって解析することができる。解析方法は、例えば非特許文献３に開示されている方法など、一般的に用いられている方法によって行うことができる。定量的ＲＴ-ＰＣＲは感度が高いことから、より精度良く肺癌の原因を特定することができる。
　癌患者由来の生体試料は、ここではホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）して作製した切片材料からｍｉＲＮＡを抽出して用いているが、手術や内視鏡等で採取した癌組織を固定せずに、あるいは新鮮凍結組織を用いてもよい。本発明者らは、新鮮凍結組織とＦＦＰＥ材料との間でｍｉＲＮＡ発現の一致度を調べた結果、一定以上発現している２００～３００個のｍｉＲＮＡではＲ＝０．７６～０．９０と良い相関が得られることを確認している。したがって、ＦＦＰＥ材料又は新鮮凍結組織のいずれを用いた場合でも、発癌の原因を特定することができる。
　具体的には、本発明で特定されたアスベスト、喫煙、あるいはこれら両者と相関のあるｍｉＲＮＡであるｈｓａ－ｍｉＲ－１４７１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１３７、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５７、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ（非喫煙者におけるアスベストの有無を特徴付けるｍｉＲＮＡ群）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－５ｐ（重喫煙者におけるアスベストの有無を特徴付けるｍｉＲＮＡ群）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９７２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１３７、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ（アスベスト沈着群における喫煙の有無を特徴付ける群）のｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆体の変化を解析することによって、肺癌発症の原因にアスベスト、及び／又は喫煙が関与するか特定することができる。以下、ヒトのｍｉＲＮＡであることを明記する「ｈｓａ」を省略して記載することもあるが、すべてヒト型のｍｉＲＮＡである。
　検査に使用するｍｉＲＮＡは、各群において１種のｍｉＲＮＡを単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよいが、２種以上組み合わせて用いる方が検査の精度の向上を図ることができる。
　また、上述のアスベスト暴露、喫煙によって増減が見られるｍｉＲＮＡのうち、癌発症により増加が見られるｍｉＲＮＡの機能を抑制する核酸分子をデザインし、治療薬として用いることができる。また、肺癌で開発が行われているｌｅｔ－７を対象としたｍｉＲＮＡ補充剤のように、発現の低下しているｍｉＲＮＡを補充することによって治療効果を期待することができる。したがって、癌発症に伴って増加するｍｉＲＮＡのアンタゴニストを開発したり、減少するｍｉＲＮＡを補充剤として用いることにより、ｍｉＲＮＡを直接標的とする医薬を開発することができる。
　また、本発明は、アスベスト又は喫煙に起因する肺癌の治療剤候補化合物のスクリーニング方法に関する。具体的には、培養細胞の培養液に治療薬の候補化合物を添加して、上述のアスベスト暴露、喫煙によって増減が見られるｍｉＲＮＡを指標としてスクリーニングを行うことができる。細胞株は、本発明で変化の見られたｍｉＲＮＡを検出することができればどのような細胞を用いてもよいが、肺組織に由来する細胞株、例えば喫煙者の肺腺癌に由来する細胞株Ａ５４９を用いることができる。また、肺に由来する初代培養細胞を用いることが好ましい。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
１．材料と方法
１-１．症例について
　喫煙とアスベスト沈着の有無により患者を４群に分けて発現に変化のあるｍｉＲＮＡの検索を行った。解析に用いた２０２例の患者の症例を表１（表１－１～表１－４）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表１中、Ａｓｂｅｓｔｏｓ　Ｂｕｒｄｅｎは、アスベスト沈着量（ＡＢ）を乾燥肺重量あたりのアスベスト小体数で表したものである。Ｓｍｏｋｉｎｇ　Ｉｎｄｅｘ（ＳＩ、喫煙指数）は（１日に吸うたばこの本数）×（喫煙年数）により算出した値を示す。また、ＡＢ＿０１２は、アスベスト小体数が、０：アスベスト小体無し、１：０＜ＡＢ＜５０００、２：ＡＢ≧５０００を表す。ＳＩ＿０１２は、喫煙指数を表し、０：非喫煙、１：０＜ＳＩ＜４００、２：ＳＩ≧４００を表す。ＡＢ＝０は５３例、ＡＢ＝１は３８例、ＡＢ＝２は１１１例であった。また、ＳＩ＝０は４９例、ＳＩ＝１は２４例、ＳＩ＝２は１２９例であった。
　アスベスト沈着量や喫煙指数による患者の分類は、予め１１０例の患者サンプルについて、閾値を検討し分類を行った。ＡＢ≧５０００の群とＡＢ＜５０００の群とに分けると、アスベスト沈着の多い群とアスベストの少ない群とを特徴付けられるｍｉＲＮＡを抽出し、両群を分類できる可能性が示唆された。喫煙関連では、閾値をＳＩ＝４００としたＳＩ≧４００群とＳＩ＜４００群とを比較した結果、階層クラスター解析では有意な結果は得られなかったが、ｖｏｌｃａｎｏ　ｐｌｏｔでは高度喫煙群がややまとまる傾向が見られた。そこで、アスベスト沈着量は、５０００を閾値とし、ＡＢ＝０、０＜ＡＢ＜５０００、ＡＢ≧５０００の３つの群に分類し、喫煙指数は、４００を閾値とし、ＳＩ＝０、０＜ＳＩ＜４００、ＳＩ≧４００の３つの群に分類した。
　また、Ｈｉｓｔｌｏｇｙの欄において、ＡＤＣは腺癌（Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＳＣＬＣは小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ）、ＮＳＣＬＣは非小細胞肺癌（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ）、ＳＣＣは扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を表す。
１－２．方法
（１）アスベスト量の計測
　全２０２症例を対象に、全国の労災病院で使用されている低温灰化法（神山変法）により、パラフィンブロック中の正常肺組織を脱パラフィン処理し、乾燥組織からの抽出液を用いて、光学顕微鏡により肺内アスベスト数を計測し、乾燥肺重量あたりのアスベスト量を求めた。
（２）ＲＮＡの抽出
　ＲＮＡは腫瘍組織のＦＦＰＥ材料から抽出した。腫瘍ＦＦＰＥ材料は、８μｍに薄切しヘマトキシリン染色した切片から、病理医が実体顕微鏡の下で腫瘍組織を用手的に採取し、ｍｉＲＮｅａｓｙ　ＦＦＰＥ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは、電気泳動により２３－２６ｎｔで高いピークがあり、十分量のｍｉＲＮＡが含まれていることを確認した。ＲＮＡ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ値）は、概ね２．１～２．６と良好であった。
（３）ｍｉＲＮＡ解析
　全２０２症例のＦＦＰＥ組織から上記の方法によって抽出した全ＲＮＡを用い、網羅的ｍｉＲＮＡ発現解析を実施した。ｍｉＲＮＡは、Ａｇｉｌｅｎｔ　ｍｉＲＮＡ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　Ｖ１６．０を用い解析した。このマイクロアレイは、１３６８個のｍｉＲＮＡプローブを搭載している。このうち、ヒトのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ　ｍｉＲ）プローブは１２２３個であった。
　本発明では多施設（がん研究会がん研究所、岡山労災病院、東京女子医科大学、千葉労災病院、広島大学）から得られた症例をもとに分析を行っている。一般に遺伝子発現解析というものは、施設や国によってその発現の特徴が大きく異なると言われる。言い換えれば、ある施設で得られた結果は他の施設では再現されないことが多い。そこで一般に、多施設で得られた検体を用いる場合には、全症例をｔｒａｉｎｉｎｇ　ｓｅｔとｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　ｓｅｔに分け、ｔｒａｉｎｉｎｇ　ｓｅｔで得られた結果をｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　ｓｅｔで検証する、ということが行われる。本発明においても、表２に示すように、２０２症例を全体の３分の２をＴｒａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔ（ｎ＝１３５）とし、残りの３分の１をＶａｌｉｄａｔｉｏｎ　Ｓｅｔ（ｎ＝６７）とした。セットの作成には、Ｅｘｃｅｌで発生させた乱数により、各症例を無作為に振り分けた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表２に示すように、ＡＢ＝０は５３例、０＜ＡＢ＜５０００は３８例、ＡＢ≧５０００は１１１例である。喫煙については、ＳＩ＝０は４９例、０＜ＳＩ＜４００は２４例、ＳＩ≧４００は１２９例である。対象症例の発癌因子への曝露量は、アスベストの沈着量はゼロから職業曝露まで、喫煙は非喫煙者から重喫煙者まで、非常に広範囲に分布している症例群である。アスベスト暴露、喫煙、それぞれの発癌との相関を解析する場合には、表２で示した患者症例の分類を用いて解析を行った。
　さらに、アスベスト単独、喫煙単独、アスベストと喫煙の共同効果のそれぞれを特徴付けるｍｉＲＮＡを検出するために、アスベストと喫煙という二つ因子により症例を４群に分けた。すなわち、表３に示すように、ＡＢ＝０、ＡＢ＝５０００、ＳＩ＝０、ＳＩ＝４００という閾値を設け、アスベスト曝露・喫煙量の少なくとも一方が中間群（０＜ＡＢ＜５０００、０＜ＳＩ＜４００）に入らない１４９例を抽出し解析の対象とした。このように症例を分類することにより、混合曝露の解析対象を、職業曝露レベルのアスベスト沈着（ＡＢ≧５０００）、および重喫煙（ＳＩ≧４００）を満たす症例に絞ったことになる。この１４９例の群では、Ｔｒａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔはｎ＝９８、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　Ｓｅｔはｎ＝５１であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表３下には、該当する症例をアスベストに対する職業暴露の有無、重喫煙の有無により夫々分けた場合の人数（職業暴露、重喫煙群の構成）、また、各群を組み合わせた際に構成する人数（組み合わせ）の内訳を示している。アスベストと喫煙の混合暴露を解析する場合には、表３で示した患者症例の分類を用いて解析を行った。
２．解析結果
［実施例１］
［アスベスト曝露により発現が変動するｍｉＲＮＡ（Ｔｒａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔにおける解析）］
　Ｔｒａｉｎｉｎｇ　ＳｅｔにおいてＡＢ＝０群（ｎ＝３４）、０＜ＡＢ＜５０００群（ｎ＝２８）、ＡＢ≧５０００群（ｎ＝７３）の相互間で３種類の比較をし、Ｏｎｅｗａｙ　ＡＮＯＶＡ検定（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正）でｐ値により有意となる変動幅を示したｍｉＲＮＡの数を表４に示した。ｐ＜０．０５という条件では、３８個のｈｓａ－ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ）が抽出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　Ｐ＜０．０５の条件では３８個のｈｕｍａｎ　（ｈｓａ－）ｍｉＲＮＡが残った。この３８個を表５に示した。例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－４３１については、ｐ値は１．３９Ｅ－０２（ｐ＝０．０１３９）であり、ＡＢ≧５０００群とＡＢ＝０群との間の比較（［２］ｖｓ［０］）におけるｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ（ＦＣ）は３．８２倍で、アスベストの増加と共に発現量は減少した（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、表中、ｄｏｗｎで示す。）。この表では、ＡＢ＝０群とＡＢ≧５０００群間の比較（［２］ｖｓ［０］）、すなわちアスベスト暴露によりアスベストの沈着量が高い群と、アスベスト沈着の無い群において、ＦＣの大きいｍｉＲＮＡを上から順に示した。ＡＢ＝０群とＡＢ≧５０００群間の比較（［２］ｖｓ［０］）において、ＦＣ１．５０以上のｍｉＲＮＡ１４種については、表中で影をつけて示している。
　なお、表中ＦＣはシグナル値の比であるＦｏｌｄ　Ｃｈａｎｇｅを示し、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎの欄の（［１］ｖｓ［０］）は、［１］（０＜ＡＢ＜５０００）と［０］（アスベスト小体無し）間の比較、（［２］ｖｓ［０］）は［２］（ＡＢ≧５０００）と［０］（アスベスト小体無し）間の比較、（［２］ｖｓ［１］）は、［２］（ＡＢ≧５０００）と［１］（０＜ＡＢ＜５０００）との比較を表す。また、ｕｐは、ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎであり、発現量の増加、ｄｏｗｎは、ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎであり、発現量の減少を示す。さらに、ｃｈｒは、ｍｉＲＮＡの染色体上の位置を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　また、発現量がアスベスト沈着量とどのように関連しているか、症例がどのようにクラスターしているかを、主成分分析と階層クラスター解析を行った。ここでは、結果を図示しないが、どちらのクラスター解析の結果も、アスベスト沈着量が多い症例は、比較的まとまりがあるように見えるが、ＡＢ≧５０００とＡＢ＝０がきれいに分かれているとは言えなかった。
［実施例２］
［喫煙により発現が変動するｍｉＲＮＡ（Ｔｒａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔにおける解析）］
　同様の解析を、喫煙についてもＴｒａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔにおいて実施した。すなわち、ＳＩ＝０群（ｎ＝４９、［０］）、０＜ＳＩ＜４００群（ｎ＝２４、［１］）、ＳＩ≧４００群（ｎ＝１２９、［２］）の相互間で３種類の比較をし、Ｏｎｅｗａｙ　ＡＮＯＶＡ検定（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正）でｐ値により有意となる変動幅を示したｍｉＲＮＡの数を表６に示した。Ｐ＜０．０５の条件で５０個のｈｕｍａｎ（ｈｓａ－）　ｍｉＲＮＡが残った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　Ｐ＜０．０５の５０個のｍｉＲＮＡを表７に示した。アスベストの場合と同様に、この表では、ＳＩ＝０群とＳＩ≧４００群間の比較（［２］ｖｓ［０］）において、ＦＣの大きいｍｉＲＮＡを上から順に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　ここでは、結果を図示しないが、発現量が喫煙量とどのように関連しているについても、主成分分析と階層クラスター解析で示した。主成分分析の結果では、喫煙量が多い症例は、比較的まとまりがあるように見えたが、階層クラスター解析では、非喫煙者がまとまっているとは言いがたかった。
［実施例３］
［アスベスト曝露に関連して、Ｔｒａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔで得られたｍｉＲＮＡのＶａｌｉｄａｔｉｏｎ　Ｓｅｔにおける検証］
　実施例１に示したように、アスベストの曝露（ＡＢ≧５０００）に関連してＦＣ＞１．５の条件を満たしたもの（表５、ＦＣ［２］ｖｓ［０］）は１４個であったが、条件を少し緩めてＦＣ＞１．４として抽出される２１個のｍｉＲＮＡに関して、Ｔｒａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔにおける傾向（ｕｐ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎかｄｏｗｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎか）がＶａｌｉｄａｔｉｏｎ　Ｓｅｔで再現されるかどうかを検討した。表８に、対象とした２１個のｍｉＲＮＡと、それらのＶａｌｉｄａｔｉｏｎ　Ｓｅｔにおける統計値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　相関回帰分析による検定で有意（ｐ＜０．０５）となったのは、ｍｉＲ－４３１，ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－１９７３、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ｂの９個であった。また、ｍｉＲ－３２０ｃは、ｐ値が０．０８６４であり、境界領域のｍｉＲＮＡであり、有効である可能性がある。これら９つのｍｉＲＮＡは、Ｔｒａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔにおいてアスベスト沈着量と有意に相関があるものとして抽出され、さらに、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　Ｓｅｔにおいても有意な相関が見られたｍｉＲＮＡである。したがって、これらのｍｉＲＮＡによって、アスベスト沈着量を推定することができる。
［実施例４］
［喫煙に関連して、Ｔｒａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔで得られたｍｉＲＮＡのＶａｌｉｄａｔｉｏｎ　Ｓｅｔにおける検証］
　実施例３と同様に、Ｔｒａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔにおける解析により抽出した、喫煙群において有意に発現変動した８個のｍｉＲＮＡを用いて、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　Ｓｅｔにおける相関性を、単回帰分析により検定した。その結果、表９に示すように、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　Ｓｅｔにおいてｐ＜０．０５の水準で有意となったものは無かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
［実施例５］
［アスベストと喫煙との混合曝露の解析］
　アスベストとタバコの混合曝露を解析するために、表３に示す１４９症例を用いた４群を構成した。Ｔｒａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔは９８例、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　Ｓｅｔは５１例である。表１０にＴｒａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔを構成する症例数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　ａ群とｃ群とを比較して、非喫煙者におけるアスベスト曝露を特徴づけるｍｉＲＮＡを、ｐ＜０．０５およびＦＣ＞２．０の条件で１０個抽出した。ｂ群とｄ群との比較では、重喫煙者におけるアスベスト曝露を特徴付けるｍｉＲＮＡを、ｐ＜０．０５、ＦＣ＞１．５の条件で８個抽出した。一方、ｄ群とｃ群との比較により、アスベスト曝露なし群における喫煙を特徴づけるｍｉＲＮＡは、ｐ＜０．０５、ＦＣ＞１．２の条件で３個抽出された。ｂ群とａ群との比較では、アスベスト沈着群における喫煙を特徴づけるｍｉＲＮＡを、ｐ＜０．０５、ＦＣ＞１．５の条件で２０個抽出できた。抽出された各群でのｍｉＲＮＡを表１１（表１１－１～表１１－２）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　次に、Ｔｒａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔで抽出されたこれらのｍｉＲＮＡについて、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　Ｓｅｔにおいて有意かどうかを検討した。結果をまとめて表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　非喫煙者におけるアスベスト曝露を特徴付けるｍｉＲＮＡ１０個のうち、ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－９９ｂの６個が有意に相関、あるいは境界値であった。重喫煙者においてアスベスト曝露を特徴付ける８個のｍｉＲＮＡでは、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ５７４－５ｐの３個が有意、あるいは境界値であった。一方、喫煙については、アスベスト沈着なしの群で喫煙を特徴づける３個のｍｉＲＮＡは、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　Ｓｅｔではいずれも有意とならなかった。アスベスト曝露群で喫煙と相関していた２０個のｍｉＲＮＡでは、ｍｉＲ－１９７２、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－５１３ｂ、ｍｉＲ－９９ａ、ｍｉＲ－９９ｂの７個が有意、あるいは境界値であった。
　以上の結果から、ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－４２５７は、ｐ値が０．０５未満であることから、非喫煙者におけるアスベストの有無を特徴付けるｍｉＲＮＡとして統計学的に有意である。また、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－９９ｂは、ｐ値が０．０５以上０．１未満の境界領域のｍｉＲＮＡであり、非喫煙者におけるアスベストの有無を特徴付けるｍｉＲＮＡとして有効である可能性がある。また、ｍｉＲ－５７４－５ｐは、ｐ値が０．０５未満であることから、重喫煙者におけるアスベストの有無を特徴付けるｍｉＲＮＡとして統計学的に有意である。ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－３７８ｂは、ｐ値が０．０５以上０．１未満の境界領域のｍｉＲＮＡであり、重喫煙者におけるアスベストの有無を特徴付けるｍｉＲＮＡとして有効である可能性がある。さらに、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－５１３ｂはｐ値が０．０５未満であることから、アスベスト沈着群における喫煙の有無を特徴付けるｍｉＲＮＡとして統計学的に有意である。ｍｉＲ－１９７２、ｍｉＲ－９９ａ、ｍｉＲ－９９ｂは、ｐ値が０．０５以上０．１未満の界領域のｍｉＲＮＡであり、アスベスト沈着群における喫煙の有無を特徴付けるｍｉＲＮＡとして有効である可能性がある。
　これらのうち、ｐ＜０．０５で有意なもの、あるいは境界領域であり有効である可能性の高いもの１１個のｍｉＲＮＡ（非喫煙におけるアスベスト暴露を特徴付けるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－９２ａ、重喫煙におけるアスベスト暴露を特徴付けるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－５７４－５ｐ、アスベスト暴露群における喫煙を特徴づけるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－１９７２、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ-５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－５１３ｂ）について、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　Ｓｅｔにおける症例分布と回帰曲線を図１に示した。図１に示すように、回帰曲線の傾きは比較的大きく、アスベスト小体計測に代わるマーカーとしてこれらｍｉＲＮＡの発現の変化を使用できることは明らかである。ししたがって、これらｍｉＲＮＡをマーカーとして使用することにより、石綿救済制度が適用できる患者を精度よく見極めることができる。
　また、これらｍｉＲＮＡは新たな肺癌のマーカーでもあることから、これらｍｉＲＮＡを指標に薬剤のスクリーニング、あるいはｍｉＲＮＡ自体を肺癌の治療薬として使用できる可能性もある。
 

Claims (15)

  1. 　被験者から得られた試料中のｍｉＲＮＡ量を測定し、
    　ｍｉＲ－４３１，ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－１９７３、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ｂ、ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－９９ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－１９７２、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ａの少なくともいずれか１つを解析することによって、肺癌の原因を特定することを特徴とする方法。
  2. 　請求項１に記載の肺癌の原因を特定する方法であって、
    　肺癌の原因がアスベスト暴露、及び／又は喫煙であることを特徴とする方法。
  3. 　ｍｉＲ－４３１、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－１９７３、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ｂ、ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－９９ｂ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－１９７２、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ａの少なくともいずれか１つであることを特徴とする肺癌の原因を特定するためのマーカー。
  4. 　請求項３記載のマーカーであって、
    　肺癌の原因がアスベスト暴露、及び／又は喫煙であることを特徴とする肺癌の原因を特定するためのマーカー。
  5. 　請求項３又は４記載のマーカーであって、
    　前記肺癌の原因がアスベスト沈着量と相関するかを検出するためのマーカーであり、
    　前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－４３１、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－１９７３、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ｂの少なくともいずれか１つであることを特徴とする肺癌の原因を特定するためのマーカー。
  6. 　請求項３又は４記載のマーカーであって、
    　前記肺癌の原因が非喫煙者におけるアスベスト暴露によるかを検出するためのマーカーであり、
    　前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－９９ｂの少なくともいずれか１つであることを特徴とする肺癌の原因を特定するためのマーカー。
  7. 　請求項３又は４記載のマーカーであって、
    　前記肺癌の原因が重喫煙者におけるアスベスト暴露によるかを検出するためのマーカーであり、
    　前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－５７４－５ｐの少なくともいずれか１つであることを特徴とする肺癌の原因を特定するためのマーカー。
  8. 　請求項３又は４記載のマーカーであって、
    　前記肺癌の原因がアスベスト暴露群で喫煙の関与を検出するためのマーカーであり、
    　前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１９７２、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－５１３ｂ、ｍｉＲ－９９ａ、ｍｉＲ－９９ｂの少なくともいずれか１つであることを特徴とする肺癌の原因を特定するためのマーカー。
  9. 　ｍｉＲ－４３１、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－１９７３、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ｂ、ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－９９ｂ、ｍｉＲ－１９７２、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ａの少なくともいずれか１つを測定するためのプローブ、及び検出に必要な試薬を含むことを特徴とする肺癌の原因を特定するためのキット。
  10. 　請求項９記載のキットであって、
    　前記肺癌の原因がアスベスト暴露、及び／又は喫煙であることを特徴とする肺癌の原因を特定するためのキット。
  11. 　請求項９又は１０に記載のキットであって、
    　前記肺癌の原因がアスベスト沈着量と相関するかを検出するためのキットであり、
    　前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－４３１、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－１９７３、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ｂの少なくともいずれか１つを測定するためのプローブ、及び検出に必要な試薬を含むことを特徴とする肺癌の原因を特定するためのキット。
  12. 　請求項９又は１０に記載のキットであって、
    　前記肺癌の原因が非喫煙者におけるアスベスト暴露によるかを検出するためのキットであり、
    　前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－９９ｂの少なくともいずれか１つを測定するためのプローブ、及び検出に必要な試薬を含むことを特徴とする肺癌の原因を特定するためのキット。
  13. 　請求項９又は１０に記載のキットであって、
    　前記肺癌の原因が重喫煙者におけるアスベスト暴露によるかを検出するためのキットであり、
    　前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－５７４－５ｐの少なくともいずれか１つを測定するためのプローブ、及び検出に必要な試薬を含むことを特徴とする肺癌の原因を特定するためのキット。
  14. 　請求項９又は１０に記載のキットであって、
    　前記肺癌の原因がアスベスト暴露群で喫煙の関与を検出するためのキットであり、
    　前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１９７２、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－５１３ｂ、ｍｉＲ－９９ａ、ｍｉＲ－９９ｂの少なくともいずれか１つを測定するためのプローブ、及び検出に必要な試薬を含むことを特徴とする肺癌の原因を特定するためのキット。
  15. 　肺癌を治療するための薬剤をスクリーニングする方法であって、
    　ｍｉＲ－４３１、ｍｉＲ－３７８ｂ、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－３２０ｃ、ｍｉＲ－１９７３、ｍｉＲ－４２５７、ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｍｉＲ－７６５、ｍｉＲ－３６４８、ｍｉＲ－５１３ｂ、ｍｉＲ－１４７１、ｍｉＲ－３１３７、ｍｉＲ－３６５１、ｍｉＲ－９９ｂ、ｍｉＲ－１９７２、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ａの少なくともいずれか１つの発現量の増減を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
     
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