CN106479981B - 一种人子宫内膜癌细胞系及其建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人子宫内膜癌细胞系及其建立方法。所述的人子宫内膜癌细胞系保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.12290。建立方法的步骤：(A)获取新鲜的临床子宫内膜癌手术切除标本，采用II胶原酶消化法进行细胞分离原代培养；(B)当细胞汇合度达90％左右时，进行细胞传代培养，完成hEMC20121018的建系。本发明的人子宫内膜癌细胞系具有稳定的细胞生物学特性，高表达HER‑2基因编码蛋白，且在哺乳动物体内体内能够形成肿瘤。可直接应用于细胞生物学、分子生物学、抗肿瘤药物筛选等相关重要研究，是应用于基础研究和临床前期应用的理想人子宫内膜癌细胞系。

Description

一种人子宫内膜癌细胞系及其建立方法

技术领域

本发明涉及生物细胞领域，特别涉及一种人子宫内膜癌细胞系及其建立方法。

背景技术

子宫内膜癌是女性常见的生殖道恶性肿瘤之一，子宫内膜癌在美国、欧洲等发达地区。目前已接近新发妇科恶性肿瘤的50％，据美国国家癌症研究所报道，2015年美国子宫内膜癌的新发病例54870例，死亡10170例。虽然发展中国家子宫内膜癌的发病率低于发达国家，但其死亡率34％(21000/62000)显著高于发达国家21％(29000/136000)。子宫内膜绝大多数为腺癌，多见于更年期与绝经后妇女。由于子宫内膜癌的发病机制及侵袭转移仍不十分清楚，目前尚无有效的预防方法，对于晚期及不能耐受手术的病人，没有特异性的化疗、放疗方案，患者预后差。所以，建立多种不同生物学特性的子宫内膜癌细胞系是深入开展子宫内膜癌研究的基础。

目前，已知的子宫内膜癌细胞系多于20世纪60-80年代建立，如Ishikawa细胞系和HTB111，HTB112，HTB113，CRL-95等，收录在美国组织细胞培养库(ATCC)。Keiichi Isaka等从1名50岁低分化子宫内膜癌病人的手术标本建立一株细胞系EN，伴有P53突变。HEC-1-A及其亚株HEC-1-B是H.Kuramoto等人于1968年从一位IA期子宫内膜癌患者身上分离获得，PAF可诱导HEC-1-A细胞c-fos的表达，HEC-1-B细胞在培养第135天到190天之间，表现出稳定的生长周期，且重现扁平，与亲本细胞系相比，更具铺路石式样，其主要染色体组是亲本细胞的两倍。1997年，岱美茹等报道了国内第一个正式建立的子宫内膜腺癌细胞系HEC-D，为子宫内膜癌生物学研究提供了体外模型。吴中明等用1名65岁IV期中度分化子宫内膜腺癌病人的腹水内癌细胞培养成功，建立JEC细胞系。Fuijaswa等从一高分化子宫内膜腺癌病人和一中度分化内膜腺癌病人标本分离出两株不同的细胞系HEC-251和HEC-252。Hasegawa等获得一来源于未分化内膜癌的细胞系TMG-1。

但是，随着细胞系体外传代次数的增多，其一些特有的生物学特征会逐渐改变或消失。例如，Ishikawa高分化内膜样癌细胞系，来源于一名39岁女性患者，雌孕激素受体阳性，细胞生长无雌激素依赖性，已建系20余年，得到了广泛的应用。但是随着培养时间的延长，Ishikawa细胞逐渐去分化，细胞形态向未分化性状转变，因此，不断建立新的细胞系，具有重要的意义。现有的人子宫内膜癌细胞系存在的生物多样性低，与临床上子宫内膜癌的生物学性状相差较大等不足。但肿瘤细胞系为研究肿瘤生化、代谢、免疫及细胞调控提供很好的模型，所以，建立新的子宫内膜癌细胞系，将为研究子宫内膜癌提供良好的研究材料，将进一步促进子宫内膜癌的基础和临床研究。

发明内容

本发明针对上述问题，提供一种新的人子宫内膜癌细胞系及其建立方法和应用。本发明所提供的人子宫内膜癌细胞，名称为人子宫内膜癌细胞系hEMC20121018，简称hEMC1018，并于2016年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12290。

所述的人子宫内膜癌细胞系hEMC20121018，性状稳定，可传100世代，成瘤率高，潜伏期短，均一性好，可直接用于进行细胞学实验、抗肿瘤药物筛选和体外建立动物模型等相关重要研究，是应用于基础研究和临床前期的理想人子宫内膜癌细胞系。

所述的人子宫内膜癌细胞优选为中-低分化腺癌。

所述的人子宫内膜癌细胞系hEMC20121018的生物学特性，其特征在于：具有稳定的细胞生物学特性，瘤细胞贴壁生长，代谢旺盛，生长快速，并可重叠生长，具有良好的体外培养扩增性；具有稳定的克隆形成能力和迁移、侵袭能力；细胞系高表达HER-2基因编码蛋白；细胞系在哺乳动物体内能够形成肿瘤，致瘤性强，可成功制备子宫内膜癌发生、发展的动物模型，该动物模型可用于研究子宫内膜癌发生发展分子机制、药物筛选及发现子宫内膜癌相关新生物标志等，是人子宫内膜癌基础研究和临床前期应用的理想细胞系。

所述的哺乳动物为本领域常规的哺乳动物，优选为BALB/C-nu/nu裸小鼠。

所述的人子宫内膜癌细胞系hEMC20121018对多西他赛和顺铂具有稳定的敏感性。

为了实现上述目的，本发明还提供一种人子宫内膜癌细胞系hEMC20121018的建立方法，包括如下步骤。

步骤(A)获取新鲜的临床子宫内膜癌手术切除标本，采用II胶原酶消化法，进行细胞分离原代培养。

步骤(B)当细胞汇合度达90％左右时，进行细胞传代培养，完成hEMC20121018的建系。

所述步骤(A)的具体方法如下。

(1)标本组织的处理：将新鲜离体组织浸润于RPMI-1640培养液；用PBS液冲洗组织标本，处理组织后，再用PBS液大量冲洗组织后，反复剪切组织至糊状，加入胶原酶II型。

(2)消化反应：将步骤(1)的组织置于含5％CO2，37℃的培养箱中进行消化处理，每隔20min用移液器吹打消化中的组织；加入含10％胎牛血清的混合培养基进行中和，静置培养数分钟。

(3)离心、培养：收集步骤(2)得到的消化液的上层液体进行离心处理，弃上清液，用混合培养液悬浮细胞团后，接种于培养瓶中，置于5％CO2，37℃的培养箱中静置培养；换液时，吸出旧培养基，用PH为7.4的PBS清洗培养瓶，加入含10％胎牛血清的混合培养基，置于5％CO2，37℃培养箱中，静置培养，备用。

所述的RPMI-1640培养液含100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的双抗，且含10％胎牛血清。

所述步骤(B)的具体方法如下。

(1)细胞悬浮、离心：吸弃进行原代培养的培养瓶中的培养液，用含双抗的PH为7.4的PBS液清洗培养瓶；加入含0.25％EDTA的胰蛋白酶消化液，使细胞消化液100％覆盖细胞培养瓶底；置于5％CO2,37℃培养箱中，静置培养2-3分钟；加入与消化液等量混合培养基进行中和，吹打培养瓶，吸出细胞悬浮液，离心。

(2)换液、培养：取步骤(1)离心处理的细胞液，弃上清液，加入细胞培养液，重悬细胞，将细胞悬液加入新的培养瓶，置于5％CO2，37℃培养箱中，静置培养，当细胞传代至第十代以后，将培养液更换为RPMI-1640培养液，得到所述的子宫内膜癌细胞系hEMC20121018。

所述的PBS液的原料组成及用量为含100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的双抗、NaCl8.5g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.85g、KH₂PO₄ 0.27g，1000ml蒸馏水，PH7.4。

所述的细胞培养液为RPMI1640与DMEM/F12按1:1比例混合(各占50％)。

所述的混合培养基为RPMI-1640培养液和DMEM/F12培养液按1:1比例混合(各占45％)，以及10％胎牛血清。

本发明的有益效果。

1.本发明的人子宫内膜癌细胞系是从人子宫内膜癌组织中获得，性状可稳定传代至100世代以上。应用细胞生物学、肿瘤病理学及分子肿瘤学等相关实验方法，可以对该细胞系的生物学行为进行了全面评估，发现该细胞系具有稳定的体外增殖、无限传代能力、克隆形成能力和侵袭、转移能力，且在裸小鼠体内具有较强的致瘤性，成瘤率高，皮下和腹腔成瘤率为66.67％，潜伏期短(28天)，均一性好。

2.本发明的人子宫内膜癌细胞系性状稳定，可直接应用于细胞生物学、分子生物学、抗肿瘤药物筛选等相关重要研究，是应用于基础研究和临床前期应用的理想人子宫内膜癌细胞系。

生物材料的保藏。

本发明的人子宫内膜癌细胞系于2016年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，培养物名称为人子宫内膜癌细胞系hEMC20121018，保藏编号为CGMCCNO.12290。

附图说明

图1人子宫内膜癌细胞hEMC20121018G1光镜下(x100)形态图。

图2人子宫内膜癌细胞hEMC20121018G42光镜下(x100)形态图。

图3人子宫内膜癌细胞hEMC20121018G51光镜下(x100)形态图。

图4人子宫内膜癌细胞hEMC20121018G100光镜下(x100)形态图。

图5人子宫内膜癌细胞hEMC20121018生长时间曲线。

图6流式细胞仪检测hEMC20121018的细胞周期情况。

图7ModFit分析软件进行倍体和细胞周期分析结果。

图8人子宫内膜癌细胞hEMC20121018克隆形成能力检测结果。

图9人子宫内膜癌细胞hEMC20121018克隆形成率柱状图。

图10倒置显微镜下观察人子宫内膜癌细胞hEMC20121018划痕愈合情况。

图11细胞划痕愈合率(迁移率)折线图。

图12Transwell迁移实验显微镜下计数迁移细胞数的视野细胞图片。

图13迁移细胞数计数的平均值(x200)柱状图。

图14Transwell侵袭实验显微镜下计数侵袭细胞数的视野细胞图片。

图15侵袭细胞数计数的平均值(x200)柱状图。

图16人子宫内膜癌细胞hEMC20121018成瘤性检测结果图片，其中A为裸鼠皮下成瘤图片，B为裸鼠腹腔成瘤图片；其中a.紫1号；b.紫2号；c.紫3号；d.26号；e.27号；f.28号；g.紫4号；h.无号；i.29号。

图17子宫内膜癌细胞系hEMC20121018高表达HER-2蛋白的蛋白质印迹检测结果。

图18不同浓度多西他赛作用于人子宫内膜癌hEMC20121018细胞48后对其形态的影响；其中：A.0nmol/L；B.0.1nmol/L；C.1nmol/L；D.10nmol/L；E.100nmol/L。

图19不同浓度顺铂作用于人子宫内膜癌hEMC20121018细胞48后对其形态的影响；其中：A.0ug/mL；B.2ug/mL；C.5ug/mL；D.8ug/mL；E.10ug/mL。

图20CCK8法测试人子宫内膜癌hEMC20121018细胞对多西他赛的反应性。

图21CCK8法测试人子宫内膜癌hEMC20121018细胞对顺铂的反应性。

图22FCM法检测多西他赛对人子宫内膜癌hEMC20121018细胞周期的影响；其中：A.0nmol/L；B.0.1nmol/L；C.1nmol/L；D.10nmol/L；E.100nmol/L。

图23FCM法检测顺铂对人子宫内膜癌hEMC20121018细胞周期的影响。其中：A.0ug/mL；B.2ug/mL；C.5ug/mL；D.8ug/mL；E.10ug/mL。

具体实施方式

下面通过实施例的方法进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围内。下列实施例中未做特殊说明，均为常规的方法或者条件。

实施例1。

一、人子宫内膜癌细胞系hEMC20121018的建立。

临床采集子宫内膜样腺癌患者术后肿瘤组织进行子宫内膜癌原代细胞培养。

该患者病历资料：许凤兰，年龄62岁。临床表现为中-低分化腺癌伴鳞状上皮化生，宫颈浸润1/3，宫口见浸润。

将该肿瘤组织离体后立即置冰盒低温保持，30min内送回实验室进行细胞分离原代培养。

原代培养：取手术后新鲜离体组织浸润RPMI-1640培养液中，送至实验室进行处理，用PBS液冲洗组织标本5遍，用组织剪修剪组织，去除坏死，再用PBS液大量冲洗组织后，用组织剪反复剪切组织至糊状，加入10ml胶原酶II型(浓度1mg/ml)；将其放置含5％CO₂，37℃的培养箱中，消化1h，每隔20min用移液器吹打消化中的组织。消化1h后，组织呈云雾状，取出；加入与消化液等量的含10％胎牛血清的混合培养基(RPMI1640和DMEM/F12)进行中和，静置培养5min；将收集的上层消化液进行离心，1500rpm/min离心处理10min，弃上清液，用5ml混合培养液悬浮细胞团后，接种于培养瓶中，置于含5％CO₂，37℃的培养箱中培养；观察培养瓶中培养液颜色，细胞生长密度，确定是否换液，培养瓶中培养液颜色变黄，进行换液处理；换液时，吸出旧培养基，用PBS液清洗培养瓶2次；加入4ml含10％胎牛血清的混合培养基，放置5％CO₂,37℃培养箱中静置培养；当细胞生长状态好，第一代细胞汇合度达90％左右时，进行细胞传代，见图1。

传代培养：吸出原代培养的培养瓶中的培养液，用含双抗的PBS液(PH7.4)清洗培养瓶2次；加入0.5ml含EDTA的胰蛋白酶消化液至细胞培养瓶，轻轻摇动，使细胞消化液刚刚覆盖细胞培养瓶底；细胞培养瓶置于5％CO₂,37℃培养箱中，静置培养2分钟,显微镜下观察细胞的消化态，加入与消化液等量混合培养基进行中和，吹打培养瓶中悬浮细胞，吸出细胞悬浮液转移至离心管中，1000rpm离心处理5min；弃上清液，加入5ml细胞培养液，重悬细胞，细胞计数后，分瓶，加入适量细胞培养液至培养瓶中，置于5％CO₂，37℃培养箱中静置培养，当细胞传代至第十代以后，将培养液更换为RPMI-1640培养液5ml。

细胞冻存：预先配制冻存液:含10％DMSO的完全生长培养基(含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液)；弃去培养瓶中的培养基，PBS清洗培养瓶2次，加入0.5ml含EDTA的消化液至细胞培养瓶，轻轻摇动，使细胞消化液刚刚覆盖细胞培养瓶底；细胞培养瓶置于5％CO₂，37℃培养箱中静置培养3分钟，显微镜下观察细胞的消化状态，加入2ml含10％胎牛血清的混合培养基进行中和，吹打培养瓶中悬浮细胞，吸出细胞悬浮液转移至离心管中，1000rpm离心处理5min；弃上清液，加入1.8ml冻存液重悬细胞，转移至冻存管中，密封后，标记冻存细胞名称和冻存日期。

将原代培养的细胞在体外进行持续传代培养，至第42和51世代，显微镜下观察子宫内膜癌细胞，见图2和图3。进行持续传代培养至第100世代，显微镜下观察子宫内膜癌细胞，见图4，hEMC20121018细胞失去了接触抑制，呈恶性生长，具有重叠生长的特点，贴壁细胞生长以不规则铺路石样为主，符合上皮样细胞的特点。至此，顺利完成hEMC20121018的建系。

二、子宫内膜癌细胞hEMC20121018的生物学特性检测。

1.hEMC20121018细胞的增殖能力。

采用MTT实验方法评估hEMC20121018细胞的增殖能力,绘制hEMC20121018细胞的生长曲线。取对数生长期的细胞，分别进行0.25％胰蛋白酶消化后，按照每孔细胞数为2×10³单细胞悬液接种至96孔板中，每孔培养基总量为200ul，每组细胞设5个复孔。放入5％CO2、37℃培养箱中培养，分别孵育24、48、72、96、120小时，每孔加入浓度为5mg/ml MTT液20μl，37℃孵育4小时，去上清，每孔加入DMSO 150ul，轻轻振荡10min，用酶标定量仪测定490nm吸光度值。连续5天测量OD值，以调零对照组平均值调零，各组所测OD值应减去空白组OD值，然后以时间为横轴、OD值为纵轴绘制细胞生长曲线，见图5，细胞贴壁后细胞呈指数生长，具有良好的体外培养扩增性。

采用细胞周期实验评估hEMC20121018细胞的增殖能力。取对数生长期的细胞，小心收集细胞培养液到一个离心管内，备用。用0.25％胰蛋白酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞，再次收集到离心管内。2500rpm离心处理5分钟，沉淀细胞。小心吸除上清液，可以残留约50ul左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS(温度为4℃)，重悬细胞，并转移到1.5ml离心管内。再次离心(500rpm)处理5分钟,沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50ul左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底，以适当分散细胞，避免细胞成团。加入1ml冰浴预冷70％乙醇(温度为4℃)中，轻轻吹打混匀，固定过夜。然后2500rpm离心5分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约50ul左右的70％乙醇，以避免吸走细胞。加入约1ml冰浴预冷的PBS(温度为4℃)，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50ul左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底，以适当分散细胞，避免细胞成团。根据待检测样品的数量配制适量的碘化丙啶染色液，每管细胞样品中加入0.5ml碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟。染色完成后用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况，见图6。采用ModFit分析软件进行倍体和细胞周期分析数据，如表1，分析结果的柱状图，见图7，细胞增殖能力较强，具有良好的体外培养扩增性。

表1 ModFit分析软件进行倍体和细胞周期分析数据。

细胞周期	EMC1018
		G0/G1	59.48±2.39
S&G2/M	40.52±2.39

2.hEMC20121018细胞的克隆能力。

克隆形成实验评估hEMC20121018细胞的克隆形成能力。取对数生长期的子宫内膜癌细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化并用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，重悬成单细胞悬液，计数，备用。将细胞悬液稀释，最终细胞数目要求为2x10⁴个/ml，每组细胞以每皿200个细胞的密度接种于含10mL 37℃预温10％胎牛血清的培养液培养液的培养皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养12天。经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时(细胞长成细胞团块，在培养皿中形成一个白色的细胞团)，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4％多聚甲醛固定细胞30分钟，然后弃去固定液，加适量GIMSA染色液染10分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆数，见图8。最后计算克隆形成率，见表2，根据信息作柱状图，见图9。克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％。以上结果提示，200个hEMC20121018单细胞经过12天常规培养，约73％左右会形成单克隆，具有稳定的克隆形成和增殖能力。

表2克隆形成率(％)。

	EMC1018
		Colony Formation Numbers	73±4.36

3.hEMC20121018细胞的迁移能力。

划痕实验评估hEMC20121018细胞的迁移能力。用0.25％胰酶1ml，消化处于对数生长期的子宫内膜癌细胞，调节细胞浓度至3x10⁵/ml,取1ml上述细胞悬液接种到六孔板中过夜培养24h，待细胞汇合度至90％时，用10ul灭菌枪头轻轻在培养孔中垂直划痕，PBS漂洗3次，加入含有2％胎牛血清的RPMI-1640培养基后，倒置显微镜下拍照记为0h，分别在24h、48h、72h进行换液，并在倒置显微镜下观察划痕细胞愈合情况，见图10。实验组与对照组细胞划痕后的愈合率及统计分析表，见表3，细胞划痕愈合率(迁移率)折线，见图11，该细胞系具有较强的划痕愈合能力和迁移能力。

表3细胞划痕后的愈合率及统计分析表。

Transwell迁移实验评估hEMC20121018细胞的迁移能力。用0.25％胰酶1ml，消化处于对数生长期的子宫内膜癌细胞，用无血清的RPMI-1640培养基调节细胞浓度至1x10⁵/ml。在Transwell的上室加入200ul细胞悬液，在下室加入500ul含20％胎牛血清的RPMI-1640培养基，过夜孵育24小时后，取出上室用棉签将上室表面的细胞轻轻拭去，用PBS洗涤小室后，4％多聚甲醛固定迁移至小室外表面的细胞，0.1％结晶紫染色15min，倒置显微镜下计数迁移细胞数，取视野细胞，见图12，Transwell迁移实验细胞穿越至下室数目，见表4，根据表4信息计数其平均值(x200)柱状图，见图13。该细胞具有较强的迁移能力。

表4 Transwell迁移实验细胞穿越至下室数目。

	EMC1018
		Transwell cells(n)	75±1.73

4.hEMC20121018细胞的侵袭能力。

Transwell侵袭实验评估hEMC20121018细胞的侵袭能力。将Matrigel胶(BD公司，货号356234)4℃溶解，次日在冰上操作，按照Matrigel胶：无血清RPMI-1640培养液＝1:7比例，稀释Matrigel胶，取42ul稀释后Matrigel胶加到Transwell上室中37℃孵育1h。用0.25％胰酶消化子宫内膜癌细胞后，用无血清的RPMI-1640培养液重悬成单细胞悬液，调整细胞数为1×10⁵/ml。在Transwell小室(Corning公司生产)的上室加入细胞悬液200μl，下室中加入500μl含20％胎牛血清的RPMI-1640培养液，5％CO2、37℃培养箱中培养48小时。取出Transwell小室，用PBS洗3次，用棉签擦去微孔膜上层的细胞，4％多聚甲醛固定30min，0.1％结晶紫染色15min后用PBS清洗3次，显微镜下观察拍照，见图14，Transwell侵袭实验细胞穿越Matrigel胶细胞数目，见表5，进行细胞计数(x200)柱状图，见图15，该细胞系具有较强的侵袭能力。

表5 Transwell侵袭实验细胞穿越Matrigel胶细胞数目。

	EMC1018
		Transwell cells(n)	48±8.89

三、原代与第51代hEMC20121018(G51/PG)细胞转录组测序。

收集实施例1子宫内膜癌原代细胞与第51细胞，trizol处理后，送华大基因公司进行测序检测，检测结果：将子宫内膜癌EMCA-G51与EMCA-PG对照组比较，其中2倍以上变化的基因共(1676)个，上调2倍以上的基因共(1196)个，下调2倍以上的基因共(480)个；上调5倍以上的基因共(293)个，下调5倍以上的基因共(171)个；上调10倍以上的基因共(23)个，下调10倍以上基因共(24)个，差异表达10倍以上的基因，见表6，其余基因转录水平未见明显差异。

表6差异表达10倍以上的基因。

由此可见，该细胞系建系后与原代细胞相比出现了少量癌基因及抑癌基因表达的变化，差异表达较为明显的见上表，但是对于大部分基因来说，没有明显变化。表明，该子宫内膜癌细胞建系后与原代基本保持相似性，细胞生物学特性较为稳定。

四、hEMC20121018细胞的成瘤性检测。

采用裸鼠皮下成瘤及腹腔成瘤实验对hEMC20121018细胞进行成瘤性检测。收集对数生长期子宫内膜癌细胞，用0.25％胰酶消化后，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液终止消化，3000rpm离心处理3min后，用PBS重悬，吹打成单细胞悬液，再次3000rpm离心处理3min，用生理盐水重悬细胞。计数细胞数，皮下荷瘤组，调整细胞数为每只鼠10⁷/200μL，收集至1.5mL EP管中，30min内用，将细胞悬液用1mL注射器(BD公司)皮下接种于裸鼠右上腋窝内侧，接种3只裸鼠，命名为紫1号、紫2号、紫3号，见图16A；腹腔接种组，调整细胞数为每只鼠10⁷/200μL，接种至裸鼠腹腔，共接种6只，命名为26号、27号、28号、29号、无号、紫4号鼠,见图16B。实验结果为：皮下荷瘤组3只鼠中，2只成瘤，1只疑似休眠，皮下成瘤率为66.67％；腹腔接种组6只鼠中，4只成瘤，2只无肿物，腹腔成瘤率为66.67％。可见该细胞达10⁷数量级，可在裸鼠体内，包括皮下和腹腔形成肿瘤，具有高度致瘤性。

五、子宫内膜癌细胞系hEMC20121018高表达HER-2蛋白。

Western Blot法检测hEMC20121018细胞中HER-2蛋白的表达情况，结果显示HER-2蛋白呈高表达，见图17。

六、子宫内膜癌细胞系hEMC20121018对化疗药物敏感性测定。

1.不同浓度多西他赛和顺铂对人子宫内膜癌hEMC20121018细胞形态的影响。

本实验采用作用时间相同(48h)，不同浓度多西他赛(0nmol/L、0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L)和顺铂(0ug/mL、2ug/mL、5ug/mL、8ug/mL、10ug/mL)，作用人子宫内膜癌hEMC20121018细胞，显微镜下观察人子宫内膜癌hEMC20121018细胞形态的改变。结果显示，多西他赛和顺铂作用人子宫内膜癌EMC1018细胞后，细胞形态变圆，边缘不清，细胞数目随药物浓度增大而减少，见图18-19。

2.CCK-8法对人子宫内膜癌细胞hEMC20121018进行化疗药物敏感性的检测。

通过CCK-8法对人子宫内膜癌细胞hEMC20121018进行化疗药物敏感性的检测，分别取不同浓度(0nmol/L、0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L)多西他赛和不同浓度(0ug/mL、2ug/mL、5ug/mL、8ug/mL、10ug/mL)顺铂。结果显示：多西他赛和顺铂能够抑制该细胞系的增殖作用，并具有浓度和时间依赖性。在相同作用时间下，随着多西他赛浓度的增加，细胞的抑制率升高，具有明显的浓度依赖性；在相同浓度条件下，随着作用时间的延长，多西他赛对细胞的抑制率升高，具有时间依赖性；24h、48h和72h的IC50分别为254.7nmol/L、115.6nmol/L、19.25nmol/L。在相同作用时间下，随着顺铂浓度的增加，细胞的抑制率升高，具有明显的剂量依赖性；在相同浓度条件下，随着作用时间的延长，顺铂对细胞的抑制率升高，具有时间依赖性；24h、48h和72h的IC50分别为0.23ug/mL、0.21ug/mL、0.20ug/mL，以上结果提示，子宫内膜癌EMC1018细胞对化疗药物多西他赛和顺铂敏感，见图20-21。

3.不同浓度多西他赛和顺铂对人子宫内膜癌hEMC20121018细胞周期的影响。

采用FCM方法检测不同浓度多西他赛和顺铂对人子宫内膜癌细胞hEMC20121018细胞周期的影响，分别取不同浓度(0nmol/L、0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L)多西他赛和不同浓度(0ug/mL、2ug/mL、5ug/mL、8ug/mL、10ug/mL)顺铂。结果显示：随着多西他赛浓度和顺铂升高，子宫内膜癌hEMC1018细胞G0/G1期所占比例增多，而合成增殖的S期明显减少而阻滞细胞于G0/G1期。提示多西他赛和顺铂能抑制子宫内膜癌hEMC1018细胞DNA的合成，而且这种抑制作用与顺铂的浓度存在明显的依赖关系，见图22-23。

Claims (5)

1.一种人子宫内膜癌细胞系，其特征在于：所述的人子宫内膜癌细胞系保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.12290。

2.如权利要求1所述的人子宫内膜癌细胞系,其特征在于，所述人子宫内膜癌细胞为中-低分化腺癌。

3.如权利要求1所述的人子宫内膜癌细胞系，其特征在于，所述人子宫内膜癌细胞系具有稳定的细胞生物学特性，高表达HER-2基因编码蛋白，且在哺乳动物体内能够形成肿瘤。

4.如权利要求3所述的人子宫内膜癌细胞系，其特征在于：所述的哺乳动物为BALB/C-nu/nu裸小鼠。

5.如权利要求1-4任一项所述的人子宫内膜癌细胞系的用途，其特征在于，所述的人子宫内膜癌细胞系应用于抗肿瘤药物筛选的研究。