CN109749999A - 肿瘤体外培养方法及临床化疗药物筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物药效筛选领域，具体公开了一种肿瘤体外培养方法，该培养方法包括采集肿瘤组织样本；对所述肿瘤组织样本进行处理,并分选出肿瘤单细胞和巨噬细胞；将所述肿瘤单细胞置于充满水凝胶的环境以对所述肿瘤单细胞进行筛选，以获得肿瘤干细胞；将所述肿瘤干细胞和所述巨噬细胞建立共培养模型，以获得体外培养肿瘤样本。通过上述方法，本发明能够在体外筛选出具有高度增殖和分化能力的肿瘤干细胞，从而将肿瘤干细胞植入动物体内，能够极大缩短成瘤时间，提高成瘤率，以进行药敏实验，进而加快了药敏实验进程，为患者治疗争取时间。
Description
技术领域
本发明涉及药物药效筛选领域，特别是涉及肿瘤体外培养方法及临床化疗药物筛选方法。
背景技术
肿瘤的病死率高居诸病之首，并还在持续上升，成为威胁人民健康的大敌。而现有的癌症治疗方式存在诸多问题，药物疗效的不确定性，在长期的使用过程中极易出现耐药和严重的副反应；很多时候更有效的治疗方法往往是多种药物组合治疗，但这样更容易产生未知的药物反应，且短时间内无法找到最优化的治疗方法。因此肿瘤的治疗必须向个体化、精准化治疗发展。人源肿瘤移植瘤(Patient-Derived Xenograft,PDX)模型是把病人的肿瘤块直接移植到免疫系统改良后的小鼠体内从而生长出肿瘤，能准确地反映“源瘤病人”的病理学、遗传学特征以及药物反应。将PDX小鼠进行复制扩增后，通过试药，最终挑选出与个体匹配度最高、疗效最好的一到两种药物组合，对病人进行精准治疗；从而减少患者因为不必要的试药造成的身体损害，极大程度延长患者的生存时间以及生存质量。
目前，运用PDX模型进行个体化精准医疗的主要难点在于模型建成周期与药敏测试花费时间长，以及PDX模型的移植成瘤率低。对于肿瘤发展迅速、生存期短的患者而言，有些未能获得药敏结果就已经死亡。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供肿瘤体外培养方法及临床化疗药物筛选方法，能够体外培养筛选出具有高度增殖和分化能力的肿瘤干细胞，从而将肿瘤干细胞植入动物体内后，能够极大缩短成瘤时间，提高成瘤率。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是提供一种肿瘤体外培养方法，所述培养方法包括：采集肿瘤组织样本；对所述肿瘤组织样本进行处理,并分选出肿瘤单细胞和巨噬细胞；将所述肿瘤单细胞置于充满第一水凝胶的环境以对所述肿瘤单细胞进行筛选，以获得肿瘤干细胞；将所述肿瘤干细胞和所述巨噬细胞建立共培养模型，以获得体外培养肿瘤样本。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是提供一种临床化疗药物筛选方法，所述筛选方法包括:采集肿瘤组织样本；对所述肿瘤组织样本进行处理,并分选出肿瘤单细胞和巨噬细胞；将所述肿瘤单细胞置于充满第一水凝胶的环境以对所述肿瘤单细胞进行筛选，以获得肿瘤干细胞；将所述肿瘤干细胞和所述巨噬细胞建立共培养模型，以获得体外培养肿瘤样本；将所述体外培养肿瘤样本植入动物体内，按临床给药途径给药；检测药效敏感性。
本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，通过在体外筛选出具有高度增殖和分化能力的肿瘤干细胞，从而将肿瘤干细胞植入动物体内，能够极大缩短成瘤时间，提高成瘤率，以进行药敏实验，进而加快了药敏实验进程，为患者治疗争取时间。另外，本发明通过将巨噬细胞和肿瘤干细胞共同培养，模拟人体的免疫微环境，并植入动物体内，由于巨噬细胞在肿瘤细胞分泌的细胞因子作用下会向M2型极化，而M2型巨噬细胞对肿瘤生长有促进作用，进一步缩短了成瘤时间，并减轻了临床实验的成本。总之，本发明具有操作便捷，费用低，可重复性强，易于推广的优点。
附图说明
图1是本申请肿瘤体外培养方法一实施例的流程示意图；
图2是本申请临床化疗药物筛选方法一实施例的流程示意图；
图3是本申请临床化疗药物筛选方法一实施例的效果示意图；
图4是本申请临床化疗药物筛选方法一具体实施例的得到的药筛结果示意图；
图5是传统PDX模型检测同一肿瘤组织得到的药筛结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性的劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
请参阅图1，图1是本申请肿瘤体外培养方法一实施例的流程示意图。
S101：采集肿瘤组织样本。
采集临床患者新鲜的肿瘤组织或者小鼠PDX模型的肿瘤组织作为肿瘤组织样本。肿瘤组织样本在运输和保存中需经液氮保护，在尽可能短的时间内运至实验室进行后续操作。
S102：对肿瘤组织样本进行处理，并分选出肿瘤单细胞和巨噬细胞。
在一个应用场景中，上述步骤S102中对肿瘤组织样本主要进行消化处理，使得细胞分散，从而分选出所需的肿瘤单细胞和巨噬细胞。巨噬细胞为与肿瘤相关的巨噬细胞，例如M2型巨噬细胞，对肿瘤生长有促进作用。
对肿瘤组织样本进行处理具体包括：A、剔除非肿瘤组织和坏死组织，将肿瘤组织样本切成多个组织块，例如切成1mm3、2mm3或者3mm3的小块。B、利用第一缓冲液冲洗组织块并离心去除上清液，从而去除外源杂质，第一缓冲液可以是PBS(磷酸缓冲盐溶液)或者其他缓冲液。C、向组织块中加入胶原酶，在第一预设温度内摇床孵育第一预设时间，胶原酶用于去除外基质蛋白、多糖和脂类等其他物质，加入的胶原酶类型根据组织块的类型来选择。第一预设时间可以是2h～6h，例如2h、3h、4h、5h或者6h，第一预设温度为36～38℃，例如36℃、37℃或者38℃。D、过滤去除组织残块和细胞团，以获得第一细胞悬浮液，其中，可采用40μm～50μm的尼龙网过滤，例如40μm、45μm或者50μm，也可利用过滤膜等其他过滤方式。E、随后对第一细胞悬浮液进行离心处理，以获得第一细胞沉淀。F、利用第二缓冲液重悬并清洗第一细胞沉淀，离心去除上清液，以获得第二细胞沉淀，第二缓冲液可以是含胎牛血清(FBS)的PBS缓冲液，胎牛血清具有保证细胞活力的效果。G、将第二细胞沉淀重悬于第三缓冲液中，计数，并调整细胞密度至第一预值，以获得第二细胞悬浮液，第二悬浮液包含肿瘤单细胞和巨噬细胞，上述第三缓冲液可以是含FBS的PBS缓冲液，上述第一预值可以是1×108/ml。
上述涉及离心操作的步骤中离心速度可以是800rpm、1000rpm或者1200rpm，离心时间可以是3min、5min或者7min，在此离心速度下的细胞可以保持较高的活性，同时在此离心时间下的细胞可以获得较好的分离效果。
在另一个应用场景中，上述步骤S102中分选出肿瘤单细胞和巨噬细胞具体包括：
A、向第二细胞悬浮液中分别加入肿瘤细胞分选磁珠(CD133)或者巨噬细胞(CD11b)分选磁珠，在第二预设温度内孵育第二预设时间，其中，第二预设温度为3℃、4℃或者5℃等，第二预设时间为20min、30min或者40min等。B、加入第四缓冲液清洗并离心去除上清液，以获得第三细胞沉淀，其中，第四缓冲液包括多倍体积的PBS或者其他可以清洗细胞的缓冲液，离心速度可以是800rpm、1000rpm或者1200rpm，离心时间可以是3min、5min或者7min。C、再加入第五缓冲液充分混悬第三细胞沉淀后，分别加入对应细胞种类的二抗包被的超微磁珠(即若之前步骤A中加入肿瘤细胞分选磁珠的，此处则加入肿瘤细胞的二抗包被超微磁珠，若之前步骤中加入巨噬细胞分选磁珠的，此处则加入巨噬细胞的二抗包被超微磁珠)，混匀后置第三预设温度内孵育第三预设时间，得到第三细胞悬浮液。其中，第五缓冲液可以是0.3ml/1×108细胞密度的PBS缓冲液，第三预设温度为8-15℃，具体可以是8℃、11.5℃或者15℃，第三预设时间为10-15min，具体可以是10min、12.5min或者15min。D、将分离柱安装入磁场中，加入第六缓冲液，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱，其中，第六缓冲液为PES或者其他可以用于清洗细胞的缓冲液。E、将第三细胞悬浮液加入分离柱中，在重力作用下自然流尽，收集流出的液体，离心去除上清液，加入细胞培养液重悬，计数，并调整细胞密度至第二预值，得到肿瘤单细胞；其中，第二预值为1-10×105/mL，例如1×105/mL、5×105/mL或者10×105/mL等，离心速度可以是800rpm、1000rpm或者1200rpm，离心时间可以是2min、3min或者4min。
S103：将肿瘤单细胞置于充满第一水凝胶的环境以对肿瘤单细胞进行筛选，以获得肿瘤干细胞。
由于肿瘤干细胞具有高度增殖和分化能力，通过在体外筛选出含肿瘤干细胞的第一水凝胶，并将含肿瘤干细胞的第一水凝胶植入动物体内，能够极大缩短成瘤时间，提高成瘤率，以进行后续药敏实验，进而加快了药敏实验进程，为患者治疗争取时间。
具体操作步骤为：
将肿瘤单细胞用第七缓冲液清洗多次，并与第一质量分数的低分子量透明质酸溶液、第五质量分数的高分子量透明质酸溶液和第二质量分数的海藻酸钠溶液混合，最终调整细胞密度至第三预值，获得细胞材料混合溶液。其中，第七缓冲液可以是PBS缓冲液，或者其他用于清洗细胞的缓冲液；第三预值可以是0.9x105个/ml、1x105个/ml或者1.1x105个/ml。
将第三浓度的CaCl2溶液和第四质量分数的壳聚糖溶液混合加入培养皿中，通过微量注射器将细胞材料混合溶液滴入培养皿中，进行交联反应，得到含有肿瘤单细胞的第一水凝胶。其中，交联反应完全，交联反应的时间控制在5-10min，例如5min、7min或者10min等。
其中，第一质量分数为0.05％-0.15％；第二质量分数为2％-4％；第三浓度为90mmol/L-110mmol/L；第四质量分数为0.03％-0.04％；第五质量分数为0.05％-0.15％。
交联反应完成后用吸枪吸出多余的CaCl2溶液，并用生理盐水清洗，去除Ca离子。可利用显微镜观察Ca离子是否充分去除干净，通过显微镜下查看是否有亮点存在，若无亮点，则Ca离子已去除干净。
将含有肿瘤单细胞的第一水凝胶加入含1-3％血清的培养基，放入细胞培养箱培养48h，并筛选出含有肿瘤干细胞的第一水凝胶。其中，培养基中含有的血清浓度还可以是1％、2％或者3％。
具体筛选方法：肿瘤干细胞在低血清培养基中培养形成漂浮细胞球。对含漂浮细胞球的水凝胶进行再次筛选，其中，水凝胶的弹性模量在8000-8400Pa，低分子量透明质酸含量在2.0-3.0％的最佳。干细胞的维持和分化受微环境的生物物理学调控，包括机械负荷，基质材料特性和细胞形状，弹性模量在8000-8400Pa的水凝胶对肿瘤干细胞的生长具有促进作用。另外，透明质酸作为细胞外基质的组成成分之一，可通过与受体的相互作用影响细胞的生理行为，低分子量透明质酸含量在2.0-3.0％的对肿瘤干细胞的生长具有促进作用。
S104：将肿瘤干细胞和巨噬细胞建立共培养模型，以获得体外培养肿瘤样本。
取S102中含有肿瘤干细胞的第一水凝胶，并制备含巨噬细胞的第二水凝胶。将含肿瘤干细胞的第一水凝胶和含巨噬细胞的第二水凝胶在同一个培养基中共同培养，并分隔开，以获得体外培养肿瘤样本。体外培养肿瘤样本包括含肿瘤干细胞的第一水凝胶和含巨噬细胞的第二水凝胶。通过将巨噬细胞和肿瘤干细胞共同培养，模拟人体的免疫微环境，并植入动物体内，由于巨噬细胞在肿瘤细胞分泌的细胞因子作用下会向M2型极化，而M2型巨噬细胞对肿瘤生长有促进作用，进一步缩短了成瘤时间，并减轻了临床实验的成本。
其中，上述制备含巨噬细胞的第二水凝胶的方式与含有肿瘤干细胞的第一水凝胶类似，在此不再赘述。
请参阅图2和图3，图2是本申请临床化疗药物筛选方法一实施例的流程示意图；图3是本申请临床化疗药物筛选方法一实施例的效果示意图。
S201：采集肿瘤组织样本。
S202：对肿瘤组织样本进行处理，并分选出肿瘤单细胞和巨噬细胞。
S203：将肿瘤单细胞置于充满第一水凝胶的环境以对肿瘤单细胞进行筛选，以获得肿瘤干细胞。
S204：将肿瘤干细胞和巨噬细胞建立共培养模型，以获得体外培养肿瘤样本。
步骤S201-S204与本申请提供的肿瘤体外培养方法一实施例的S101-S104步骤基本一直，此处不再赘述。
S205：将体外培养肿瘤样本植入动物体内，按临床给药途径给药。
用肿瘤穿刺针将体外培养肿瘤样本接种至实验小鼠背部皮下，伤口用医用胶粘合，按临床给药途径分别对实验小鼠进行给药处理。
S206：检测药效敏感性。
给药5-7天后，从各实验小鼠体内取出接种的体外培养肿瘤样本，对肿瘤细胞进行活力测试，即可得到对应药物的对肿瘤的抑制效果，从而完成药筛实验。具体给药天数可以是5天、6天或者7天。
由于肿瘤干细胞具有高度增殖和分化能力，通过在体外筛选出含肿瘤干细胞的水凝胶，并将含肿瘤干细胞的水凝胶植入动物体内，能够极大缩短成瘤时间，提高成瘤率，进而加快了药筛实验进程，为患者治疗争取时间。
下面将结合一个具体实施例的对本申请的临床化疗药物筛选方法进一步描述。
实施例：
S301：采集肿瘤组织样本。
本实施例中，肿瘤组织样本来自临床患者的手术样本，为乳腺瘤组织。
S302：对肿瘤组织样本进行处理，分选出肿瘤单细胞和巨噬细胞。
本实施例中，对肿瘤组织样本进行处理的具体步骤包括：
剔除非肿瘤组织和坏死组织，将肿瘤组织样本切成2mm3的小块。用PBS缓冲液冲洗并收集组织块，随后1000rpm离心5min去除上清液。向组织块中加入II型胶原酶，37℃摇床孵育4h。用40μm的尼龙网过滤，去除组织残块和细胞团，获得第一细胞悬浮液，1000rpm离心5min去除上清液，获得第一细胞沉淀。将第一细胞沉淀使用含1％胎牛血清(FBS)的PBS缓冲液重悬细胞并进行清洗，并再次1000rpm离心5min去除上清液，获得第二细胞沉淀。将第二细胞沉淀重悬于含1％胎牛血清的PBS缓冲液中，计数，并调整细胞密度至1×108/mL。
分选出肿瘤单细胞和巨噬细胞的具体步骤包括：
以15μl/107细胞的浓度向第二细胞悬浮液中分别加入肿瘤细胞分选磁珠(CD133)，4℃孵育30min。用20倍体积的PBS缓冲液清洗第二细胞悬浮液，随后1000rpm离心5分钟去除上清液，获得第三细胞沉淀。再以0.3ml/1×108细胞的浓度加入PBS缓冲液充分混悬细胞，随后加入肿瘤细胞二抗包被的超微磁珠，混匀后置8℃孵育15min，得到第三细胞悬浮液。将分离柱安装入磁场，加入0.5ml PBS缓冲液，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱。随后将第三细胞悬浮液加入分离柱中，在重力作用下自然流尽，收集流出的液体，1000rpm离心3分钟去除上清液，得到肿瘤单细胞，加入细胞培养液重悬，计数，调整细胞密度至5×105。
以上述同样的方法分选出巨噬细胞。
S303：将肿瘤单细胞置于充满第一水凝胶的环境以对肿瘤单细胞进行筛选，以获得肿瘤干细胞。
具体操作步骤为：
取肿瘤单细胞，并用PBS溶液清洗两次，与3％质量分数为低分子量透明质酸溶液、0.10％质量分数的高分子量透明质酸和3％质量分数海藻酸钠溶液混合，最终调整细胞密度至1x105个/ml，获得细胞材料混合溶液。其中，第七缓冲液可以是PBS缓冲液，或者其他用于清洗细胞的缓冲液。
将浓度为110mmol/L的CaCl2溶液和0.035％质量分数壳聚糖溶液混合加入培养皿中，通过1ml微量注射器将细胞材料混合溶液滴入培养皿中，交联5min，使得交联充分，得到含肿瘤单细胞的水凝胶。
交联后用移液枪吸出多余CaCl2溶液，并用生理盐水(NaCl溶液)反复清洗3次，显微镜下观察Ca离子是否充分去除干净，结果无亮点，Ca离子已去除干净。
将含有肿瘤单细胞的第一水凝胶加入低血清培养基，放入细胞培养箱培养48h，并筛选出肿瘤干细胞。
具体筛选方法：肿瘤干细胞在低血清培养基中培养形成漂浮细胞球。对含漂浮细胞球的水凝胶进行再次筛选，其中，水凝胶的弹性模量在8000-8400Pa范围内，低分子量透明质酸含量在2.0-3.0％范围内。
S304：将S303中筛选出的肿瘤干细胞和巨噬细胞建立共培养模型，以获得体外培养肿瘤样本。
将S302中分选得到的巨噬细胞置于充满水凝胶的环境中，制备得到含巨噬细胞的第二水凝胶，操作步骤与S303中大致相同，不同之处在于，海藻酸钠溶液浓度为1.2％。
将S303中的含肿瘤干细胞的第一水凝胶和含巨噬细胞的第二水凝胶放置于同一个RPMI-1640培养基中培养，并用消毒的丝网隔开，培养24h，以获得体外培养肿瘤样本，体外培养肿瘤样本包括含肿瘤干细胞的第一水凝胶和含巨噬细胞的第二水凝胶。
S305：将体外培养肿瘤样本植入动物体内，按临床给药途径给药。
收集体外培养肿瘤样本，用肿瘤穿刺针将体外培养肿瘤样本接种至实验小鼠背部皮下，伤口用医用胶粘合。设置给药组和空白对照组。
本实施例中，实验小鼠为4周龄的雌性裸小鼠，饲养于SPF级别动物房，实验开始前动物适应性饲养三天。
本实施例中，给药组有顺铂给药组(cisplatin)，紫杉醇给药组(paclitaxelliposome)以及多西他赛给药组(docetaxel)，按临床用药途径给药5天。空白对照组(control)不给药。
S306：检测药效敏感性。
给药5天后，从小鼠体内取出体外培养肿瘤样本，即取出含肿瘤干细胞的水凝胶，检测肿瘤细胞活力，计算出各给药组的肿瘤细胞活力增殖百分比(T/C％)，结果参见图4，图4为本申请临床化疗药物筛选方法一具体实施例的得到的药筛结果。
由图4可知，化疗药物多西他赛和顺铂对该患者均有好的抑制效果。
S307：与传统PDX模型得到的药筛结果对比分析。
传统PDX模型药筛过程为：
首先将相同临床肿瘤组织直接接种到免疫系统缺陷的小鼠身上，等待其成瘤(1-2个月)后，将该小鼠身上的肿瘤取出，接种到实验小鼠上(1-2个月)，成瘤后用于药筛实验。该结果有空白对照组(control)，顺铂给药组(cisplatin)，紫杉醇给药组(paclitaxelliposome)以及多西他赛给药组(docetaxel)，将以上药物分别施用于小鼠15天，观测期间小鼠肿瘤体积变化。药筛结果如图5，图5为传统PDX模型检测同一肿瘤组织得到的药筛结果。通过图5可知，化疗药物多西他赛和顺铂对该患者均有好的抑制效果。
综上所述，本实施例的药筛结果与传统PDX模型实验得到的药筛结果一致。但本实施例的实验时间较传统PDX模型实验比大幅缩短，能够加快患者药敏结果的获得，为患者治疗争取更多的时间。同时，实验所需的小鼠数量少于传统PDX模型所需的小鼠数量，成本费用更低，适合规模推广。
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效原理变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种肿瘤体外培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：
采集肿瘤组织样本；
对所述肿瘤组织样本进行处理,并分选出肿瘤单细胞和巨噬细胞；
将所述肿瘤单细胞置于充满第一水凝胶的环境以对所述肿瘤单细胞进行筛选，以获得肿瘤干细胞；
将所述肿瘤干细胞和所述巨噬细胞建立共培养模型，以获得体外培养肿瘤样本。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述将所述肿瘤干细胞和所述巨噬细胞建立共培养模型，以获得体外培养肿瘤样本具体包括：
取含有所述肿瘤干细胞的所述第一水凝胶，并制备含巨噬细胞的第二水凝胶，将含有所述肿瘤干细胞的所述第一水凝胶和所述含巨噬细胞的所述第二水凝胶在同一个培养基中共同培养，并隔开，以获得体外培养肿瘤样本，所述体外培养肿瘤样本包括含所述肿瘤干细胞的所述第一水凝胶和含所述巨噬细胞的所述第二水凝胶。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述对所述肿瘤组织样本进行处理包括：
将所述肿瘤组织样本切成多个组织块；
利用第一缓冲液冲洗所述组织块并离心去除上清液；
向所述组织块中加入胶原酶，在第一预设温度内摇床孵育第一预设时间；
过滤去除组织残块和细胞团，以获得第一细胞悬浮液；
对所述第一细胞悬浮液进行离心处理，以获得第一细胞沉淀；
利用第二缓冲液重悬并清洗所述第一细胞沉淀，离心去除上清液，以获得第二细胞沉淀；
将所述第二细胞沉淀重悬于第三缓冲液中，计数，并调整细胞密度至第一预值，以获得第二细胞悬浮液，其中，所述第二细胞悬浮液中包含所述肿瘤单细胞和所述巨噬细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分选出肿瘤单细胞和巨噬细胞具体包括：
向所述第二细胞悬浮液中分别加入肿瘤细胞分选磁珠或者巨噬细胞分选磁珠，在第二预设温度内孵育第二预设时间；
利用第四缓冲液清洗并离心去除上清液，以获得第三细胞沉淀；
加入第五缓冲液充分混悬所述第三细胞沉淀后，分别加入对应细胞种类的二抗包被的超微磁珠，混匀后置第三预设温度内孵育第三预设时间，得到第三细胞悬浮液；
将分离柱安装入磁场中，加入第六缓冲液，在重力作用下自然流尽，以预处理所述分离柱；
将所述第三细胞悬浮液加入所述分离柱中，在重力作用下自然流尽，收集流出的液体，离心去除上清液，加入细胞培养液重悬，计数并调整细胞密度至第二预值，得到所述肿瘤单细胞或者得到所述巨噬细胞。
5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述第一水凝胶和所述第二水凝胶由海藻酸钠、透明质酸、氯化钙和壳聚糖进行交联得到。
6.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述将所述肿瘤单细胞置于充满第一水凝胶的环境以对所述肿瘤单细胞进行筛选，以获得肿瘤干细胞具体包括：
将所述肿瘤单细胞用第七缓冲液清洗,并与第一质量分数的低分子量透明质酸溶液、第五质量分数的高分子量透明质酸溶液和第二质量分数的海藻酸钠溶液混合,调整细胞密度至第三预值，获得细胞材料混合溶液；
将第三浓度的氯化钙溶液和第四质量分数的壳聚糖溶液混合加入培养皿中，通过注射器将所述细胞材料混合溶液滴入所述培养皿中，进行交联反应，得到含有所述肿瘤单细胞的所述第一水凝胶；
交联反应完成后吸出多余的氯化钙溶液，并用生理盐水清洗，去除钙离子；
将含有所述肿瘤单细胞的所述第一水凝胶加入低血清培养基，放入细胞培养箱培养并筛选出含所述肿瘤干细胞的所述第一水凝胶。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，
所述第一质量分数为0.05％-0.15％
所述第二质量分数为2％-4％；
所述第三浓度为90mmol/L-110mmol/L；
所述第四质量分数为0.03％-0.04％；
所述第五质量分数为0.05％-0.15％。
8.一种临床化疗药物筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括:
采集肿瘤组织样本；
对所述肿瘤组织样本进行处理,并分选出肿瘤单细胞和巨噬细胞；
将所述肿瘤单细胞置于充满水凝胶的环境以对所述肿瘤单细胞进行筛选，以获得肿瘤干细胞；
将所述肿瘤干细胞和所述巨噬细胞建立共培养模型，以获得体外培养肿瘤样本；
将所述体外培养肿瘤样本植入动物体内，按临床给药途径给药；
检测药效敏感性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述将所述体外培养肿瘤样本植入动物体内包括：
用肿瘤穿刺针将所述体外培养肿瘤样本接种至实验小鼠背部皮下，伤口用医用胶粘合。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述检测药效敏感性具体包括：
从所述动物体内取出接种的所述体外培养肿瘤样本，对所述体外培养肿瘤样本进行活力测试。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190514 |