CN109294990A - 一种模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞医学领域，具体涉及一种模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法及应用。本发明提供一种模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法，所述方法为：将BPDE和球形SNPs作为诱导剂，诱导BEAS‑2B细胞和THP‑9细胞共培养体系中的BEAS‑2B细胞发生恶性转化，所建立的细胞模型高度模拟与宣威肺癌发病机制相同的肺癌诱导发生过程，在研究肺癌的发生和筛选预防治疗肺癌药物中有应用价值。

Description

一种模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法及应用
技术领域
本发明涉及细胞医学领域，具体涉及一种模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法及应用。
背景技术
宣威地处中国西南，是云南省曲靖地区一个富产煤矿的大县。6257平方公里的宣威县拥有120万人口。然而因肺癌的高发率，也受到了国内外众多医学研究者的广泛关注。大量的资料显示，在2004-2005年每100000宣威人中就有91人死于肺癌，这远高于国际肺癌致死率的平均水平(每100000人有31人死于肺癌)。先期的研究资料表明，宣威农村取暖生饭的能源主要以宣威本地生产的烟煤为主。而由于宣威农村生火炉灶几乎都没有安置排烟装置，从而引起了严重的室内空气污染。
烟煤一词是指成型于晚二叠纪世的煤，由于燃烧时会释放大量可视性烟雾灰尘，因此被称为烟煤。中国按煤化程度和煤的粘结性把烟煤分为：炼焦煤、1/3炼焦煤、气肥煤和贫瘦煤4大类。宣威煤层形成于晚二叠纪时期，所产煤矿大部分为烟煤，无烟煤所占比例非常少。而对于制成煤球或者煤粉的烟煤燃烧烟雾成分分析显示，这些烟雾中含有非常高的有机化合物和纳米级颗粒，其中有机化合物以苯并芘浓度最高。而在宣威烟煤烟雾中，也发现存在有异常多的纳米级硅颗粒。
燃烧的烟雾中含有大量的以苯并芘为主的多芳香族化合物。以苯并芘为例，此化合物可以与DNA以共价键结合形成加合物，从而导致基因突变并最终引起癌变，因此当时主流观点也认为烟煤燃烧释放的苯并芘是导致宣威肺癌高发和特异性现象的“罪魁祸首”。
但是，烟雾中含有的大量的纳米级硅对宣威肺癌的发生可能也起到促进作用。其实，早期人们已经发现纳米硅的毒性受体内和体外物质的影响。早有研究表明，烟草与晶体硅共同暴漏对人类的致癌作用要远高于晶体硅的单独暴漏。由于宣威地区烟煤煤粉中的无定型球形硅占据50％以上，而且在本地区烟煤燃烧的烟雾中还发现大量的纳米级别硅颗粒，宣威肺癌高爆发性很可能是烟煤燃烧过程中产生的纳米级硅颗粒与多芳香族化合物协同作用而引发的。
无定型纳米硅的肺毒性效应研究还处于起步阶段，体内与体外实验所得结论也不完全一致，肺脏是烟煤燃烧粉尘暴漏的最直接，最重要的靶器官，并且巨噬细胞是肺部清除外来异物重要的炎症细胞。随着社会工业和科技的不断发展，煤矿是支持工业发展的必不可少的因素，因此也带来了环境污染这一严重问题，并且中国肺癌发生率的增长也与环境污染有密不可分的关系。宣威地区只是中国工业化发展的一个缩影，为揭示宣威肺癌高爆发原因，避免类似于宣威地区的中国其它重工业城市出现相同现象，为彻底找到解决宣威地区烟煤污染方法提供理论依据，二氧化硅纳米粒子(silica nanoparticles，SNPs)与多芳香族化合物(PAHs)二者对于肺毒性的模型建立和机制研究将变得十分有必要。现有的已建立的肺部疾病相关的细胞模型主要是关于矽肺的，而且所用诱发因子是单一的二氧化硅结晶，实际的肺癌发病机制十分复杂，特别是被称为“世纪之谜”的宣威肺癌。模拟多种诱因导致的类似宣威肺癌的发病机制的细胞模型急需建立，用于探究肺癌的发病机制及开发相关治疗策略。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法及应用，本发明的细胞模型中的二氧化硅纳米粒子(SNPs)和二羟环氧苯并芘(BPDE)分别模拟宣威地区烟煤煤粉中的两种主要成分，人正常肺上皮细胞(BEAS-2B细胞)和单核巨噬细胞(THP-1细胞)的共培养体系模拟人肺组织细胞环境，本发明所构建的细胞模型高度模拟与宣威肺癌发病机制相似的肺癌的发生，为探究相同原因引发的肺癌的发病机制提供细胞模型工具，同时为筛选预防及治疗此类肺癌药物或策略提供验证途径。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是：
一种模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法，所述方法包括如下步骤：
①细胞培养
BEAS-2B细胞所用细胞培养基为添加10％FBS的LHC-9培养液，细胞贴壁生长至底面90％时用0.25％的胰蛋白酶进行消化传代；
THP-1细胞所用培养基为添加10％FBS的LHC-9培养液，细胞悬浮生长，每2-3天更换一次培养基，将培养瓶直立静置半小时左右，待大部分细胞沉至瓶底，吸出1/2-2/3的旧培养基，加入新的LHC-9培养液继续培养；
②共培养体系构建
将消化好的BEAS-2B细胞和THP-9细胞混合于新的培养瓶中，细胞浓度比为：BEAS-2B：THP-9＝5：1，培养基为添加10％FBS的LHC-9培养液；
③细胞模型的建立
在上述步骤②共培养体系中加入BPDE和球形SNPs，所述BPDE的终浓度为200-1200nmol/ml；所述球形SNPs的终浓度为1.5625-25μg/ml，混匀后，将该共培养体系置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养18-36小时，则模拟肺癌发生机制的细胞模型建立完成。
优选的，上述模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法中，所述步骤③中的BPDE的终浓度为800nmol/ml。
优选的，上述模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法中，所述步骤③中的球形SNPs的终浓度为12.5μg/ml。
优选的，上述模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法中，所述步骤③中的所建共培养体系的培养时间为24小时。
进一步，上述的模拟肺癌发生机制的细胞模型可以模拟由多芳香族化合物和无定型硅颗粒共同诱导的肺癌的发生。
本发明还提供一种模拟肺癌发生机制的细胞模型在筛选预防和治疗宣威肺癌的药物中的应用。
进一步，上述的模拟肺癌发生机制的细胞模型在筛选预防宣威肺癌的药物中的应用方法为：将待测药物加入BEAS-2B细胞和THP-9细胞共培养体系中，作用3-6小时后，再加入终浓度为800nmol/ml的BPDE和终浓度为12.5μg/ml的球形SNPs，培养24小时后，检测BEAS-2B细胞恶性转化程度；
所述待测药物为预测具有预防宣威肺癌的药物；
所述检测BEAS-2B细胞恶性转化程度的方法为western blot法检测Ki67和PCNA蛋白。
进一步，上述的模拟肺癌发生机制的细胞模型在筛选治疗宣威肺癌的药物中的应用方法为：在BEAS-2B细胞和THP-9细胞共培养体系中加入终浓度为800nmol/ml的BPDE和终浓度为12.5μg/ml的球形SNPs，共培养24小时后，在共培养体系中加入待测药物，作用3-6小时后，检测BEAS-2B细胞恶性转化程度；
所述待测药物为预测具有治疗宣威肺癌的药物；
所述检测BEAS-2B细胞恶性转化程度的方法为western blot法检测Ki67和PCNA蛋白。
有益效果：
1、目前现有的模拟肺癌发生的细胞模型多是单因素诱导细胞恶性转化的发生，但现实的肺癌发生多是许多因素共同导致，如被称为“世纪之谜”的宣威肺癌，本发明所建立的模拟肺癌发生的细胞模型所使用的诱导因素是BPDE和球形SNPs，二者在宣威地区烟煤中含量高，高度模拟现实诱导癌变环境；
2、人体组织的细胞环境是多样的，现有的许多细胞模型在模拟疾病发生过程时仅使用单一的一种细胞，不能准确的模拟体内细胞恶性转化的过程，本发明所建立的模拟肺癌发生的细胞模型使用了人正常肺上皮细胞和免疫细胞THP-1共培养体系模拟人正常肺组织细胞环境，更与现实情况接近；
3、本发明所建立的模拟肺癌发生的细胞模型经实验证明，其中的诱导因素BPDE和球形SNPs的确能促进人正常肺上皮细胞恶性转化，体系中的异常表达的细胞因子与宣威肺癌患者血清中的部分一致，本发明所构建的模拟肺癌发生的细胞模型能够模拟类似宣威肺癌发病机制的肺癌发生过程；
4、本发明探索出BPDE对BEAS-2B和THP-1细胞共培养体系最佳作用浓度为800nmol/ml，球形SNPs对BEAS-2B和THP-1细胞共培养体最佳作用浓度为12.5μg/ml，为以后的相关研究奠定基础。
本发明所提供的模拟肺癌发生机制的细胞模型的建立方法简单易实施，免去研究人员进行如BPDE和SNPs最佳使用浓度探索等过程，其在筛选预防和治疗发病机制与宣威肺癌相似的肺癌中有很大的应用价值。
附图说明
图1是不同浓度球形SNPs或BPDE作用于BEAS-2B细胞或THP-1细胞24小时后细胞生存率统计图；
图2是球形SNPs对染毒BPDE的BEAS-2B细胞增殖影响结果图：
A：软琼脂克隆的形成图像；
B：不同浓度的球形SNPs促使染毒BPDE的BEAS-2B细胞的克隆形成率，其中***表示P<0.01；
C：仅加入THP-1细胞和加入THP-1和12.5umol/ml的SNPs分别对染毒BPDE的BEAS-2B细胞的克隆率，其中***表示P<0.01，NS表示P>0.05；
图3是裸鼠皮下成瘤实验结果图：
A：剥离的肿瘤组织照片；
B：肿瘤体积统计结；
图4是western blot检测裸鼠皮下肿瘤组织中Ki67和PCNA蛋白表达量结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：球形SNPs对与THP-1细胞共培养的BPDE染毒的BEAS-2B细胞的作用的条件探索与模型构建
1最佳作用浓度探索
培养BEAS-2B和THP-1细胞所用的培养基是内含10％FBS的LHC-9培养液，2-3天更换一次培养液。
1.1探索步骤
⑴设完全培养基为空白组，未经任何毒物处理的细胞为对照组，每个剂量实验组设定3个平行孔；
⑵调整BEAS-2B细胞或THP-1细胞浓度为1×105个/ml，均匀的接种于96孔板，每孔200ul，待细胞贴壁生长24小时后，弃去原培养液；
⑶加入BPDE的浓度分别为0、200nmol/ml、400nmol/ml、800nmol/ml和1.2umol/ml；加入球形SNPS的浓度分别为0、1.5625μg/ml、3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml和25μg/ml；
⑷染毒24小时后弃去每孔中的培养液，加入含10％CCK8的DMEM培养液；
⑸培养4小时后，弃去CCK8溶液，每孔加入DMSO100ul，混匀，在超净台中室温放置10分钟，使残留CCK8结晶体充分溶解；
⑹使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光值(OD)值。用受试物各浓度的吸光值与对照组(未经处理的细胞)相比得出的百分率作为各个浓度组的细胞生存率，公式为：细胞生存率＝实验组OD值－空白组OD值/对照组OD值－空白对照组OD值。每个浓度组所测得细胞生存率最接近0.8为最佳毒物浓度。
1.2结果
由CCK8细胞增殖实验表明，12.5μg/ml球形SNPs和800nmol/mlBPDE染毒BEAS-2B细胞的生存率最接近0.8(如图1)。然而，不同浓度的球形SNPs和BPDE分别与THP-1细胞共培养24小时后，其生存率都大于0.8，显示较小几乎无的细胞毒性。总之，12.5μg/ml球形SNPs和800mmol/ml的BPDE是作用于THP-1细胞和BEAS-2B细胞共培养体系的最佳浓度。
2探索球形SNPs刺激THP-1细胞对染毒BPDE的BEAS-2B细胞增殖影响
2.1实验步骤
(1)在BEAS-2B细胞培养液中加入800mmol/ml的BPDE，作用24小时，使BEAS-2B细胞成为染毒细胞；
(2)使用不同浓度梯度的球形SNPs(0，3.125，6.25，12.5，25μmol/mL)与染毒的BEAS-2B细胞和THP-1细胞进行共培养24小时，培养基使用LHC-9；
(3)取上述步骤(1)、(2)中的处于对数期的BEAS-2B细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液备用，如有药物干预，在此步细胞悬液中加入相应干预药物即可；
(4)将0.8％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0.8％的上层琼脂，每孔加1ml上层琼脂和100ul单细胞悬液(约1000cell/每孔)，混匀，室温凝固；
(5)置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养2周，计数每个细胞克隆所含细胞的数量，计算细胞集落形成率，拍照。克隆形成率＝克隆数量/接种细胞数量×100％。
2.2结果
经软琼脂克隆实验表明，与未经球形SNPs处理的染毒BPDE的THP-1细胞共培养中的BEA3-2B细胞对比，不同浓度的球形SNPs都能促进BEAS-2B细胞的克隆率，且有剂量依赖关系。其中12.5umol/ml的球形SNPs促进效率最高(图2)。以染毒BPDE的BEAS-2B细胞为未处理组，加入THP-1细胞共培养24小时后，由软琼脂克隆实验表明，与未理组对比，THP-1细胞对染毒BEAS-2B细胞的克隆率无统计学意义，P>0.05。总之，在THP-1细胞和BPDE染毒的BEAS-2B细胞共培养体系中，THP-1细胞对BPDE染毒的BEAS-2B细胞的增殖无影响，但是球形SNPs促进BPDE染毒的BEAS-2B细胞增殖。
3球形SNPs通过刺激THP-1促进染毒的BEAS-2B细胞发生恶性转化
3.1EMT染色
EMT是上皮细胞因获得间叶细胞表型而引起自身生理和表型改变的过程。它打破了细胞-细胞和细胞-基质间的关联，使上皮细胞获得锚定非依赖生长的能力，而此能力正是肿瘤细胞的标示之一。在体外，为了进一步证明球形SNPs对BPDE诱导的BEAS-2B细胞恶性转化的促进作用，我们分别对BPDE，BPDE-SNPs处理的BEAS-2B细胞和THP-1细胞共培养14天，由细胞免疫化学检测ENT标记蛋白的结果显示,与only-BPDE处理的BEAS-2B细胞对比，BPDE-SNPs处理的BEAS-2B细胞中的上皮标记蛋白CK，E-CA表达量下调。反之，间叶细胞标记蛋白FN上调。然而Vimentin在两种处理方式的BEAS-2B细胞中表达差别不明显。总之，这些结果进一步表明，在体外无定型纳米硅可以促进THP-1诱导的染毒BEAS-2B细胞恶性转化的过程。
3.2成瘤实验
(1)分组：
BPDE处理组：BEAS-2B细胞+800nmol/L的BPDE刺激+THP-1，细胞数量比为：BEAS-2B细胞：THP-1＝5:1，先用BPDE刺激THP-1后加入BEAS-2B细胞共培养。
BPDE-SNPs处理组：BEAS-2B细胞+800nmol/L的BPDE刺激+THP-1+12.5μg/ml的球形SNPs；
(2)步骤：
①上述两组分别共培养24小时后，取BEAS-2B细胞制成细胞悬液，每组注射六只裸鼠，每个注射点接种1×106个细胞，进行皮下注射；
②饲养裸鼠至肉眼可见瘤体(约一周左右)；
③开始测量瘤体大小(最长径a和最短径b，3天一次，连续6次)。此时多数瘤体已经长出，较明显。以时间为横坐标，肿瘤体积为纵坐标绘制肿瘤生长曲线；
④取瘤组织并照相肿瘤体积按照公式：V＝a×2b×0.52计算肿瘤体积(mm3)；
⑤对取下的瘤组织进行HE染色；
⑥提取两组肿瘤组织的蛋白后，western blot检测两组增殖相关的Ki67蛋白和PCNA蛋白。
(3)结果：
a.肿瘤体积统计
从第7天开始，每三天观察一次，在25天取出所有裸鼠的皮下瘤体。BPDE处理组中六只裸鼠瘤体体积平均体积为595.70mm3，是BPDE-SNPs处理组平均体积218.64mm3一倍左右且有时间依赖关系，并且同一时间点两组对比也都有统计学意义，结果见图3。再者，EMT结果也显示BPDE-SNPs处理的BEAS-2B细胞的EMT现象更为明显。总之，这些结果表明在体内无定型纳米硅可以促进THP-1诱导的染毒BEAS-2B细胞向肿瘤细胞转化的过程。
b.Ki67蛋白和PCNA蛋白表达量
促炎症细胞因子最易引起的是细胞增生，然而促炎细胞因子也与细胞凋亡有密切关系，为了揭示在球形SNPs协同BPDE对BEAS-2B增值和凋亡的影响。通过western blot检测两组的Ki67蛋白和PCNA蛋白(如图4)。Ki67蛋白和PCNA在两组都有表达，只是在BPDE-SNPs处理的BEAS-2B细胞中Ki67蛋白和PCNA表达量更高。这些表明了在球形SNPs协同BPDE促使BEAS-2B细胞癌变中，虽然增殖和凋亡现象同时存在，但是以增殖为主。
炎症是贯穿肺癌发生始末过程的。对于肺脏，巨噬细胞是整个过程是最为重要的炎性细胞。在实施例一中，我们的模型表明以THP-1为代表的人类单核细胞可促进染毒BEAS-2B细胞转化，为了探索污染空气中的复合物在宣威肺癌发生过程中的作用，我们以此模型为基础，使用不同剂量的无定型纳米硅进行染毒发现，12.5μg/ml的无定型纳米硅可显著促进染毒BPDE的BEAS-2B细胞发生恶性转化，本实施例首次成功的在体外模拟了以无定型纳米硅和BaP为主的宣威空气污染复合物在人体肺脏癌变过程中的作用，并通过裸鼠成瘤进行实时动态的观察二者在肿瘤发生过程中的协同倍增关系，为研究宣威肺癌发病机制和开发治疗策略奠定基础。
实施例二：所建细胞模型与实际肺癌患者血清中细胞因子表达比较
1细胞模型中细胞因子检测
1.1分组
实验分为两组：对照组为BEAS-2B细胞+800nmol/L的BPDE刺激+THP-1；实验组为BEAS-2B细胞+800nmol/L的BPDE刺激+THP-1+12.5μg/ml球形SNPs。
1.2实验步骤
(1)悬液芯片实验
将两组细胞分别培养24小时和48小时检测培养上清液。按照悬液芯片试剂盒(Bio-Plex)说明书，检测各细胞因子的表达量。
(2)Realtime-PCR实验
将两组细胞分别培养24小时和48小时检测培养上清液。分别提取两组细胞的RNA进行RT-qPCR检测，分别对BPDE和BPDE-SNPs染毒的BEAS-2B和THP-1细胞共培养0小时、12小时、24小时、36小时和48小时后，经实时荧光定量PCR对每个时间点的共培养细胞中IL-1β、CCL2、MCP-3、SDF-1α和TGF-α细胞因子mRNA进行检测。各细胞因子引物序列如表1所示：
表1qPCR检测各细胞因子引物序列
1.3实验结果
为了揭示球形SNPs引发共培养体系中高表达细胞因子的类型，分别将BPDE和BPDE-SNPs染毒BEAS-2B细胞和THP-1细胞，共培养24小时和48小时后经悬液芯片对两组的上清液进行检测发现，与BPDE处理组比较，IL-1β、CCL2、MCP-3、SDF-1α和TGF-α在BPDE-SNPs处理组中表达上调且有显著统计学意义。此外，两组共培养24小时与48小时的悬液芯片结果对比，IL-1β、CCL2、MCP-3、SDF-1α和TGF-α无统计学意义。总之，这揭示无定型SNPs促进BEAS-2B细胞恶性转化的过程中，IL-1β、CCL2、MCP-3、SDF-1α和TGF-α促炎细胞因子可能发挥了重要的作用。
RT-qPCR结果表明，与BPDE组比较，高表达细胞因子的mRNA在BPDE-SNPs处理组共培养36小时相对表达量最高。但是仅IL-1β和TGF-α的mRNA有时间效应关系。此外，CCL2、MCP-3的mRNA在每个时间点表达量无变化且无时间变化趋势。
2宣威肺癌患者血清中细胞因子检测
通过ELISA方法对23个宣威肺癌患者(TMN分期为I和II期)，25个宣威良性肿瘤患者和22个非宣威肺癌患者(TMN分期为I和II期)血清中的IL-1β、CCL2、MCP-3、SDF-1α和TGF-α进行检测。我们发现经三组对比后仅IL-1β和TGF-α有统计学意义，P<0.05。CCL2，MCP-3，和SDF-1α表达量无明显变化。这表明了IL-1β和TGF-α在宣威肺癌发生的过程中起到重要的作用(如表2所示)。
表2血清细胞因子含量比较
实施例二比较了所构建的细胞模型中的细胞因子和宣威肺癌患者血清中细胞因子的含量，结果表明，二者均存在IL-1β和TGF-α表达异常的情况，间接表明，用球形SNPs和BPDE作用于BEAS-2B和THP-1细胞共培养体系模拟了纳米级硅颗粒和苯并芘对肺部细胞的影响，对该模型的研究表明，球形SNPs和BPDE可协同促进BEAS-2B细胞恶性转化，使BEAS-2B细胞由正常向癌变发展。此模型模拟诱导人正常肺上皮细胞的癌变过程，对于与宣威肺癌发病原因相似的肺癌发病机制研究和治疗策略开发具有重要意义。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。最后说明的是，以上实施例仅用于说明解释本发明的技术方案而非限制，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法，其特征为：所述方法包括如下步骤：
①细胞培养
BEAS-2B细胞所用细胞培养基为添加10％FBS的LHC-9培养液，细胞贴壁生长至底面90％时用0.25％的胰蛋白酶进行消化传代；
THP-1细胞所用培养基为添加10％FBS的LHC-9培养液，细胞悬浮生长，每2-3天更换一次培养基，将培养瓶直立静置半小时左右，待大部分细胞沉至瓶底，吸出1/2-2/3的旧培养基，加入新的LHC-9培养液继续培养；
②共培养体系构建
将消化好的BEAS-2B细胞和THP-9细胞混合于新的培养瓶中，细胞浓度比为：BEAS-2B：THP-9＝5:1，培养基为添加10％FBS的LHC-9培养液；
③细胞模型的建立
在上述步骤②共培养体系中加入BPDE和球形SNPs，所述BPDE的终浓度为200-1200nmol/ml；所述球形SNPs的终浓度为1.5625-25μg/ml，混匀后，将该共培养体系置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养18-36小时，则模拟肺癌发生机制的细胞模型建立完成。
2.根据权利要求1所述的模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法，其特征为：所述步骤③中的BPDE的最佳终浓度为800nmol/ml。
3.根据权利要求1所述的模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法，其特征为：所述步骤③中的球形SNPs的最佳终浓度为12.5μg/ml。
4.根据权利要求1所述的模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法，其特征为：所述步骤③中的所建细胞模型共培养体系的最佳培养时间为24小时。
5.根据权利要求1所述的模拟肺癌发生机制的细胞模型建立方法，其特征为：所述模拟肺癌发生机制的细胞模型模拟由多芳香族化合物和无定型硅颗粒共同诱导的肺癌的发生过程。
6.权利要求1-5任意一项在筛选预防和治疗宣威肺癌的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的模拟肺癌发生机制的细胞模型在筛选预防宣威肺癌的药物中的应用，其特征为：所述应用方法是：将待测药物加入BEAS-2B细胞和THP-9细胞共培养体系中，作用3-6小时后，再加入终浓度为800nmol/ml的BPDE和终浓度为12.5μg/ml的球形SNPs，培养24小时后，检测BEAS-2B细胞恶性转化程度；
所述待测药物为预测具有预防宣威肺癌作用的药物；
所述检测BEAS-2B细胞恶性转化程度的方法为western blot法检测Ki67和PCNA蛋白。
8.根据权利要求6所述的模拟肺癌发生机制的细胞模型在筛选治疗宣威肺癌的药物中的应用，其特征为：所述应用方法是：在BEAS-2B细胞和THP-9细胞共培养体系中加入终浓度为800nmol/ml的BPDE和终浓度为12.5μg/ml的球形SNPs，共培养24小时后，在共培养体系中加入待测药物，作用3-6小时后，检测BEAS-2B细胞恶性转化程度；
所述待测药物为预测具有治疗宣威肺癌作用的药物；
所述检测BEAS-2B细胞恶性转化程度的方法为western blot法检测Ki67和PCNA蛋白。
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