CN115820858B - 一种血清在制备云南宣威肺癌诊断药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血清在制备云南宣威肺癌诊断药物中的应用。所述血清联合传统肺癌肿瘤标志物用于制备云南宣威肺癌诊断药物。所述血清为miR‑4646‑5p、miR‑3654、miR‑3651或miR‑720中的一种或几种。所述传统肺癌肿瘤标志物为前胃泌素释放肽、细胞角蛋白19片段21‑1和鳞状细胞癌相关抗原、癌胚抗原、神经元特异性烯醇化酶中的一种。本发明血清联合传统肺癌肿瘤标志物时可具有更好的诊断效能。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种血清在制备云南宣威肺癌诊断药物中的应用。
背景技术
非小细胞肺癌死亡率高的主要原因是其肿瘤转移较早，病症表现相对较晚，患者通常发现就诊已出现转移，局部期和转移期的总5年生存率分别为16.6％和3.9％，而宣威肺癌亦是如此，因此，需要考虑如何更有效的在早期筛查时就予以发现并及时治疗。对于肺癌来说，目前常用的手段可以分为影像学检查和实验室检查，影像学检验中如低剂量螺旋CT等新技术可以早期发现肿瘤，但假阳性率高，低收入地区难以普及。而实验室检查有无创、样本易于获取、检测快捷的有点，其分子生物学的进步为疾病诊断和治疗提供了另一个机会，表观遗传学生物标记物已被证明在肺癌的早期检测和监测中可能有用。此外，预测性生物标记物现在是预测靶向治疗反应的有用工具。
miRNA是长度小于200bp的短链非编码RNA，广泛存在于人类各种体液(血液、唾液、尿液、脑脊液、乳汁、胸腹水)和细胞外泌体中并稳定表达，它配合长链非编码RNA以特异性识别结合抑制翻译或切割RNA转录本进而调节蛋白质编码基因的表达。相同或不同类型的miRNA在不同的癌症中可作为癌基因或抑癌基因，影响方法是一种或多种miRNA表达水平的上调或者下调可以影响靶向原癌基因的信号转导通路，进而促进或者抑制肿瘤的各项机制，miRNA在肝癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌和乳腺癌等中均有表达。由于miRNA的高稳定性和在体液中易于检测的特性，它们在不同类型的癌症中具有潜在的预后和诊断功效。研究显示，miRNA在肺癌产生和发展中发挥了重要作用，它在肺癌的肿瘤生成生长、侵袭、迁移、血管生成和上皮-间充质转化等环节都发挥了作用。在过去十年中不断有研究证明，来源于切除肿瘤样本或细针抽吸样本中的miRNA已经可以成为有效的肿瘤生物标志物，随着技术的不断发展，各种无创或微创样本，如体液样本中的痰液，血浆，血清或全血肺泡灌洗液、尿液、脑脊液、各类细胞外泌体中存在的miRNA也逐步被发现可以用于早期检测癌症的侵入性较小的生物标志物。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种血清在制备云南宣威肺癌诊断药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种血清在制备云南宣威肺癌诊断药物中的应用。
可选地，所述血清联合传统肺癌肿瘤标志物用于制备云南宣威肺癌诊断药物。
可选地，所述血清为miR-4646-5p、miR-3654、miR-3651或miR-720中的一种或几种。
可选地，所述传统肺癌肿瘤标志物为前胃泌素释放肽、细胞角蛋白19片段21-1和鳞状细胞癌相关抗原、癌胚抗原、神经元特异性烯醇化酶中的一种。
可选地，miR-720联合细胞角蛋白19片段21-1用于制备云南宣威肺癌诊断药物。
可选地，miR-3654、miR-720和细胞角蛋白19片段21-1联合用于制备云南宣威肺癌诊断药物。
可选地，miR-720联合癌胚抗原用于制备云南宣威肺癌诊断药物。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)单个miR-3654、miR-720、细胞角蛋白19片段21-1在宣威肺癌组和非宣威肺癌组患者中表达水平存在显著差异，其中miR-720诊断价值最佳，AUC为0.655，高于同组其他指标；上述三个指标联合，对于区分宣威组和非宣威肺癌组，其ROC曲线下面积AUC为0.792，高于其他联合检测指标。。
2)单个miR-3654、miR-720在非宣威肺癌组和健康体检组中表达水平存在显著差异，其中miR-720诊断价值最佳，AUC为0.931，高于同组其他指标；两个指标联合诊断非宣威肺癌组，其ROC曲线下面积AUC为0.943，高于其他联合检测指标。
3)单个miR-720、癌胚抗原在宣威肺癌组和健康体检组中表达水平存在显著差异，其中miR-720诊断价值最佳，AUC为0.930，高于同组其他指标；两个指标联合诊断宣威肺癌组，其ROC曲线下面积AUC为0.939，高于其他联合检测指标。
4)在血清中miR-3654和miR-720具有成为诊断生物标志物的潜力，联合传统肺癌肿瘤标志物时可具有更好的诊断效能。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明4种miRNA和U6在宣威肺癌标本中的电泳结果；
图2是本发明4种miRNA和U6在宣威肺癌标本中的电泳结果；
图3是本发明miR-4646-5P测序与BLAST比对结果图，；
图4是本发明miR-3654测序与BLAST比对结果图；
图5是本发明miR-3651测序与BLAST比对结果图；
图6是本发明U6测序与BLAST比对结果图；
图7是本发明4种miRNA在非宣威肺癌与宣威肺癌、良性肺肿瘤、非肺癌肺疾病、健康人群组受试者血清中相对表达情况图；其中，A代表血清miR-4646-5p、B代表血清miR-3654、C代表血清miR-3651、D代表血清miR-720；内线表示中值，内底线和顶线分别表示第25和第75百分位，*和***分别代表P，0.05和0.0001；
图8是本发明非小细胞肺癌和健康人群组受试者血清传统肺癌肿瘤标志物的含量比较；其中，A代表血清ProGRP、B代表CEA、C代表NSE、D代表SCC、E代表CYFRA21-1的比较，内线表示中值，内底线和顶线分别表示第25和第75百分位；*、**、***分别代表P，0.05和0.01和0.001。
图9是本发明单独miRNA和传统肺癌肿瘤标志物区分宣威肺癌和非宣威肺癌的ROC曲线分析结果和拟合优度结果(一)；其中，(A)CEA的ROC曲线，(B)NSE的ROC曲线，(C)proGRP的ROC曲线，(D)SCC的ROC曲线，(E)CYFRA21-1的ROC曲线，(F)miR-4646-5p的ROC曲线，(G)miR-3654的ROC曲线，(H)miR-3651的ROC曲线，(I)miR-720的ROC曲线。
图10是本发明单独miRNA和传统肺癌肿瘤标志物区分宣威肺癌和非宣威肺癌的ROC曲线分析结果和拟合优度结果(二)；其中，(J)miR-3654的拟合优度结果，(K)miR-720的拟合优度结果，(L)CYFRA21-1的拟合优度结果。
图11是本发明miRNA和传统肺癌肿瘤标志物联合区分宣威肺癌和非宣威肺癌的ROC曲线分析结果；其中，(A)miR-720+CYFRA21-1的ROC曲线结果，(B)miR-3654+CYFRA21-1的ROC曲线结果，(C)
miR-720+miR-3654的ROC曲线结果，(D)miR-3654+miR-720+CYFRA21-1的ROC曲线结果，(E)的ROC曲线结果，(F)miR-3654+miR-720+5种传统肺癌标志物联合组的ROC曲线结果；
图12是存在诊断价值miRNA单独和联合诊断非宣威肺癌的ROC曲线结果(A)miR-3654的ROC曲线，(B)miR-720的ROC曲线，(C)miR-720+miR-3654的ROC曲线；
图13是本发明存在诊断价值的miRNA单独和联合诊断宣威肺癌的ROC曲线结果和拟合优度结果；(A)miR-720的ROC曲线结果，(B)CEA的ROC曲线结果，(C)miR-720+CEA的ROC曲线结果，(D)miR-720的拟合优度结果，(E)CEA的拟合优度结果。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1样本计算、分组与收集
1.1样本统计量计算
各组例数计算采用两组间均数计算中的两组例数分配均等时样本含量计算公式n＝2[(tɑ+tβ)s/δ]2，其中s为标准差，δ为容许误差。计算例数采用数据来源预实验时通过实时荧光定量PCR检测3例NSCLC、3例宣威肺癌血清、3例良性肺肿瘤和3例健康对照中miRNA的表达水平。
1.1.1以miR-4646-5p含量为例
恶性组：s＝0.186，均值＝1.243
宣威肺癌组：s＝1.659，均值＝2.166
δ＝宣威肺癌组均值-恶性组均值＝2.166-1.243＝0.923，s取1.659
用尝试法迭代出样本量，查Z界值表得，单侧Z0.05＝1.645、单侧Z0.10＝1.282代入公式得，n1＝2[(1.645+1.282)×1.659÷0.923]2≈55。
以2n1-2＝55×2-2＝108作为自由度，查T界值表得，单侧t0.05,108＝1.660,t0.10,108＝1.290
代入公式得，n2＝2[(1.660+1.290)×1.659÷0.923]2≈56
以2n2-2＝112-2＝110作为自由度，查T界值表得，单侧t0.05，110＝1.660,t0.10，110＝1.290
带入公式得，n3＝2[(1.660+1.290)×1.659÷0.923]2≈56
因此，每组至少需要56个样本才能得到结果的差异有统计学意义的结论。
1.1.2以miR-720含量为例
恶性组：s＝0.689，均值＝1.436
宣威肺癌组：s＝1.480，均值＝1.051
δ＝宣威肺癌组均值-恶性组均值＝1.436-1.051＝0.385，s取0.689
用尝试法迭代出样本量，查Z界值表得，单侧Z0.05＝1.645、单侧Z0.10＝1.282
代入公式得，n1＝2[(1.645+1.282)×0.689÷0.385]2≈55
以2n1-2＝55×2-2＝108作为自由度，查T界值表得，单侧t0.05,108＝1.660,t0.05,108＝1.290
代入公式得，n2＝2[(1.660+1.290)×0.689÷0.385]2≈56
以2n2-2＝112-2＝110作为自由度，查T界值表得，单侧t0.05,110＝1.660,t0.10,110＝1.290
带入公式得，n3＝2[(1.660+1.290)×1.659÷0.923]2≈56
因此，每组至少需要56个样本才能得到结果的差异有统计学意义的结论，所以后续的研究中我们采用60-61例入组。
1.2纳排标准
本实验纳入排出标准为：
(1)宣威肺癌：籍贯宣威并于宣威地区居住超过15年，经皮肺穿刺活检或术后病理诊断为非小细胞肺癌，手术前均未接收过化放疗及免疫治疗，未合并其他免疫性疾病、消耗性疾病及其他恶性肿瘤。
(2)非宣威肺癌：经皮肺穿刺活检或术后病理诊断为非小细胞肺癌；手术前均未接收过化放疗及免疫治疗，未合并其他免疫性疾病、消耗性疾病及其他恶性肿瘤。
(3)良性肺肿瘤组:经皮肺穿刺活检或术后病理诊断为肺部良性肿瘤(包括炎性假瘤、结核瘤、错构瘤、炎性肌纤维瘤)，未合并其他免疫性疾病、代谢性疾病及恶性肿瘤。
(4)非肿瘤肺病组：诊断为肺部良性疾病(包含肺炎、慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘)，未合并其他免疫性疾病、消耗性疾病及恶性肿瘤。
(5)健康体检组:影像及实验室检测结果均在正常参考区间内，未合并其他免疫性疾病、消耗性疾病及恶性肿瘤。
本研究经昆明医科大学伦理委员会批准，入选患者已填写知情同意书。
1.3样本收集
收集2020年9月到2021年10月间昆明医科大学第一附属医院胸外科经病理学诊断的61例宣威肺癌，其中男性36例，女性25例，年龄55.78±9.36岁。60例非宣威肺癌患者术前血清，其中男性33例，女性27例，年龄54.50±9.77岁。60例良性肺肿瘤患者术前血清，其中男性32例，女性28例，年龄52.91±11.91岁。60例非肺癌肺病患者血清，其中男性38例，女性22例，年龄51.48±11.10岁。60例健康人血清，其中男性29例，女性31例，年龄46.53±12.46岁。收集样本后进行两步离心(4℃1500g离心10min,4℃13000g离心15min)以消除细胞沉淀物，部分血清通过全自动化学发光法检测其传统肺癌肿瘤标志物表达水平，另一部分并转移至1.5ml的无RNase酶EP管中，存放于-196℃液氮中保存直至进行和miRNA提取。并收集患者年龄、性别等一般资料。
1.4统计分析
各项统计数据采用SPSS 17.0软件进行处理，计量资料根据数据类型采用均值(x±s)或中位数W(p25,p75)表示，正态性检验采用K-S检验，正态分布数据采用t检验；非正态分布非正态数据采用Mann-Whitney U秩和检验，采用二元logstic回归确定各参数与肺癌是否有关，使用SPSS 17.0版本生成ROCs和AUCs和尤登指数(Youden's index,YI)以评估诊断敏感度和特异性，对ROC曲线采用Hosmer和Lemeshow拟合优度检验评估其可靠性。除了拟合优度要求P值>0.05，其余统计学检验结果要求P小于0.05被认为具有统计学意义。
实施例2筛选候选miRNA
3例NSCLC、3例宣威肺癌血清、3例良性肺肿瘤和3例健康对照进行预实验研究，对宣威肺癌血清样本中的4个目标microRNA和内参进行实时荧光定量PCR，当日将PCR产物电泳，显示并未出现片状拖带和涂抹带(图1、2)，且产物均<100bp，符合预期大小。配合RT-qPCR时的熔解峰曲线，可见峰型单一，说明并未出现特异性扩增或引物二聚体，将此结果Ct值2-ΔCt换算后的结果导入软件。将产物一并送晨绿生物系统公司进行测序，公司回报的测序峰图背景干净，峰型尖锐可读，碱基所对应编码一致，说明测序结果可以使用。将测序所得的序列输入UCSC数据库进行BLAT比对，比对结果与目的miRNA结果一致，表明扩增产物特异，扩增结果可信，microRNA和内参可以用于下一步实验(图3、4、5、6，图中YourSeq为测序返回所得序列，绿色条带为BLAST数据库中目的miRNA)。
实施例3相关miRNA模板提取、逆转录、实时荧光定量PCR相对定量实验过程
3.3.1提取miRNA
(1)实验前准备：10ul枪头、200ul枪头1000ul枪头、1.5m1EP管经0.1％RNA酶抑制剂(qiagen)溶液浸泡过夜，随后121℃高温高压消毒30mim并65℃烘干备用。提前几小时从液氮罐中取出待测样本解冻，miRcute miRNA Isolation Kit(qiagen)试剂盒中RE和RDW中按厂家要求加入要求体积无水乙醇(安徽安特食品股份有限公司)
(2)样品处理：每200ul血清中加入吸入200ul体积MZ buffer至EP管中，振荡器振荡30s；
(3)室温静置5min，使上下清液完全分离(使核酸蛋白复合物完全分离)
(4)4℃条件下，12000g离心10min，将上清液吸入新的EP管中，再加入200ul无水氯仿(三氯甲烷)后，使用振荡器震荡15s，将EP管在室温放置5min；
(5)量取上清液体积并将其中缓慢加入量取体积三分之一的无水乙醇，将其混匀，匀液转入miRspin管中，室温静置2分钟后，4℃、12000g离心30秒，完成后将miRspin管废弃并保存流出液。
(6)量取流出液体积并将其中缓慢加入量取体积三分之二的无水乙醇，并混匀，匀液转入miRelute管中，室温静置2分钟后，4℃、12000g离心30秒，完成后将miRelute管保存并废弃流出液。
(7)吸附柱中加入500ul去蛋白液MRD,,室温静置2分钟后，4℃12000g离心30s，弃去吸附柱收集管中的液体；
(8)吸附柱中加入500ul漂洗液RW,室温静置2分钟后，4℃12000g离心30s，弃去吸附柱收集管中的液体；
(9)重复操作8一次；
(10)离心完后将吸附柱miRelute放置于ep管中，离心1min 12000g去除残液；
(11)将其放入超净工作台中，开盖，静置片刻，以吹干其中漂洗液；
(12)将吸附柱miRelute放置于新的ep管中，加15-30ulRNase-free water
(13)核酸蛋白仪提前预热15min，采用1ul RNase-free water进行调光程，选择RNA选项，检测提取miRNA的浓度、A260/A280，包括miRNA的要求A260/A280比值在1.8-2.0之间,miRNA浓度要求大于20ng/ul最优；
(14)检测完毕后擦拭机器关闭相关仪器，进行cDNA逆转录过程。
3.3.2逆转录过程
(1)采用miRcute Plus miRNA First-Strand CdnaKit(天根)进行加尾法cDNA逆转录，根据miRcute Plus miRNA First-Strand CdnaKit试剂盒提供说明书，按表1成分于冰上配制反应混合液(最后加入miRNA RT Enzyme Mix)，采用Poly A聚合酶在miRNA的3端加多聚A尾生成miRNA对应的第一链cDNA，逆转录程序见表2。
(2)cDNA逆转录结束后，将核酸蛋白仪提前预热15min，采用1ul RNase-freewater进行调光程，选择ssDNA选项，检测逆转录后cDNA的浓度、A260/A280并记录，立即进行qRP-PCR。不立即实验时则放置于-20℃保存。
表1加尾法逆转录体系反应液
表2加尾法逆转录体系程序
3.3.3荧光定量PCR过程
(1)采用miRcute Plus miRNA Qpcr Kit(天根)试剂盒进行荧光实时定量PCR,miRNA上游特异引物购买自北京擎科生物科技有限公司,下游通用引物来自miRNA荧光定量PCR试剂盒(由miRcute Plus miRNA QpcrKit试剂盒自带)，引物经该公司进行引物特异性验证合格；
其中，miR-4646-5p-F的核苷酸序列为：GGCACTGGGAAGAGGAGCT，具体如SEQ IDNO.1所示；
miR-3654-F的核苷酸序列为：CTGGACAAGCTGAGGAA，具体如SEQ ID NO.1所示；
miR-3651-F的核苷酸序列为：CATAGCCCGGTCGCTGGT，具体如SEQ ID NO.1所示；
miR-720-F的核苷酸序列为：CCGGCTCTCGCTGGGG，具体如SEQ ID NO.1所示；
U6-F的核苷酸序列为：CTCGCTTCGGCAGCACA，具体如SEQ ID NO.1所示；
(2)反应体系为20ul体系，实验要求体系见表3，试剂盒标注PCR扩增条件见表4，但此体系需要进行优化后才能用于本发明，优化结果见表5。miRNA的PCR测量采用ABI 7300荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR及绘制融解曲线，采用U6作为内参对肺癌患者血清中的4个miRNA进行检测，
(3)称取0.5g琼脂糖凝胶粉((Biowest Agarose)，加入25m1DEPC处理水(0.1％DEPC溶液经121℃高温高压消毒15min并冷却)加热至透亮后冷却至60℃左右，加入2.5ul的染料(Bio-Red)，冷却制胶。在孔中加入1ul的6×上样染料和5ul的PCR产物，其中一孔加入6ul的marker，采用220v电泳30min(Tanon EPS300电泳系统)。观察(EimageQuant公司LAS500成像)图像是否清晰，位置是否正确，并配合相应的RT-qPCR熔解峰曲线判断有无特异性扩增或引物二聚体，并将电泳后结果送至云南晨绿技术公司测序，将测序结果返回后与BLAST库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中序列进行比对，正确后进行下一步比对。
(4)检测血清中含量时采用2-ΔCT法分别肺癌患者、良性肿瘤患者、肺部疾病患者、健康人群血清中对该4个miRNA进行相对定量，ΔCt＝(目的基因Ct-内参基因Ct)，当loga2大于1时定义为表达水平高，小于-1定义为表达水平低，在两者之间定义为表达无改变。分析两者间是否存在差异性，在宣威肺癌患者中出现与肺癌患者、良性肿瘤患者、肺部疾病患者、健康人群中均存在差异表达的miRNA，则认为该miRNA在宣威肺腺癌中可能存在差异表达，在肺癌患者中出现与良性肺肿瘤患者、肺部疾病患者健康人群均存在差异表达的miRNA，则认为该miRNA在NSCLC中可能存在差异表达。在良性肺肿瘤患者中出现与肺癌患者、肺部疾病患者、健康人群均存在差异表达的miRNA，则认为该miRNA在良性肺肿瘤中可能存在差异表达。肺部疾病患者中出现与肺癌患者、良性肺肿瘤患者、健康人群均存在差异表达的miRNA，则认为该miRNA在肺部疾病中可能存在差异表达。
表3采用SYBR Green的RT-qPCR体系(未优化)
表4荧光定量PCR反应程序
表5采用SYBR Green的RT-qPCR体系
实施例4分析患者一般临床资料和血清传统肺癌肿瘤标志物评估
收集并分析参与实验的非宣威肺癌组、宣威肺癌、组良性肺肿瘤组患者、肺部疾病组患者、健康人群组中的患者性别、年龄是否大于60岁、是否吸烟等一般临床资料，并收集患者免疫、生化及血清肿瘤标志物检测结果，此结果来源于昆明医科大学第一附属医院临床实验室测量的相关患者血清样本中的NSE、CEA、CYFRA21-1、ProGRP和SCC水平。分析实验结果的miRNA含量与这些临床资料的相关性，如果存在相关性可做ROC曲线并根据每组情况具体分析，并依照具体情况做拟合优度检验ROC曲线。
1、各组中miR-4646-5p、miR-3654、miR-3651、miR-720表达检测及分析对61名宣威肺癌患者组、60名非宣威肺癌患者组与60名良性肺肿瘤患者组、60名非肺癌肺病患者组和60名健康人组的血清样本进行分组检测。结果散点分布如图7所示，对结果进行了k-s检验，发现4种结果均为非正态分布，采用M-W U秩和检验，结果见表6、7、8。结果可发现：
宣威肺癌组的血清miR-720相对表达水平显著高于非宣威肺癌组(6.55vs41.82，P＝0.012)。宣威肺癌组中miR-4646-5P、miR-3651、miR-720相对表达水平显著高于健康体检组(14.08vs3.95，P＝0.001；41.82vs10.62，P＝0.001)；miR-3654相对表达水平显著低于健康体检组(1.85vs3.28，P＝0.001)。非宣威肺癌组中miR-4646-5p、miR-3651相对表达水平显著高于健康体检组(7.13vs3.95，P＝0.001；25.89vs3.28，P＝0.001)；miR-3654、miR-720相对表达水平显著低于健康体检组(3.22vs4.26，P＝0.001；6.55vs10.62，P＝0.001)。
非宣威肺癌组中miR-4646-5p、miR-3654、miR-3651、miR-720相对表达水平与良性肺肿瘤组存在统计学差异(P＝0.002；P＝0.006；P＝0.027；0.001)，非宣威肺癌组中miR-4646-5p、miR-3654、miR-3651、miR-720相对表达水平与非肿瘤肺病组存在统计学差异(P＝0.001；P＝0.018；P＝0.012；P＝0.001)。宣威肺癌组中miR-3654、miR-3651与良性肺肿瘤组存在统计学差异(P＝0.006；P＝0.001)。宣威肺癌组中miR-4646-5p、miR-3651、miR-720相对表达水平与非肿瘤肺病组存在统计学差异(P＝0.006；P＝0.001；P＝0.001)。良性肺肿瘤组中miR-3654、miR-720相对表达水平与非肿瘤肺病组存在统计学差异(P＝0.001；P＝0.023；P＝0.001)。良性肺肿瘤组中miR-4646-5p、miR-3651、miR-720相对表达水平与健康体检组存在统计学差异(P＝0.001；P＝0.001；P＝0.001)。非肿瘤肺病组中miR-4646-5p、miR-3654、miR-3651、miR-720相对表达水平与健康体检组存在统计学差异(P＝0.001；P＝0.002；P＝0.001；P＝0.001)。其余组均不存在统计学差异(P>0.05)。
表6非宣威组的表达水平与各组的比较
注：因各组miRNA结果均为非正态分布，所以结果取中位数，括号内为25百分位数，75百分位数。
表7宣威肺癌组的表达水平与各组的比较
表8良性肺肿瘤组、非肺癌肺病组的表达水平与各组的比较
注：因各组miRNA结果均为非正态分布，所以结果取中位数，括号内为25百分位数，75百分位数。
2、各组一般资料和血清传统肺癌肿瘤标志物指标的差异及其临床病理相关性
对所有组别的进行一般资料检验，结果见表9，各一般资料因素间并无统计学差异(P>0.05)，后对各组血清传统肺癌肿瘤标志物水平(CEA、NSE、SCC、CYFRA21-1、ProGRP)进行检验，结果见于表10、11和图8。
结果可发现非宣威肺癌组中CYFRA21-1表达水平与宣威肺癌组、良性肿瘤组存在统计学差异(P＝0.031)，非宣威肺癌组中CEA、NSE、CYFRA21-1表达水平与非肿瘤肺病组、健康体检组存在统计学差异(P＝0.001；P＝0.030；P＝0.011)。宣威肺癌组中CYFRA21-1表达水平与非肿瘤肺病组存在统计学差异(P＝0.032)。宣威肺癌组中CEA、NSE、CYFRA21-1与健康体检组存在统计学差异(P＝0.030；P＝0.002；P＝0.001)。良性肺肿瘤组中CEA表达水平与非肿瘤肺病组存在统计学差异(P＝0.015)。良性肺肿瘤组中CEA、NSE、SCC、CYFRA21-1表达水平与健康体检组存在统计学差异(P＝0.001；P＝0.037；P＝0.046；P＝0.004)。非肿瘤肺病组中NSE、CYFRA21-1、proGRP表达水平与健康体检组存在统计学差异(P＝0.004；P＝0.002；P＝0.048)。其余组均不存在统计学差异(P>0.05)。此处需要注意，虽然组间存在统计学差异，但是并不表示超过正常范围，此处差异也不能代表其诊断情况，应以具体数值看待其诊断情况。
表9各组的一般资料分析
注：性别、是否吸烟的P值为此组与健康组比较结果；结果为均值加减标准
表10五组受试者血清传统肺癌肿瘤标志物的含量比较
注：因各组肿瘤标志物结果均为非正态分布，所以结果取中位数值，括号内为25百分位数，75百分位数。*、**、***分别代表P，0.05和0.01和0.001。
表11五组受试者血清传统肺癌肿瘤标志物的含量比较
注：因各组肿瘤标志物结果均为非正态分布，所以结果取均值，括号内为25百分位数，75百分位数。*、**、***分别代表P，0.05和0.01和0.001。
3miR-4646-5p、miR-3654、miR-3651、miR-720和传统肺癌肿瘤标志物在宣威肺癌和非宣威肺癌患者中的诊断价值分析
3.1 4种miRNA和传统肺癌肿瘤标志物区分宣威肺癌和非宣威肺癌患者的价值研究
将4种miRNA与所有的传统肺癌肿瘤标志物均进行ROC曲线分析，其目的是在两组差异非显著假设的前提下，分析所有指标数据组在ROC曲线分析中是否具有潜在的区分宣威肺癌和非宣威肺癌患者的效能，这样可以较为全面的评估所有指标ROC曲线区分效能的潜在预测空间，避免遗漏可能可以用于区分宣威肺癌和非宣威肺癌的指标。
通过ROC曲线分析得到：CEA的灵敏度和特异性分别为65.52％和60.38％，AUC为0.612。NSE的灵敏度和特异性分别为68.97％和58.49％，AUC为0.580。proGRP的灵敏度和特异性分别为72.73％和50％，AUC为0.564。SCC的灵敏度和特异性分别为75.00％和60.87％，AUC为0.674。CYFRA21-1的灵敏度和特异性分别为78.57％和64.29％，AUC为0.678。miR-4646-5p的灵敏度和特异性分别为50.88％和78.57％，AUC为0.607。miR-3654的灵敏度和特异性分别为80.3％和42.86％，AUC为0.613。miR-3651的灵敏度和特异性分别为42.37％和76.74％，AUC为0.606。miR-720的灵敏度和特异性分别为49.12％和90.48％，AUC为0.655。最后得到三个存在区分价值的指标：miR-3654(P＝0.025)、miR-720(P＝0.005)、CYFRA211(P＝0.022)，其AUC为0.613、0.655、0.678，其余结果p>0.05，均不存在区分价值，具体结果见表12、图9和图10，对三个存在区分价值的指标进行了回归分析和拟合优度，其回归分析均存在统计学差异(表13)，拟合优度(表14)评价ROC曲线可靠，证明相关指标存在回归关系，可以用于ROC曲线分析，miR-3654的回归关系为为负回归，其余两个指标为正回归，提示miR-3654可能在宣威肺癌与非宣威肺癌中存在特异的情况。在miRNA组中miR-720的区分效能最高，敏感度为49.12％，特异性为90.48％。其次是miR-3654，敏感度为80.3％，特异性为42.86％。传统肺癌肿瘤标志物中只有CYFRA21-1存在诊断价值，敏感度为78.57％，特异性为64.29％。miR-720的AUC虽然略低于CYFRA21-1，但其诊断的特异性好于CYFRA21-1，为90.48％。
为了进一步验证联合指标是否能增加区分效能，我们依照ROC曲线分析结果设计了5种组合：miR-720+CYFRA21-1组、miR-3654+CYFRA21-1组、miR-3654+miR-720组、miR-3654+miR-720+CYFRA21-1组、5种传统肺癌肿瘤标志物联合组、miR-3654+miR-720+5种传统肺癌标志物联合组。五个组进行ROC曲线分析的各项结果见表15和图11，通过ROC曲线分析得到miR-720+CYFRA21-1的灵敏度和特异性分别为84.48％和64.29％，AUC为0.737。miR-3654+CYFRA21-1的灵敏度和特异性分别为79.31％和67.86％，AUC为0.725。miR-720+miR-3654的灵敏度和特异性分别为55.17％和85.71％，AUC为0.678。miR-3654+miR-720+CYFRA21-1的灵敏度和特异性分别为70.69％和82.14％，AUC为0.777。5种传统肺癌肿瘤标志物联合组的灵敏度和特异性分别为85.71％和50.00％，AUC为0.671。
miR-3654+miR-720+5种传统肺癌标志物联合组的灵敏度和特异性分别为63.79％和83.33％，AUC为0.720。其中miR-3654+miR-720+CYFRA21-1的AUC最佳，为0.777，敏感度为70.69％，特异性为82.14％。
miR-3654+miR-720的特异性为85.71％，是特异性最高的联合组，5种传统肺癌肿瘤标志物联合组的敏感度为85.71％，是敏感度最高的联合组。
表12单独miRNA和传统肺癌肿瘤标志物区分宣威肺癌和非宣威肺癌的ROC曲线分析结果
表13存在区分价值指标的回归结果
表14存在区分价值指标的Hosmer和Lemeshow拟合优度检验
注：拟合优度p大于0.05表示ROC曲线结果可靠。
表15miRNA和传统肺癌肿瘤标志物联合区分宣威肺癌和非宣威肺癌的ROC
曲线分析结果
3.24种miRNA和传统肺癌肿瘤标志物在非宣威肺癌中的诊断价值研究
对非宣威肺癌组和健康人组中的4种miRNA(miR-4646-5p、miR-3654、miR-3651、miR-720)和5种传统肺癌肿瘤标志物水平进行二元logstic回归分析，结果发现，miR-3654含量、miR-720含量存在正回归关系(miR-3654，P<0.05,B＝1.05；miR-720,P<0.05,B＝3.647)，miR-4646-5p、miR-3651和其余4种传统肺癌肿瘤标志物的二元logstic回归结果均显示与是否患肺癌不存在回归性(P>0.05)，故不可用于下一步的ROC曲线。
上述指标的ROC曲线结果汇总在表16和图11中。结果显示，miR-3654的灵敏度和特异性分别为83.7％和79.3％，AUC为0.828(图12A)。miR-720灵敏度和特异性分别为85.1％和93.1％，AUC为0.931。在两种miRNA中，miR-720的AUC最高(图12B)，这表明血清miR-720可能是NSCLC诊断的合适指标。
为了检验联合诊断指标是否能获得更好的诊断能力，将miR-3654+miR-720联合进行ROC曲线分析，发现联合使用两种血清miRNA(miR-3654+miR-720)产生的灵敏度为85.71％，特异性为93.1％，AUC为0.943(图12C)。
表16存在诊断价值miRNA单独和联合诊断非宣威肺癌的ROC曲线结果
3.34种miRNA和传统肺癌肿瘤标志物在宣威肺癌中的诊断价值研究
对宣威肺癌组和健康人组中的4种miRNA(miR-4646-5p、miR-3654、miR-3651、miR-720)和5种传统肺癌肿瘤标志物水平进行二元logstic回归分析，结果发现，CEA、miR-720含量存在正回归关系(CEA，P<0.05,B＝-0.153；miR-720,P<0.05,B＝3.155)，miR-4646-5p、miR-3651和其余肺癌肿瘤标志物的二元logstic回归结果均显示与是否患肺癌不存在相关性，故不可用于下一步的ROC曲线。
上述指标的ROC曲线结果汇总在表17和图13中，对ROC曲线分析结果进行Hosmer和Lemeshow拟合优度检验，结果显示两个指标的p值均>0.05，表示ROC曲线拟合结果可靠，结果见图13、表18。结果显示，CEA的灵敏度、特异性和AUC分别为63.33％、75.76％和0.660(图13A)。miR-720的灵敏度、特异性和AUC分别为86.21％、93.1％和0.930(图13B)，这表明血清miR-720可能是宣威肺癌诊断的合适指标。
为了检验联合诊断指标是否能获得更好的诊断能力，将miR-720和CEA联合进行ROC曲线分析，发现联合时，产生的灵敏度为89.66％，特异性为93.10％，AUC为0.939(图13C)。
表17存在诊断价值的miRNA单独和联合诊断宣威肺癌的ROC曲线结果
表18存在诊断宣威肺癌价值指标的Hosmer和Lemeshow拟合优度检验
总之，1.宣威肺癌组的血清miR-720相对表达水平显著高于非宣威肺癌组。宣威肺癌组中miR-4646-5p、miR-3651、miR-720相对表达水平显著高于健康体检组；miR-3654相对表达水平显著低于健康体检组。非宣威肺癌组中miR-4646-5p、miR-3651相对表达水平显著高于健康体检组；miR-3654、miR-720相对表达水平显著低于健康体检组。
2.单个指标中miR-3654、miR-720、细胞角蛋白19片段21-1可以用于区分宣威肺癌和非宣威肺癌组，其中miR-720区分效能最佳，AUC为0.655，高于同组其他指标。单个miR-3654、miR-720可以用于诊断非宣威肺癌组患者和健康体检组，其中miR-720诊断价值最佳，AUC为0.931，高于同组其他指标。单个miR-720、癌胚抗原可以用于诊断宣威肺癌组和健康体检组，其中miR-720诊断价值最佳，AUC为0.930，高于同组其他指标。
3.miR-3654、miR-720和细胞角蛋白19片段21-1联合，对于区分宣威组和非宣威肺癌组，其ROC曲线下面积AUC为0.792，高于其他联合检测指标。miR-3654和miR-720联合诊断非宣威肺癌组，其ROC曲线下面积AUC为0.943，高于其他联合检测指标。miR-720和癌胚抗原联合诊断宣威肺癌组，其ROC曲线下面积AUC为0.939，高于其他联合检测指标。
4.在血清中miR-3654和miR-720具有成为诊断生物标志物的潜力，联合传统肺癌肿瘤标志物时可具有更好的诊断效能。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (1)
1.检测血清中标志物表达水平的试剂在制备区分宣威肺癌和非宣威肺癌的诊断试剂中的应用，其特征在于，所述标志物为miR-3654、miR-720和CYFRA21-1，所述宣威肺癌、非宣威肺癌为非小细胞肺癌。
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