CN106659743A

CN106659743A - 免疫病症的治疗

Info

Publication number: CN106659743A
Application number: CN201580030754.4A
Authority: CN
Inventors: S·伊茨库; P·西蒙斯
Original assignee: Msore Blass International Co Ltd
Current assignee: Msore Blass International Co Ltd; Mesoblast International SARL
Priority date: 2014-06-10
Filing date: 2015-06-01
Publication date: 2017-05-10
Anticipated expiration: 2035-06-01
Also published as: US10624930B2; US20200281984A1; JP2023090901A; AU2020244403B2; WO2015189063A1; JP7009594B2; JP6800757B2; AU2020244403A1; JP2017526619A; CA2950804A1; EP3154565B1; KR20230038590A; US20230141347A1; HK1231386A1; EP4137146A1; JP2022040254A; CN106659743B; JP7279212B2; US11406669B2; AU2015273799A1

Abstract

本公开涉及表达高水平血管生成素‑1(Ang1)的干细胞和其用于抑制M1型巨噬细胞产生和治疗例如糖尿病等发炎性疾病的用途。

Description

免疫病症的治疗

技术领域

本公开涉及表达高水平血管生成素-1(Ang1)的干细胞和其抑制TNF-α和/或IL-6释放以及治疗例如糖尿病等发炎性疾病的用途。

发明背景

血管生成素属于血管生长因子家族，血管生长因子在胚胎和出生后血管生成中起作用。Ang1促进内皮细胞和一些非内皮细胞(例如平滑肌细胞)的迁移。Ang1还诱导内皮细胞萌发和重新组织到小管中。Ang1对内皮细胞发挥有效的消炎作用，遏制血管内皮生长因子(VEGF)诱发的E-选择素、ICAM-1和VCAM-1上调，并抑制回应于VEGF和TNF-α的白细胞附着和迁移(Kim等人Circ Res.,89(6),477-479,2001)。

当前大部分1型糖尿病患者的疗法是基于定期皮下注射短效和长效胰岛素制剂的混合物。施用给与中效和长效组分与更持续作用型态的不同尺寸的可溶性胰岛素粒子的悬浮液以实现激素的恒定基线水平(Heine等人Br Med J(Clin Res编辑)290:204-205,1985)。

此当前疗法的一个缺点是迟效制剂一般不产生平稳的胰岛素背景水平，引起高血糖或者低血糖。高血糖的问题在于其可能引起糖尿病患者中进一步的并发症。举例来说，慢性高血糖引起严重小血管(视网膜病和肾病)、大血管(中风、心肌梗塞)和神经病并发症。这些破坏性并发症可以通过血糖水平的标准化来预防。

近年来，基于干细胞的技术已经显现为一种治疗糖尿病的可能方法。然而，除与可能需要终身免疫抑制的根本自体免疫疾病相关的问题外，这些技术尚有待显现为一种有前途的治疗选择。

因此，在糖尿病和/或其相关病状或症状的患者中治疗需求仍未满足，需要新的治疗选择。

本申请中任何文献的引用或鉴别并非许可此类文献可作为本公开的现有技术使用。

发明概要

本发明人已经发现其能够使用表达高水平Ang1的未遗传修饰的干细胞增加人类受试者中消炎细胞的产生，不需要用表达Ang1的核酸转染细胞。

本发明人还发现其能够在人类受试者中降低TNF-α水平、降低IL-6水平和/或增加IL-10水平。这些发现表明此类表达升高水平的Ang1的未遗传修饰的干细胞适于治疗发炎性病症，例如糖尿病和其相关病状和症状。

实际上，本发明人已经发现其能够使用表达高水平Ang1的未遗传修饰的干细胞在患有糖尿病的人类受试者中降低HbA1c、降低空腹胰岛素水平和/或增加脂肪细胞因子水平，不需要用表达Ang1的核酸转染细胞。

在其它实例中，本发明人还展示其能够使用表达高水平Ang1的未遗传修饰的干细胞改善人类受试者中类风湿性关节炎和糖尿病性肾病的症状，不需要用表达Ang1的核酸转染细胞。

因此，在一个实例中，本公开提供了一种增加有需要的受试者中消炎细胞的产生和/或功能的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含未遗传修饰的干细胞的组合物，其中所述未遗传修饰的干细胞表达至少0.1μg/10⁶个细胞的量的血管生成素-1(Ang1)。

在一个实例中，消炎细胞是Th2细胞、TReg细胞或M2型巨噬细胞。

在另一实例中，所述方法增加受试者中M2型巨噬细胞的数目。

在另一实例中，所述方法增加受试者中M2型巨噬细胞的数目至总单核细胞群体的至少10％。

在另一实例中，所述方法增加受试者中M2型巨噬细胞的数目至总单核细胞群体的至少20％。

在另一实例中，所述方法增加受试者中M2型巨噬细胞的数目至总单核细胞群体的至少40％。

在另一实例中，所述方法增加受试者中M2型巨噬细胞的数目至总单核细胞群体的至少80％。

在另一实例中，所述方法增加受试者中M2型巨噬细胞的数目至总单核细胞群体的至少90％。

在另一实例中，M2型巨噬细胞是CD14+CD16+。

在另一实例中，M2型巨噬细胞是CD14+CD16+CD163+。

在另一实例中，M2型巨噬细胞是CD14+CD16+CD206+。

在另一实例中，M2型巨噬细胞是CD14+CD16+CD163+CD206+。

在另一实例中，M2型巨噬细胞是CD14++CD16+。

在另一实例中，M2型巨噬细胞是CD14++CD16+CD163+。

在另一实例中，M2型巨噬细胞是CD14++CD16+CD206+。

在另一实例中，M2型巨噬细胞是CD14++CD16+CD163+CD206+。

在另一实例中，所述方法促进巨噬细胞从M1极化成M2表型。

在另一实例中，所述方法促进促炎性T辅助细胞分化成Th2或TReg细胞。

在一个实例中，促炎性T辅助细胞是Th17细胞。

在一个实例中，增加受试者中消炎细胞的产生和/或功能引起：

-受试者中IL-6水平降低；

-受试者中TNF-α水平降低；和/或

-受试者中IL-10水平增加。

在一个实例中，所述方法增加受试者中消炎细胞因子的水平。

在一个实例中，所述方法增加受试者中IL-10的水平。

在一个实例中，所述方法降低受试者中促炎性细胞因子的水平。

在一个实例中，所述方法降低受试者中IL-6、TNF-α和/或IL-17中任一者的水平。

在一个实例中，所述方法还抑制促炎性细胞的产生和/或功能。

在一个实例中，促炎性细胞是Th17细胞或M1型巨噬细胞。

在另一实例中，本公开提供了一种方法，其中所述方法抑制M1型巨噬细胞极化。

在另一实例中，本公开提供了一种方法，其中所述方法促进巨噬细胞从M1极化成M2表型。

在另一实例中，本公开提供了一种方法，其中所述方法抑制M1型巨噬细胞衍生细胞因子释放。

在另一实例中，本公开提供了一种方法，其中所抑制的M1型巨噬细胞衍生细胞因子是TNF-α和/或IL-6。

在另一实例中，本公开提供了一种治疗发炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含未遗传修饰的干细胞的组合物，其中所述未遗传修饰的干细胞表达至少0.1μg/10⁶个细胞的量的血管生成素-1(Ang1)。

在另一实例中，发炎性疾病是糖尿病或选自由以下组成的组的糖尿病相关病状或症状：异常伤口愈合、心脏病发作症状、中风症状、周围血管疾病症状、截肢、肾病症状、肾衰竭、失明、神经病、肾病、视网膜病、发炎、性交不能或非酒精性脂肪肝炎(NASH)。

举例来说，本公开提供了一种治疗类风湿性关节炎的方法。

举例来说，本公开提供了一种治疗糖尿病性视网膜病的方法。

在另一实例中，本公开的方法包括向所述受试者施用包含未遗传修饰的干细胞的组合物，其中所述未遗传修饰的干细胞表达至少0.1μg/10⁶个细胞的量的血管生成素-1(Ang1)。在另一实例中，干细胞表达至少0.5μg/10⁶个细胞的量的Ang1。在另一实例中，干细胞表达至少0.7μg/10⁶个细胞的量的Ang1。在另一实例中，干细胞表达至少1μg/10⁶个细胞的量的Ang1。

在另一实例中，干细胞表达少于约0.1μg/10⁶个细胞的量的VEGF。在另一实例中，干细胞表达少于约0.05μg/10⁶个细胞的量的VEGF。在另一实例中，干细胞表达少于约0.04μg/10⁶个细胞的量的VEGF。在另一实例中，干细胞表达少于约0.03μg/10⁶个细胞的量的VEGF。在另一实例中，干细胞表达少于约0.02μg/10⁶个细胞的量的VEGF。在另一实例中，干细胞表达少于约0.01μg/10⁶个细胞的量的VEGF。

在另一实例中，干细胞表达至少约2:1比率的Ang1:VEGF。在另一实例中，干细胞表达至少约10:1比率的Ang1:VEGF。在另一实例中，干细胞表达至少约20:1比率的Ang1:VEGF。在另一实例中，干细胞表达至少约30:1比率的Ang1:VEGF。在另一实例中，干细胞表达至少约50:1比率的Ang1:VEGF。

在另一实例中，干细胞为间质干细胞。在另一实例中，干细胞为间质前驱细胞。在另一实例中，干细胞是诱导多潜能干细胞(iPS细胞)。

在另一实例中，组合物进一步包含可接受的药物载剂。

在另一实例中，通过根据下述体外方法培养未遗传修饰的干细胞，产生组合物。

在一个实例中，干细胞可以从任何哺乳动物获得。举例来说，干细胞可以来源于灵长类动物、奶牛、绵羊、马、犬、猫或山羊。在另一实例中，干细胞为人类干细胞。

在另一实例中，发炎性疾病是II型糖尿病。

在一个实例中，治疗II型糖尿病的方法可包括向受试者施用每公斤约0.1×10⁶至约3×10⁶个干细胞。

在一个实例中，治疗II型糖尿病的方法可包括向受试者施用每公斤约0.3×10⁶至约2×10⁶个干细胞。

在一个实例中，治疗II型糖尿病的方法可包括向受试者施用每公斤约1×10⁶至约2×10⁶个干细胞。

在一个实例中，治疗II型糖尿病的方法可包括向受试者施用每公斤约2×10⁶个干细胞。

在一个实例中，以下任一者指示所述受试者中糖尿病或糖尿病相关病状或症状已得到治疗：

-HbA1c值(总血红蛋白％)减少；

-空腹胰岛素水平降低；

-IL-6水平降低；

-TNF-α水平降低；和/或

-脂肪细胞因子水平增加。

在一个实例中，受试者具有II型糖尿病，其中受试者的葡萄糖水平的控制不足。

在一个实例中，二甲双胍(metformin)对受试者的葡萄糖水平的控制不足。

在一个实例中，受试者具有超过7.5％的基线HbA1c值。

在一个实例中，受试者具有大于或等于8％的基线HbA1c值。

在一个实例中，发炎性疾病是类风湿性关节炎。

在一个实例中，治疗类风湿性关节炎的方法可包括向受试者施用每公斤约0.5×10⁶至约3.0×10⁶个干细胞。

在一个实例中，治疗类风湿性关节炎的方法可包括向受试者施用每公斤约1.0×10⁶至约2.0×10⁶个干细胞。

在一个实例中，以下任一者指示类风湿性关节炎已得到治疗：

-ACR20；

-ACR50；

-ACR70；

-IL-6水平降低；和/或

-疾病活性评分降低。

在另一实例中，发炎性疾病是糖尿病性神经病。

在一个实例中，治疗类风湿性关节炎的方法可包括向受试者施用约1.0×10⁸至约4.0×10⁸个干细胞。

在一个实例中，治疗类风湿性关节炎的方法可包括向受试者施用约1.5×10⁸至约3.0×10⁸个干细胞。

在一个实例中，以下任一者指示糖尿病性肾病已得到治疗：

-抑制eGFR和/或mGFR下降；

-改善eGFR和/或mGFR；和/或

-IL-6水平降低。

在一个实例中，受试者基线eGFR超过约35ml/min/1.73m²。

在一个实例中，受试者基线eGFR超过30ml/min/1.73m²。

在一个实例中，受试者基线eGFR超过28ml/min/1.73m²。

在一个实例中，受试者基线eGFR超过25ml/min/1.73m²。

在一个实例中，干细胞全身施用。

在一个实例中，干细胞静脉内施用。

在另一实例中，本公开涉及包含未遗传修饰的干细胞的组合物的用途，其中所述未遗传修饰的干细胞表达升高水平的血管生成素-1(Ang1)，所述组合物用于制造供治疗发炎性疾病用的药物。

在另一实例中，本公开涉及一种包含未遗传修饰的干细胞的组合物，其中所述未遗传修饰的干细胞表达升高水平的血管生成素-1(Ang1)，所述组合物用于治疗发炎性疾病。

在另一实例中，本公开涉及一种包含未遗传修饰的干细胞的组合物，其中当用于治疗发炎性疾病时所述未遗传修饰的干细胞表达升高水平的血管生成素-1(Ang1)。

图示简单说明

图1：使用当前(方法A)和重新调配的培养基(方法B)的MPC生长。Y轴指示细胞数；X轴为时间，以天为单位。对照培养基为用于方法A的培养基，且重新调配的培养基为用于方法B的培养基。

图2：在当前(方法A)和重新调配的培养基(方法B)中的MPC倍增时间。MPC在当前αMEM培养物中生长(方法A)或在改良的αMEM中重新调配(方法B)。细胞从P3传代到P5。

图3：MPC群体倍增时间(PDL)。MPC在当前αMEM培养基(方法A)对比重新调配的αMEM(方法B)中从P3生长至P5。在当前(方法A)培养基中生长的MPC进行8个PDL，且在重新调配的培养基(方法B)中生长的MPC进行7.33个PDL。

图4：CD14+免疫选择的单核细胞与MPC共培养产生展现M2巨噬细胞的表型特性的CD14+16+巨噬细胞。

图5：与MPC共培养预防巨噬细胞在发炎驱动下(LPS)分泌TNFα。

图6：通过与MPC在LPS存在下共培养，增强巨噬细胞产生消炎细胞因子IL-10。

图7：MPC在调节巨噬细胞极化中的作用。

图8：分泌PGE2：IL-1β和TNFα的累加效应。

图9：施用MPC后促炎性和消炎细胞因子的水平的变化。

图10：在建立疾病后期(第42天)时施用MPC引起关节中发炎细胞因子的水平降低。

图11：组1-3的MPC给药

图12：第12周脂肪细胞因子水平(自基线的变化)。

图13：第12周TNF-α水平(自基线的变化)。

图14：第12周IL-6水平(自基线的变化)。

图15：基线HbA1c<8％或≥8％的子群的HbA1c改变

图16：第12周处于目标HbA1c(<7.0％)下的受试者

图17：随着时间推移的中位IL-6改变

图18：生物制剂难治性RA的ACR 20反应：1M MPC/kg

图19：生物制剂难治性RA的ACR 50反应：1M MPC/kg

图20：生物制剂难治性RA的ACR 70反应：1M MPC/kg

图21：随着时间推移组分的ACR反应；以周计，触痛(TJC；左)和肿胀(SJC；右)关节数

图22：随着时间推移组分的ACR反应；以周计，受试者疾病活性总评估(SGADA)(左)；以周计，研究者疾病活性总评估(IGADA)(右)。

图23：第12周DASCRP反应者分析。

图24：健康评估问卷疾病指数(HAQ-DI)：到达MCID的比例(-0.22)

图25：第12周mGFR[⁹⁹Tc DTPA]和eGFR[MDRD]，自基线的变化(ml/min/1.73m²)。

图26：第12周IL-6自基线的中位变化

图27：MPC治疗的患者中基线IL-6与第12周血清肌酸酐提高相关。

图28：在基线eGFR>30ml/min/1.73m²的mGFR和eGFR受试者中第12周自基线的变化。

发明详述

通用技术和定义

本说明书通篇中，除非以其它方式特别陈述或上下文另外要求，否则对单个步骤、目标组合物、步骤组或目标组合物组的提及应涵盖那些步骤、目标组合物、步骤组或目标组合物组的一个和多个(即一个或多个)。

本领域技术人员将了解本文中描述的公开内容可以进行除特别描述内容以外的变化和修改。应了解本公开包括所有这类变化和修改。本公开还包括所有在本说明书中个别或共同提及或指示的步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任两个或超过两个所述步骤或特征。

本公开在范围上不受本文所述的特定实施方案限制，这些实施方案仅仅是为了例示而已。功能同等的产物、组合物和方法清楚地在如本文中描述的公开内容的范围内。

除非另外特别陈述，否则本文公开的任何实例作必要修改后应适用于任何其它实例。

除非另外特别定义，否则本文中使用的所有技术和科学名词都应具有与本领域(例如细胞培养、分子遗传学、干细胞分化、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)技术人员通常所了解相同的含义。

除非另外指明，否则本公开中利用的干细胞、细胞培养和免疫技术是本领域技术人员众所周知的标准程序。此类技术在例如以下等来源中文献通篇中加以描述和解释：J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)；T.A.Brown(编辑),Essential Molecular Biology:APractical Approach,第1和2卷,IRL Press(1991),D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)；以及F.M.Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括所有更新，直至现在)；Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory,(1988)；以及J.E.Coligan等人(编辑)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括所有更新，直至现在)。

应了解术语“和/或”，例如“X和/或Y”意指“X和Y”或“X或Y”，且应清楚证明两种含义或者任一含义。

如本文所用，除非相反陈述，否则术语“约”是指指定值+/-10％，更优选地+/-5％。

体积百分比(v/v％)定义[(溶质体积)/(溶液体积)]×100％。体积百分比是相对于溶液体积。举例来说，补充5％v/v FCS的细胞培养基意指每100ml细胞培养基存在约5mlFCS。

本说明书通篇中，应了解词语“包含(comprise)”或例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”意味包括所述要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤组，但不排除任何其它要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤组。

干细胞

如本文所用，术语“干细胞”是指能够产生表型和基因型一致的子代以及至少一种其它最终细胞类型(例如终末分化的细胞)的自我更新细胞。术语“干细胞”包括全能细胞、多能细胞和多潜能细胞以及来源于其分化的祖细胞和/或前驱细胞。干细胞可以是成年或胚胎干细胞。

如本文所用，术语“全能细胞(totipotent cell)”或“全能细胞(totipotentialcell)”是指能够形成完整胚胎的细胞(例如胚泡)。

如本文所用，术语“多能细胞(pluripotent cell)”或“多能细胞(pluripotentialcell)”是指具有完整的分化多样性，即能够生长成哺乳动物身体大约260种细胞类型任一者的细胞。多能细胞可以自我更新，且可保持在组织内休眠或静止。

“多潜能细胞(multipotential cell)”或“多潜能细胞(multipotent cell)”意指能够产生若干成熟细胞类型任一者的细胞。如本文所用，此短语涵盖成年祖细胞和这些细胞的多潜能子代。不同于多能细胞，多潜能细胞不能够形成所有细胞类型。

如本文所用，术语“间质谱系前驱细胞或干细胞”是指可以分化成间质细胞类型的细胞。举例来说，间质谱系前驱细胞和间质前驱细胞可以分化成骨骼、软骨、肌肉和脂肪细胞以及纤维结缔组织。

在一个实例中，表达升高水平Ang1的干细胞是STRO-1+间质前驱细胞。

STRO-1+多潜能细胞是在骨髓、血液、牙髓、脂肪组织、皮肤、脾、胰腺、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨骼、韧带、腱、骨骼肌、真皮和骨膜中发现的细胞。因此，STRO-1+多潜能细胞能够分化成大量细胞类型，包括(但不限于)脂肪、骨、软骨、弹性和纤维结缔组织。这些细胞进入的特定谱系定型和分化途径取决于来自机械影响的多种影响和/或内源性生物活性因子，例如生长因子、细胞因子和/或宿主组织建立的局部微环境条件。在一个实施方案中，STRO-1+多潜能细胞是非造血祖细胞，其分裂产生子细胞，这些子细胞是干细胞或者是将按期不可逆地分化产生表型细胞的前驱细胞。

在一个实例中，STRO-1+细胞从获自受试者(例如有待治疗的受试者或相关受试者或无关受试者(无论是相同物种还是不同)的样品富集。术语“富集(enriched)”、“富集(enrichment)”或其变化形式在本文中用以描述当与未处理的细胞群体(例如天然环境中的细胞)比较时，一种特定细胞类型的比例或大量特定细胞类型的比例增加的细胞群体。在一个实例中，STRO-1+细胞富集的群体包含至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％或85％或95％或99％STRO-1+细胞。关于此，术语“STRO-1+细胞富集的细胞群体”将清楚地证明术语“包含X％STRO-1+细胞的细胞群体”，其中X％是如本文中叙述的百分比。在一些实例中，STRO-1+细胞可以形成克隆源性群落，例如CFU-F(成纤维细胞)或其子集(例如50％或60％或70％或80％或90％或95％)可以具有此活性。

在一个实例中，表达升高水平Ang1的干细胞从包含STRO-1+细胞的细胞制剂以可选择形式富集。关于此，应了解术语“可选择形式”意指细胞表达标记物(例如细胞表面标记物)，从而允许选择STRO-1+细胞。标记物可以是STRO-1，但无须是STRO-1。举例来说，如本文中描述和/或例示，表达STRO-2和/或STRO-3(TNAP)和/或STRO-4和/或VCAM-1和/或CD146和/或3G5的细胞(例如MPC)还表达STRO-1(且可以是STRO-1^亮)。因此，指示细胞是STRO-1+并不意指通过STRO-1表达选择细胞。在一个实例中，基于至少STRO-3表达，例如其是STRO-3+(TNAP+)，来选择细胞。在另一实例中，基于至少STRO-4表达，例如其是STRO-4+，来选择细胞。

提及细胞或其群体的选择不一定要求从特定的组织来源选择。如本文所述，STRO-1+细胞可以从各种来源选择或分离或富集。也就是说，在一些实例中，这些术语支持从包含STRO-1+细胞的任何组织(例如MPC)或血管化组织或包含外膜细胞(例如STRO-1+外膜细胞)的组织或本文中叙述的任一种或多种组织选择。

在一个实例中，表达升高水平Ang1的干细胞表达一种或多种个别或共同选自由以下组成的组的标记物：STRO-1+、TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)、CD45+、CD146+、3G5+、CC9或其任何组合。

“个别”意指本公开分别涵盖叙述的标记物或标记物组，且尽管个别标记物或标记物组可能在本文中未分别列出，但随附权利要求书可分别且彼此区别地定义此类标记物或标记物组。

“共同”意指本公开涵盖任何数目的叙述的标记物或肽组或其组合，且尽管此类数目的标记物或标记物组或其组合可能在本文中未特别列出，但随附权利要求书可分别且与标记物或标记物组的任何其它组合相区别地定义此类组合或亚组合。

在一个实例中，STRO-1+细胞是STRO-1^亮(同义词STRO-1^bri)。在一个实例中，STRO-1^bri细胞相对于STRO-1^暗或STRO-1^中间细胞优先富集。

在一个实例中，STRO-1^亮细胞另外是TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)和/或CD146+中的一个或多个。举例来说，针对上述标记物的一个或多个，选择细胞，和/或选择展示表达上述标记物中的一个或多个的细胞。关于此，展示表达标记物的细胞无须特别测试，而是可以测试以前富集或分离的细胞，且随后使用、分离或富集的细胞可以合理地假设成也表达相同的标记物。

在一个实例中，STRO-1^亮通过免疫选择来分离。在一个实例中，STRO-1^亮细胞通过表达TNAP的细胞的免疫选择来分离。如本文所用，术语“TNAP”意图涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有同功异型物。举例来说，该术语涵盖肝同功异型物(LAP)、骨骼同功异型物(BAP)和肾同功异型物(KAP)。在一个实例中，TNAP是BAP。在一个实例中，如本文所用，TNAP是指可以结合由融合瘤细胞系产生的STRO-3抗体的分子，STRO-3抗体依据布达佩斯条约(theBudapest Treaty)的条款以寄存编号PTA-7282于2005年12月19日寄存在ATCC。

在一个实例中，间质前驱细胞或干细胞是CD29+、CD54+、CD73+、CD90+、CD102+、CD105+、CD106+、CD166+、MHC1+间质干细胞(例如remestemcel-L)。

在一个实例中，间质前驱细胞是如WO 2004/85630中定义的血管周间质前驱细胞。举例来说，间质前驱细胞表达血管周细胞的标记物，例如细胞是STRO-1+或STRO-1^亮和/或3G5+。在一个实例中，细胞是或以前是从血管化组织或器官或其部分分离的细胞或其子代。

称为对既定标记物呈“阳性”的细胞可以表达低(lo或暗)或高(亮、bri)水平的该标记物，取决于细胞表面上标记物存在的程度，其中所述术语涉及荧光强度或者用于细胞分类过程中的其它标记物。在所分类的特定细胞群体上使用的标记物的上下文中将了解lo(或暗或暗淡)与bri的区别。称为对既定标记物呈“阴性”的细胞不一定完全缺乏该细胞。此术语意指该细胞表达相对极低水平的所述标记物，且当可检测地标记或超过背景水平，例如使用同型对照抗体检测的水平而不可检测时，其产生极低信号。

当本文中使用时，术语“亮”是指细胞表面上在可检测地标记时产生相对高信号的标记物。虽然不希望受理论限制，但提出“亮”细胞表达的目标标记物蛋白质(例如由STRO-1识别的抗原)比样品中其它细胞多。举例来说，当用FITC结合的STRO-1抗体标记时，如荧光活化细胞分类(FACS)分析所测定，STRO-1^bri细胞产生的荧光信号比非亮细胞(STRO-1^暗淡/暗)大。在一个实例中，“亮”细胞构成起始样品中所含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％。在其它实例中，“亮”细胞构成起始样品中所含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％或至少约2％。在一个实例中，STRO-1^亮细胞相对于“背景”，即STRO-1-细胞，具有2log量值更高的STRO-1表面表达。比较起来，STRO-1^暗淡和/或STRO-1^中间细胞相对于“背景”具有少于2log量值更高的STRO-1表面表达，通常约1log或更少。

在一个实例中，显著比例的STRO-1+多潜能细胞能够分化成至少两种不同的生殖系。多潜能细胞可以定型的谱系的非限制性实例包括骨骼前驱细胞；对胆管上皮细胞和肝细胞是多潜能的肝细胞祖细胞；神经限制细胞，其可以产生进展成少突神经胶质细胞和星形细胞的胶质细胞前驱物；进展成神经元的神经元前驱物；心肌和心肌细胞的前驱物，葡萄糖反应性分泌胰岛素的胰腺β-细胞系。其它谱系包括(但不限于)成牙质细胞、产生牙质的细胞和软骨细胞以及以下前驱细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、例如角化细胞等皮肤细胞、树突状细胞、毛囊细胞、输尿管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、外膜细胞、血管细胞、上皮细胞、神经胶质细胞、神经元细胞、星形细胞和少突神经胶质细胞。

在另一实例中，STRO-1+细胞不能在培养时产生造血细胞。

在一个实例中，目前描述的干细胞是间质干细胞。间质干细胞(MSC)可以是均质组合物或可以是MSC富集的混合细胞群体。均质间质干细胞组合物可以通过培养附着骨髓或骨膜细胞来获得，且间质干细胞可以通过用独特的单克隆抗体鉴别的特定细胞表面标记物来鉴别。用于获得间质干细胞富集的细胞群体的方法描述于例如美国专利No 5,486,359中。间质干细胞的替代来源包括(但不限于)血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、骨骼和软骨膜。

可以通过大量不同的方法实现携带上述细胞表面标记物的干细胞的识别、选择和纯化。举例来说，结合剂施加于相关标记物，接着分离展现结合，高水平结合或低水平结合或无结合的那些细胞。

举例来说，结合剂可以包括抗体，例如单克隆抗体或基于抗体的分子。

抗体和其它结合分子可以用于多种技术中，以选择和纯化表达特定细胞表面标记物的干细胞。

用于选择和纯化的技术可包括(但不限于)使用抗体涂布的磁珠进行磁力分离、亲和层析法和用附接于固体基质的抗体“淘洗”、荧光活化细胞分类(FACS)。

表达特定标记物的表达升高水平Ang1的干细胞可以经由阳性免疫选择从细胞群体选择或纯化。举例来说，间质前驱细胞可以基于STRO-1抗体的细胞表面表达，从细胞群体分离和富集(参见例如Gronthos和Simmons 1995)。

根据本公开的分离的干细胞可以通过培养而体外扩增。如本领域技术人员所了解，干细胞可以低温保存，解冻，并随后通过培养而体外扩增。在一个实例中，将干细胞接种在生长培养基中，并使其附着培养容器，在37℃、20％O₂下过夜。随后替换生长培养基并将细胞在37℃、5％O₂下再培养68至72小时。

在一个实例中，将分离的干细胞以50,000个细胞/平方厘米接种在补充血清的生长培养基中，并使其附着培养容器，在37℃、20％O₂下过夜。随后用补充有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的软骨形成基础培养基(CBM；Lonza,Walkersville,MD)替换生长培养基并将细胞在37℃、5％O₂下再培养68至72小时。

本领域中已知初级干细胞培养的多种其它方法。举例来说，可以使用Gronthos和Simmons 1995中描述的方法进行初级干细胞培养。

培养的干细胞表型上不同于体内细胞。其可以表达例如CD44。

在一个实施方案中，培养的干细胞在生物学上不同于体内细胞，具有较高的再生速率。

培养的干细胞可以在施用于受试者前低温保存。举例来说，表达升高水平Ang1的干细胞可以在施用于受试者前低温保存。

未遗传修饰的细胞

如本文所用，术语“未遗传修饰”是指没有通过用表达或编码Ang1的核酸转染而修饰的细胞。为了避免引起怀疑，在本公开的上下文中，用编码Ang1的核酸转染的干细胞将视为经遗传修饰。在本公开的上下文中，“未遗传修饰”的细胞在某种程度上天然地表达Ang1。

Ang1和/或VEGF的表达

表达升高水平Ang1的干细胞未经遗传修饰并表达至少0.1μg/10⁶个细胞的量的Ang1。然而，在不同的实施方案中，设想表达升高水平Ang1的干细胞可以表达至少0.2μg/10⁶个细胞、0.3μg/10⁶个细胞、0.4μg/10⁶个细胞、0.5μg/10⁶个细胞、0.6μg/10⁶个细胞、0.7μg/10⁶个细胞、0.8μg/10⁶个细胞、0.9μg/10⁶个细胞、1μg/10⁶个细胞、1.1μg/10⁶个细胞、1.2μg/10⁶个细胞、1.3μg/10⁶个细胞、1.4μg/10⁶个细胞、1.5μg/10⁶个细胞的量的Ang1。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞表达至少0.2μg/10⁶个细胞至约1.5μg/10⁶个细胞的量的Ang1。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞表达至少0.3μg/10⁶个细胞至约1.4μg/10⁶个细胞的量的Ang1。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞表达至少0.4μg/10⁶个细胞至约1.3μg/10⁶个细胞的量的Ang1。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞表达至少0.5μg/10⁶个细胞至约1.2μg/10⁶个细胞的量的Ang1。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞表达至少0.55μg/10⁶个细胞至约1.1μg/10⁶个细胞的量的Ang1。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞表达至少0.6μg/10⁶个细胞至约1.0μg/10⁶个细胞的量的Ang1。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞表达至少0.65μg/10⁶个细胞至约0.9μg/10⁶个细胞的量的Ang1。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞表达至少0.7μg/10⁶个细胞至约0.8μg/10⁶个细胞的量的Ang1。

在另一方面，表达升高水平的Ang1的未遗传修饰的干细胞表达少于约0.01μg/10⁶个细胞的量的VEGF。

在另一方面，表达升高水平Ang1的未遗传修饰的干细胞表达少于约0.05μg/10⁶个细胞的量的VEGF。然而，在不同的实施方案中，设想表达升高水平Ang1的干细胞可以表达少于约0.05μg/10⁶个细胞、0.04μg/10⁶个细胞、0.03μg/10⁶个细胞、0.02μg/10⁶个细胞、0.01μg/10⁶个细胞、0.009μg/10⁶个细胞、0.008μg/10⁶个细胞、0.007μg/10⁶个细胞、0.006μg/10⁶个细胞、0.005μg/10⁶个细胞、0.004μg/10⁶个细胞、0.003μg/10⁶个细胞、0.002μg/10⁶个细胞、0.001μg/10⁶个细胞的量的VEGF。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞表达至少0.001μg/10⁶个细胞至约0.1μg/10⁶个细胞的量的VEGF。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞表达至少0.0025μg/10⁶个细胞至约0.09μg/10⁶个细胞的量的VEGF。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞表达至少0.0075μg/10⁶个细胞至约0.08μg/10⁶个细胞的量的VEGF。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞表达至少0.01μg/10⁶个细胞至约0.07μg/10⁶个细胞的量的VEGF。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞表达至少0.02μg/10⁶个细胞至约0.06μg/10⁶个细胞的量的VEGF。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞表达至少0.02μg/10⁶个细胞至约0.05μg/10⁶个细胞的量的VEGF。

在干细胞的组合物或培养物中表达的细胞Ang1和/或VEGF的量可以通过本领域技术人员已知的方法测定。此类方法包括(但不限于)定量分析法，例如定量ELISA分析法。然而，应了解本公开的范围不限于用于测定在表达升高水平Ang1的干细胞中表达的Ang1或VEGF的量或水平的任何特定方法。

在一个实例中，干细胞的组合物或培养物表达的Ang1或VEGF的水平由ELISA分析法测定。在此类分析法中，将来自干细胞培养物的细胞溶解产物添加到ELISA板的孔中。孔可以用针对Ang1或VEGF的初级抗体(单克隆或多克隆抗体)涂布。接着洗涤孔，接着与针对初级抗体的二级抗体(单克隆或多克隆抗体)接触。二级抗体结合于适当的酶，例如辣根过氧化酶。接着可以培育孔，接着在培育期后洗涤。接着孔与结合于二级抗体的酶的适当底物(例如一种或多种色原)接触。可以采用的色原包括(但不限于)过氧化氢和四甲基联苯胺。添加底物后，将孔培育适当时间。培育结束后，将“中止”溶液添加到孔中以中止酶与底物的反应。接着测量样品的光密度(OD)。样品的光密度与含有已知量的Ang1或VEGF的样品的光密度相关，以确定测试的干细胞培养物表达的Ang1或VEGF的量。

在另一方面，表达升高水平Ang1的未遗传修饰的干细胞表达至少约2:1比率的Ang1:VEGF。然而，在不同的实施方案中，设想表达升高水平Ang1的干细胞可以表达至少约10:1、15:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、50:1比率的Ang1:VEGF。

本领域技术人员将显而易见用于确定Ang1:VEGF表达比率的方法。在确定Ang1与VEGF表达比率的方法的一个实例中，Ang1和VEGF表达水平经由如以上所讨论的定量ELISA定量。在此类实例中，在定量Ang1和VEGF的水平后，基于Ang1和VEGF的定量水平的比率可以表示为：(Ang1水平/VEGF水平)＝Ang1:VEGF比率。

细胞组合物

在本公开的一个实例中，干细胞呈组合物形式施用。在一个实例中，此类组合物包含药学上可接受的载剂和/或赋形剂。

术语“载剂”和“赋形剂”是指通常用于本领域中，以促进活性化合物的存储、施用和/或生物活性的物质组合物(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Mac Publishing Company(1980))。载剂也可以减少活性化合物的任何不合需要的副作用。适合的载剂是例如稳定的，例如不能与载剂中其它成分反应。在一个实例中，在治疗采用的剂量和浓度下载剂在接受者中不会产生显著的局部或全身副作用。

适用于本公开的载剂包括通常使用的载剂，例如水、生理盐水、右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液(Ringer's solution)、缓冲溶液、透明质烷和二醇是示例性液体载剂，特别是(等张时)用于溶液。适合的药物载剂和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻谷、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。

在另一实例中，载剂是例如其中细胞生长或悬浮的培养基组合物。举例来说，此类培养基组合物不会在其施用的受试者中诱发任何副作用。

示例性载剂和赋形剂不会不利地影响细胞的存活力和/或细胞减轻、预防或延迟代谢综合症和/或肥胖症的能力。

在一个实例中，载剂或赋形剂提供缓冲活性以将细胞和/或可溶性因子维持在适合的pH值下，从而发挥生物活性，例如载剂或赋形剂是磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。PBS代表一种有吸引力的载剂或赋形剂，因为其与细胞和因子最低限度地相互作用且允许细胞和因子快速地释放，在这种情况下，本公开的组合物可以呈液体产生，例如通过注射直接施加到血流或组织或组织周围或附近的区域中。

干细胞和/或其子代细胞也可以并入或埋入与接受者相容并降解成对接受者无害的产物的支架内。这些支架为待移植到受试者中的细胞提供了支持和保护。天然和/或合成的生物可降解支架是此类支架的实例。

多种不同的支架可以成功用于本公开的实施中。示例性支架包括(但不限于)生物可降解支架。天然的生物可降解支架包括胶原蛋白、纤维结合蛋白和层粘连蛋白支架。用于细胞移植支架的适合合成材料应能支持大规模细胞生长和细胞功能。此类支架也可以是可再吸收的。适合的支架包括聚乙醇酸支架，例如Vacanti等人,J.Ped.Surg.23:3-9 1988；Cima等人,Biotechnol.Bioeng.38:145 1991；Vacanti等人,Plast.Reconstr.Surg.88:753-9 1991所述；或合成聚合物，例如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。

在另一实例中，细胞可以在凝胶支架(例如来自Upjohn Company的Gelfoam)中施用。

本文所述的细胞组合物可以单独或呈与其它细胞的混合物施用。不同类型的细胞可以在临施用前或施用后立即与本公开的组合物混合，或其可以在施用前一起共培养一段时间。

在一个实例中，组合物包含有效量或治疗或预防有效量的细胞。举例来说，组合物包含约1×10⁵个具有升高Ang1水平的干细胞至约1×10⁷个具有升高Ang1水平的干细胞或约1×10⁶个具有升高Ang1的干细胞至约5×10⁶个具有升高Ang1的干细胞/公斤。

待施用的干细胞的确切剂量取决于多种因子，包括(但不限于)患者的年龄、体重和性别，所治疗的疾病或病症以及其程度和严重程度。

在一个实例中，低剂量的细胞施用于受试者。示例性剂量包括约0.1×10⁴至约0.5×10⁶个细胞/公斤之间，例如约0.1×10⁵至约0.5×10⁶个细胞/公斤之间，例如约0.5×10⁵至约0.5×10⁶个细胞/公斤之间，例如约0.1×10⁶至约0.5×10⁶个细胞/公斤之间，例如约0.2×10⁶或0.3×10⁶或0.4×10⁶个细胞/公斤。

举例来说，可向受试者施用每公斤约0.1×10⁶、约0.2×10⁶、约0.3×10⁶、约0.4×10⁶、约0.5×10⁶个细胞。

在其它实例中，向受试者施用每公斤约0.6×10⁶、约0.7×10⁶、约0.8×10⁶、约0.9×10⁶、约1.0×10⁶、约1.1×10⁶、约1.2×10⁶、约1.3×10⁶、约1.4×10⁶个细胞。

在一个实例中，高剂量的细胞施用于受试者。示例性剂量包括至少约1.5×10⁶个细胞/公斤。举例来说，高剂量包含约1.5×10⁶至约6×10⁶个细胞/公斤之间，例如约1.5×10⁶至约5×10⁶个细胞/公斤之间，例如约1.5×10⁶至约4×10⁶个细胞/公斤之间，例如约1.5×10⁶至约3×10⁶个细胞/公斤之间。举例来说，高剂量包含约1.5×10⁶或约2×10⁶个细胞/公斤。举例来说，高剂量包含约1.5×10⁶个细胞/公斤。举例来说，高剂量包含约2×10⁶个细胞/公斤。举例来说，高剂量包含约3×10⁶个细胞/公斤。

在其它实例中，向受试者施用每公斤约1.5×10⁶、约1.6×10⁶、约1.7×10⁶、约1.8×10⁶、约1.9×10⁶、约2.0×10⁶、约2.1×10⁶、约2.2×10⁶、约2.3×10⁶、约2.4×10⁶、约2.5×10⁶、约2.6×10⁶、约2.7×10⁶、约2.8×10⁶、约2.9×10⁶、约3.0×10⁶、约3.1×10⁶、约3.2×10⁶、约3.3×10⁶、约3.4×10⁶、约3.5×10⁶、约3.6×10⁶、约3.7×10⁶、约3.8×10⁶、约3.9×10⁶、约4.0×10⁶个细胞。

在其它实例中，向受试者施用每公斤约1.0×10⁸、约1.1×10⁸、约1.2×10⁸、约1.3×10⁸、约1.4×10⁸、约1.5×10⁸、约1.6×10⁸、约1.7×10⁸、约1.8×10⁸、约1.9×10⁸、约2.0×10⁸、约2.1×10⁸、约2.2×10⁸、约2.3×10⁸、约2.4×10⁸、约2.5×10⁸、约2.6×10⁸、约2.7×10⁸、约2.8×10⁸、约2.9×10⁸个细胞、约3.0×10⁸、约3.1×10⁸、约3.2×10⁸、约3.3×10⁸、约3.4×10⁸、约3.5×10⁸、约3.6×10⁸、约3.7×10⁸、约3.8×10⁸、约3.9×10⁸、约4.0×10⁸个细胞。

间质谱系前驱细胞或干细胞可占组合物细胞群体的至少约5％。在其它实例中，间质谱系前驱细胞或干细胞可占组合物细胞群体的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％。

表达CD44的干细胞可占组合物细胞群体的至少约5％。在其它实例中，表达CD44的干细胞可占组合物细胞群体的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、至少约100％。

在一些实例中，细胞容纳在一腔室内，该腔室不允许细胞离开到受试者循环中，然而，允许细胞分泌的因子进入循环。以此方式，可溶性因子可以通过允许细胞分泌因子到受试者循环中而施用于受试者。此类腔室可以同等地植入受试者中的部位以增加例如植入心脏中或心脏附近的可溶性因子的局部水平。

干细胞可以全身施用，例如通过静脉内、动脉内或腹膜内施用。

间质谱系前驱细胞或干细胞也可以通过鼻内、肌肉内、关节内或心内施用来施用。

举例来说，间质谱系前驱细胞或干细胞可以直接施用于疼痛或肿胀关节中。

在另一实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞经由冠状动脉内输注施用。举例来说，间质谱系前驱细胞或干细胞可以施用左前降(LAD)动脉。

在另一实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞经由肾内输注施用。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞可以呈单次剂量施用。

在一些实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞可以多剂量施用。举例来说，至少2剂、至少3剂、至少4剂、至少5剂、至少6剂、至少7剂、至少8剂、至少9剂、至少10剂。

包含表达升高水平Ang1的干细胞的组合物可以低温保存。干细胞的低温保存可以使用本领域中已知的慢速冷却法或‘快速’冷冻方案进行。在一个实例中，与解冻细胞相比，低温保存方法维持低温保存细胞类似的表型、细胞表面标记物和生长速率。

低温保存的组合物可以包含低温保存溶液。低温保存溶液的pH值通常是约6.5至8。

在一个实例中，低温保存溶液的pH值是约7.4。

低温保存溶液可以包含无菌的非热性等张溶液，例如PlasmaLyte 100mLPlasmaLyte含有526mg氯化钠USP(NaCl)；502mg葡糖酸钠(C₆H₁₁NaO₇)；368mg三水合乙酸钠USP(C₂H₃NaO₂·3H₂O)；37mg氯化钾USP(KCl)；和30mg氯化镁USP(MgCl₂·6H₂O)。其不含抗微生物剂。用氢氧化钠调整pH值。pH值是7.4(6.5至8.0)。

为了促进冷冻，通常将例如二甲亚砜(DMSO)等低温保护剂添加到低温保存溶液。理想地，低温保护剂应对细胞和患者来说是无毒的，非抗原性、化学惰性，在解冻后存活率高并允许在不洗涤下移植。然而，最常使用的低温防护剂DMSO展示一定细胞毒性。羟乙基淀粉(HES)可以用作DMSO的替代品或与DMSO组合，以降低低温保存溶液的细胞毒性。

低温保存溶液可以包含DMSO、羟乙基淀粉、人类血清组分和其它蛋白质填充剂中的一者或多者。在一个实例中，低温保存的溶液包含约5％人类血清白蛋白(HSA)和约10％DMSO。低温保存溶液可以进一步包含甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和海藻糖中的一者或多者。

低温保存的组合物可以解冻并直接施用于受试者。或者，低温保存的组合物可以解冻并在施用前使间质谱系前驱细胞或干细胞再悬浮于替代溶液中。

表达升高水平Ang1的干细胞以有效治疗动物的疾病或病症的量施用于动物。动物可以是哺乳动物，且哺乳动物可以是灵长类动物，包括人类和非人类灵长类动物。

在一个实例中，表达升高水平Ang1的干细胞施用于人类。

在一个实例中，表达升高水平Ang1的干细胞施用于患有糖尿病的受试者。

在一个实例中，表达升高水平Ang1的干细胞施用于患有II型糖尿病的受试者。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于患有II型糖尿病的基线HbA1c值超过约7％的受试者。举例来说，表达升高水平的Ang1的干细胞可施用于患有II型糖尿病的基线HbA1c值超过约7.1％、约7.2％、约7.3％、约7.4％、约7.5％、约7.6％、约7.7％、约7.8％、约7.9％、约8.0％、约8.1％、约8.2％、约8.3％、约8.4％、约8.5％、约8.6％、约8.7％、约8.8％、约8.9％、约9.0％的受试者。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞可施用患有II型糖尿病的基线HbA1c值大于或等于约8.0％的受试者。

本领域普通技术人员将显而易见用于确定HbA1c值(总血红蛋白％)的方法。用于确定HbA1c值(总血红蛋白％)的方法的实例包括高效液体色谱法(HPLC)或免疫分析法。本领域普通技术人员也将意识到HbA1c值可以表示为其它值，例如mmol/mol。

在一个实例中，通过HPLC测定受试者HbA1c值。

在一个实例中，通过免疫分析法测定受试者HbA1c值。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于患有II型糖尿病的受试者，其中受试者的葡萄糖水平的控制不足。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于患有II型糖尿病的受试者，其中二甲双胍或二甲双胍加另一口服治疗剂对受试者的葡萄糖水平的控制不足。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于患有慢性肾病的受试者。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于患有糖尿病性肾病的受试者。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于患有II型糖尿病和慢性肾病的受试者。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于患有II型糖尿病和糖尿病性肾病的受试者。

估计肾小球滤过率(eGFR)用以筛选和检测早期肾损害和监测肾状态。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于基线eGFR超过约35ml/min/1.73m²、约34ml/min/1.73m²、约44ml/min/1.73m²、约32ml/min/1.73m²、约31ml/min/1.73m²、约30ml/min/1.73m²、约29ml/min/1.73m²、约28ml/min/1.73m²、约27ml/min/1.73m²、约26ml/min/1.73m²、约25ml/min/1.73m²的受试者。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于具有肾功能阶段3A、3B、4或5的受试者。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于具有肾功能阶段3B的受试者。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于受试者

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于基线eGFR大于或等于30ml/min/1.73m²的受试者。

本领域普通技术人员将显而易见用于估计GFR的方法并例示于下文中。可以使用肌酸酐和/或胱抑素C水平计算eGFR。

举例来说，可以使用MDRD等式计算eGFR：

GFR(mL/min/1.73m²)＝175×(S_cr)^-1.¹⁵⁴×(Age)^-0.²⁰³×(女性0.742)×(非裔美国人1.212)

在其它实例中可以使用CKD-EPI等式计算eGFR(Levey等人Ann Intern.Med.150(9),604-12,2009)；

GFR＝141×min(S_cr/κ,1)^α×max(S_cr/κ,1)^-1.209×0.993^Age×1.018[女性]×1.159[黑人]

其中；

S_cr为血清肌酸酐，以mg/dL为单位，

κ对于女性为0.7，且对于男性为0.9，

α对于女性为-0.329，且对于男性，为-0.411，

min指示S_cr/κ或1的最小值，以及

max指示S_cr/κ或1的最大值。

eGFR也可以随着时间推移不断地计算和监测，以确定eGFR是下降还是提高。可以在对照组与处理组之间比较eGFR以鉴别在处理组中是否抑制eGFR的下降。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于患有关节炎的受试者。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于患有类风湿性关节炎的受试者。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于患有类风湿性关节炎的分类为不完全抗TNFα反应者的受试者。

在一个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于患有类风湿性关节炎的类风湿性关节炎生物疗法失效的受试者。

在两个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于患有类风湿性关节炎的两种类风湿性关节炎生物疗法失效的受试者。

在两个实例中，表达升高水平的Ang1的干细胞施用于患有类风湿性关节炎的三种类风湿性关节炎生物疗法失效的受试者。

TNF-α、IL-6、IL-17的抑制

TNF-α、IL-6和IL-17是被称为细胞因子的化学信使。这些分子回应于多种信号从细胞释放。在本发明的上下文中，术语‘抑制(inhibit或inhibiting)’是指例如蛋白质(例如细胞因子)等物质或过程(例如细胞分化或细胞极化)的可测量水平的减少或遏制。

因此，在一个实例中，设想施用包含表达升高水平的Ang1的干细胞的细胞组合物将降低受试者中TNF-α、IL-17和/或IL-6的可测量水平。在此实例中，抑制TNF-α、IL-17和/或IL-6从细胞释放。

在一个实例中，本公开涉及一种监测受试者对施用表达升高水平的Ang1的干细胞的反应的方法。在此实例中，可以在施用表达升高水平的Ang1的干细胞后的一段时间内监测水平或例如细胞因子等促炎性和/或消炎标记物。

在一个实例中，本公开涉及一种在施用表达升高水平的Ang1的干细胞后监测受试者反应的方法，所述方法包括：评估从已经施用表达升高水平的Ang1的干细胞的受试者获得的例如全血样品等样品中发炎和/或消炎标记物的水平；以及基于促炎性和/或消炎标记物的水平，确定受试者是否对施用表达升高水平的Ang1的干细胞作出反应。

在一个实例中，消炎标记物水平增加和/或发炎标记物水平下降表明受试者对施用干细胞作出反应。

在一个实例中，发炎和/或消炎标记物是细胞或细胞群体。

在一个实例中，消炎细胞数目增加和/或发炎细胞数目下降指示受试者对施用干细胞作出反应。

在一个实例中，消炎细胞是Th2细胞、Treg细胞和/或M2型巨噬细胞。

在一个实例中，发炎细胞是Th17细胞和/或M1型巨噬细胞。

熟习此项技术者可以使用多种分析法，所述分析法可以用于确定发炎细胞数目是否已经降低和/或消炎细胞数目是否已经增加。

举例来说，可使用基于流式细胞术的技术，例如荧光激活细胞分类术(FACS)，针对细胞表面标记物的表达来评估从全血样品分离的细胞群体。

在一个实例中，CD14+单核细胞可以从获自施用表达升高水平的Ang1的干细胞的受试者的全血样品纯化。可针对CD16、CD163和CD206表达评估单核细胞，以鉴别M1和M2型巨噬细胞的比例。可以随着时间推移，评估多个样品以确定M1型巨噬细胞数目是降低还是递降，和/或M2型巨噬细胞水平是增加还是递增。在一个实例中，相对于从施用干细胞前的受试者获得的样品(例如基线或治疗前参考样品)中M1和/或M2型巨噬细胞数目，评估M1和/或M2型巨噬细胞数目。

在另一实例中，评估的发炎和/或消炎标记物是细胞因子。

在一个实例中，发炎标记物是TNF-α、IL-17和/或IL-6。

在一个实例中，消炎标记物是IL-10。

熟习此项技术者可以使用多种分析法，所述分析法可以确定TNF-α、IL-17和/或IL-6水平是否已经降低或IL-10水平是否已经增加。在一个实例中，可以使用分光光度技术，例如Immulite化学发光免疫分析法，测定TNF-α、IL-17、IL-10和/或IL-6浓度水平。在另一实例中，可以使用Luminex平台，使用市售试剂盒(Millipore)，测量TNF-α、IL-17、IL-10和/或IL-6浓度水平。

在一个实例中，施用包含表达升高水平的Ang1的干细胞的细胞组合物将抑制巨噬细胞的TNF-α和/或IL-6释放。熟习此项技术者可以使用多种方法，所述方法可以确定TNF-α和/或IL-6从巨噬细胞的释放是否减少。举例来说，巨噬细胞可以体外培养，并暴露于包含表达升高水平Ang1的干细胞的组合物或者适合对照。一段时间后，接着可以使用以上例示的方法评估TNF-α和/或IL-6释放。接着暴露于包含表达升高水平的Ang1的干细胞的细胞组合物的细胞中TNF-α和/或IL-6水平可以与对照细胞中TNF-α和/或IL-6水平相比，以确定TNF-α和/或IL-6水平是否降低。

已经定义巨噬细胞的两种不同极化状态：经典活化(M1)的巨噬细胞表型或“M1型巨噬细胞”，和替代性活化(M2)的巨噬细胞表型或M2型巨噬细胞(Gordon和Taylor.,Nat.Rev.Immunol.5:953-964,2005；Mantovani等人,Trends Immunol.23:549-555,2002)。M1型巨噬细胞具有“促炎性”细胞因子型态(例如TNF-α、IL-6、IL-1-β、IL-12、IL-23)。而M2型巨噬细胞具有“消炎”细胞因子型态(例如IL-10)。在一个实例中，设想施用包含表达升高水平的Ang1的干细胞的细胞组合物将抑制M1型巨噬细胞的细胞因子释放。在另一实例中，设想施用包含表达升高水平的Ang1的干细胞的细胞组合物将抑制M1型巨噬细胞的TNF-α和/或IL-6释放。熟习此项技术者可以使用多种分析法，所述分析法可以确定M1型巨噬细胞的TNF-α、IL-6和/或其它细胞因子释放是否减少。举例来说，在上述体外分析法中使用M1型巨噬细胞。在此实例中，可以通过从全血样品进行免疫选择来纯化CD14+单核细胞。

增加消炎细胞产生和/或功能

在一个实例中，本公开涉及一种增加受试者中消炎细胞产生和/或功能的方法，其通过施用表达升高水平的Ang1的干细胞。

术语“消炎细胞”在本公开的上下文中用以指在受试者中引发或介导消炎反应的细胞。“消炎细胞”可以直接作用于细胞群体或目标以指导消炎反应。或者，本公开涵盖的消炎细胞可以表达或分泌作用于特定细胞群体或目标以指导消炎反应的例如细胞因子等因子。

消炎细胞的实例包括Th2细胞、Treg细胞和/或M2型巨噬细胞。

在一个实例中，本公开涉及一种增加受试者中Th2细胞、Treg和/或M2型巨噬细胞数目的方法，其通过施用表达升高水平的Ang1的干细胞。

在一个实例中，本公开涉及一种增加受试者中M2型巨噬细胞数目的方法，其通过施用表达升高水平的Ang1的干细胞。

在一个实例中，本公开的方法增加受试者中M2型巨噬细胞数目至总单核细胞群体的至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％。

在一个实例中，本公开的方法增加受试者中M2型巨噬细胞数目至总单核细胞群体的至少约10％。

在一个实例中，本公开的方法增加受试者中M2型巨噬细胞数目至总单核细胞群体的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％。

本领域普通技术人员容易使用此项技术中已知的多种方法确定相对于受试者的总单核细胞群体的M2-巨噬细胞％。举例来说，M2巨噬细胞可以基于其CD14和CD16以及例如CD163和CD206等其它标记物的表达来确定。

在此实例中，可以从受试者获得全血样品，可以经由FACS基于CD14的表达免疫选择细胞。接着可以针对CD16、CD163和CD206的表达评估CD14+细胞。CD14+CD16+CD163+CD206+的比例可以相对于样品中总CD14+细胞群体计算。

-受试者中IL-6水平降低；

-受试者中TNF-α水平降低；和/或

-受试者中IL-10水平增加。

在另一实例中，本公开的方法是一种促进巨噬细胞从M1极化成M2表型的方法。

举例来说，本公开提供了一种促进有需要的受试者中M1型巨噬细胞极化成M2型巨噬细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含未遗传修饰的干细胞的组合物，其中所述未遗传修饰的干细胞表达至少0.1μg/10⁶个细胞的量的血管生成素-1(Ang1)。

在此实例中，CD14+CD16+细胞、CD14++CD16+细胞、CD14+CD16+CD163+细胞、CD14++CD16+CD163+细胞、CD14+CD16+CD206+细胞、CD14++CD16+CD206+细胞、CD14+CD16+CD163+CD206+细胞、CD14++CD16+CD163+CD206+细胞、CD14+CD163+细胞、CD14++CD163+细胞、CD14+CD206+细胞、CD14++CD206+细胞、CD14+CD163+206+细胞、CD14++CD163+CD206+细胞产生或数目增加、IL-6水平降低、TNF-α水平降低和/或IL-10水平增加可以指示已经促进M1型巨噬细胞极化成M2型巨噬细胞。

相反地，在另一实例中，本公开提供了一种抑制M2型巨噬细胞极化成M1型巨噬细胞的方法。

在另一实例中，本公开提供了一种抑制有需要的受试者中M1型巨噬细胞产生和/或功能的方法，所述方法包括向受试者施用包含未遗传修饰的干细胞的组合物，其中所述未遗传修饰的干细胞表达升高水平的血管生成素-1(Ang1)。

治疗方法

本公开涉及一种治疗发炎性疾病的方法。

如本文所用，术语“发炎性疾病”涵盖包括(但不限于)以下的疾病：瘙痒、皮肤发炎、牛皮癣、多发性硬化、类风湿性关节炎、骨关节炎、全身性红斑狼疮、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroidis)、重症肌无力、I型或II型糖尿病、糖尿病性肾病、哮喘、发炎性肺损伤、发炎性肝损伤、发炎性肾小球损伤、异位性皮炎、变应性接触性皮炎、刺激性接触性皮炎、脂溢性皮炎、休格连氏综合症(Sjoegren's syndrome)、角膜结膜炎、葡萄膜炎、发炎性肠病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎、关节、皮肤或肌肉发炎性疾病、急性或慢性发炎性关节炎、肌炎、髓鞘脱失病、慢性阻塞性肺病、间质性肺病、间质性肾炎和慢性活动型肝炎。

在一个实例中，本公开的方法治疗的发炎性疾病是糖尿病。在另一实例中，发炎性疾病是糖尿病相关病状或症状。在此实例中，可以治疗的症状包括：异常伤口愈合、与心脏病发作相关的症状(例如胸痛)、与中风相关的症状、周围血管疾病症状、截肢、肾病、肾衰竭、失明、神经病、发炎、性交不能或非酒精性脂肪肝炎(NASH)。

举例来说，本公开的方法治疗的发炎性疾病是类风湿性关节炎。

举例来说，本公开的方法治疗的发炎性疾病是糖尿病性视网膜病。

在一个实例中，本公开涉及一种治疗糖尿病的方法。

在一个实例中，本公开涉及一种治疗II型糖尿病的方法。

在一个实例中，本公开涉及一种治疗糖尿病性肾病的方法。

在一个实例中，本公开涉及一种治疗类风湿性关节炎的方法。

如本文所用，应了解术语“治疗(treat或treatment或treating)”意指施用治疗有效量的细胞。在本公开的上下文中，术语“细胞的治疗有效量”是指细胞有效预防、改善或治疗发炎性疾病或病症的量。此类有效量一般将改善发炎性疾病或病症的征象、症状和/或其它指示物。举例来说，在糖尿病中，有效量的细胞可降低HbA1c值、降低例如IL-6和/或TNF-α等细胞因子水平、降低空腹胰岛素和/或增加脂肪细胞因子水平。

举例来说，在类风湿性关节炎中，有效量的细胞可以实现ACR20、ACR 50和/或ACR70、降低例如IL-6等细胞因子水平和/或降低疾病活性评分。

举例来说，在糖尿病性肾病中，有效量的细胞可以抑制eGFR或mGFR下降、改善eGFR或mGFR和/或降低例如IL-6等细胞因子水平。

在糖尿病或其相关病状或症状的上下文中，熟习此项技术者可以使用多种常规临床分析法，所述分析法可以用于确定HbA1c值降低、空腹胰岛素降低和/或脂肪细胞因子水平增加。举例来说，血液样品一般将从受试者获得，接着进行免疫分析法以检测HbA1c、胰岛素和脂肪细胞因子水平。

细胞培养方法

在一个实施方案中，产生表达升高水平Ang1的干细胞的方法包括：在细胞培养基中培养干细胞群体，其中所述细胞培养基含有短效L-抗坏血酸衍生物，但不含有大量的长效L-抗坏血酸衍生物；和/或补充少于10％v/v胎牛血清。

术语“培养基(media)”或“培养基(medium)”在提及细胞培养时使用时包括细胞周围环境的组分。设想培养基促成和/或提供足够诱导Ang1表达的表达的条件。培养基可以是固体、液体、气体或各相和物质的混合物。培养基可以包括液体生长培养基以及不保持细胞生长的液体介质。培养基还包括凝胶状培养基，例如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性气体培养基包括在皮式培养皿(petri dish)或其它固体或半固体支撑物上生长的细胞所暴露的气相。术语“培养基”还指意图用于细胞培养中，即使尚未与细胞接触的物质。

用于产生表达升高水平Ang1的干细胞的方法中的培养基可以通过使用用于培养干细胞的培养基作为基础培养基来制备。基础培养基包括例如伊格尔最低必需(MEM)培养基、α改性MEM培养基和其混合培养基，且不特别限制，只要其可以用于培养干细胞即可。

此外，培养基可以含有例如脂肪酸或脂质、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、缓冲剂、无机盐等任何组分。

细胞培养基还可以含有所有必需氨基酸且还可以含有非必需氨基酸。一般说来，氨基酸分为必需氨基酸(Thr、Met、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Lys、His)和非必需氨基酸(Gly、Ala、Ser、Cys、Gln、Asn、Asp、Tyr、Arg、Pro)。

抗坏血酸是多种细胞在培养时生长和分化的必需补充物。现在了解特定的抗坏血酸衍生物是“短效”的，因为其在溶液中不稳定，尤其是在中性pH值和37℃的正常细胞培养条件下。这些短效衍生物迅速氧化成乙二酸或苏糖酸。在培养基(pH 7)中在37℃下，在24小时内氧化使这些短效抗坏血酸衍生物的水平降低大约80％-90％。因此，在多种细胞类型的常规细胞培养中，短效抗坏血酸衍生物已经替换成更稳定的“长效”抗坏血酸衍生物。

在本公开的上下文中，术语“短效”涵盖在中性pH值和37℃的培养条件下24小时细胞培养后氧化大约80％-90％的抗坏血酸衍生物。在一个实例中，短效L-抗坏血酸衍生物是L-抗坏血酸盐。举例来说，在本公开的上下文中，L-抗坏血酸钠盐是“短效”抗坏血酸衍生物。

相比之下，术语“长效”涵盖在中性pH值和37℃的培养条件下24小时细胞培养后未氧化大约80％-90％的抗坏血酸衍生物。在一个实例中，在本公开的上下文中，L-抗坏血酸-2-磷酸盐是“长效”抗坏血酸衍生物。长效抗坏血酸衍生物的其它实例包括四己基癸基抗坏血酸酯、抗坏血酸磷酸镁和2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸。

在一个实例中，用于产生表达升高水平Ang1的干细胞的方法中的细胞培养基补充短效抗坏血酸衍生物。举例来说，细胞培养基可以含有至少约0.005g/L的短效抗坏血酸衍生物。在另一实例中，细胞培养基可以含有至少约0.01g/L的短效抗坏血酸衍生物。举例来说，细胞培养基可以含有至少约0.02g/L的短效抗坏血酸衍生物。在另一实例中，细胞培养基可以含有至少约0.03g/L的短效抗坏血酸衍生物。举例来说，细胞培养基可以含有至少约0.04g/L的短效抗坏血酸衍生物。在另一实例中，细胞培养基可以含有至少约0.05g/L的短效抗坏血酸衍生物。在另一实例中，细胞培养基可以含有至少约0.06g/L的短效抗坏血酸衍生物。在此实施方案的一个实例中，细胞培养基补充L-抗坏血酸钠盐。

在另一实例中，细胞培养基含有短效抗坏血酸衍生物，但不含有大量的长效抗坏血酸衍生物。举例来说，细胞培养基可以含有短效抗坏血酸衍生物，但不超过0.04g/L的长效抗坏血酸衍生物。在另一实例中，细胞培养基可以含有短效抗坏血酸衍生物，但不超过0.03g/L的长效抗坏血酸衍生物。在另一实例中，细胞培养基可以含有短效抗坏血酸衍生物，但不超过0.02g/L的长效抗坏血酸衍生物。在另一实例中，细胞培养基可以含有短效抗坏血酸衍生物，但不超过0.01g/L的长效抗坏血酸衍生物。在另一实例中，细胞培养基可以含有短效抗坏血酸衍生物，但不超过0.005g/L的长效抗坏血酸衍生物。在另一实例中，细胞培养基可以含有短效抗坏血酸衍生物，但不含长效抗坏血酸衍生物。

在另一实例中，细胞培养基含有L-抗坏血酸钠盐，但不含有大量的L-抗坏血酸-2-磷酸盐。

用于产生表达升高水平Ang1的干细胞的方法中的细胞培养基可以是含血清的培养基或无血清的培养基。

培养基可以含有或不含有血清替换品。血清替换品可以是例如白蛋白(例如富含脂质的白蛋白)、转铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前驱物、微量元素、2-巯基乙醇或3'-硫醇甘油或适当含有血清同等物的替换品。此类血清替换品可以例如通过国际公布WO 93/30679中描述的方法制备，且也可以使用市售产品。

在一个实例中，用于产生表达升高水平Ang1的干细胞的方法中的细胞培养基补充至少约9％v/v、至少约8％v/v、至少约7％v/v、至少约6％v/v、至少约5％v/v、至少约4％v/v、至少约3％v/v、至少约2％v/v、至少约1％v/v FCS。还设想在本公开的上下文中术语胎牛血清(fetal calf serum，FCS)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)可以互换使用。

在一个实施方案中，细胞培养基补充非胎儿血清。设想培养基可以补充至少约1％v/v、至少约2％v/v、至少约3％v/v、至少约4％v/v、至少约5％v/v、至少约6％v/v、至少约7％v/v、至少约8％v/v、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、至少约23％、至少约24％、至少约25％v/v非胎儿血清。

举例来说，培养基可以补充哺乳动物非胎儿血清。

举例来说，培养基可以补充人类非胎儿血清。

举例来说，培养基可以补充新生血清。设想培养基可以补充至少约1％v/v、至少约2％v/v、至少约3％v/v、至少约4％v/v、至少约5％v/v、至少约6％v/v、至少约7％v/v、至少约8％v/v、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、至少约23％、至少约24％、至少约25％v/v新生血清。

在一个实施方案中，细胞培养基补充哺乳动物新生血清。

举例来说，培养基可以补充新生牛血清(NBCS)。设想培养基可以补充至少约1％v/v、至少约2％v/v、至少约3％v/v、至少约4％v/v、至少约5％v/v、至少约6％v/v、至少约7％v/v、至少约8％v/v、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、至少约23％、至少约24％、至少约25％v/v NBCS。

在一个实施方案中，细胞培养基补充人类新生血清。

举例来说，细胞培养基可以补充至少约1％v/v、至少约2％v/v、至少约3％v/v、至少约4％v/v、至少约5％v/v、至少约6％v/v、至少约7％v/v、至少约8％v/v、至少约9％v/v人类新生血清。举例来说，人类新生血清从脐带血“脐带血”获得。

在一个实施方案中，培养基补充成年血清。设想培养基可以补充至少约1％v/v、至少约2％v/v、至少约3％v/v、至少约4％v/v、至少约5％v/v、至少约6％v/v、至少约7％v/v、至少约8％v/v、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、至少约23％、至少约24％、至少约25％v/v成年血清。

在一个实施方案中，细胞培养基补充哺乳动物成年血清。

举例来说，细胞培养基可以补充至少约1％v/v、至少约2％v/v、至少约3％v/v、至少约4％v/v、至少约5％v/v、至少约6％v/v、至少约7％v/v、至少约8％v/v、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、至少约23％、至少约24％、至少约25％v/v哺乳动物成年血清。

举例来说，细胞培养基可以补充至少约1％v/v、至少约2％v/v、至少约3％v/v、至少约4％v/v、至少约5％v/v、至少约6％v/v、至少约7％v/v、至少约8％v/v、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、至少约23％、至少约24％、至少约25％v/v成年牛血清。

在一个实施方案中，细胞培养基补充成人血清。

举例来说，细胞培养基可以补充至少约1％v/v、至少约2％v/v、至少约3％v/v、至少约4％v/v、至少约5％v/v、至少约6％v/v、至少约7％v/v、至少约8％v/v、至少约9％v/v成人血清。

举例来说，细胞培养基可以补充至少约1％v/v、至少约2％v/v、至少约3％v/v、至少约4％v/v、至少约5％v/v、至少约6％v/v、至少约7％v/v、至少约8％v/v、至少约9％v/v人类AB血清。

在一个实例中，细胞培养基补充至少约3％人类AB血清。

在一个实施方案中，培养基补充FCS与NBCS的混合物。

举例来说，培养基可以补充FCS与NBCS的混合物，使得FCS:NBCS比率为至少约0.4:1、至少约0.5:1、至少约0.6:1、至少约0.7:1、至少约0.8:1、至少约0.9:1、至少约1:1、至少约1.5:1、至少约2:1。

举例来说，设想FCS与NBCS的混合物可以占细胞培养基的至少约1％v/v、至少约2％v/v、至少约3％v/v、至少约4％v/v、至少约5％v/v、至少约6％v/v、至少约7％v/v、至少约8％v/v、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、至少约23％、至少约24％、至少约25％v/v。然而，在此实例中，细胞培养基补充至少约1％v/v、至少约2％v/v、至少约3％v/v、至少约4％v/v、至少约5％v/v、至少约6％v/v、至少约7％v/v、至少约8％v/v、至少约9％v/v，但少于10％v/v FCS。

在一个实施方案中，细胞培养基无FCS血清。

在一个实施方案中，细胞培养基无胎儿血清。

在一个实施方案中，细胞培养基补充非胎儿血清。

在一个实施方案中，细胞培养基无胎儿血清且补充非胎儿血清。

在另一个实施方案中，细胞培养基补充一种或多种选自由以下组成的组的刺激因子：1α,25-二羟基维生素D3(1,25D)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和基质衍生因子1α(SDF-1α)。在另一个实施方案中，细胞也可以在足够支持细胞生长的量的至少一种细胞因子存在下培养。

在另一个实施方案中，细胞在足够支持细胞生长的量的血小板细胞溶解产物存在下培养。举例来说，细胞可以在足够支持细胞生长的量的人类血小板细胞溶解产物中培养。

在一个实例中，细胞用足够支持细胞生长的量的人类AB血清和人类血小板细胞溶解产物培养。

本领域普通技术人员还可以使用以下例示的方法产生表达升高水平的Ang1的干细胞。

分析细胞的治疗/预防潜能

本领域技术人员将显而易见用于测定表达升高水平Ang1的干细胞治疗或预防或延迟病症发作或进展的能力的方法。举例来说，可以评估干细胞增加Ang1水平的能力。

在一个实例中，测试表达至少0.1μg/10⁶个细胞的量的Ang1的未遗传修饰的干细胞在体外和/或体内增加Ang1表达的能力。在这些实例中，在施用表达升高水平Ang1的干细胞后评估细胞或组织的Ang1表达的发展。

熟练技工从上述将显而易见，本公开还提供了一种鉴别或分离细胞用于治疗、预防或延迟病症的方法，所述方法包括：

(i)向罹患相关病症的受试者施用表达升高水平Ang1的干细胞并评估受试者的病症的症状；

(ii)将(i)中受试者病症的症状与罹患病症的尚未施用干细胞的对照受试者的病症症状或活性比较，其中与对照受试者比较，测试受试者中症状的改善表明干细胞治疗所述病症。细胞可以是本文根据任何实例所述的任何细胞。

实施例

实施例1：通过选择STRO-3 ⁺ 细胞进行MPC免疫选择

骨髓(BM)是从健康的正常成年志愿者(20-35岁)收获。简单地说，从髂后嵴吸出40ml BM到含有肝素锂抗凝剂的管中。

如先前描述(Zannettino等人Blood,92:2613-2628,1998)，通过使用Lymphoprep^TM(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)进行密度梯度分离来制备骨髓单核细胞(BMMNC)。在400×g下在4℃下离心30分钟后，用移液管去除血沉棕黄层，并在由含有5％胎牛血清(FCS,CSLLimited,Victoria,Australia)的汉克氏平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS；Life Technologies,Gaithersburg,MD)构成的“HHF”中洗涤三次。

随后通过如先前描述的磁性活化细胞分类(Gronthos等人,Journal of CellScience116:1827-1835,2003；Gronthos和Simmons,Blood,85,929-940,1995)来分离STRO-3⁺(或TNAP⁺)细胞。简单地说，大约1-3×10⁸BMMNC在由含10％(v/v)正常兔血清的HHF组成的阻断缓冲液中在冰上培育20分钟。将细胞与200μl 10μg/ml STRO-3mAb于阻断缓冲液中的溶液一起在冰上培育1小时。随后细胞在HHF中通过在400×g下离心洗涤两次。添加HHF缓冲液中山羊抗小鼠γ-生物素(Southern Biotechnology Associates,Birmingham,UK)的1/50稀释液并将细胞在冰上培育1小时。将细胞在MACS缓冲液(补充1％BSA、5mM EDTA和0.01％叠氮化钠的无Ca²⁺和Mn²⁺的PBS)中如上洗涤两次并再悬浮于0.9ml最终体积的MACS缓冲液中。

将100μl抗生蛋白链菌素微珠(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach,Germany)添加到细胞悬浮液中并在冰上培育15分钟。将细胞悬浮液洗涤两次并再悬浮于0.5ml MACS缓冲液中，且随后负载到微型MACS柱(MS Columns,Miltenyi Biotec)上，且用0.5ml MACS缓冲液洗涤三次，以收回不结合STRO-3mAb(以寄存编号PTA-7282于2005年12月19日寄存在美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)-参见国际公布WO2006/108229)的细胞。添加另外1ml MACS缓冲液后，将柱从磁体去除并通过正压分离TNAP⁺细胞。来自各洗脱份的细胞的等分试样可以用抗生蛋白链菌素-FITC染色，并通过流式细胞术评估纯度。

以此方式分离的MPC是STRO-1^亮MPC。

实施例2：起始培养基-过程A

具有厄尔平衡盐(Earle’s balanced salt)的伊格尔氏最低必需培养基(MEM)的α改性通常称为伊格尔氏αMEM，其含有非必需氨基酸、丙酮酸钠和其它维生素。这些改性首次描述用于生长杂交小鼠和仓鼠细胞(Stanners等人,Nat New Biol.,230,52-54,1971)。

适于培养初级干细胞的伊格尔氏αMEM培养基可以从多种来源获得，包括LifeTechnologies和Sigma。

建立初级干细胞培养物的详细方法，包括用于例示过程中的所需生长因子，描述于Gronthos和Simmons,Blood,85,929-940,1995中。

在过程A中，补充10％胎牛血清、L-抗坏血酸-2-磷酸盐(100μM)、地塞米松(10-7M)和/或无机磷酸盐(3mM)的伊格尔氏αMEM培养基用于培养干细胞。

实施例3：改性培养基-过程B

在过程B中，通过以下，来改性用于过程A的伊格尔氏αMEM培养基(改性αMEM)：

-将长效抗坏血酸衍生物L-抗坏血酸-2-磷酸盐替换成短效抗坏血酸衍生物L-抗坏血酸钠(50mg/L)；

-FCS从10％v/v减少到5％v/v；

-补充非胎儿血清(5％v/v)。

表1：过程A与B之间的差异概述

实施例4：细胞培养

间质前驱细胞(MPC)是从单个供体获得并在低温保存后存储。

一般地说，细胞培养涉及以下步骤：

将低温保存的MPC解冻，以10,000个细胞/平方厘米接种，并在起始培养基(过程A；n＝3)或者改性培养基(过程B；n＝3)中在20％O₂、37℃下生长到90％汇合。

为了产生条件培养基，将生长培养基替换成补充FCS的EBM-2基础培养基(Lonza)，体积是200μl培养基/平方厘米。将细胞再培养3天，接着收集培养基并离心，以去除任何细胞，并将所得上清液收集且存储在-80℃下。

使用Luminex平台，使用市售试剂盒(Millipore)测量生长因子浓度。

细胞培养后，评估MPC生长动力学(参见图1-3)。在细胞培养过程A和B后，未观测到细胞生长、MPC倍增时间或群体倍增时间显著变化。

MPC还根据其细胞标记物STRO-1、CC9和STRO-4以及促血管生成生长因子Ang1和VEGF的表达水平进行表征。

在细胞培养过程A和B后，MPC中STRO-1、CC9和STRO-4水平是可比的。

然而，培养过程B：

-增加Ang1水平；

-减少VEGF水平；

-Ang1:VEGF比率与以前证明特别有效地加强血管形成的Ang1:VEGF比率一致。

在过程A或B中培养的MPC的条件培养基中Ang1和VEGF的水平(μg/10⁶个细胞)的测量展示于表2中。

表2：从单个供体(三个复制品)中获得的MPC在过程A和B后的表征

实施例5：改性培养条件-过程C和D

为了控制长效抗坏血酸衍生物L-抗坏血酸-2-磷酸盐替换成短效抗坏血酸衍生物L-抗坏血酸钠，来自3个不同供体的MPC连续在α-MEM+10％FCS+50mg/L L-抗坏血酸钠(过程C)或α-MEM+3％人类AB血清+50mg/L L-抗坏血酸钠(过程D)+生长因子(例如PDGF和EGF)中增殖。

在过程C和D中细胞培养后评估Ang1和VEGF水平。在过程C或D中培养的MPC的条件培养基中Ang1和VEGF的水平(ug/10⁶个细胞)展示于表3中。

与过程C比较，培养过程D：

-增加Ang1水平；

-减少VEGF水平；

-增加Ang1:VEGF比率。

与过程A比较，过程C和D使Ang1的表达水平逐渐增加。此表明短效抗坏血酸衍生物和非胎儿血清的存在各独立地增加Ang1表达且对增加Ang1表达一起展现协同效应。

表3：来自3个不同供体(三个复制品)的MPC在过程C和D后的表征

实例6：促炎性M1单核细胞极化成M2表型

从全血免疫选择CD14+单核细胞。基于CD16表达表征单核细胞群体。5.2％细胞展现M2型巨噬细胞的表型特性(CD14⁺CD16⁺)(图4)。

CD14+单核细胞与表达升高水平的Ang1的MPC共培养七天。从两种独立的供体(#023和#009)获得MPC。

三天共培养后，针对以下，评估细胞：

-CD14、CD16表达；以及

-回应于脂多糖(LPS)的TNF-α分泌。添加1ng/ml LPS，历时24小时(+输送抑制剂，最终5小时)。

共培养引起：

-产生展现M2型巨噬细胞的表型特性的巨噬细胞(CD14⁺CD16⁺CD163⁺CD206⁺)(图4)；

-预防巨噬细胞在发炎驱动下(LPS)分泌TNFα(图5)。

共培养7天后，针对IL-10回应于LPS的分泌，评估细胞。添加1ng/ml LPS，历时24小时(+输送抑制剂，最终5小时)。通过细胞内流式细胞术分析IL-10表达。通过与MPC在LPS存在下共培养，增强巨噬细胞产生IL-10(图6)。

这些数据表明表达升高水平的Ang1的MPC促进M2型巨噬细胞产生(图7)。

表达升高水平的Ang1的干细胞与单独或与TNF-α组合的递增水平的IL-1β一起培养，以评估这些细胞因子对PGE2分泌的作用。

观测到IL-1β和TNF-α对PGE2表达的累加效应(图8)。

PGE2促进Th17细胞分化成Th2和TReg细胞以及M1型巨噬细胞极化成M2型巨噬细胞(图7)。在患有例如II型糖尿病等发炎性疾病的受试者中观测到升高的IL-1和TNF-α水平。

因此，回应于TNFα和IL1β，PGE2从表达升高水平的Ang1的干细胞分泌增加表明表达升高水平的Ang1的干细胞可以增加患有发炎性疾病的受试者中消炎细胞产生。具体地说，表达升高水平的Ang1的干细胞可以：

-通过促进M1型巨噬细胞极化成M2型巨噬细胞，增加M2型巨噬细胞产生；和/或

-通过促进Th17细胞分化增加Th2和Treg产生。

实例7：胶原蛋白诱发的关节炎的绵羊模型

表达升高水平的Ang1的干细胞施用于类风湿性关节炎的绵羊模型(Thorpe等人Clinical&Exp.Rheumatology,10:143-150(1992))。模型特征在于类风湿性关节炎的全身性和关节发炎表现。

1.5×10⁸个低温保存的绵羊MPC经由颈静脉静脉内施用。

在两周内评估IL-17和IL-10水平。促炎性和消炎细胞因子水平的变化展示在(图9)中。

还在建立疾病后期(第42天)时施用表达升高水平的Ang1的干细胞。施用干细胞引起关节中发炎细胞因子的水平降低(图10)。

实例8：糖尿病中干细胞施用

3剂间质前驱细胞(MPC)的单一静脉内输注与注射安慰剂对照的患有二甲双胍或二甲双胍加另一种口服药剂控制不足的2型糖尿病的人类受试者比较。在12周内评估基线HbA1c、IL-6、TNF-α、空腹胰岛素、脂肪细胞因子、骨钙蛋白和hsCRP的变化。

受试者分成3组(图11)：

组1：MPC剂量1(0.3×10⁶个细胞/公斤)[n＝15]或安慰剂[n＝5]

组2：MPC剂量1(1.0×10⁶个细胞/公斤)[n＝15]或安慰剂[n＝5]

组3：MPC剂量1(2.0×10⁶个细胞/公斤)[n＝15]或安慰剂[n＝5]

与安慰剂对照受试者中HbA1c略微增加比较，在MPC治疗的受试者中，HbA1c略微降低(表4)。在第8周，与安慰剂对比，在组2中观测到更大程度的HbA1c减少(表4)。在基线HbA1c值≥8％的受试者中观测到更大程度的HbA1c减少的趋势(图15)。在第12周45名受试者中的八名(17.8％)实现目标HbA1c(<7.0％)(图16)。

与安慰剂对照受试者比较，在MPC治疗的受试者中观测到空腹胰岛素和脂肪细胞因子水平改善的趋势(图12)。与安慰剂对照受试者比较，在MPC治疗的受试者中TNF-α和IL-6水平降低，在组3中观测到最显著的降低(图13)。组3中，TNF-α(图13)和IL-6(图14)自基线的变化分别是-0.26pg/ml和-0.47pg/ml(图13)。

表4：

随访获得的基线HbA1c(％)和自基线的变化的概述。

值是与安慰剂的最小平方平均差(SE)

实例9：类风湿性关节炎中干细胞施用

单次静脉内输注2剂间质前驱细胞(MPC)与注射安慰剂对照的患有类风湿性关节炎的分类为不完全抗TNFα反应者的人类受试者或多达2种其它生物制剂失效的那些受试者相比。

试验中包括的48名受试者是：+RF/抗CCP；>4个肿胀/触痛关节；ESR/CRP>ULN。

受试者分成两组：

组1：MPC剂量(1.0×10⁶个细胞/公斤)[n＝16]或安慰剂[n＝8]

组2：MPC剂量(2.0×10⁶个细胞/公斤)[n＝16]或安慰剂[n＝8]

输注三个月后评估的终点包括：

-TNFα；IL-6(图17)、IL-17；RANKL；MMP-1、MMP-3、MMP-9；TIMP-1、TIMP-2、TIMP-4和骨钙蛋白水平。在第0、1、2、4、6、8和10周评估水平；

-ACR 20(图18)/50(图19)/70(图20)；

-ACR核心组(图21；图22)；

-症状缓解(疾病活性评分(DAS28(CRP))<2.6)(图23)；

-疾病活性评分自基线的变化(DAS28)；ESR/CRP；HAQ-DI(图24)；SF-36(症状缓解DAS28(CRP)<2.6)；反应DAS28(CRP)<3.2；图23)。

-在第6和第12个月手/腕x射线。

没有与组1相关的治疗相关严重不良事件(SAE)。在3个月内看到早期和持续功效。

在第1-12周，在组1中，与安慰剂比较，IL-6水平从基线减少(图17)。

数据证明可高于其它生物制剂的约20％潜在症状缓解率(图23)。

组1的十二周主要终点揭露了比安慰剂改善的反应的一致趋势。

跟踪中期分析证明作用在反应者中随着时间推移持久。

组2进行更高单次剂量的测试。

实例10：糖尿病性肾病中干细胞施用

单次静脉内输注2剂间质前驱细胞(MPC)与注射安慰剂对照的患有2型糖尿病和中度至重度慢性肾病的人类受试者相比，所述人类受试者进行针对糖尿病性肾病的ACEi或ARB疗法的稳定方案。

受试者分成两组：

组1：MPC剂量1(1.5×10⁸个细胞/公斤)[n＝10]或安慰剂[n＝5]

组2：MPC剂量1(3.0×10⁸个细胞/公斤)[n＝10]或安慰剂[n＝5]

输注后3个月和6个月评估的终点：

-测量GFR(mGFR[99Tc DTPA])(图25)、估计GFR(eGFR[MDRD])(图25)、IL-6(图26)；和血清肌酸酐水平；

-IL-6与血清肌酸酐水平之间的相关性(图27)。

在初始24周的研究时期内，相对于安慰剂，在MPC治疗的受试者中，观测到通过测量与估计GFR，保护或改善肾功能的趋势：

-两种MPC剂量的治疗作用类似；

-在基线eGFR>30ml/min/1.73m²的受试者中MPC的治疗作用更显著(图28)；

-在基线IL-6水平超过中位数的受试者中MPC的治疗作用更显著；

-基线IL-6水平与血清肌酸酐的MPC相关的改善之间显著相关(图27)；

-在MPC组中，对比安慰剂，第12周血清IL-6水平存在剂量依赖性变化(图26)。

本领域技术人员应了解，在不脱离如广泛描述的本公开的精神或范围下，可对如特定实施方案中所示的公开内容进行许多改变和/或修改。因此，本发明的实施方案在各个方面都被认为是例示性而非限制性的。

本申请主张于2014年6月10日提出的AU 2014901294和2014年6月13日提出的AU2014902257的优先权，其公开内容以引用的方式并入本文中。

本文中论述和/或提及的所有公布都整体并入本文中。

已经包括在本说明书内的文献、法案、材料、装置、论文等的任何论述都仅仅是为了提供本公开的背景。并不因为任何或所有这些内容在本申请的每个权利要求的优先权日前已存在而承认其形成现有技术基础的一部分，或是与本公开有关的领域中的公知常识。

Claims

1.一种增加有需要的受试者中消炎细胞的产生和/或功能的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含未遗传修饰的干细胞的组合物，其中所述未遗传修饰的干细胞表达至少0.1μg/10⁶个细胞的量的血管生成素-1(Ang1)。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述消炎细胞是Th2细胞、TReg细胞或M2型巨噬细胞。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法增加所述受试者中M2型巨噬细胞的数目。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法增加所述受试者中M2型巨噬细胞的数目至总单核细胞群体的至少10％。

5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法增加所述受试者中M2型巨噬细胞的数目至总单核细胞群体的至少20％。

6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法增加所述受试者中M2型巨噬细胞的数目至总单核细胞群体的至少40％。

7.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法增加所述受试者中M2型巨噬细胞的数目至总单核细胞群体的至少80％。

8.如权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述M2型巨噬细胞是CD14++CD16+。

9.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法促进巨噬细胞从M1极化成M2表型。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法促进促炎性T辅助细胞分化成Th2或TReg细胞。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述促炎性T辅助细胞是Th17细胞。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述增加所述受试者中消炎细胞的产生和/或功能引起：

-所述受试者中IL-6水平降低；

-所述受试者中TNF-α水平降低；和/或

-所述受试者中IL-10水平增加。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述方法增加所述受试者中消炎细胞因子的水平。

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述方法增加所述受试者中IL-10的水平。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述方法降低所述受试者中促炎性细胞因子的水平。

16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述方法降低所述受试者中IL-6、TNF-α和/或IL-17中任一者的水平。

17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法还抑制促炎性细胞的产生和/或功能。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述促炎性细胞是Th17细胞或M1型巨噬细胞。

19.一种治疗受试者的发炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含未遗传修饰的干细胞的组合物，其中所述未遗传修饰的干细胞表达至少0.1μg/10⁶个细胞的量的血管生成素-1(Ang1)。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述未遗传修饰的干细胞表达至少0.5μg/10⁶个细胞的量的Ang1。

21.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述未遗传修饰的干细胞表达至少0.7μg/10⁶个细胞的量的Ang1。

22.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述未遗传修饰的干细胞表达少于约0.05μg/10⁶个细胞的量的血管内皮生长因子(VEGF)。

23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述未遗传修饰的干细胞表达至少约20:1比率的Ang1:VEGF。

24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述未遗传修饰的干细胞是间质前驱细胞。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述干细胞是间质千细胞。

26.如权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述发炎性疾病是糖尿病或选自由以下组成的组的糖尿病相关病状或症状：异常伤口愈合、心脏病发作症状、中风症状、周围血管疾病症状、截肢、肾病症状、肾衰竭、失明、神经病、肾病、视网膜病、发炎、性交不能或非酒精性脂肪肝炎(NASH)。

27.如权利要求19至26中任一项所述的方法，其中所述发炎性疾病是II型糖尿病。

28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用每公斤约0.1×10⁶至约3×10⁶个干细胞。

29.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用每公斤约0.3×10⁶至约2×10⁶个干细胞。

30.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用每公斤约1×10⁶至约2×10⁶个干细胞。

31.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用每公斤约2×10⁶个干细胞。

32.如权利要求20至25中任一项所述的方法，其中以下任一者指示所述受试者的所述糖尿病或糖尿病相关病状或症状已得到治疗：

-HbA1c值(总血红蛋白％)减少；

-空腹胰岛素水平降低；

-IL-6水平降低；

-TNF-α水平降低；和/或

-脂肪细胞因子水平增加。

33.如权利要求26至32中任一项所述的方法，其中二甲双胍(metformin)对所述受试者的葡萄糖水平的控制不足。

34.如权利要求26至33中任一项所述的方法，其中所述受试者具有超过7.5％的基线HbA1c值。

35.如权利要求26至34中任一项所述的方法，其中所述受试者具有大于或等于8％的基线HbA1c值。

36.如权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述发炎性疾病是类风湿性关节炎。

37.如权利要求26至31和36中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用每公斤约0.5×10⁶至约3.0×10⁶个干细胞。

38.如权利要求26至31和36中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用每公斤约1.0×10⁶至约2.0×10⁶个干细胞。

39.如权利要求26至31和36至38中任一项所述的方法，其中以下任一者指示所述类风湿性关节炎已得到治疗：

-ACR20；

-ACR50；

-ACR70；

-IL-6水平降低；和/或

-疾病活性评分降低。

40.如权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述发炎性疾病是糖尿病性肾病。

41.如权利要求26至31和40中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用约1.0×10⁸至约4.0×10⁸个干细胞。

42.如权利要求26至31和40中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用约1.5×10⁸至约3.0×10⁸个干细胞。

43.如权利要求26至31和40至42中任一项所述的方法，其中以下任一者指示所述糖尿病性肾病已得到治疗：

-抑制eGFR和/或mGFR下降；

-改善eGFR和/或mGFR；和/或

-IL-6水平降低。

44.如权利要求26至31或40至43中任一项所述的方法，其中所述受试者的基线eGFR超过约35ml/min/1.73m²。

45.如权利要求26至31或40至44中任一项所述的方法，其中所述受试者的基线eGFR超过30ml/min/1.73m²。

46.如权利要求26至31或40至44中任一项所述的方法，其中所述受试者的基线eGFR超过28ml/min/1.73m²。

47.如权利要求26至31或40至44中任一项所述的方法，其中所述受试者的基线eGFR超过25ml/min/1.73m²。

48.如权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述干细胞全身施用。

49.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中所述干细胞静脉内施用。

50.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述干细胞多剂量施用。

51.一种包含未遗传修饰的干细胞的组合物，其中所述未遗传修饰的干细胞表达至少0.1μg/10⁶个细胞的量的血管生成素-1(Ang1)，用于治疗发炎性病症。

52.一种包含未遗传修饰的干细胞的组合物的用途，其中所述未遗传修饰的干细胞表达至少0.1μg/10⁶个细胞的量的血管生成素-1(Ang1)，其用于制造供治疗发炎性疾病用的药物。