CN106661551A - 由淋巴细胞产生多谱系潜能细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明一般地涉及产生表现多谱系潜能的细胞的方法以及由此产生的细胞。更特别地，本发明涉及由CD4⁺单个核细胞、CD8⁺单个核细胞、CD25⁺单个核细胞、CD19⁺单个核细胞或CD20⁺单个核细胞产生哺乳动物干细胞的体外方法，以及由此产生的细胞。该发现现在促进了用于可靠和有效地产生用于多种临床和研究环境的多谱系潜能细胞(例如干细胞)群的手段的设计。这些用途尤其包括本发明多谱系潜能细胞的体外或体内定向分化以及通过施用本发明的多谱系潜能细胞或者由其得到的更加完全分化的细胞群来治疗性或预防性治疗一系列病症。还促进了基于体外的筛选系统的设计，所述系统用于测试这些细胞可能暴露的潜在治疗或培养方案的治疗效果和/或毒性。

Description

由淋巴细胞产生多谱系潜能细胞的方法

技术领域

本发明一般地涉及产生表现多谱系潜能(multilineage potential)的细胞的方法以及由此产生的细胞。更特别地，本发明涉及由CD4⁺单个核细胞、CD8⁺单个核细胞、CD25⁺单个核细胞、CD19⁺单个核细胞或CD20⁺单个核细胞产生哺乳动物干细胞的体外方法，以及由此产生的细胞。该发现现在促进了用于可靠和有效地产生用于多种临床和研究环境的多谱系潜能细胞(例如干细胞)群的手段(means)的设计。这些用途尤其包括本发明多谱系潜能细胞的体外或体内定向分化以及通过施用本发明的多谱系潜能细胞或者由其得到的更加完全分化的细胞群来治疗性或预防性治疗一系列病症。还促进了基于体外的筛选系统的设计，所述系统用于测试这些细胞可能暴露的潜在治疗或培养方案的治疗效果和/或毒性。

背景技术

在本说明书中由作者引用的出版物的书目细节在说明书结尾处按字母顺序收录。

本说明书中对任何现有出版物(或从其得到的信息)或任何已知事物的引用不是并且不应被视为承认或认可或以任何形式暗示该现有出版物(或从其得到的信息)或已知事物形成了本说明书涉及的领域中的公知常识的一部分。

在鉴定、分离和产生哺乳动物干细胞和祖细胞方面存在相当大的兴趣。提及的“干细胞”和“祖细胞”通常理解为包括多种细胞类型，包括能够产生任何细胞类型(包括生殖细胞)的全能细胞(totipotent cell)和能够产生更有限种类的成熟细胞谱系的多潜能前体细胞(pluripotent precursor cell)。一些前体细胞类型仍然更加分化，并且对应于能够产生特定细胞谱系细胞的前体。这些能力充当了器官和组织完全发育所必需的所有细胞分化和特化的基础。

对于体外再现该发育途径中选定方面，已经非常关注干细胞的分离和培养。例如，可以通过培养囊胚内细胞团衍生细胞并且频繁重复分离和传代培养来建立胚胎干细胞。在适当的条件下，可以维持体外培养，同时维持干细胞的正常核型和全能性(totipotency)。在促进干细胞沿着特定谱系分化方面也取得了显著进展。虽然已经从人中分离出了ES细胞，但是其在研究和治疗中的应用受到伦理考虑的阻碍。

成体组织也含有干细胞群，其可以自我复制并产生经历不可逆的终末分化的子细胞(Science，287，1442-1446，2000)。表征得最好的是造血干细胞及其后代，但是在大多数组织中鉴定到了干细胞，包括间充质细胞、神经元和造血细胞(Science，284，143-147，1999；Science，287，1433-1438，2000；J.Hepatol.，29，676-682，1998)。间充质干细胞被鉴定为骨髓中的粘附成纤维细胞样细胞，其具有成为间充质组织(包括骨、软骨、脂肪、肌肉和骨髓基质)的分化潜能(Science，284，143-147，1999)。间充质祖细胞具有与间充质干细胞相似的形态学和表型特征和分化潜能，并且已被报道为以极低频率存在于脐带血(Br.J.Haematol.，109，235-242，2000)、胎儿(Blood，98，2396-2402，2001)和成人外周血(Arthritis Res.，2，477-488，2000)中。

为此，分化总被认为是采取通过许多基因调节的干细胞的线性进展形式，以最终获得终末分化的体细胞的表型，所述体细胞的功能被明确限定并且其寿命受限。这样的细胞的实例包括红细胞、破骨细胞、胰岛细胞和血小板。认为干细胞分裂、自我更新并产生子细胞以定型(commitment)为特定的体细胞谱系(不对称分裂)。还认为在适当的环境条件下，干细胞可以对称分裂以产生干细胞库的倍增。

然而，事实上，干细胞的有效和可靠的分离、维持和特别是扩增仍然是难以捉摸的。因此，仍然需要开发有效和可重复地促进干细胞的分离、维持和分化的新手段。

在本发明之前的工作中，已经确定干细胞扩增并不必然需要凭借不对称干细胞分裂而发生，来提供干细胞更新和相关子细胞沿着特定谱系直至终末分化的线性分化。相反，可以通过成熟细胞转变回具有多谱系潜能的细胞来实现扩增。该发现现已促进了用于可靠和有效地产生表现出多谱系潜能的细胞的手段的开发，从而提供有价值的机制，通过所述机制，可以制备可用于临床和研究用途的干细胞群和/或从其分化的体细胞。

发明内容

在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”及变化形式如“包含”和“含有”将被理解为暗示包括所述整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。

如本文所使用的，术语“衍生自”应当被认为是指特定整体或整体的组来源于指定物种，但不一定直接从指定来源获得。此外，如本文所使用的，未用数量词限定的名词包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

本发明的一个方面涉及产生哺乳动物多谱系潜能细胞的方法，所述方法包括建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的单个核细胞(mononuclear cell)悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为表现多谱系分化潜能的细胞。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一方面，提供了产生哺乳动物多谱系潜能细胞的方法，所述方法包括建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的淋巴细胞悬液，所述淋巴细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单核细胞(monocytes cell)转变为表现多谱系分化潜能的细胞。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一方面，提供了产生哺乳动物多谱系潜能细胞的方法，所述方法包括建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的外周血衍生单核细胞悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为表现多谱系分化潜能的细胞。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一方面，提供了产生哺乳动物多谱系潜能细胞的方法，所述方法包括建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的单个核细胞悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为表现多谱系分化潜能的细胞，所述多谱系潜能细胞表现造血和/或间充质潜能。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一方面，提供了产生哺乳动物多谱系潜能细胞的方法，所述方法包括建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的单个核细胞悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-20％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为表现多谱系分化潜能的细胞。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一方面，提供了产生人多谱系潜能细胞的方法，所述方法包括建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的人外周血单个核细胞悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为表现多谱系分化潜能的细胞。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

在本发明的另一方面，提供了促进哺乳动物MLPC衍生细胞的产生的方法，所述方法包括：

(i)建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(a)10-40％v/v或其功能等同比例的单个核细胞悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(b)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(c)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为MLPC；以及任选地

(ii)使步骤(i)的MLPC与刺激接触以引导所述MLPC分化为MLPC衍生表型。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一个方面，提供了促进哺乳动物MLPC衍生细胞的产生的方法，所述方法包括：

(i)建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(a)10-40％v/v或其功能等同比例的单个核细胞悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19和CD20；

(b)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(c)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为MLPC；以及任选地

(ii)使步骤(i)的MLPC与刺激接触以引导所述MLPC分化为造血或间充质表型。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

本发明的另一个方面涉及治疗性和/或预防性治疗哺乳动物中的病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效数目的已根据本发明的方法产生的MLPC或者部分或完全分化的MLPC衍生细胞。

在另一方面，提供了治疗性和/或预防性治疗哺乳动物中特征是造血或间充质功能(functioning)异常的病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用：

(i)有效数目的已根据本发明的方法产生的造血干细胞或者部分或完全分化的造血干细胞衍生细胞；或

(ii)有效数目的已根据本发明的方法产生的间充质干细胞或者部分或完全分化的间充质干细胞衍生细胞。

本发明的另一方面涉及MLPC或MLPC衍生细胞群在制备用于在哺乳动物中治疗病症之药物中的用途，所述细胞已根据本发明的方法产生。

本发明的另一方面涉及MLPC或MLPC衍生细胞以及已根据本发明的方法产生的MLPC或MLPC衍生细胞。

附图说明

图1是在培养后第1天(A)和第4天(B)的CD4⁺PBMC的形态的照片表示。

图2是在培养后第1天(A)和第4天(B)的CD8⁺PBMC的形态的照片表示。

图3是在培养后第1天(A)和第4天(B)的CD19⁺PBMC的形态的照片表示。

图4是在培养后第1天(A)和第4天(B)的CD25⁺PBMC的形态的照片表示。

图5是在培养后第1天(A)和第4天(B)的CD20⁺PBMC的形态的照片表示。

图6是CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺、CD20⁺和CD25⁺淋巴细胞中(A)巢蛋白、GATA结合因子-4(GATA-4)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(B)窖蛋白的蛋白质表达的照片表示。

图7是CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺、CD20⁺和CD25⁺淋巴细胞中(A)肌动蛋白(对照)、突触泡蛋白(SYP)和神经生成素3(B)β烯醇化酶(ENO-3)、颗粒酶B(GZMB)和神经生长因子(NGF)的蛋白质表达的照片表示。

具体实施方式

本发明部分地基于对以下内容的确定：成体干细胞的扩增并不必然基于不对称干细胞分裂的发生以实现干细胞更新和沿着特定体细胞谱系的分化两者。特别地，多能干细胞可以来源于T淋巴细胞，其被诱导转变成多谱系潜能状态，随后在适当的刺激下进行对称分裂和分化。这一发现非常重要，因为本领域的一大难题就是还未找到在体外有效诱导干细胞更新和扩增的方法。因此，本发明提供了用于常规在体外产生哺乳动物干细胞的手段，其基于诱导成熟哺乳动物细胞去分化为表现出多谱系潜能的干细胞表型。因此，这些发现的体内和体外应用的潜力极其广泛，包括但不限于干细胞群的体外产生、本发明干细胞的体外或体内定向分化、基于其的治疗性或预防性治疗方案以及对本发明的细胞可能暴露的潜在治疗或培养方案的有效性和/或毒性的体外评估。

因此，本发明的一个方面涉及产生哺乳动物多谱系潜能细胞的方法，所述方法包括建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的单个核细胞悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为表现多谱系分化潜能的细胞。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为70％v/v或其功能等同比例。

提及的“单个核细胞(mononuclear cell)”应理解为是指具有单个核的细胞。在白细胞的情况下，这主要描述单核细胞(monocytes)和淋巴细胞。本发明涉及对于以下内容的确定：当根据本发明的方法培养时，表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20的单个核细胞可以被诱导转变为多谱系潜能状态。提及的表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20的细胞应理解为是指表达CD4和CD8抗原之一或两者或表达CD25或CD19或CD20的单个核细胞。这些细胞表面分子的表达可以是瞬时的(例如在T细胞分化期间胸腺细胞上的CD4和CD8的双阳性表达)或者是持续的。然而，应当理解，不管CD4/CD8表达是瞬时的还是持续的，本发明的方法涉及使用在初始培养时表达CD4和/或CD8的细胞。相应的含义应当理解为适用于表达CD25或CD19或CD20的细胞。也就是说，提及了在瞬时或持续基础上表达CD25或CD19或CD20的单个核细胞，只要在初始培养时这些细胞表达这些细胞表面标志物之一即可。

不将本发明限于任何一种理论或作用模式，CD4是存在于T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的表面上的糖蛋白。其为免疫球蛋白超家族的成员，并且包含四个免疫球蛋白结构域D₁至D₄。CD4也被另称为leu-3和T4。CD8主要在细胞毒T细胞的表面上表达，但也可在自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、皮质胸腺细胞和树突状细胞上发现。CD8采取由一对CD8链组成的二聚体形式，最常见的是CD8-α和CD8-β链。这两个链也都是免疫球蛋白超家族的成员。尽管CD8最常见表达为异二聚体，但在一些细胞上也表达同二聚体，例如CD8-α同二聚体。CD25是IL-2受体的α链。其为存在于活化T细胞、活化B细胞、一些胸腺细胞、骨髓前体和少突细胞上的I型跨膜蛋白，与CD122缔合以形成可以作为IL-2的高亲和力受体的异二聚体。尽管CD25已经被用作鉴定调节性T细胞的标志物，但已经发现人中的一部分静息记忆T细胞组成型地表达CD25。CD19基因编码与B淋巴细胞的抗原受体组装的细胞表面分子，以降低抗原受体依赖性刺激的阈值。其在滤泡树突状细胞和B细胞上表达。事实上，其存在于从发育期间的最早可识别的B谱系细胞到B细胞母细胞(B-cell blast)的B细胞上。然而，其在熟化为浆细胞时丧失。其主要作为B细胞共受体与CD21和CD81结合。激活后，CD19的胞质尾部变为磷酸化，这导致被Src家族激酶结合并募集PK-3激酶。不将本发明限于任何一种理论或作用模式，CD20是在所有B细胞(起始于前B阶段并且浓度逐渐增加直至熟化)的表面上表达的活化糖基化磷蛋白。

因此，在一个实施方案中，所述CD4⁺和/或CD8⁺单个核细胞是胸腺细胞、T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞或树突状细胞。

在另一个实施方案中，所述CD25⁺细胞是调节性T细胞或记忆T细胞。

在另一个实施方案中，所述CD19⁺细胞是任何分化阶段的B细胞。

为此，提及的“CD4”、“CD8”、“CD25”、“CD19”和“CD20”应理解为是指CD4、CD8、CD25、CD19和CD20的所有形式以及这些分子的功能突变体或多态形式(polymorphic form)，包括可能源自这些分子的mRNA的选择性剪接的异构形式(isomeric form)。提及的“CD4”、“CD8”、“CD25”、“CD19”和“CD20”也应理解为包括提及这些分子的所有形式，包括可在细胞表面上表达的所有前体、原蛋白或中间体形式。还应当理解为延伸至任何CD4、CD8、CD25、CD19或CD20细胞表面分子，无论是作为二聚体、多聚体还是融合蛋白存在。

如本文所详述的，CD4、CD8、CD25、CD19和CD20分子主要在淋巴细胞和NK细胞上广泛表达。提及的“淋巴细胞”应理解为是指任何淋巴细胞或NK细胞，不管其分化的发育阶段或相关CD分子的表达水平如何。

不将本发明限于任何一种理论或作用模式，胸腺细胞是存在于胸腺中的造血祖细胞。它们基于细胞表面标志物的表达被分为多个不同的熟化阶段。最早的胸腺细胞阶段是“双阴性”阶段(即CD4和CD8两者均阴性)，其也被描述为谱系阴性并且可以分为四个亚阶段。下一个主要阶段是“双阳性”阶段(即CD4和CD8两者均阳性)。熟化的最后阶段是单阳性阶段(CD8或CD8阳性)。

胸腺细胞来源于骨髓造血祖细胞。在进入胸腺后，祖细胞增殖以产生早期淋巴样祖细胞群。该步骤之后是产生从皮质-髓质连接处向胸腺囊迁移的CD4^-/CD8^-胸腺细胞。除增殖以外，CD4^-/CD8^-胸腺细胞群内还发生分化和T谱系定型。在这个阶段还发生可选谱系潜能(例如髓样、B和NK谱系潜能)的定型或丧失。在T谱系定型之后，胸腺细胞经历β-选择。^[6]T细胞识别外来抗原的能力由T细胞受体介导，其为能够识别由MHC呈递的短蛋白肽的表面蛋白。

与大多数基因(其在表达它们的每个细胞中具有稳定序列)不同，T细胞受体由一系列可选基因片段(alternative gene fragment)构成。为了产生功能性T细胞受体，双阴性胸腺细胞经历TCR基因重排。TCR重排发生于两个步骤中。首先，TCRβ链在T细胞发育的CD4^-/CD8^-阶段重排。TCRβ链与前Tα配对以产生前TCR。重排过程中的细胞缺点在于许多T细胞受体基因片段的组合是非功能性的。为了消除已经产生非功能性T细胞受体的胸腺细胞，只允许已经成功重排β链以产生功能性前TCR的细胞发育超过CD4^-/CD8^-阶段。不能产生功能性前TCR的细胞通过细胞凋亡消除。

在β选择后，胸腺细胞分化为CD4⁺CD8⁺双阳性细胞，其然后经历TCRα重排，得到完全组装的TCR。然而，这些T细胞受体中的许多由于不能结合MHC而仍然是非功能性的。因此，胸腺细胞发育的下一个主要阶段是阳性选择，其中只保留表达能够结合MHC的T细胞受体的那些胸腺细胞。

然后，阳性选择的双阳性胸腺细胞经历谱系定型，熟化为CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞。此后发生阴性选择以消除自身反应性胸腺细胞。一旦熟化过程完成，T细胞离开胸腺并进入外周血流。

关于调节性T细胞，它们是通过其与胸腺内细胞的相互作用在双阳性阶段而被选择的，其起始Foxp3的转录以成为T_reg细胞，但是其可能直到单阳性阶段才开始表达Foxp3，那时它们才是功能性T_reg。T_reg不表现出NKT或γδT细胞的受限TCR表达，而表现出比效应T细胞更大的TCR多样性，偏向于自身肽。T_reg选择的过程由与自身肽MHC复合物相互作用的亲和力决定。成为T_reg的选择作用是“Goldilocks”过程。具体地，接收非常强信号的T细胞将经历凋亡性死亡，而接收弱信号的细胞将存活并被选择成为效应细胞。如果T细胞接收中等信号，则其将成为调节性细胞。由于T细胞活化过程的随机性质，具有给定TCR的所有T细胞群将最终成为T_eff和T_reg的混合物，相对比例由T细胞对自身肽-MHC的亲和力决定。

自然杀伤(NK)细胞是T细胞的异质群，其共有T细胞和自然杀伤(NK)细胞的性质。这些细胞中的许多识别非多态性CD1d分子，其为结合自身和外来脂质和糖脂的抗原呈递分子。它们只占全部外周血T细胞的约0.1％。NK细胞共表达αβ T细胞受体(TCR)，但也表达通常与NK细胞缔合的多种分子标志物，如NK1.1。了解得最清楚的NK细胞与常规αβ T细胞的区别在于其TCR的多样性受限更多(‘不变’或‘1型’NK)。它们和其他CD1d限制的T细胞(‘2型’NK)识别由CD1d分子(抗原呈递分子CD1家族的成员)呈递的脂质和糖脂，而不是肽-MHC复合物呈递的脂质和糖脂。因此，已知NK细胞对于识别来自生物体(例如引起结核病的分枝杆菌)的糖脂很重要。

B细胞发育经历几个阶段，每个阶段代表了抗体基因座中的基因组含量的变化。抗体由两条相同的轻链和两条相同的重链构成，并且规定它们的基因存在于‘V’(可变)区和‘C’(恒定)区。重链的‘V’区有V、D和J三个区段，其在被称为VDJ重组的过程中随机重组以在每个单独B细胞中的免疫球蛋白中产生独特的可变结构域。轻链‘V’区发生类似的重排，只是仅涉及两个区段V和J。下表描述了B细胞发育的不同阶段的免疫球蛋白形成过程。

当B细胞在熟化过程中的任何步骤中失败，它将通过克隆缺失死亡。B细胞在骨髓中持续产生。像T细胞一样，未成熟B细胞在离开骨髓前要通过免疫系统测试自身反应性。在骨髓中产生中枢耐受性。B细胞受体与自身抗原结合太强烈的未成熟B细胞将不被允许熟化。如果发现B细胞对自身具有高反应性，可发生三种机制。

·克隆缺失：通常通过凋亡除去有特定的自身抗原特异性的B细胞。

·受体编辑：给予自身反应性B细胞的受体重排其构象的机会。该过程通过重组活化基因(Recombination activating gene)的持续表达发生。通过RAG的帮助，受体编辑涉及B细胞受体的轻链基因重排。如果受体编辑未能产生自体反应较小的受体，将会发生凋亡。

·无变应性(Anergy)：当与小的可溶性的弱交联自身抗原结合时，B细胞进入永久无响应的状态。

B细胞类型包括：

·血浆B细胞(也称为浆细胞(plasma cell或plasmocyte)和效应B细胞)是已经暴露于抗原并且产生和分泌大量抗体的大B细胞。这些细胞是寿命短暂的细胞，当诱导免疫应答的刺激剂消除时，其经历凋亡。这是由于停止了持续暴露于存活所需的各种集落刺激因子而发生的。

·记忆B细胞由对初次免疫应答期间遇到的抗原具有特异性的活化B细胞形成。这些细胞能够存活很长时间并且能够在第二次暴露于相同抗原后快速响应。

·B-1细胞表达比IgG更大量的IgM，并且其受体表现出多特异性，意味着其对许多不同抗原具有低亲和力。多特异性免疫球蛋白通常表现出对于其他免疫球蛋白、自身抗原和常见细菌多糖的偏好。

·B2细胞

·边缘区B细胞

·滤泡B细胞

·调节性B细胞是参与免疫调节的B细胞。Breg的子集存在于B-1和B-2细胞群两者中。两个描述得最详细的表型是人中的B10(CD5+CD1d+)子集和CD24+CD38+子集。

提及的CD4⁺和/或CD8⁺或CD25⁺“淋巴细胞”应理解为是指在发育的任何分化阶段的淋巴细胞，包括但不限于，双阳性和单阳性胸腺细胞和成熟T细胞，包括幼稚记忆和活化T细胞和NK细胞。仍然不以任何方式限制本发明，尽管大部分T细胞将表达αβ T细胞受体，但是已经确定γδ T细胞受体细胞的亚群也表达CD4或CD8。因此，任何淋巴细胞，无论是γδ还是αβ，只要其表达CD4或CD8之一或两者，就应当理解为落入本发明方法的范围之内。同样地，提及的CD19⁺淋巴细胞应理解为是指任何分化阶段的B细胞。

在另一个实施方案中，所述单个核细胞是淋巴细胞。

根据本实施方案，提供了产生哺乳动物多谱系潜能细胞的方法，所述方法包括建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的淋巴细胞悬液，所述淋巴细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单核细胞转变为表现多谱系分化潜能的细胞。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为70％v/v或其功能等同比例。

在一个实施方案中，所述淋巴细胞是双阳性的CD4⁺/CD8⁺胸腺细胞。

在另一个实施方案中，所述淋巴细胞是单阳性CD4⁺或CD8⁺T细胞。

在又一个实施方案中，所述淋巴细胞是CD8⁺NK细胞。

在又一个实施方案中，所述淋巴细胞是CD25⁺调节性T细胞。

在又一个实施方案中，所述淋巴细胞是CD19⁺B细胞。

在又一个实施方案中，所述单个核细胞是CD20⁺细胞。

应理解的是，本发明的单个核细胞可以来源于任何合适的组织，包括外周血和脾。

在又一个实施方案中，所述单个核细胞来源于外周血。

根据本实施方案，提供了产生哺乳动物多谱系潜能细胞的方法，所述方法包括建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的外周血衍生单个核细胞悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为表现多谱系分化潜能的细胞。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为70％v/v或其功能等同比例。

在一个实施方案中，所述单个核细胞是淋巴细胞。

在又一个实施方案中，所述淋巴细胞是单阳性CD4⁺或CD8⁺T细胞、CD8⁺NK细胞、CD25⁺T细胞、CD19⁺B细胞或CD20⁺B细胞。

如前文详述的，已经确定了成熟体细胞，特别是单个核细胞(如淋巴细胞)，可以被诱导转变成多谱系分化潜能的状态。因此，提及表现“多谱系分化潜能”或“多谱系潜能”的细胞应理解为是指表现出沿超过一种体细胞分化途径发育的潜能的细胞。例如，细胞可能能够产生一系列体细胞类型，这样的细胞通常被称为多能或多潜能。这些细胞表现为定型至比全能细胞受更多限制的谱系范围，后者是可以在固有可能的任何分化方向(包括全部体细胞谱系和配子)发育的细胞。不将本发明限于任何一种理论或作用模式，在干细胞来自出生后组织的情况下，其也经常被称为“成体干细胞”。那些经典称为“祖”细胞或“前体”细胞的许多细胞也可落入“多谱系分化潜能”的定义范围内，这基于在适当的刺激条件下，其可以产生超过一种体细胞谱系的细胞。在通过本发明方法产生的细胞方面提及“干细胞”的情况下，这应理解为是指表现出本文定义的多谱系分化潜能的细胞。

在本发明的一个实施方案中，已经确定可以诱导CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞转变为多谱系分化潜能表型，其表现为沿着多种不同谱系(例如造血谱系或间充质谱系)分化的潜能。例如，在适当的刺激下，本发明多潜能细胞可以定向向下分化为造血谱系，包括单核造血细胞(例如淋巴细胞或单核细胞)、多形核造血细胞(例如嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞)、红细胞或血小板，或沿着间充质谱系分化，如结缔组织，如骨、软骨、平滑肌、肌腱、韧带、基质(stroma)、骨髓、真皮和脂肪。在适当刺激的存在下，这些细胞也可以被诱导沿其他谱系分化，例如神经元谱系。还应当理解，虽然根据本发明方法产生的所有多谱系潜能细胞可以来源于许多不同的起始群中的一种，但是它们都表现出沿着多个谱系分化的潜力。不将本发明限于任何一种理论或作用模式，由本发明的CD4、CD8、CD25、CD19或CD20起始细胞产生的多谱系细胞表现出独特的表型谱。虽然所有这些细胞均表现出多能性，但是这些细胞在其倾向方面可能表现出功能差异(如果有的话)，以在不存在特定细胞外刺激的情况下沿着特定谱系分化。然而，在提供特定的刺激时，分化可以定向为沿着任何期望的谱系。

因此，本发明的一个实施方案涉及产生哺乳动物多谱系潜能细胞的方法，所述方法包括建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的单个核细胞悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为表现多谱系分化潜能的细胞，所述多谱系潜能细胞表现造血和/或间充质潜能。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为70％v/v或其功能等同比例。

在另一个实施方案中，所述CD4⁺衍生多谱系潜能细胞表达CD44⁺和CD45⁺。

在又一个实施方案中，所述CD8⁺衍生多谱系潜能细胞表达CD45⁺和CD47⁺。

在又一个实施方案中，所述CD25⁺衍生多谱系潜能细胞表达CD23⁺。

在又一个实施方案中，所述CD19⁺衍生多谱系潜能细胞表达CD44⁺和CD45⁺。

更优选地，所述造血潜能是分化成淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞或血小板的潜能，并且所述间充质潜能是分化成骨、软骨、平滑肌、肌腱、韧带、基质、骨髓、真皮或脂肪的细胞的潜能。

本文使用的术语“哺乳动物”和“哺乳类”包括人、灵长类、家畜动物(例如马、牛、羊、猪、驴)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠)、伴侣动物(例如狗、猫)和圈养野生动物(例如袋鼠、鹿、狐狸)。优选地，哺乳动物是人或实验室试验动物。甚至更优选地，哺乳动物是人。

提及诱导CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞(例如单核细胞)“转变”成多谱系潜能表型应理解为是指诱导基因、形态和/或功能变化，所述变化是体细胞表型改变为本文所定义类型的多谱系潜能表型所需要的。

在诱导CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞体外去分化为多谱系潜能细胞方面，这可以在小规模的体外组织培养或大规模的生物反应器生产的情况下实现。

如前文详述的，已经确定了CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞转变成多谱系潜能细胞可以通过在体外使所述细胞经受独特的细胞培养方案来实现。具体地，将单个核细胞的起始样品与白蛋白和细胞培养基以特定比例一起培养。这是本发明方法的一个特别的优点，因为不像大多数细胞培养系统，本发明培养物的建立不是基于培养特定浓度的细胞(这需要确定细胞数目并适当调节细胞浓度)，而是基于围绕体积比例的培养物而设计，不论该体积内细胞的实际数目如何。这使得本发明方法非常简单，并且可基于CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞的任何可用或方便操作的起始体积来常规进行。

因此，本发明的体外细胞培养系统围绕CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞悬液的起始体积来建立。提及的“悬液”应理解为是指非附着细胞的样品。这些细胞可以被包含在维持细胞存活状态的任何适当的介质中，如等渗溶液(例如PBS、盐水、Hank氏平衡盐溶液或其他平衡盐溶液变化形式)、细胞培养基、体液(例如血清)等。本发明细胞可以用其他方法(例如正或负磁珠分离)进行富集或处理，根据所使用方法的性质，这将导致CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞的最终悬液被包含在各种不同等渗溶液中的任一种中。不论获得的细胞的实际浓度如何，任何适当的体积的该悬液可用于建立本发明的培养物。这种体积将基于试图使用的培养系统的类型来选择。例如，如果培养在基于烧瓶的系统、基于包的系统或基于滚瓶的系统中，可能的是较小体积(多至约1升)将形成细胞培养物的全部。然而，在生物反应器的情况下，可能考虑显著更大体积的细胞培养物，因此可以使用较大的起始体积。确定合适的最终细胞培养体积以用于所使用的特定细胞培养系统情况完全在本领域技术人员的技术范围之内。

在初始建立本发明的细胞培养物方面，将经受培养的细胞培养物的最终体积包含约15％v/v的CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞悬液，连同约15％v/v的5％-85％白蛋白溶液和约70％v/v的细胞培养基。如本文所详述的，提及的这些百分比数值是近似的，其近似程度为：与这些特定百分比的一些偏差是可接受的，并且提供了功能等同比例。根据示例性培养系统的非常简单和常规的性质来确定与上述百分比数值的何种偏差程度是可行完全在本领域技术人员的技术范围之内。例如，预期约20％至40％v/v的单个核细胞悬液和5-40％的5％-85％白蛋白溶液可以是有效的，特别是10％-40％、15％-40％、20％-40％或约15％。对于本发明白蛋白溶液，约4％至90％，或5％-86％，或优选5％-7％的溶液可以是同样有效的。可以使用30％-60％的细胞培养基，例如30％-40％。

不以任何方式限制本发明，已经确定跨越很宽范围的白蛋白浓度在本发明的方法中有效。因此，可以使用5％-85％、5％-80％、5％-75％、5％-70％、5％-65％、5％-60％、5％-50％、5％-45％、5％-40％、5％-35％、5％-30％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％的浓度范围。在一个实施方案中，所述浓度为5％-20％。

因此，本发明的一个实施方案涉及产生哺乳动物多谱系潜能细胞的方法，所述方法包括建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(i)20-40％v/v或其功能等同比例的单个核细胞悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)20-40％v/v或其功能等同比例的约5％-20％白蛋白溶液；和

(iii)30-50％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为表现多谱系分化潜能的细胞。

在一个实施方案中，所述CD4⁺或CD8⁺单个核细胞悬液为30％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30％v/v或其功能等同比例。

在另一个实施方案中，所述CD19⁺单个核细胞悬液为40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以20％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为40％v/v或其功能等同比例。

在又一个实施方案中，所述CD25⁺单个核细胞悬液为20％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为40％v/v或其功能等同比例。

在又一个实施方案中，所述CD20⁺单个核细胞悬液为20％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为40％v/v或其功能等同比例。

在又一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为70％v/v或其功能等同比例。

在另一个实施方案中，所述白蛋白溶液的浓度为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。

不应将本发明限制于提及严格遵守本文所详述(尤其是与上述实施方案有关)的百分比数值，而是在其范围内包括保持本发明的功能并且可以由本领域技术人员常规和容易地评估的这些百分比的变化。

如前文详述的，起始细胞悬液中CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞的浓度可以是任意细胞数目。无论细胞数目是相对低还是相对高，本发明的重要方面在于，起始细胞悬液为起始细胞培养物的总体积的15-40％v/v，而不论该悬液内细胞的浓度如何。然而，在一个优选的实施方案中，尽管起始细胞浓度并不存在下限或上限，但是建议细胞数目不应过高而使得培养期间培养容器中没有足够的表面积用于这些单个核细胞附着。虽然在起始细胞浓度过高使得没有足够表面积用于这些细胞附着的情况下所述方法也能成功产生表现多谱系分化潜能的细胞，但是可简单地观察到不能附着的那些细胞没有去分化成干细胞，因此虽然所述方法是有效的，但不是最佳效率的。因此，在这方面，从效率最大化观点来看，可能希望确保这样的细胞浓度，其使得起始细胞培养物部分在所有存在的细胞均能够附着于选择用于培养的特定组织培养容器的环境下培养。例如，在使用培养袋容器时，不超过10⁶个细胞/ml的细胞浓度是合适的。

在使用白蛋白溶液的方面，6％的白蛋白溶液通常是可商购的，但另外也可以由任何合适的等渗溶液(例如盐水)构成。应理解的是，提及的“白蛋白”意指在蒸馏水和半饱和硫酸铵溶液中可溶，但是在完全饱和的硫酸铵溶液中不可溶的球状蛋白的组。例如，血清白蛋白(其为血清的主要蛋白质)可用于本发明方法的上下文。然而，应理解的是，任何白蛋白分子均可以使用，例如乳白蛋白或卵白蛋白。还应理解的是，白蛋白的任何合成重组或衍生物形式也可用在本发明方法中。本领域技术人员将理解，通过例如占本发明起始培养物体积的15％v/v的比例使用6％白蛋白溶液，实现了0.9％白蛋白的有效浓度。

起始培养体积的其余部分由细胞培养基构成，其优选地占起始细胞培养物体积的30-80％。提及的“细胞培养基”应理解为是指被设计来支持哺乳动物细胞生长的液体或凝胶，特别是支持干细胞培养的培养基。为此目的，可以使用任何合适的细胞培养基，包括基本培养基(其提供用于细胞生长所需的最低营养物)，或富集培养基(其可以包含额外营养物以促进哺乳动物细胞存活和生长的维持)。适合使用的培养基的实例包括DMEM和RPMI。也可以使用补充的基本培养基，其包含额外选择的试剂，例如氨基酸或糖以促进细胞存活和生长的维持。培养基也可以进一步补充任何其他合适的试剂，例如抗生素。在另一个实例中，细胞培养基补充有胰岛素以进一步支持细胞存活和生长。但是应当理解的是，提及的30-80％v/v的细胞培养基是独立的要求，其不受起始CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞或白蛋白悬浮于其中的溶液的性质影响，无论其是等渗溶液如盐水还是基本培养基。事实上本发明的一个特别的优点在于，不论在引入到本发明的培养系统中之前单个核细胞初始悬浮于其中或白蛋白溶解于其中的溶液的性质如何，对于作为起始细胞培养群的总体积百分比的30-80％v/v细胞培养基的要求保持不变。

在一个实施方案中，所述细胞培养物还包含10mg/L的胰岛素。

如前文详述的，本发明方法是基于将CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞的群与细胞培养基和5％-85％白蛋白溶液以特定比例一起培养，以诱导单个核细胞去分化为间充质/造血干细胞表型。将所述CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞在体外培养一定时间，直到实现本发明干细胞表型。在一个实施方案中，已经确定3-8天，特别是4-7天的培养期适合于产生本发明干细胞。将理解，对体外培养细胞取样以确定必要的去分化程度是否发生完全在本领域技术人员的技术范围之内。确定温度和CO₂百分比两者方面最合适的条件来培养细胞也完全在本领域技术人员的技术范围之内。不将本发明限于任何一种理论或作用模式，已经确定在培养人CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞时，4至5天的孵育是特别合适的。培养可以在认为合适的条件下进行，以在数天的培养期中维持良好的细胞存活和生长。为此目的，将理解，建立适当的细胞培养条件对本领域技术人员来说是常规程序。

因此，在一个实施方案中，提供了产生人多谱系潜能细胞的方法，所述方法包括建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的人外周血单个核细胞悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为表现多谱系分化潜能的细胞。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为70％v/v或其功能等同比例。

在一个实施方案中，所述白蛋白溶液为5％-20％，优选5％-15％。

在一个实施方案中，所述细胞培养物还包含10mg/L的人胰岛素或其功能性片段或等同物。

在另一个实施方案中，所述细胞培养4至7天，特别是4至5天或3至6天。

如上文详述的，本发明是在体外对CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞的分离群进行的。为此，应理解的是，本发明细胞可以是从个体(例如，作为治疗对象的个体)新鲜分离的，或者可以来自非新鲜的来源，例如来自细胞的培养物(例如，其中扩增细胞数目和/或培养细胞以使得其可接受分化信号)或细胞的冷冻储备物(例如，已建立的T细胞系)，其可以是在更早时间点从个体或另一来源分离的。还应理解的是，本发明细胞可以已经经历一些其他形式的处理或操作，例如但不限于富集或纯化、细胞周期状态的修改或细胞系的形成。因此，本发明细胞可以是原代细胞或次生细胞。原代细胞是从个体中分离的细胞。次生细胞是在其分离后，在实施本发明方法之前，已经经历了一些形式的体外操作(例如制备细胞系)的细胞。还应理解的是，起始CD4、CD8、CD25、CD19或CD20单个核细胞群可以是相对纯的，或者其可以是异质细胞群(例如外周血细胞群)的一部分。这将在下文进一步讨论。

在一个相关方面，应理解的是，本发明的方法也可适于诱导通过本发明方法产生的多谱系潜能细胞(MLPC)分化成更成熟的表型。例如，在本发明的一个实施方案的情况下，造血干细胞产生所有血细胞(例如，红细胞、血小板、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞)，而间充质干细胞产生各种各样的结缔组织，包括骨、软骨、平滑肌、肌腱、韧带、基质、骨髓、真皮和脂肪。在本发明方法产生具有造血和间充质潜能两者的情况下，本发明方法可适于在体外或在体内包括进一步的步骤，其将本发明MLPC群引入到实现沿目的谱系部分或完全分化所需的特定刺激。

还应当理解，虽然该另外的定向分化事件可便于在体外进行，但是其也可以在体内实现。这将在下文中更详细地讨论。然而，特定的原位环境也可方便地提供引导MLPC沿着特定谱系分化所需的信号范围。

因此，提及的“MLPC衍生细胞”应理解为是指比MLPC更加分化并且可以由所述MLPC产生的细胞类型。这些细胞将对应于已知的MLPC所产生谱系的细胞，例如，在造血干细胞情况下的血细胞和在间充质干细胞情况下的结缔组织。应理解的是，本发明MLPC衍生细胞可以是更加分化的祖细胞，其不可逆地定型为沿着细胞谱系的特定亚组分化，例如造血干细胞或间充质干细胞，或者其可对应于特定细胞谱系的部分或最终分化形式，例如红细胞、淋巴细胞等。因此，应理解的是，落入本发明这个方面的范围之内的细胞可以处于发育的MLPC之后的任何分化阶段。如前面详述的，这种进一步的分化可以组成性地(constitutively)发生或者可能需要一种或更多种另外的信号。这些信号可以在体外提供，例如在小规模体外组织培养或大规模生物反应器生产的情况下，或者在体内微环境中，例如如果将前体细胞移植到合适的组织微环境中以使其进一步分化。

因此，在本发明的一个相关方面中，提供了促进哺乳动物MLPC衍生细胞的产生的方法，所述方法包括：

(i)建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(a)10-40％v/v或其功能等同比例的单个核细胞悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(b)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(c)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为MLPC；以及任选地

(ii)使步骤(i)的MLPC与刺激接触以引导所述MLPC分化为MLPC衍生表型。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为70％v/v或其功能等同比例。

在一个实施方案中，所述CD4⁺和/或CD8⁺单个核细胞是淋巴细胞，更优选外周血衍生CD4或CD8单阳性T细胞。

在又一个实施方案中，所述淋巴细胞是CD8⁺NK细胞。

在又一个实施方案中，所述淋巴细胞是CD25⁺调节性T细胞。

在又一个实施方案中，所述淋巴细胞是CD19⁺B细胞。

在又一个实施方案中，所述淋巴细胞是CD20⁺B细胞。

在另一个实施方案中，所述白蛋白为5％-20％。

在又一个实施方案中，所述MLPC表现出造血潜能和间充质潜能两者。

根据该实施方案，因此优选地提供了促进哺乳动物MLPC衍生细胞的产生的方法，所述方法包括：

(i)建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(a)10-40％v/v或其功能等同比例的单个核细胞悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(b)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(c)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为MLPC；以及任选地

(ii)使步骤(i)的MLPC与刺激接触以引导所述MLPC分化为造血或间充质表型。

在一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一个实施方案中，所述单个核细胞悬液为15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为70％v/v或其功能等同比例。

还更优选的是所述造血干细胞衍生细胞是红细胞、血小板、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞。

在另一个优选的实施方案中，所述间充质干细胞衍生细胞是结缔组织细胞，例如骨、软骨、平滑肌、肌腱、韧带、基质、骨髓、真皮或脂肪的细胞。

在本发明的这一方面的情况下，应理解的是，可产生细胞聚集物如组织(例如，肌肉或皮组织)或细胞悬液(例如，造血细胞悬液)两者。

如上文详述的，本发明是基于以下的确定：可以从CD4、CD18、CD25、CD19或CD20单个核细胞产生干细胞。为此目的，应理解，这可以在引导起始群的所有CD4、CD8、CD25、CD19和CD20细胞转变的情况下或者在引导这些体细胞起始群的亚群转变的情况下实现。这可能取决于例如起始细胞群的纯度和/或异质性。另外，本发明的培养系统可以导致产生异质细胞群。例如，如果并非起始群的所有细胞都转变成MLPC表型或者如果并非所有MLPC细胞随后都被诱导分化成更成熟和同质的表型，这就可能发生。情况是，由于并非起始群的所有细胞可必然地分化成MLPC表型或MLPC衍生表型，并且获得的MLPC衍生细胞输出本身可以是异质的，所以本发明方法可能需要使用筛选和选择步骤来鉴定和分离表现出期望表型的细胞。鉴定方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于：

(i)细胞谱系特异性结构的检测。

根据待鉴定的结构类型，可以例如通过光学显微术、荧光亲和标记、荧光显微术或电子显微术来进行细胞谱系特异性结构的检测。光学显微术可用于检测形态特征，例如淋巴细胞vs多形核细胞vs红细胞核特征或多核骨骼肌细胞。在另一个实例中，可以鉴定直径为约10-30μm，具有未成熟心肌细胞的圆形或棒状形态特征的单个核细胞。电子显微术可用于检测的结构如肌节、X-带、Z-体、闰盘、间隙连接或桥粒。荧光亲和标记和荧光显微术可用于通过与所讨论的结构特异性结合并且直接或间接地与荧光团缀合的荧光标记的分子(通常是抗体)来检测细胞谱系特异性结构。可以用适当的检测和计算系统中来执行这样的结构的自动化定量。

(ii)细胞谱系特异性蛋白质的检测。

细胞谱系特异性蛋白质(例如细胞表面蛋白质或细胞内蛋白质)的检测可例如通过荧光亲和标记和荧光显微术方便地实现。特异性蛋白质可以在全细胞和组织中检测。简单地说，将荧光标记的抗体在固定细胞上孵育，以检测特异性心脏标志物。或者，可以使用诸如Western免疫印迹或杂交微阵列(“蛋白质芯片”)技术。可以通过这种方法检测的蛋白质可以是特定细胞群中任何特征性的蛋白质。例如，可以通过一种或更多种细胞表面分子表达的存在或不存在来区分前体/祖细胞类型的类别。在这方面，这种方法可用于基于任何一种或更多种分子的表达通过阳性或阴性选择步骤来鉴定细胞类型。更成熟细胞通常可以凭借其在文献中良好确定的一系列特异性细胞表面或细胞内蛋白质的表达来表征。例如，所有造血细胞类型的分化阶段在细胞表面分子的表达模式方面已经被充分确定。同样地，肌肉细胞和其他间充质衍生细胞类型在发育的各个分化阶段的蛋白质表达谱方面也已经进行了良好记录。为此，本发明的MLPC通常表达一系列本文示例的细胞表面标志物，这些表面标志物是一般单个核细胞干细胞，间充质干细胞、造血干细胞、多谱系潜能细胞和神经元干细胞特征性的细胞表面标志物。

(iii)细胞谱系特异性RNA或DNA的检测。

这种方法优选使用RT-PCR或实时(qRT-PCR)实现。或者，其他可以使用的方法包括杂交微阵列(“RNA芯片”)或Northern印迹或Southern印迹。RT-PCR可以用来检测基本上编码任何蛋白质的特定RNA，如在上文第(ii)点中详述的蛋白质，或者被分泌或另外不方便通过第(ii)点中详述的方法检测的蛋白质。例如，在早期B细胞分化的情况下，在重排免疫球蛋白分子的细胞表面表达之前，可以在DNA水平检测到免疫球蛋白基因重排。

(iv)细胞谱系特异性功能活性的检测。

虽然一般认为在其功能方面分析细胞群不是如第(i)至(iii)点那样方便的筛选方法，但是在一些情况下可能并非如此。例如，在试图产生心肌细胞的情况下，可以在光学显微镜下简单地筛选心脏特异性的机械收缩。

应当理解的是，在表征通过使用本发明方法获得的细胞群的情况下，可以使用任何一种或更多种上文详述的技术。

在根据本发明方法培养之前针对CD4、CD8、CD25、CD19或CD20淋巴细胞富集成熟体细胞群或者在分离或富集由其得到的MLPC细胞群方面，可以再次使用各种公知的技术。如上文详述的，抗体和其他细胞表面结合分子(例如凝集素)对于鉴定与特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标志物特别有用。所述抗体可以附着到固体支持物以允许进行分离。然而，其他细胞分离技术包括基于物理特性的差异(密度梯度离心和逆流离心淘析)和活体染色性质的差异(线粒体结合染料若丹明123和DNA结合染料Hoechst 33342)的那些。

分离方法可包括使用抗体或凝集素包被的磁珠的磁分离、亲和色谱、利用附着于固体基质的抗体的“淘选”或任何其他方便的技术。提供特别精确分离的其他技术包括荧光激活细胞分选术，这种技术也适于基于形态特征的细胞分离，所述形态特征可通过前向vs侧向光散射辨别。鉴于这些技术可适于阳性选择或阴性选择的情况，另外的阴性选择技术包括但不限于定点施用溶细胞剂、凋亡剂或其他毒剂。这可以最方便地通过将这样的试剂偶联至单克隆抗体以促进其定向递送来实现。在另一个实例中，用抗体调理然后施用补体可实现相同结果。

这些技术可以作为单步骤或多步骤方案进行，以实现期望水平的纯化或富集。

由于本发明的细胞和组织的增殖能力对于给定用途如修复受损组织或测试治疗性治疗方案的效果是必不可少的，所以可能期望筛选表现出充足水平的增殖能力的细胞。可以通过多种标准技术进行细胞增殖能力的确定。优选地，通过³[H]-胸苷或¹²⁵I-碘代脱氧尿苷摄取测定实现增殖的确定。或者，使用代谢染料如XTT的比色测定或直接细胞计数可用于确定增殖能力。也可通过细胞周期标志物如Ki-67的表达评估增殖能力。

如上文详述的，本发明的方法在体外进行。在体外技术方面，现因此提供了常规和可靠地小规模或大规模生产MLPC或MLPC衍生细胞的手段。在小规模生产方面，其可以在例如组织培养瓶或袋中实现，这可特别适于针对给定个体并在特定条件情况下生产细胞群。在大规模生产方面，本发明方法提供了满足大规模需求的可行手段。根据本发明方法实现大规模生产的一种手段是通过使用生物反应器。

生物反应器被设计为提供模拟体内营养物浓度和速率以受控的浓度和速率递送培养基和氧的培养过程。生物反应器已经市售了许多年，并且采用了多种类型的培养技术。在用于哺乳动物细胞培养的不同生物反应器中，大部分已被设计为允许用于生产单一细胞类型的高密度培养物，因此可用于本发明。这些高密度系统的典型应用是产生作为终产物的由细胞产生的条件培养基。对于例如单克隆抗体的杂交瘤生产和包装细胞系用于病毒载体生产正是如此。然而，这些应用不同于其中治疗性终产物是所收获的细胞本身的应用，如在本发明中那样。

一旦运行，生物反应器提供自动调节的培养基流动、氧气递送以及温度和pH的控制，并且其通常允许生产大量的细胞。因此，生物反应器节省劳动并使过程中污染的可能性最小化，并且最精密的生物反应器允许涉及最少的人工劳动需求和开放处理步骤的建立、生长、选择和收获过程。这样的生物反应器最佳地设计成用于均质细胞混合物或聚集的细胞群，如本发明所构思的。用于本发明的合适的生物反应器包括但不限于在以下中描述的那些：美国专利No.5,763,194、美国专利No.5,985,653和6,238,908、美国专利No.5,512,480、美国专利No.5,459,069、5,763,266、5,888,807和5,688,687。

对于任何大体积、长期的细胞培养(例如其中期望MLPC体外定向分化的)，需要控制几个基本的参数。培养物必须提供有允许细胞生存力维持、增殖和分化(假设在几个独立的分化培养物和条件的情况下)以及最终细胞培养物保存的培养基。通常，通过生物反应器中的泵浦机构向细胞递送各种培养基，定期进料和更换培养基。更换过程允许从培养物除去副产物。生长的细胞或组织也需要氧源。不同的细胞类型可具有不同的氧需求。因此，用于给细胞供氧的柔性且可调节的装置是期望的部件。

根据具体的培养，培养室中细胞群的均匀分布和培养基的供应可以为重要的过程控制。这种控制通常通过使用悬浮培养设计来实现，在细胞-细胞相互作用不重要的情况下，其可能有效。悬浮培养系统的实例包括各种罐式反应器设计和可透气塑料袋。对于不要求组装成三维结构或需要接近基质或饲养层的细胞(例如大多数血细胞前体或成熟血细胞)，可以使用这样的悬浮设计。

在培养过程结束时有效收集细胞是有效细胞培养系统的重要特征。生产细胞作为产物的一种方法是在限定空间中培养细胞，不用物理屏障来回收，使得细胞产物通过简单洗脱就产生易控制的、体积浓缩的细胞，其适于在设计用于所述目的的商业、封闭系统细胞洗涤器中进行最终洗涤。最佳地，系统允许加入具有或没有防腐剂的可药用载体或细胞储存化合物，以及提供到合适的无菌包装中的有效收获。最佳地，可完成收获和包装过程而不破坏培养室的流体路径的无菌屏障。

对于任何细胞培养过程，一个主要的担心是无菌性。当产品细胞要向患者移植时(通常在患者患病或免疫功能低下之时)，必须不存在微生物。

本发明的开发现已促进了用于治疗或预防性治疗对象的手段的开发。特别是，在本发明的优选实施方案的情况下，基于向这些对象施用通常已根据本发明方法产生的MLPC或者部分或完全分化的MLPC衍生细胞(例如，造血或间充质衍生细胞)，提供了治疗表现出不足、不充分或异常造血或间充质细胞功能的患者的手段。

所述方法可应用于广泛范围的病症，包括但不限于造血疾病、循环疾病、中风、心肌梗塞、高血压骨疾病、II型糖尿病、不育、损坏或形态异常的软骨或其他组织、疝修复、利用支持网和生物支架的盆底脱垂手术、用于其他肌肉骨骼疾病的细胞疗法，以及在衰老、手术或创伤的情况下替换有缺陷的支持组织。

提及特征为“造血或间充质细胞功能异常，，的病症应理解为是指至少部分地由于造血或间充质谱系细胞的功能或发育方面的缺陷的或不需的或不期望的结果造成的任何病症。这可对应于均质或异质细胞群。提及“造血干细胞”、“造血干细胞衍生细胞”、“间充质干细胞”或“间充质干细胞衍生细胞”应理解为具有上文所定义的相同含义。本发明缺陷应理解为是指细胞的不正常的或其他方面不期望的任何结构或功能特征，包括这些细胞的产生数目不足。

因此，本发明的另一个方面涉及治疗性和/或预防性治疗哺乳动物的病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效数目的已根据本发明的方法产生的MLPC或者部分或完全分化的MLPC衍生细胞。

更特别地，提供了治疗性和/或预防性治疗哺乳动物中特征为造血或间充质功能异常的病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用：

(i)有效数目的已根据本发明方法产生的造血干细胞或者部分或完全分化的造血干细胞衍生细胞；或

(ii)有效数目的已根据本发明方法产生的间充质干细胞或者部分或完全分化的间充质干细胞衍生细胞。

提及向个体“施用”有效数目的本发明细胞应理解为是指向哺乳动物引入根据本发明方法产生的离体细胞群。提及“施用”，“试剂”应理解为向哺乳动物中引入有效量的一种或更多种刺激，所述刺激作用于引入体内的MLPC以产生MLPC衍生细胞。

根据本发明，本发明MLPC或MLPC衍生细胞优选为自体细胞，所述自体细胞被鉴定、分离和/或离体分化成所需的表型，并且移植回最初获得它们的个体。然而，应理解的是，本发明仍然延伸到使用从任何其他合适来源得到的细胞，其中所述细胞与治疗对象个体呈现相同的主要组织相容性谱。因此，这样的细胞有效地为自体的，因为它们不会导致通常与移植呈现外来MHC谱的细胞相关联的组织相容性问题。这样的细胞应理解为落入“自体”的定义内。例如，在某些情况下，本发明细胞分离自遗传学上的同卵双生体(identical twin)可能是合乎期望的、必要的或具有实际意义的。所述细胞也可以已被工程化以表现出期望的主要组织相容性谱。使用这样的细胞克服了在组织和器官移植物的情况下固有遇到的困难。但是，在分离或产生自体细胞不可能或不可行的情况下，可能有必要使用同种异体(allogeneic)干细胞。“同种异体”细胞是分离自与被治疗对象相同的物种但是表现出不同MHC谱的那些。虽然在治疗剂的情况下使用这样的细胞可能必须使用免疫抑制处理，但是通过使用与被治疗对象呈现出类似MHC谱的细胞(例如由亲戚如兄弟姐妹、父母或子女分离/产生的细胞群)，该问题可被最小化。本发明还应理解为延伸到异种移植。即，根据本发明方法产生并且引入到患者中的细胞分离自被治疗对象以外物种的哺乳动物物种。

不将本发明限于任何一种理论或作用模式，甚至仅部分恢复异常细胞群所不提供的功能将改善许多病症的症状。因此，提及“有效数目”意指对于以下所需的细胞数目：至少部分地获得期望效果，或者延迟被治疗的特定病症的发作、抑制被治疗的特定病症的进展，或者完全停止被治疗的特定病症的发作或进展。这样的量当然将取决于被治疗的特定病症，病症的严重程度和个体患者参数，包括年龄、身体状况、尺寸、重量、生理状况，同时进行的治疗，医疗史和与所讨论病症有关的参数。本领域技术人员将能够确定构成有效剂量的本发明细胞和组织的数目及其最佳施用方式，而不需要过度实验，后一话题将在下文中进一步讨论。这些因素是本领域普通技术人员公知的，并且可以用不超过常规实验来解决。通常优选的是使用最大细胞数目，即，根据合理的医学判断的最高安全数目。但是，本领域普通技术人员将理解，由于医学原因、心理原因或任何其他原因，也可施用较低的细胞数目。

如前文所讨论的，还应理解，虽然本发明的方法在其范围内包括向患有如本文所定义的病症的个体引入转变的或者完全或部分分化的细胞，但并不需要向个体引入的群的每一细胞均已获得目标MLPC或MLPC衍生表型。例如，当CD4、CD8、CD25、CD19或CD20淋巴细胞群已转变成MLPC并且一起施用时，可能存在尚未转变成表现所需表型的细胞的细胞群。在施用MLPC衍生细胞群，例如特定造血或间充质群的情况下，可出现相同的问题。因此，只要如此引入的细胞的相关部分构成如上定义的“有效数目”，就实现了本发明。然而，在一个特别优选的实施方案中，已经经历分化的细胞群将进行成功分化细胞的鉴定、其分离以及引入到对象个体。这提供了选择异质MLPC衍生细胞群的手段(例如在以下情况下可能发生，诱导间充质衍生结缔组织发育)或挑选出用于施用的特定细胞亚群(例如红细胞)。选择来应用的方法类型将取决于被治疗病症的性质。但是，预期通常期望施用纯细胞群，以避免潜在副作用，例如畸胎瘤形成。或者，在一些情况下，可能可行的是使MLPC群分化，并且只要该群作为整体显示为表现必要的功能活性，该群作为整体就可以引入到对象个体中，而不需要预先移除不相干细胞类型。因此，在这种情况下，提及“有效数目”应理解为是指使得分化细胞的数目足以产生实现治疗对象病症的本发明的目的的活性水平所需的待引入细胞的总数目。

如上文详述的，在体外进行MLPC转变。在这种情况下，则需要将本发明细胞引入到个体中。例如，可以通过直接注射来引入细胞悬液，或者在血块内引入细胞悬液，其中细胞被固定在血块中从而有利于移植。细胞也可以在移植之前封装。封装是这样的技术，其可用于防止可能的继续增殖(即，表现出永生的特征)的细胞的传播，或者使组织不相容的排斥问题最小化。但是，封装的有用性将取决于移植细胞所需要提供的功能。例如，如果主要需要移植细胞分泌可溶性因子，封装的细胞群将可能实现该目的。但是，例如如果需要移植细胞的收缩特性，将可能需要细胞与肌肉的现有组织支架整合。封装细胞将无法有效做到这一点。

向患者施用的细胞可以通过任何合适的途径以单剂量或多剂量施用。优选地，并且在可能的情况中，使用单次施用。根据所需修复的类型，通过注射的施用可以针对组织或器官的不同区域。

将理解，根据本发明的这些方面，向患者施用的细胞可以采取任何合适的形式，例如作为细胞悬液(例如，血细胞)或采取组织移植物的形式(例如结缔组织)。在产生单细胞悬液的情况下，也可以设计分化方案使得其有利于维持细胞悬液。或者，如果细胞聚集或组织形成，这些将分散到细胞悬液中。在使用细胞悬液方面，也可能期望选出特定细胞亚群来向患者施用，例如特定的单核造血细胞。在期望将组织移植到患者中的情况下，这通常需要手术植入(与通过针或导管的施用相反)。或者，可移植这种组织的仅一部分。在另一个实例中，可通过标准组织工程技术来产生工程化组织，例如通过用本发明的细胞和组织接种具有设计形式的组织工程化支架，在接种细胞或组织能够在支架中定殖从而能够产生所形成组织的条件下培养接种的支架。然后向接受者施用形成的组织，例如使用标准手术植入技术。可以例如使用包含细胞外基质组分(例如层粘连蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白等)的生物相容性、可生物降解的聚合物纤维或泡沫产生合适的支架。用于产生或获得合适的支架、培养这种支架和治疗性植入这种支架的详细的指导方针可在文献中获得(例如，参考Kim S.S.和Vacanti J.P.，1999.Semin Pediatr Surg.8：119，Osiris，Therapeutics，Inc.的美国专利No.6,387,369；Bell E.的美国专利申请No.US20020094573A1)。

根据本发明的方法，其他蛋白质或非蛋白质分子可以与本发明细胞的引入一起或者在其之前或之后共施用。“共施用”意指在同一制剂中或者在不同制剂中通过相同或不同途径同时施用，或者通过相同或不同途径按顺序施用。“顺序”施用是指在引入这些细胞和施用蛋白质或非蛋白质分子之间，或者在开始这些细胞的功能活性和施用蛋白质或非蛋白质分子之间的秒、分钟、小时或天的时间差。其中可能需要这种共施用的情况的实例包括但不限于：

(i)当向对象施用非同基因(non-syngeneic)细胞或组织时，经常出现对象对这些细胞或组织的免疫排斥。在这种情况下，有必要也用免疫抑制方案治疗患者，优选在所述施用之前开始，以使得这样的排斥最小化。用于例如通过施用环孢菌素A、免疫抑制抗体等来抑制同种异体移植排斥的免疫抑制方案是普遍和标准的做法。

(ii)根据被治疗病症的性质，可能有必要维持患者的药物的疗程，以减轻病症的症状，直到移植细胞被整合并且完全发挥作用时。或者，在治疗病症时，可能有必要开始长期使用药物，以防止损伤的再次发生。例如，当对象损伤是由自身免疫病症造成(例如，在类风湿性关节炎的情况下发生的)时，可能需要不间断地使用免疫抑制药物，即使当同基因干细胞用于替换或修复软骨时也是如此。

还应当理解的是，本发明方法可以独立进行以治疗所讨论病症，或者与被设计来促进或增强本发明治疗的一种或更多种另外的技术一起进行。这些另外的技术可以采用共施用其他蛋白质或非蛋白质分子的形式，如前文所述。

本发明的另一个方面涉及MLPC或MLPC衍生细胞的群在制备用于治疗哺乳动物中的病症的药物中的用途，所述细胞已根据本发明的方法产生。

本发明的另一个方面涉及已根据本发明方法产生的MLPC或MLPC衍生细胞。

优选地，所述MLPC是造血或间充质干细胞。

在本发明的一个相关方面中，进行治疗或预防的对象可以是需要治疗性或预防性治疗的任何人或动物。在这一点上，本文提及的“治疗”和“预防”应在其最广泛的范围内考虑。术语“治疗”并不一定意味着治疗哺乳动物直到完全恢复。同样地，“预防”不一定意味着对象最终不感染疾病病症。因此，治疗和预防包括改善特定病症的症状或者防止或以其他方式降低出现特定病症的风险。术语“预防”可以认为是降低特定病症发作的严重程度。“治疗”也可以降低现有病症的严重程度。

用于体外产生MLPC和MLPC衍生细胞的方法的开发现在已经促进了用于测试现有或潜在的治疗或培养方案的有效性和毒性的基于体外的筛选系统的开发。

因此，根据本发明的另一个方面，提供了评估治疗或培养方案对于MLPC或MLPC衍生细胞的表型或功能状态的影响的方法，所述方法包括使所述MLPC或MLPC衍生细胞经受所述治疗方案并且筛选改变的功能或表型状态，所述细胞由根据前文定义的方法产生。

优选地，所述MLPC是造血或间充质干细胞。

通过“改变”意指分析本发明的一种或更多种功能或表型参数相对于未治疗细胞的变化。当所讨论治疗方案被设计来改善细胞功能时，这可能是理想的结果。然而，在治疗方案与不利的结果有关时，这可指示毒性，因此使用治疗方案是不适合的。现在已经公知的是，在个体对于特定药物的响应性方面观察到的差异通常与所述个体的独特遗传组成有关。因此，本发明方法提供了在使用来源于所讨论个体的核材料产生的细胞上测试现有的或新的治疗方案的有价值的手段。这提供用于在体内施用药物之前评估药物对个体细胞系统的可能有效性的独特手段。在患者非常不舒服的情况下，可以避免或至少最小化可能由治疗方案造成的导致不期望结果的生理应激。

因此，本发明的这一方面提供了优化被设计来使细胞功能正常化的治疗的手段。但是，所述方法也可用于评估治疗的毒性，特别是利用化合物的治疗。因此，响应于利用化合物的治疗，例如在本发明的细胞和组织中，不能产生与造血或间充质表型有关的特征可用于评估该化合物的毒性。

因此，本发明的方法可用于筛选和/或测试药物、其他治疗方案或培养条件。在评估表型的改变的情况下，本发明的这个方面可以用来监测本发明细胞和组织的基因表达谱的变化。因此，根据本发明这个方面的方法可用于确定例如响应于治疗的基因表达模式的变化。

优选地，本发明细胞或组织所经受的治疗是暴露于化合物。优选地，化合物是药物或生理离子。或者，化合物可以是生长因子或分化因子。为此目的，非常希望具有能够在施用药物之前预测对于细胞群的这种副作用的可用方法。

通过参照以下非限制性实施例进一步描述了本发明。

实施例1.

CD4+、CD8+、CD19+、CD20+和CD25+PBMC细胞培养物中的CD标志物和蛋白质表达

从20-40岁的健康志愿者收集外周血单个核细胞(PBMC)并且通过GE Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare Instructions 71-7167-00 AG)根据产品说明书分级。

使用所选附着方法由PBMC产生CD4+、CD8+、CD19+、CD20+和CD25+白细胞。简要地说，通过微珠(MACS)独立地从PBMC纯化这五个淋巴细胞群，纯度通常＞90％，通过流式细胞术验证。

将这些淋巴细胞的每个群单独培养在无菌的FEP培养袋中。这些最终培养基是重构的30％CD4⁺和CD8⁺PBMC、40％的6％人白蛋白(CSL Behring)溶液和30％细胞培养基，以及2％胰岛素(Invitrogen，USA)。40％CD19⁺PBMC细胞是重构的20％的6％人白蛋白(CSLBehring)溶液和40％细胞培养基。20％的CD20⁺和CD25⁺细胞是重构的40％的6％人白蛋白(CSL Behring)溶液和40％细胞培养基，以及2％胰岛素(Invitrogen，USA)。细胞在这些混合物中在5％CO₂的加湿孵育器中于37℃生长3-6天。

在这段孵育期中，通过流式细胞术检查五个淋巴细胞群(CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺、CD20⁺和CD25⁺)的CD标志物和表面蛋白质表达。此外，在CD4⁺群中，通过Western印迹检查总细胞蛋白质的表达。

PBMC的形态观察

利用来自在37℃的CO₂孵育器中孵育1天和4天后的细胞培养物样品制备切片。为了研究PBMC的生物学特征，在细胞培养期间通过倒置显微镜分析附着细胞表型(图1至5)。

通过流式细胞术分析的CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺、CD20⁺和CD25⁺的CD标志物表达

分别从FEP培养袋中收获CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺、CD20⁺和CD25⁺PBMC并且用PBS(含有2％胎牛血清；FBS)洗涤，在4℃下于640×g下离心5分钟，保留细胞沉淀。将细胞密度调整到每管3×10⁵个细胞用于流式细胞术测定。用荧光标记的抗体标记这5个白细胞群。最后，向每个管中加入100微升固定缓冲液(BD)，然后在4℃孵育20分钟，最后在4℃下在黑暗中储存直至流式细胞术分析(Bacton Dickinson)。使用CellQuest软件鉴定活细胞，所得数据在表1-10中示出。

通过western印迹分析的CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺、CD20⁺和CD25⁺淋巴细胞的蛋白质表达

细胞提取物的制备

在培养3-6天后，从来自40位健康志愿者的CD4⁺PBMC细胞中独立地提取细胞蛋白质。简要地说，通过RIPA裂解缓冲液(Millipore，Temecula.CA 92590)获得细胞蛋白质提取物。将提取的悬液在冰上孵育20分钟，然后在13000×g离心5分钟。收集上清液(可溶级分)用于蛋白质表达。

Western印迹分析

针对多种蛋白质的抗体购自市售品。这些包括胶原I型、HLA 1类、TAZ、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)、碱性磷酸酶、神经生长因子(NGF)、肿瘤坏死因子配体超家族成员18(TNFSF18)、干细胞抗原-1(Sca-1)、窖蛋白-2和穿孔素(Abcam Inc.)；CDX2、纤连蛋白、巨噬细胞-1抗原(MAC-1)、M钙粘蛋白、MyoD(MYOD1)、核转录因子Y亚基α(NF-YA)、Notch 1、配对盒-5(PAX-5)、P-糖蛋白、Wiskott-Aldrich综合征蛋白(WASP)(Epitomic Inc)；α-辅肌动蛋白、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶IV)、细胞视黄酸结合蛋白(CRABP II)、GATA结合因子-4(GATA4)、缺氧诱导因子-1a(HIF-1a)、肌细胞生成素、Achaete-scute同源物1(ASCL1)、突触泡蛋白(SYP)、巢蛋白和Runt相关转录因子3(Runx3)(Merck MilliporeHeadquarters.)、膜联蛋白VI(G-10)、神经生成素3(E-8)、颗粒酶B、谷氨酸脱羧酶(GAD2，D5G2)、神经纤毛蛋白-2、β烯醇化酶(ENO-3)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒溶蛋白(F-9)(Santa Cruz Biotechnology.)、Fms相关酪氨酸激酶1(FLT-1)和多药耐药相关蛋白1(MRP1)(CHEMICON international，SerlogicalR公司的一个部门)和PU.1(Cell SignalingTechnology，Inc.)。

将这些细胞裂解物的上清液用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。将100微克每种细胞裂解物样品上样到Pierce 4-20％Tris-甘氨酸凝胶(ThermoSCIENTIFIC，Rockford USA)。电泳后，将凝胶印迹到PVDF膜(Millpore，Temecula.CA92590)上。将PVDF膜在Tris缓冲盐水Tween-20缓冲液(10mMTris，pH 8.0，150mM NaCl)中用5％脱脂牛奶封闭，然后将膜在新鲜5％脱脂牛奶Tris缓冲盐水Tween-20缓冲液中用多种一抗在2-5℃下孵育18-20小时。将膜洗涤，然后用辣根过氧化物酶缀合的二抗孵育。用Amersham增强型化学发光系统进行带的可视化。用CCD相机记录响应条带并且用MultiGauge软件进行分析。使用β-肌动蛋白标准化的内部对照确定半定量分析的表达百分比增加。结果在本文中示出在图6-7和表11中。

表1衍生自根据本发明方法培养的CD4⁺PBMC的多谱系祖细胞的流式细胞术分析

表2衍生自根据本发明方法培养的CD4⁺PBMC的多谱系祖细胞的流式细胞术分析

表3.衍生自根据本发明方法培养的CD8⁺PBMC的多谱系祖细胞的流式细胞术分析

表4衍生自根据本发明方法培养的CD8⁺PBMC的多谱系祖细胞的流式细胞术分析

表5.衍生自根据本发明方法培养的CD19⁺PBMC的多谱系祖细胞的流式细胞术分析

表6.衍生自根据本发明方法培养的CD19⁺PBMC的多谱系祖细胞的流式细胞术分析

表7.衍生自根据本发明方法培养的CD20⁺PBMC的多谱系祖细胞的流式细胞术分析

表8衍生自根据本发明方法培养的CD20⁺PBMC的多谱系祖细胞的流式细胞术分析

表9.衍生自根据本发明方法培养的CD25⁺PBMC的多谱系祖细胞的流式细胞术分析

表10.衍生自根据本发明方法培养的CD25⁺PBMC的多谱系祖细胞的流式细胞术分析

表11.通过western印迹分析，CD4+ PBMC示出多种蛋白质表达。A-F示出通过半定量分析的CD4⁺PBMC的蛋白质表达，通过内部对照β-肌动蛋白归一化确定表达的百分比提高。将0-20％、21-40％、41-60％、61-80％和81-100％的5个水平分别表示为“+”、“++”、“+++”、“++++”和“+++++”。

A.CD4⁺PBMC蛋白质表达的肌动蛋白、穿孔素、HLA I类ABC、TAZ、胶原蛋白I、ALP和IGFBP3

B.CD4⁺PBMC蛋白质表达的肌动蛋白、PAX5、纤连蛋白、TNFSF18、FLT-1、HIF-1α和WASP

C.CD4⁺PBMC蛋白质表达的肌动蛋白、CDX2、膜联蛋白VI、GAD2、CAMK4、α-辅肌动蛋白和神经纤毛蛋白-2

D.CD4⁺PBMC蛋白质表达的肌动蛋白、M-钙粘蛋白、Sca-1、Notch1、P-gp、NFYA和MyoD1

E.CD4⁺PBMC蛋白质表达的肌动蛋白、MAC-1、PU.1、粒溶蛋白、Runx3、ASCL1和肌细胞生成素

F.CD4⁺PBMC蛋白质表达的肌动蛋白、CRABP2、MRP1、巢蛋白、GATA4、G-CSF和窖蛋白-2

G.CD4⁺PBMC蛋白质表达的肌动蛋白、突触泡蛋白、神经生成素3、β烯醇化酶、颗粒酶B和NGF

本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些以外，本文描述的发明易于进行变化和修改。应理解本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括在本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两种或更多种所述步骤或特征的全部组合。

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Osiris，Therapeutics，Inc.的美国专利No.6,387,369

Bell E的美国专利申请No.US20020094573A1

Claims (40)

1.一种产生哺乳动物多谱系潜能细胞的方法，所述方法包括建立体外细胞培养物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的单个核细胞悬液，所述单个核细胞表达CD4、CD8、CD25、CD20或CD19；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的约5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的细胞培养基，

其中所述细胞培养物在一定条件下保持一定时间，所述保持足以诱导所述单个核细胞转变为表现多谱系分化潜能的细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述单个核细胞悬液为20％-40％v/v，例如15％v/v，或其功能等同比例。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述白蛋白为15-40％v/v或其功能等同比例，例如15％v/v或其功能等同比例。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述细胞培养基为30-80％v/v，例如70％v/v，或其功能等同比例。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述单个核细胞是淋巴细胞。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述CD4⁺和/或CD8⁺单个核细胞是胸腺细胞、T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞或树突状细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述CD4⁺和CD8⁺单个核细胞悬液为30％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为30％v/v或其功能等同比例。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述CD25⁺细胞是调节性T细胞或记忆T细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述CD25⁺单个核细胞悬液为20％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以40％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为40％v/v或其功能等同比例。

10.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述CD19⁺或CD 20⁺细胞是处于任何分化阶段的B细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述CD19⁺或CD 20⁺单个核细胞悬液为40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以20％v/v或其功能等同比例使用，并且所述培养基为40％v/v或其功能等同比例。

12.根据权利要求6所述的方法，其中所述胸腺细胞是双阳性CD4⁺/CD8⁺胸腺细胞。

13.根据权利要求5所述的方法，其中所述淋巴细胞是单阳性CD4⁺或CD8⁺T细胞或CD8⁺NK细胞。

14.根据权利要求5所述的方法，其中所述淋巴细胞是CD25⁺调节性T细胞。

15.根据权利要求5所述的方法，其中所述淋巴细胞是CD19⁺B细胞。

16.根据权利要求5所述的方法，其中所述单个核细胞是CD20+细胞。

17.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述单个核细胞来源于外周血或脾。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述多谱系潜能细胞表现出造血潜能或间充质潜能。

19.根据权利要求1至7或13中任一项所述的方法，其中所述CD4⁺衍生多谱系潜能细胞表达CD44⁺和CD45⁺。

20.根据权利要求1至7或13中任一项所述的方法，其中所述CD8⁺衍生多谱系潜能细胞表达CD45⁺和CD47⁺。

21.根据权利要求1至4、10至11或14中任一项所述的方法，其中所述CD25⁺衍生多谱系潜能细胞表达CD23⁺。

22.根据权利要求1至4、10至11或15中任一项所述的方法，其中所述CD19⁺衍生多谱系潜能细胞表达CD44⁺和CD45⁺。

23.根据权利要求18所述的方法，其中所述造血潜能是分化成淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞或血小板的潜能。

24.根据权利要求18所述的方法，其中所述间充质潜能是分化成骨、软骨、平滑肌、肌腱、韧带、基质、骨髓、真皮或脂肪的细胞的潜能。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述白蛋白浓度为5-20％或5-15％。

26.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述白蛋白浓度为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物还包含10mg/L胰岛素或其功能性片段或等同物。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述细胞培养4至7天。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞培养4至5天或3至6天。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述方法包括使表现多谱系分化潜能的细胞(MLPC)与刺激接触以引导所述MLPC分化为MLPC衍生表型的额外步骤。

32.根据权利要求1至31所述的方法，其中所述MLPC衍生表型是造血表型或间充质表型。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述造血干细胞衍生细胞是红细胞、血小板、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞。

34.根据权利要求32所述的方法，其中所述间充质干细胞衍生细胞是结缔组织细胞，例如骨、软骨、平滑肌、肌腱、韧带、基质、骨髓、真皮或脂肪的细胞。

35.一种在哺乳动物中治疗性和/或预防性治疗病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效数目的已根据权利要求1至34中任一项所述方法产生的MLPC或者部分或完全分化的MLPC衍生细胞。

36.MLPC或MLPC衍生细胞群在制备用于在哺乳动物中治疗病症之药物中的用途，所述细胞已根据权利要求1至34中任一项所述方法产生。

37.根据权利要求35或36所述的方法或用途，其中所述病症的特征是造血或间充质功能异常。

38.根据权利要求37所述的方法或用途，其中所述病症是造血疾病、循环疾病、中风、心肌梗塞、高血压骨疾病、II型糖尿病、不育、受损或形态异常的软骨或其他组织、疝修复、利用支持网和生物支架的盆底脱垂手术、用于其他肌肉骨骼疾病的细胞疗法，以及在衰老、手术或创伤的情况下更换有缺陷的支持组织。

39.MLPC或MLPC衍生细胞群，其已根据权利要求1至34中任一项所述的方法产生。

40.一种评估治疗或培养方案对MLPC或MLPC衍生细胞的表型或功能状态的影响的方法，所述方法包括使所述MLPC或MLPC衍生细胞经受所述治疗方案以及筛选改变的功能或表型状态，所述细胞已根据权利要求1至34中任一项所述的方法产生。