KR101598947B1 - 간엽 전구세포의 증식 및/또는 생존성 증강 방법 - Google Patents

간엽 전구세포의 증식 및/또는 생존성 증강 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간엽 전구세포(MPC) 및/또는 그로부터 유래된 전구세포를 SDF-1 또는 그 유사체에 노출시키는 것을 포함하는, MPC 또는 그 자손의 증식 및/또는 생존성을 증강시키는 시험관내 또는 생체내 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 분리된 MPC 또는 그 자손과, SDF-1 또는 그 유사체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 방법 및 조성물을 포유류에서 골을 생성하는 생체내 또는 생체외(ex vivo) 방법에 관한 것이다.

Description

간엽 전구세포의 증식 및/또는 생존성 증강 방법 {METHOD OF ENHANCING PROLIFERATION AND/OR SURVIVAL OF MESENCHYMAL PRECURSOR CELLS (MPC)}
본 발명은 간엽 전구세포(MPC) 및/또는 그로부터 유래된 전구세포를 포함하는 조성물 및 이들 세포의 증식 및/또는 생존성을 증강시키는 시험관내 또는 생체내 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 포유류에서 생체내 또는 생체외(ex vivo) 골을 생성하는 방법에 관한 것이다.
골 리모델링은 골의 기계적 강도 및 구조를 유지하는, 골 의 재흡수 후 신생 골 형성으로 이어지는, 성인 골에서 일어나는 연속적인 생리 과정이다. 이러한 연계된 과정에 관여하는 골 세포는 골-재흡수 세포(단핵구/대식 세포 계통의 조혈 세포로부터 유래된 파골세포) 및 골-형성 세포(간엽 기원의 골모세포)를 포함한다. 골 재흡수 과정은 류마티스 관절염 및 그외 염증성 관절염에서 국소 골절 또는 골침식과 골다공증에서 나타나는 미만성 골 감소(diffuse bone loss)와 같이, 류마티스 연구자들의 일이 관련된 수많은 임상 상태와 관련있다.
파골세포의 활성화는 류마티스 관절염(RA)에서의 침식이나 일반적인 골 감소와 같은, 병리학적 골 재흡수에 중요한 세포 과정이다. 과도하게 파골세포의 활성을 촉발시키는 수많은 인자들 중에서, IL-1과 같은 사이토카인 또는 종양 괴사 인자(TNF)-α가 중요한 역할을 수행한다. 최근에, 간질 세포(stromal cell) 유래 인자-1(SDF-1)인 케모카인이 인간 파골세포의 화학주성 보충(chemotactic recruitment), 분화 및 생존을 촉진시키는 것으로 입증되었다(Wright et al., Bone 36:840-853, 2005; Zannettino et al., Cancer Res 65(5): 1700-1709, 2005; Grassi et al., J. Cell. Physiol. 199:244-251, 2004).
케모카인은 다양한 생물 반응을 조절하는 화학주성 단백질의 슈퍼패밀리이며, 이들은 백혈구 및 림프구의 복수 계통의 신체 기관 조직을 보충하게 한다. 케모카인은 단백질의 첫번째 2개의 시스테인 잔기들의 상대적인 위치에 따라 2가지 패밀리로 분류할 수 있다. 한가지 패밀리는, 첫번째 2개의 시스테인 사이에 아미노산 잔기 하나가 있는 것으로, 즉 CXC 케모카인이며, 다른 패밀리는 첫번째 2개의 시스테인이 이웃해 있는 것, 즉 CC 케모카인이다. 인간의 경우, CXC 케모카인 유전자들은 염색체 4에 군집되어 있으며(염색체 10에 위치한 SDF-1 유전자는 제외), CC 케모카인은 염색체 17에 군집되어 있다.
케모카인의 분자 표적물은 세포 표면 리셉터이다. 이러한 리셉터 중 하나는 CXC 케모카인 리셉터4(CXCR4)로, 7개의 트랜스멤브레인 단백질로 이루어져 있으며, 이는 G1에 연계되어 있으며, 종전에는 LESTR(Loetsoher et al.,(1994) J Biol Chern 269 232-237, 1994), HUMSTR(Federsppiel et al., Genomics 16, 707-712, 1993) 및 Fusin(Feng et al., Science 272 872-877 1996)로 불리웠다. CXCR4는 조혈 기원의 세포들로부터 폭넓게 발현되며, 인간 면역결핍 바이러스1(HIV-1)에 대한 CD4+를 가지는 주된 공-리셉터이다(Feng et al., Science 272 872-877, 1996).
현재, CXCR4에 대해 유일하게 공지된 천연 리간드는 SDF-1이다. 기질 세포 유래 인자1α(SDF-1α) 및 기질 세포 유래 인자1β(SDF-1β)는 매우 유사한 단백질이다(이들은 같이 SDF-1이라 함). SDF-1 α 및 SDF-1β의 천연 아미노산 서열은 이들 단백질로 공지되어 있으며, 이들 단백질을 코딩하는 게놈 서열도 공지되어 있다(미국 특허 제 5,563,048 및 미국 특허 제 5,756,084호).
SDF-1의 3차 결정 구조는 공지되어 있다(Crump et al., EMBO J. 16 6996-7007, 1997). SDF-1의 구조-활성 분석으로, N-말단의 1-8 또는 1-9 잔기들이 리셉터 결합에 관여하지만, 1-8 및 1-9 펩티드는 단독으로는 리셉터 결합을 나타내는 시험관내 활성을 보이지 않는다는 것이 확인되었으며, 이는 상기 펩티드가 리셉터 결합에 필수적인 구조를 취하지 않는다는 연구 결과를 뒷받침한다. 이러한 결과는 단백질 스캐폴드의 나머지 부분, 및/또는 단백질 도처의 다양한 컨센서스 리셉터 결합부가 N-말단의 리셉터 결합에 구조적 요건을 매개하는데 중요하다는 것을 암시한다(Crump et al., EMBO J. 16 6996-7007, 1997). 이러한 결과를 토대로, 2가지 결합부, 잔기 1-17, 및 N-말단 영역 및 RFFESH 상류부가 참여하는 SDF-1의 CXCR4 결합 모델 2가지가 제안되었다(Crump et al., EMBO J. 16 6996-7007, 1997). 2가지 추정 결합 부위는 CXC 케모카인 전체 패밀리의 특징인 CXC 모티프에 의해 연결된다. 이들 2가지 추정 결합 부위는 다른 CC 및 CXC 케모카인에서 중요한 것으로 동정되었다(Crump et al., EMBO J. 16 6996-7007, 1997). 이는 매우 다양한 케모카인의 N-말단 영역이 리셉터 활성화에는 중요하지만, SDF-1 이외의 케모카인의 N-말단 펩티드는 리셉터 결합 활성이 결핍되어 있으며 리셉터 작용제가 아닌 것으로 보고된 바와 일치된다(Crump et al., EMBO J. 16: 6996-7007, 1997).
출생 후의 인간 골수 기질 줄기세포(postnatal human bone marrow stromal stem cell, BMSSC) 또는 간엽 전구세포(MPC)는 면역약화된(immunocompromised) 마우스에 이식하였을때, 조혈-지원성 골수 기관 및 연합된 골주(associated bone trabecular)를 재생하는 능력을 가지고 있다(Friedenstein et al. Exp Hematol. 6: 440-444, 1978; Kuznetsov et al. J Bone Miner Res. 12: 1335-1347, 1997; Pittenger et al. Science 284: 143-147, 1999; Bianco et al., Stem Cells 19: 180-192, 2001; Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003). 또한, 최근 연구에서는 BMSSC가 그 자체의 골수 지지 기질(myelo supportive stroma), 골모세포, 연골세포, 지방 세포, 근육모세포, 간 세포, 심근 세포, 및 신경 세포와 같은 다양한 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력으로 인해, 처음에 인식된 바 보다 더욱 가소적인 것으로 보고되었다(Liechty et al. Nat Med. 6: 1282-1286, 2000; Zhao et al. Bxp Neurol. 174: 11-20, 2002; Verfaillie et al. Ann N Y Acad Sci. 996: 231-234, 2003). 이러한 분화는 골 재생에 이어 생체내-증폭시킨(expanded) BMSSC 집단의 사용 가능성에 대한 조사를 초래하였다. 그러나, 인간의 다능성 BMSSC의 증식 및 생존과, 이러한 세포의 골 분화를 조절하는 임상 인자에 대한 이해 부족으로 인해 이러한 실험은 대부분 진행되지 않고 있다.
본 발명은 간엽 전구세포(MPC) 및/또는 그로부터 유래된 전구세포를 SDF-1 또는 그 유사체에 노출시키는 것을 포함하는, MPC 또는 그 자손의 증식 및/또는 생존성을 증강시키는 시험관내 또는 생체내 방법, 분리된 MPC 또는 그 자손과, SDF-1 또는 그 유사체를 포함하는 조성물, 이러한 방법 및 조성물을 포유류에서 골을 생성하는 생체내 또는 생체외(ex vivo) 방법을 제공한다.
현재 본 발명자들은 배양전에 정제된 BMSSC에 의해 고발현되며 차별적으로 발현되는 유전자로서, SDF-1을 동정하였다. 특히, 본 발명자들은 골모세포 및 골세포/골 라이닝 세포(lining cell)의 대표적인 성숙형 세포 타입에 비해, 시험관내에서 배양한 미성숙 골모세포가 SDF-1을 보다 높은 수준으로 발현함을 발견하였다. 또한, 골유도 조건에서 BMSSC를 배양하였을때 SDF-1 발현은 신속하게 하향 조절된다.
또한, BMSSC는 기능성 세포 표면 SDF-1 리셉터(CXCR4)를 발현하는 것으로 입증되었다. 형질도입한 BMSSC 세포주는 SDF-1을 높은 수준으로 분비하며, 대조군 BMSSC 세포주에 비해 생체내에서 이소 골(ectopic bone)을 형성하는 능력이 증대된다. 더욱이, SDF-1 고발현성 BMSSC는 세포 증식 및 인터루킨-4-유발성 세포사멸에 대한 보호 능력 증가를 보였다. 이와 유사하게, 섬유아세포 콜로니 형성 유닛(CFU-F)도 혈소판 유래 성장 인자 BB(PDGF-BB) 및 SDF-1와의 시험관내 상승 작용으로, 증가된 증식성 및 α-인터페론-2a-유발성 세포사멸에 대한 내성을 나타낸다.
이러한 사실들은, 케모카인 SDF-1이 미성숙 BMSSC 집단의 증식, 생존 및 골 형성력에 작용함을 의미한다.
따라서, 본 발명은 간엽 전구세포(MPC) 또는 그 자손의 증식 및/또는 생존을 증강시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 MPC 또는 그 자손을 SDF-1 또는 그 유사체에 노출시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 MPC 또는 그 자손을, SDF-1 또는 그 유사체에 노출시켜, 상기 MPC 또는 자손의 증식 및/또는 생존을 증강시키는 단계, 및 상기 증식된 집단을 상기 MPC 또는 그 자손을 특정 조직 타입으로 분화되도록 하는 조건에 두는 단계를 포함하는, 조직 특이적 분화가 예정된(committed) 세포 집단을 분화시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 SDF-1 또는 그 유사체를 과다 발현하도록 유전자 변형된 MPC 또는 그로부터 유래된 전구세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 형질감염된(transfected) MPC 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 MPC 또는 그 자손, 및 SDF-1 또는 그 유사체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 MPC 또는 그 자손을 외인성 SDF-1 또는 그 유사체에 노출시키는 단계를 포함하는, 대상체에게서 골을 생성하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물은 원하는 골 형성 부위로 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게서 골을 생성하는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 케모카인 SDF-1이 미성숙형 BNSSC 집단의 증식, 생존 및 골 형성력에 작용한다는 놀라운 사실을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 간엽 전구세포(MPC) 또는 그의 자손을 SDF-1 또는 그 유사체에 노출시키는 단계를 포함하는, MPC 또는 그의 자손의 증식 및/또는 생존을 증강시키는 방법을 제공한다.
본원에서, MPC는 다수의 다능성 세포 콜로니를 형성할 수 있는 비-조혈계 전구세포이다.
본 발명의 바람직한 예에서, MPC는 STRO-1bright, VCAM-Ibright, THY-1bright, CD 146bright 및 STR0-2bright로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커에 양성이다.
본원에서, "bright"는 검출가능하게 표지되었을 때 비교적 높은 신호를 형성하는 세포 표면상의 마커를 의미한다. 본 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, "bright" 세포는 샘플에서 다른 세포보다 표적 마커 단백질(예, STRO-1에 의해 인식된 항원)을 더 많이 발현하는 것으로 제안된다. 예컨대, STRO-1bright 세포는 FACS 분석으로 결정된 바와 따라, FITC-접합된 STRO-1 항체로 표지하였을때, 비-bright 세포(STRO- ldull / neg) 보다 형광 신호를 더 강하게 형성한다. 바람직하게는, "bright" 세포는 출발 샘플에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵구 세포로, 약 0.1% 이상을 구성한다. 다른 예에서, "bright" 세포는 출발 샘플에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵구 세포의 약 0.1%, 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 1.5% 이상 또는 약 2% 이상을 구성한다. 바람직하기로는, "bright" 세포는 STRO-1bright, VCAM-Ibright, THY-1bright, STRO-2bright 및/또는 CD146bright 세포이다. WO 01/04268에서 논의된 바와 같이, 표지 강도로 선택된 세포의 하위 집단, 예컨대, STRO-1bright 세포는 세포 마커의 양성/음성 단독 검사를 기본으로 선택된 하위 집단 보다 MPC 비율이 높다.
본 발명의 다른 바람직한 예에서, MPC는 STRO-1bri, LFA-3, THY-I, VCAM-I, ICAM-I, PECAM-I, P-셀렉틴, L-셀렉틴, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD29, CD18, CD61, β-1 인테그린, 6-19, 트롬보모듈린(thrombomodulin), CDlO, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, 렙틴-R,(STRO-2 = 렙틴-R), RANKL 및 CD146, 또는 이들 마커의 임의 조합으로 이루어진, 간엽 전구세포에 특이적인 표면 마커 군으로부터 선택된 2 이상의 마커를 보유(carry)한다.
본 발명의 다른 바람직한 예에서, MPC는 CD34, CD14, CD45, CBFA-1, 콜라겐 타입 II, PPARγ2 및 글리코포린A로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커에 대해 음성이다.
MPC 다량 함유 집단의 제조 방법은 WO 01/04268 및 WO 2004/085630에 개시되어 있다.
시험관내에서, MPC는 거의 절대적으로 순수한 제조물로서는 제조되지 않으며, 일반적으로 TSCC(tissue specific committed cell)인 다른 세포와 함께 존재될 것이다. WO 01/04268은 약 0.1% 내지 90%의 순도로 골수로부터 이러한 세포를 수확하는 방법을 언급하고 있다. 다른 수확 방법은 MPC를 보다 낮은 수준으로 존재하는 비율로 수확할 수 있다.
본 발명의 방법이 적용되는 MPC를 포함하는 집단은 조직원으로부터 직접적으로 수확할 수 있거나, 또는 이미 생체외에서 증폭된 집단일 수 있다.
예컨대, 본 발명의 방법은 이들이 존재하는 집단의 총 세포의 약 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 95% 이상을 포함하는, 실질적으로 정제된 MPC의 수확한, 무증폭시킨 집단에 적용할 수 있다. 이러한 수준은 예컨대 STRO-1bright, VCAM-Ibright, THY-1bright, CD146bright 및 STRO-2bright로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커에 양성인 세포를 선택함으로써 달성될 수 있다.
MPC는 WO 01/04268 또는 WO 2004/085630에 기재된 임의의 하나 이상의 조직 타입, 즉 골수, 치수세포(dental pulp), 지방 조직 및 피부, 또는 보다 광의적으로는 지방 조직, 치아, 치수, 피부, 간, 신장, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 비장, 림프절, 흉선, 췌장, 골, 인대, 골수, 힘줄 및 골격근으로부터 유래될 수 있다.
이러한 세포의 바람직한 공급원은 인간이며, 그러나, 본 발명은 또한 소, 양, 돼지 등과 같은 농가 가축, 개 및 고양이와 같은 가축, 마우스, 랫, 햄스터 및 토끼와 같은 실험용 동물 또는 말과 같이 스포츠에 사용되는 동물을 포함하는, 동물에 적용가능하다.
용어 "자손(progeny)"은 본원에서 MPC 유래 세포를 의미한다. 자손은 전구세포 또는 완전히 분화된 세포(예, 골세포)일 수 있다.
바람직한 일예에서, 자손은 전구세포이다.
본원에서, MPC 유래 "전구세포"는 부분적으로 특수화되거나 또는 분열되어 분화된 세포로 발생되는 조직 특이적 분화가 예정된 세포(TSCC)이다. 전구세포는 분화 경로가 예정되어 있지만, 일반적으로 성숙한 완전히 분화된 세포의 마커를 발현하지 않거나, 성숙한 완전히 분화된 세포로서는 기능하지 않는다. 따라서, 전구세포는 관련 세포 타입으로 분화되지만 정상적인 상태에서는 매우 다양한 세포 타입을 형성할 순 없다. 전구세포는 한 계통의 세포 또는 조직 타입으로 분화가 예정되는 경향이 있지만, 이들의 2가지 세포 또는 조직 타입중 하나로 분화될 수 있는 2가지 가능성을 가질 수 있다.
전구세포가 분화 예정될 수 있는 계통의 비제한적인 예로는, 골수 전구세포; 담관 상피 세포 및 간 세포로 될 수 있는 다능성 간 세포 전구체; 희소돌기아교 세포(oligodendrocyte) 및 성상 세포(astrocyte)로 진행되는 아교 세포 전구체를 만들 수 있는 신경 한정 세포; 신경으로 진행되는 신경 전구체; 심장 근육 및 심근 세포에 대한 전구체, 글루코스-반응성 인슐린 분비성 췌장 β 세포주가 있다. 그외 분화가 예정된 전구세포로는, 연골세포, 상아질모세포(odontoblast), 상아질-생산 및 연골세포, 및 하기 세포의 전구세포를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다: 망막색소 상피 세포, 섬유아세포, 각질 세포와 같은 피부 세포, 수지상 세포(dendritic cell), 모낭 세포, 신관(renal duct) 상피 세포, 평활근 및 골격근 세포, 고환 전구세포, 혈관내피 세포, 힘줄, 인대, 연골, 지방 세포, 섬유아세포, 골수 기질(marrow stroma), 심장 근육, 평활근, 골격근, 혈관주위 세포(pericyte), 혈관, 상피, 아교, 신경, 성상 세포 및 희소돌기아교 세포. 또한, 전구세포는 지방 세포, 유문상, 골, 연골, 탄력 및 섬유 연결 조직을 포함하는 연결 조직을 특이적으로 유도하는 것을 포함한다. 본 발명의 바람직한 예에서, 전구세포는 골 전구세포이다.
본원에서, "골 전구세포"는 골모세포로 분화 또는 증폭가능한 모든 세포이다. 바람직한 골 전구세포로는 골전구세포(osteoprogenitor cell) 및 골모전구세포(preosteoblast cell)를 포함한다.
본 발명에 따른 방법에 의해 유효한 증식 증강은 미자극 대조군에 상대적으로 많은 10, 20, 30, 40 또는 50%의 MPC 수 증가를 형성할 수 있다. 대안적으로, 증가는 1배, 2배 또는 그 이상의 배수일 수 있다.
본 발명의 바람직한 예에서, SDF-1 유사체는 CXCR4 신호 전달을 활성화하는 리간드이다. SDF-1 유사체는, 예컨대 천연적으로 형성되는 SDF-1의 생물학적으로 활성 단편, 변이체 또는 유도체일 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 예에 있어서, SDF-1 유사체는 HIV-1 코트 단백질 gpl20, AMD3100(AnorMED Inc, British Columbia, Canada) 및 ALX40-4C(Allelix Biopharmaceuticals Inc, Canada)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 바람직한 예에 있어서, MPC 또는 그로부터 유래된 자손은 또한, 외인성 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 줄기세포 인자(SCF), fit 3 리간드(FL), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-6(IL-6), 1α,25-디하이드록시비타민 D3(1,25D), 종양 괴사 인자 α(TNF-α 및 인터루킨-1β(IL-1β)로 이루어진 군으로부터 선택되는 자극성 인자에 노출된다.
본 발명의 방법은 예컨대 신규로 수확하거나 또는 생체외 증폭시킨 배양물과 관련된, 세포의 시험관내 배양에 이용할 수 있는 것으로 일반적으로 이해되지만, 본 발명은 MPC 또는 그로부터 유래된 자손이 신체의 조직 부위 자체(in situ)에 있으며, 여기에 외인성 SDF-1 또는 그의 유사체가 전달되는 방식으로 이용될 수도 있다. 이러한 전달이 한번으로 적합할 수도 있지만, 시간 간격을 두고 진행되는 전달(temporally spaced delivery)이 가속화된 또는 보다 큰 효과를 제공할 수 있다.
외인성 SDF-1 또는 그 유사체는 발현되어 폴리펩티드를 생산할 수 있는 핵산의 형태나 또는 폴리펩티드 형태로 대상체에게 투여될 수 있다. 예컨대, 외인성 SDF-1 또는 그 유사체는 유전학적으로 SDF-1 또는 그 유사체를 과다 발현하도록 변형되어진 숙주 세포의 형태로 또는 핵산 함유 조성물 형태로 투여될 수 있다.
생체내 전달에서, MPC 또는 그로부터 유래된 자손을 포함하는 조성물을(SDF-1 또는 그 유사체처럼 동시에) 전달하는 것이 적합할 수 있다. 예컨대, 골, 심장 근육, 혈관 조직이나 내피 세포에 상처가 난 경우에, 전달된 자손은 바람직하기로는 적어도 부분적으로 해당 세포 타입으로 분화가 예정된다(예, 골모세포, 심근 세포 또는 내피 세포). 이는 혼합된 전구세포 배양물 또는 예컨대 조직 특이적 분화가 예정된 세포 타입에 존재하는 것으로 알려진 마커로 분류되는 더욱 정제된 형태의 일부분으로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 전달되는 조성물은 조성물에 존재하거나 또는 표적 부위 자체에 존재하는 MPC를 원하는 한가지 이상의 조직 타입으로 분화시키기 위해, 하나 이상의 분화 자극 인자를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 MPC 또는 그로부터 유래된 자손을 외인성 SDF-1 또는 그 유사체에 노출시켜, MPC 또는 그 자손의 증식 및/또는 생존을 증강시키는 단계, 및 상기 증폭된 집단을 MPC 또는 그 자손이 특정 조직 타입으로 분화되게하는 조건에 두는 단계를 포함하는, 조직 특이적 분화가 예정된 세포 집단을 발생시키는 방법을 제공한다.
상기 조직 타입은 심장 근육, 혈관 조직, 골모세포, 상아질모세포, 골세포, 골 라이닝 세포 및 내피 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 세포 타입의 시험관내 발생을 위한 조건, 및 이러한 조직 타입을 생체내 조성하기 위한 조건의 예는, 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
상기 방법은 골격근, 심장 근육, 골, 치아 또는 혈관 조직의 생성 또는 재생에 적용될 수 있다. 특히, 상기 방법은 심장 근육, 심근 세포, 연골세포, 골모세포, 파골세포, 상아질모세포, 상아질 형성 연골세포, 골세포, 골 라이닝 세포, 골격 근육 세포, 혈관 내피 세포, 골수 기질, 파골세포 및 조혈 지지성 기질, 심장 근육, 골격근, 내피 세포 및 혈관 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 또는 조직의 생성이나 재생에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 특정 예는, MPC 또는 그로부터 유래된 자손을 외인성 SDF-1 또는 그 유사체에 노출시켜, MPC 또는 그 자손의 증식 및/또는 생존을 증강시키는 단계, 및 상기 증폭된 집단을 MPC가 골 전구세포로 또는 골 전구세포가 골로 분화되게하는 조건에 두는 단계를 포함하는, 생체외 골 생성 방법을 제공한다.
MPC 또는 그로부터 유래된 골 전구세포를 골로 분화되게하는 조건은 예컨대 10% FCS, 100 μM L-아스코르베이트-2-포스페이트, 덱사메타손 10-7 M 및 3 mM 무기 인산염이 보충된 αMEM에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 조건은 인간 BM 기질 세포가 시험관내에서 미네랄화된 골 기질로 발생하도록 유도하는 것으로 알려져 있다(Gronthos et al, Blood. 84-4164-13, 1994).
대안적인 예로, 상기 방법은 골 전구세포를 I형 콜라겐, 피브리노겐, 피브린, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 오스테오칼신 또는 오스테오넥틴의 존재하에 배양함으로써, 골 전구세포를 골모세포로 분화시키는 단계를 포함할 수 있다. 일 특정 예에서, 골 전구세포는 I형 콜라겐, 피브리노겐 및 피브린의 존재하에 배양한다. 대안적인 예에서, 골 전구세포는 I형 콜라겐, 피브리노겐, 피브린, 오스테오칼신 및 오스테오넥틴의 존재하에 배양한다. 상기 방법에서, I형 콜라겐, 피브리노겐, 피브린, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 오스테오칼신 또는 오스테오넥틴은 단독으로 또는 성장 인자 존재하에 사용할 수 있다. 전술한 화합물의 임의 조합은 본 발명에 포함되는 것으로 이해될 것이다.
또한, 본 발명은 분리된 MPC 또는 그로부터 유래된 자손 및 SDF-1 또는 그 유사체를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직한 예에서, 상기 조성물은 조성물의 총 세포의 약 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 95% 이상을 구성하는 정제된 MPC 또는 자손을 실질적으로 포함한다.
다른 바람직한 예에서, SDF-1 또는 그 유사체는 상기 조성물에 약 0.1 nM - 0.1 M, 0.1 nM - 0.05 M, 0.05 nM - 15 μM 또는 0.01 nM-10 μM 농도로 존재된다.
또한, 본 발명은 SDF-1을 과다 발현하도록 유전자 변형된 MPC 또는 그로부터 유래된 전구세포를 제공한다.
일 예에서, MPC 또는 그로부터 유래된 전구세포는 SDF-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염된다.
다른 예에서, MPC 또는 그로부터 유래된 전구세포의 게놈(유전제)는 SDF-1 단백질이 과다 발현 되도록 변형된다. 일 예에서, MPC 또는 그로부터 유래된 전구세포의 SDF-1 유전자 조절부는 SDF-1 단백질 과다 발현을 가져오도록 변형된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 형질감염된 MPC 집단을 포함하는 조성물을 제공하다.
본 발명의 상기 조성물은 하나 이상의 부가적인 자극성 인자를 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 부가적인 자극성 인자는 PDGF, SCF, FL, G-CSF, IL-3, IL-6, 1,25D, TNF-α 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 조성물을 전신 또는 국소 투여하여, 선택된 조직 타입, 예컨대 손상된 조직에 이식될 수 있게 하는 전달 시스템을 포함한다. 예컨대, 본 발명의 조성물은 직접 표적 조직으로 주입될 수 있다. 주입 부위는 바람직하기로는 손상부나 또는 손상된 조직 근처이다. 대안적으로, SDF-1을 발현하는 유전자 변형된 MPC 및 특이적인 재조합 리간드 또는 리셉터를 대상체에 도입하여, 표적 조직에서 동계 결합(cognate) 파트너의 발현을 유도함으로써 세포를 원하는 표적 조직으로 표적화한다.
본 발명의 조성물은 조직, 예컨대 허혈성 또는 재관류 손상으로 인해 세포사멸 과정을 밟고 있는 심근 세포, 골, 힘줄, 인대 또는 연골의 외상성 손상을 수반하는 연골세포, 또는 알코올 유발성 간경변성 간의 간 세포를 복구 또는 재생 조직하는데 사용되는, MPC 또는 그로부터 유래된 세포의 생존을 증강하는데 유용한 것으로 이해될 것이다.
일 특정예에서, 본 발명의 조성물은 골 복구 또는 재생에 사용되는, 이식된 MPC 또는 그로부터 유래된 세포의 생존을 증강하는데 유용하다. 따라서, 본 발명의 조성물은 흡수가능한 젤라틴, 셀룰로스 또는 콜라겐과 같은 매트릭스를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 소폰지, 스트립, 분말, 겔 또는 웹(web) 형태로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 MPC 또는 그로부터 유래된 자손을 대상체에서 외인성 SDF-1 또는 그 유사체에 노출시키는 단계를 포함하는, 대상체에게서 골을 생성하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 대상체의 골 형성을 원하는 부위에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게서 골을 생성하는 방법을 제공한다.
이러한 방법은 예컨대 골 복구에 사용될 수 있으며, 이러한 본 발명의 조성물 및 선택적으로 적정 지지체는 골 형성이 필요한 부위에 도입될 수 있다. 따라서, 예컨대, 골 손상 또는 종양 감염으로 인한 골 단면이 없어져서 초래되는 골격 결함(skeletal defect)은 기형 부위에 본 발명의 조성물을 이식함으로써 복구할 수 있다. 이러한 기형의 예로는 분절성 골 결함(segmental bone defect), 불유합(non-union), 부정유합(malunion) 또는 지연성 유합(delayed union), 낭(cyst), 종양, 괴사, 또는 발생 이상을 포함한다. 그외 관절 재건, 미용성 재건 또는 골 유합, 예컨대 척추골 융합이나 관절 융합과 같은 골 증대가 필요한 증상을, 골 증대가 필요한 부위에 본 발명의 조성물을 투여함으로써 대상체를 치료할 수 있다. 상기 조성물은 그로부터 골 형성을 증대시키기에 충분한 수준으로 예컨대 젤라틴, 셀룰로스 또는 콜라겐 기반 매질과 같은 재흡수성 바이오폴리머와 조합되거나 또는 칼슘 포스페이트 세라믹 비히클과 조합할 수 있다. 상기 재흡수성 바이오폴리머는 분말 또는 스폰지 형태일 수 있으며, 바람직하기로는 돼지 피부 유래의 젤라틴이다. 상기 세라믹 비히클은 미립 형태이거나 또는 구조적으로 안정한 3차 구조 이식물의 형태일 수 있다. 상기 구조적으로 안정한 3차 구조 이식물은 예컨대 정육면체, 실린더형, 블록 또는 적당한 해부학적 형태일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 신생 조직의 형성에 가까운 속도로 분해, 재흡수 또는 리모델링하는 하나 이상의 다른 성분을 포함할 수 있다. 적합한 방법 및 기술로, Caplan et al의 미국 특허 제 5,226,914호 및 미국 특허 제 5,837,539호를 참조한다. 상기 방법은 또한 보형 장치를 고정하는 것을 보조하기 위해 사용할 수 있다. 따라서, 엉덩이, 무릎 및 어깨에서 사용되는 것과 같은 보형 장치의 표면은, 또한 이식하기 전에 본 발명의 조성물로 피복될 수 있다. 상기 조성물내 MPC 또는 그로부터 유래된 자손은 이후 골 형성 세포로 분화되어, 골의 내부 성장 및 보형 장치의 병합 과정을 가속화할 수 있다(Caplan et al., 미국 특허 제 5,226,914호 및 미국 특허 제 5,837,539호).
상기 방법은 MPC 또는 그로부터 유래된 자손의 골 계통으로의 분화를 유도 또는 가속화하는 하나 이상의 생활성 인자를 대상체에 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 생활성 인자는, 예컨대 합성 글루코코르티코이드, 예컨대 덱사메타손, 또는 BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-6 또는 BMP-7과 같은 골 형태형성 단백질일 수 있다. 상기 골 형태형성 단백질은 근육내, 정맥내, 척수내(intramedullary) 또는 관절내 주입에 적합한 액체 또는 반고형 담체 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 MPC 또는 그로부터 유래된 자손을 외인성 SDF-1 또는 그 유사체에 대상체에서 노출시키는 단계를 포함하는, 대상체에게서 혈관 조직을 형성하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 혈관 조직 형성을 원하는 부위에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈관 조직을 형성하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 MPC 또는 그의 자손을 외인성 SDF-1 또는 그 유사체에 대상체에서 노출시키는 단계를 포함하는 대상체에서 심장 근육 또는 평활근을 형성하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 심장 근육 또는 평활근 형성 부위에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심장 근육 또는 평활근을 형성하는 방법을 제공한다.
명세서 전반에 걸쳐서, 용어 "포함한다" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형된 형태는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 요소, 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하는 것을 내포하며, 다른 요소, 정수, 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계 그룹을 배제하는 것이 아닌 것으로 이해될 것이다.
기질 유래 인자( stromal derived factor)-1 및 그 유사체
SDF-1은 또한 케모카인 CX 모티프 리간드 12(CXCL 12) 및 프리-B 세포 성장 자극 인자(PBSF)라고도 한다. SDF 1-α 및 1-β는 백혈구를 활성화는 인터크린(intercrine) 패밀리에 속하는 작은 사이토카인으로, 흔히 리포폴리사카라이드, TNF 또는 IL-1과 같은 전염증성 자극에 의해 유도된다. 인터크린은 2개의 이황화 결합을 형성하는 4개의 보존된 시스테인이 있는 것을 특징으로 한다. 이들은 2가지 하위패밀리로 분류할 수 있다. CC 하위패밀리의 경우, 시스테인 잔기는 서로 이웃해 있다. CXC 하위패밀리의 경우에는, 시스테인 사이에 하나의 아미노산이 들어가 있다. SDF-1 단백질은 후자 그룹에 속한다.
전술한 바와 같이, SDF-1은 SDF-1 α 및 SDF-1β라는 2 이상의 공지된 이소형(isoform)이 있다. Shirozu et al.(Genomics, 28:495, 1995)은 인간 SDF-1의 게놈 클론을 동정하였고, α 및 β 이소형이 하나의 유전자가 두가지 방식으로 스플라이싱된 결과라는 것을 확인하였다. α 형태는 엑손 1-3으로부터 유래된 것이지만, β 형태는 엑손 4의 추가적인 서열을 포함하고 있다. 전체 인간 유전자는 약 10 kb이며, 염색체 1Oq11.1에 위치되어 있다.
달리 언급이 없는 한, 용어 "SDF-1"은 본원에서 적어도 α 및/또는 β 이소형을 의미한다. 또한, 상기 용어는 본 발명의 방법에서 유용하도록 적어도 일부 활성을 유지하고 있는, 천연적으로 형성되는 분자의 생물학적으로 활성인 단편, 변이체 및 유도체를 포함한다. 바람직한 예에 있어서, 본 발명은 α 이소형의 사용에 관한 것이다.
인간, 랫, 마우스 및 고양이를 포함하여 포유류의 여러가지 천연형 SDF-1 α 및/또는 β 단백질들의 아미노산 서열이 공지되어 있다(예, Shirozu et al, Genomics, 28:495, 1995; Tashiro et al, Science 261:600, 1993; Nishimura et al, Eur. J. Immunogenet. 25:303, 1998); 및 GenBank Accession No. AFl 89724). 인간의 α 이소형의 아미노산 서열은 서열번호 1로서 제공되며, 인간 β 이소형의 아미노산 서열은 서열번호 2로 제공된다. 바람직한 SDF-1 단백질 형태는 전술한 포유류의 SDF-1 단백질이나 다른 종으로부터 수득되는 동조체(ortholog)들 중 하나와 아미노산 서열이 동일한, 정제된 천연형 SDF-1 단백질이다. 하나 이상의 특정 모티프 및/또는 도메인에 대응되거나, 또는 예컨개 아미노산 길이가 적어도 5, 10, 25, 50, 또는 75 이상인 임의 크기의 SDF-1 생물학적으로 활성인 단편은 본 발명의 범위에 속한다. 단편을 (재조합으로 또는 화학 합성에 의해) 생산 및 테스트하여, 천연 SDF-1 단백의 유사체로서 기능할 수 있는 이들의 펩티딜 단편을 동정할 수 있다.
SDF-1 변이체는 천연 SDF-1 단백질과 하나 이상의 아미노산이 상이한 펩티드 서열을 갖는다. 이러한 변이체의 펩티드 서열은 천연형 SDF-1 단백질의 하나 이상의 아미노산의 결손, 부가 또는 치환을 포함할 수 있다. 아미노산 서열 삽입체는 바람직하기로는 약 1 내지 4개의 연속 아미노산이며, 결손체는 바람직하기로는 약 1 내지 10개의 연속 아미노산이다.
SDF-1 변이체는 당업계에 공지된 다양한 기법으로 제조할 수 있다. 예로, SDF-1 변이체는 별개의 점 돌연변이(들) 도입에 의해 또는 절단에 의한 것과 같은 돌연변이 유발에 의해 만들 수 있다. 돌연변이로 천연 SDF-1 단백질과 실질적으로 동일한 기능적 활성을 가지고 있는 SDF-1 변이체를 만들 수 있다. 특히, 천연형 SDF-1 단백질의 한가지 이상의 기능적 활성을 계속적으로 발현하는 단백질의 작용성 형태(agonistic form)를 만들 수 있다. 제조가능한 그외 SDF-1 단백질 변이체로는, 예컨대 프로테아제 표적 서열을 변이시키는 돌연변이 유발로 인해 단백질분해 절단에 내성인 것을 포함한다. 펩티드의 아미노산 서열 변화가 천연형 SDF-1 단백질의 한가지 이상의 기능적 활성을 가지는 변이체를 형성할 수 있는지는, 천연형 SDF-1 단백질의 기능적 활성에 대해 변이체를 테스트함으로써, 예컨대 변이체의 본원에 기재된 MPC 증식 자극 능력을 테스트함으로써, 쉽게 알 수 있다.
당업계에는 점 돌연변이 또는 절단으로 제조한 조합 라이브러리(combinatorial library)의 유전자 산물 스크리닝 및 특정 특성을 가지는 유전자 산물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 방법에 대한 매우 다양한 기법들이 공지되어 있다. 이러한 기법들은 일반적으로 SDF-1 유전자 변이체의 조합 돌연변이 유발에 의해 제조한 유전자 라이브러리를 신속하게 스크리닝하는데 적용할 수 있을 것이다. 대규모의 유전자 라이브러리를 스크리닝하는데 가장 널리 사용되는 기법은, 전형적으로 복제가능한 발현 벡터에 유전자 라이브러리를 클로닝하는 단계, 제조된 벡터 라이브러리를 적정 세포에 형질전환시키는 단계 및 원하는 활성 검출을 통해 그것의 산물이 검출되는 유전자를 코딩하고 있는 벡터를 비교적 용이하게 분리하는 조건하에서 조합된 유전자(combinatorial gene)를 발현시키는 단계를 포함한다.
현재, SDF-1은 G-커플링된 7 트랜스멤브레인 CXCR4 리셉터(또한 퓨신(fusin) 또는 LESTR로 당업계에 알려져 있음)의 천연 작용제로만 알려져 있다. 또한, MPC는 CXCR 리셉터(서열번호 3의 인간 분자)를 발현하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본원의 SDF-1의 생물학적 작용은 틀림없이 케모카인 리셉터 SCSR4를 통해 매개될 것이다. 이에, 본 발명의 방법에 사용가능한 SDF-1 유사체는 또한 CRCX4 작용제일 수 있다. 그러나, 본 발명은 MPC가 본원에 기재된 생물학적 활성이 전적으로 또는 CRCX4와 같은 다른 리셉터와 조합하여 매개됨으로써 CXCR4 이외의 리셉터를 발현할 가능성을 배제하진 않는다.
본원에서, 용어 "SDF-1 유사체"는 구조적으로 또는 기능적으로 SDF-1과 관련있으며, 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 임의의 분자를 의미한다. 바람직하기로는, SDF-1 유사체는 SDF-1의 CXCR4 결합 길항제이다. SDF-1 유사체는 전술한 바와 같인 천연적으로 형성되는 SDF-1의 생물학적으로 활성인 단편, 변이체 및 유도체이다.
SDF-1 유사체의 예로는, 미국 특허 출원 20050065064, 미국 특허 출원 20050059584 및 Pelus et al, Exp. Hematol. 33:295, 2005에 기재된 분자를 포함한다. 또한, HIV-1 코트 단백질 gp120은 SDF-1 유사체로서 작용한다는 증거가 제시되었다(Tran et al, J. Neuroimmunol. 160, 68 2005). 또한, AMD3100(AnorMED Inc, British Columbia, Canada) 및 ALX40-4C(Allelix Biopharmaceuticals Inc, Canada)가 CXCR4 리셉터의 작용제로서 작용할 수 있다는 결과가 입증되었다(Zhang et al, J. Biol. Chem. 277, 24515 2002).
다양한 펩티드 또는 모방성(펩티도-모방체 포함) SDF-1 단백질 유사체는 기존의 기법들을 이용하여 만들 수 있다. 예로, 항체들 또는 항체 단편을 SDF-1에 결합하는 리셉터(예, CXCR4)에 대하여 제조한 다음, 스크리닝하여 천연 SDF-1 단백질의 유사체로서 작용하는 것을 동정할 수 있다. 동정된 것은 세포에서 유도 또는 방지되는 종류의 신호를 기초로 작용제로서 더욱 특정화할 수 있다.
본 발명의 유용한 SDF-1은 또한 CXCR4 리셉터 작용제 Redistribution™ 분석(Biolmage A/S, Soeberg, Denmark)을 이용하여 동정 및/또는 검증할 수 있다.
SDF-1 유사체의 다른 예는, SDF-1의 다양한 부분 또는 일부에 해당되는 구조를 함유하고 있는 화합물이다. 일예에서, 유사체는 링커에 의해 함께 연결된 M-말단 영역 및 C-말단 영역를 포함한다. 다른 예에서, SDF-1의 아미노산 잔기는, 예컨대 라이신 및 세린 잔기의 에테르화에 의해, 또는 당업계에 공지된 다른 방법으로 고리화된다. 또다른 예에서, SDF-1 유사체는 야생형 케모카인 서열로부터 유래된 아미노산을 포함하지만, 다른 아미노산은 하나 이상이 시스테인으로 치환되어 있다. 다른 예로는, N-말단 영역, 최대 3개의 역평행 β-시트를 함유하고 있는 내부 영역, α-나선 구조를 함유하고 있는 C-말단 영역, N-말단 및 내부 영역의 조합 또는 내부 및 C-말단 영역의 조합, 또는 끝으로 N-말단, 내부 및 C-말단 영역를 포함하는 케모카인 유사체를 포함한다. N-말단, 내부 및 C-말단 영역으로부터 선택된 영역은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 41, 또는 45개의 아미노산 길이일 수 있다.
본 발명의 방법에 이용가능한 SDF-1 유사체는, 알킬아미드 및 하이드라지드와 같은 치환된 아미드 및 C-말단 페닐알라닌 잔기가 펜에틸아미드 유사체로 치환된 화합물(예, 트리펩티드 Ser-Ile-Phe의 유사체로서 Ser-Ile-펜에틸아미드), 당화된 케모카인 유사체, 폴리에틸렌 글리콜 변형 유사체 또는 바이오틸화 유사체를 포함하여, C-말단 하이드록시메틸 유사체, O-변형된 유사체(예, C-말단 하이드록시메틸 벤질 에테르), N-말단이 변형된 유사체와 같은 유사체를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 이용가능한 SDF-1 유사체는 하나 이상의 변형기와 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 용어 "변형기"는 펩티드 구조에(예, 공유 결합 또는 공유 커플링에 의해) 직접적으로 부착된 구조 뿐만 아니라 펩티드 구조에(예, 안정적인 비공유 결합 조합 또는 추가적인 아미노산 잔기에 링커를 통한 공유 커플링에 의해) 간접적으로 연결된 구조를 포함한다. 용어 "변형기"는 또한 그의 모방체, 유사체 또는 유도체를 의미내며, 이는 SDF-1 코어 펩티드 구조의 측면에 위치될 수 있다. 예를 들면, 변형기는 SDF-1 펩티드 구조의 아미노-말단 또는 카르복시-말단에 커플링될 수 있으며, 또는 코어 구조의 측면에 있는 펩티드 또는 펩티드모방 영역에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 변형기는 SDF-1 펩티드 구조의 하나 이상의 아미노산 잔기의 측쇄에, 또는 코어 도메인 측면에 있는 펩티드 또는 펩티드-모방 영역에(예, 라이실(lysyl) 잔기(들)의 엡실론(epsilon) 아미노기를 통해, 아스파르트산 잔기(들) 또는 글루탐산(들)의 카르복시기를 통해, 티로실 잔기(들), 세린 잔기(들) 또는 트레오닌 잔기(들)의 하이드록시기를 통해, 또는 하나의 아미노산 측쇄상의 다른 적합한 반응성기를 통해) 커플링될 수 있다. 펩티드 구조에 공유결합으로 커플링된 변형기는 예컨대 아미드, 알킬아미노, 설피드, 카르바메이트 또는 유레아 결합을 포함하여, 당업계에 잘 알려져 있는 화학 구조 연결 방법을 이용하여 부착될 수 있다.
일부 예에서, 변형기는 사이클릭(cyclic), 헤테로사이클릭 또는 폴리사이클릭 기를 포함할 수 있다. 용어 "사이클릭기"는 본원에서 환형의 포화 또는 불포화된(즉, 방향족) 탄소수 3 내지 10, 4 내지 8, 또는 5, 6 또는 7을 가지는 기를 포함한다. 비방향족 사이클릭기로는, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 사이클로옥틸을 포함한다. 용어 "헤테로사이클릭기"로는 선택적으로 치환된, 포화 또는 불포화된, 3 내지 8일원의 사이클릭 구조를 포함하며, 하나 이상의 골격 원소는 산소, 질소, 황 또는 이들의 조합이다. 사이클릭기 또는 헤테로사이클릭기는 고리의 한곳 이상의 위치에서 비치환 또는 치환될 수 있다. 사이클릭기는 예컨대 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 아케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로사이클, 하이드록실, 아미노, 니트로, 티올, 아민, 이민, 아미드, 포스포네이트, 포스핀, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 티오에테르, 설포닐, 설포네이트, 셀레노에테르, 케톤, 알데하이드, 에스테르, -CF3, --CN으로 치환될 수 있다. 또한, 사이클릭기는 할로겐, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로사이클, 하이드록실, 아미노, 니트로, 티올 아민, 이민, 아미드, 포스포네이트, 포스핀, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 태오에테르, 설포닐, 설포네이트, 셀레노에테르, 케톤, 알데하이드, 에스테르, -CF3, --CN과 같은 치환기로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 이상의 탄소 원자로 이루어진 치환 또는 비치환된 쇄에 의해 연결될 수 있으며; 부가적으로 하나 이상의 탄소 원자는 산소, 질소 또는 황 원자로 치환될 수 있다.
본 발명의 방법에 이용가능한 SDF-1 유사체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 첨가에 의해 변형될 수 있다. PEG 변형으로 순환시간 개선, 용해도 개선, 단백질 분해에 대한 내성 개선, 항원성 및 면역성 감소, 생체이용성 개선, 독성 감소, 안정성 개선 및 제형 용이성을 유도할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜화는 또한 생활성의 실질적인 감소를 형성할 수 있다.
본 발명의 방법에 이용가능한 SDF-1 유사체는 "프로드럭" 형태로 제조될 수 있으며, 화합물은 그자체로 SDF-1 유사체로서 작용하지 않으며, 시험관내 및/또는 생체내 대사로 SDF-1 유사체로 형질전환될 수 있다. 예로, 이러한 타입의 화합물에서, 변형기는 활성의 SDF-1 유사체 형태로 대사를 통해 변환될 수 있는 프로드럭 형태로 존재할 수 있다. 이러한 변형기의 프로드럭 형태는 본원에서 "이차 변형기"라고 한다. 활성형의 펩티드계 약물 전달을 최적화하기 위하여, 대사를 제한하는 펩티드 프로드럭 제조 방법에 대한 여러가지 방법이 당업계에 공지되어 있다.
상기 각 섹션에서 언급한 본 발명의 여러가지 특징 및 예는 적절하게 다른 섹션에 적용된다. 특히, 하나의 섹션에서 명시된 특징은 적절하게 다른 섹션에 명기된 특징과 조합될 수 있다.
유전자 변형 세포의 제조
본 발명의 다른 측면에서, MPC 또는 그로부터 유래된 전구세포는 SDF-1 또는 그것의 펩티드 유사체를 생산하도록 유전자 변형될 수 있다. 전형적으로, 세포는 SDF-1 또는 그것의 펩티드 유사체를 세포에서 분비하도록 유전자 변형될 것이다.
유전자 변형된 세포는 변형된 세포의 성장을 지지할 수 있는 충분한 함량으로 하나 이상의 사이토카인의 존재하에 배양할 수 있다. 변형된 세포는 이후 선별되며, 코딩된 폴리펩티드가 과다 발현된다. 유전자 변형된 세포는 따라서 즉시(예, 이식물로서) 사용되거나, 배양, 시험관내 증폭 또는 이후 사용을 위해 저장될 수 있다. 변형된 세포는 액체 질소 동결과 같이 당업계에 공지된 방법으로 저장할 수 있다.
본원에서, 유전자 변형은 외인성 또는 외래 폴리뉴클레오티드를 MPC 또는 그로부터 유래된 전구세포에 도입하는 단계를 포함하는 모든 유전자 변형, 또는 MPC 또는 그로부터 유래된 전구세포 내부의 외인성 유전자의 변형을 포함한다. 유전자 변형은 형질감염(숙주 또는 공여체로부터 숙주 DNA를 수용자로 시험관내 또는 생체내 바이러스 매개 전달), 형질감염(분리된 바이러스 DNA 게놈을 이용한 세포의 형질전환), 리포좀 매개 전달, 전기충격, 칼슘 포스페이트 형질감염, 또는 공동침강(coprecipitation) 등을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 형질감염 방법으로는 세포와 생산자 세포의 공동 배양(Bregni et al., Blood 80:1418-1422, 1992) 또는 적정 성장 인자 및 폴리양이온의 첨가 또는 무첨가한 상태로 바이러스 상층액을 단독으로 사용하여 배양하는 것(Xu et al., Exp. Hemat. 22:223-230, 1994)을 포함한다.
SDF-1 또는 그것의 펩티드 유사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 전형적으로 벡터 형태로 숙주 세포에 도입된다. 벡터는 전형적으로, 이에 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 포함한다. 이러한 벡터 구축에 사용되는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예로, 적정 발현 벡터 구축 기법은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.(3rd Ed., 2000); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, hie, New York(1999)에 상세하게 개시되어 있다.
벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-조합 바이러스(adeno-associated virus) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스와 같은 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 합성 벡터 및 당업계에 전형적으로 사용되는 다른 재조합 비히클일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 프로모터 및 클로닝 사이트 모두를 포함하고 있는 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 벡터는 시험관내 또는 생체내에서 RNA를 전사할 수 있으며, Stratagene(La Jolla, Calif.) 및 Promega Biotech(Madison, Wis.)과 같은 회사로부터 상업적으로 구입가능하다. 특정 예로는, Stratagene의 pSG, pSV2CAT, pXt1, 및 Pharmacia의 pMSG, pSVL, pBPV 및 pSVK3가 있다.
바람직한 벡터는 레트로바이러스 벡터(Coffin et al., "Retroviruses", Chapter 9 pp; 437-473, Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1997)를 포함한다. 본 발명에 이용가능한 벡터는 당업계에 잘 알려진 과정에 의해 재조합으로 생산할 수 있다. 예컨대, WO94/29438, WO97/21824 및 WO97/21825는 레트로바이러스 패킹 플라스미드 및 패킹 세포주의 구축을 설명하고 있다. 예시적인 벡터로는 pCMV6b 및 pCMV6c(Chiron Corp.)와 같은 pCMV 포유류 발현 벡터, pSFFV-Neo, 및 pBluescript-Sk+가 있다. 이용가능한 레트로바이러스 벡터의 비제한적인 예는 쥐과, 조류, 영장류 레트로바이러스로부터 유래된 것이다. 통상적인 레트로바이러스 벡터는 Moloney 쥐과 백혈병 바이러스(MoML V-벡터)를 기본으로한 벡터를 포함한다. 다른 MoMLV 유래 벡터로는 Lmily, LINGFER, MINGFR 및 MINT(Chang et al., Blood 92:1-11, 1998)가 있다. 다른 벡터로는 Gibbon ape 백혈병 바이러스(GALV) 및 Moloney 쥐과의 육종 바이러스(MOMSV), 및 SFFV(spleen focus forming virus)가 있다. 쥐과의 줄기세포 바이러스(MESV) 유래 바이러스로는 MESV-MiLy(Agarwal et al., J. of Virology, 72:3720-3728, 1998)가 있다. 또한, 레트로바이러스 벡터로는 렌티바이러스를 기본으로하는 벡터가 있으며, 비제한적인 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1 및 HIV-2)을 기본으로하는 벡터가 있다.
레트로바이러스 벡터 구조체 생산에 있어서, 바이러스 gag, pol 및 env 서열을 바이러스에서 제거하여, 외래 DNA 서열 삽입을 위한 공간을 형성할 수 있다. 외래 DNA에 의해 코딩된 유전자는 일반적으로 LTR(long terminal repeat)에서 강력한 바이러스 프로모터의 조절하에 발현된다. 적절한 조절 조절 서열의 선택은 사용되는 숙주 세포에 따라 다르며, 선택은 당업계의 기술 범위이다. 수많은 프로모터는 LTR의 프로모터와 함께 공지되어 있다. 비제한적인 예로는 파지 람다 PL 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터(immediate early promoter); MMSV(Moloney Murine Sarcoma Virus), RSV(Rous Sacroma Virus) 또는 SFFV(Spleen Focus Forming Virus)의 U3 영역 프로모터; Granzyme A 프로모터; 및 Granzyme B 프로모터가 있다. 부가적으로 유도가능한 또는 복수의 조절 요소를 사용할 수 있다. 적합한 프로모터의 선택은 당업자에게 명백할 것이다.
이러한 구조체는 gag, pol 및 env 기능이 팩킹에 의해 세포주에 트랜스로 제공되는 경우에, 효율적으로 바이러스 입자로 팩킹될 수 있다. 따라서, 벡터 구조체를 팩킹 세포에 도입하였을 때, 배양 배지로 분비되는 감염성 바이론(infectious viron)을 생산하기 위하여, 세포에서 생산된 gag-pol 및 env 단백질은 벡터 RNA와 조합된다. 따라서, 제조된 바이러스는 표적 세포를 감염하고 DNA에 삽입될 수 있지만, 필수 팩킹 서열이 없어 감염성 바이러스 입자를 형성할 수 없다. 현재 이용되는 대부분의 팩킹 세포주는 각각 필수 코딩 서열들중 하나를 포함하고 있는 개별 플라스미드로 형질전환되며, 따라서, 복제 가능 바이러스의 제조 전에 여러번의 재조합 반응이 필수적으로 이루어진다. 대안적으로, 팩킹 세포주는 프로바이러스(provirus)를 가진다. 상기 프로바이러스는 무력화(crippled)되어, 감염성 바이러스 조합에 필요한 모든 단백질을 생산할 수 있지만, 그것의 RNA는 바이러스로 팩킹될 수 없다. 재조합 바이러스로부터 생산된 RNA가 대신 팩킹된다. 따라서, 팩킹 세포로부터 방출된 바이러스 스톡은 오직 재조합 바이러스만을 포함한다. 레트로바이러스 팩킹주의 비제한적인 예로는 PA12, PA317, PE501, PG13, PSI.CRIP, RDI 14, GP7C-tTA-G10, ProPak-A(PPA-6) 및 PT67가 있다. 참조 문헌으로는 Miller et al., MoI. Cell Biol. 6:2895, 1986; Miller et al., Biotechniques 7:980, 1989; Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460, 1988; Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8392-8396, 1993; 및 Finer et al., Blood 83:43-50, 1994가 있다.
그외 적합한 벡터는 아데노바이러스 벡터(Frey et al., Blood 91:2781, 1998; 및 WO 95/27071) 및 아데노-조합 바이러스 벡터를 포함한다. 이러한 벡터는 Chatterjee et al., Current Topics in Microbiol. And Immunol., 218:61-73, 1996; Stem cell Biology and Gene Therapy, eds. Quesenberry et al., John Wiley & Sons, 1998; 및 미국 특허 제 5,693,531호 및 제 5,691,176호에 개시된 바와 같이, 당업계에 잘 알려져 있다. 아데노바이러스 유래 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 없기 때문에 특정 조건하에서 이롭게 사용할 수 있다. 레트로바이러스 DNA와 달리, 아데노바이러스 DNA는 표적 세포의 게놈으로 삽입되어 들어가지 않는다. 또한, 외래 DNA를 수송하는 능력은 레트로바이러스 벡터 보다 아데노바이러스 벡터가 더 우수하다. 아데노-회합 바이러스 벡터는 또 하나의 유용한 전달 시스템이다. 이러한 바이러스의 DNA는 비-분열 세포에 병합할 수 있으며, 다수의 폴리뉴클레오티드는 아데노-조합 바이러스 벡터를 이용하여 여러가지 세포 타입으로 성공적으로 도입된다.
일부 예에서, 구조체 또는 벡터는 2 이상의 이종의 폴리뉴클레오티드 서열; a) SDF-1 또는 그의 펩티드 유사체를 코딩하는 핵산 서열, 및 b) 하나 이상의 부가적인 핵산 서열을 포함할 것이다. 바람직하기로는, 상기 부가적인 핵산 핵산 서열은 선택 마커, 구조 유전자, 치료 유전자, CXCR4 리셉터 또는 다른 사이토카인/케모카인 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
선택 마커는 성공적인 유전자 변형을 모니터링하기 위한 목적으로, 그리고 DNA가 삽입된 세포를 선택하기 위한 목적으로, 구조체 또는 벡터에 포함될 수 있다. 비제한적인 예로는 약물 내성 마커, 예컨대 G148 또는 히그로마이신을 포함한다. 추가적인 음성 선택을 사용할 수 있으며, 예컨대 마커는 HSV-tk 유전자이다. 이 유전자는 세포가 어사이클로비르(acyclovir) 및 간사이클로비르(gancyclovir)와 같은 물질에 민감하게 만들 것이다. NeoR(네오마이신/G148 내성) 유전자는 통상적으로 사용되지만, 표적 세포에 이미 존재하지 않는 유전자 서열의, 임의의 기존 마커 유전자를 사용할 수 있다. 다른, 비제한적인 예로는 저-친화성 NGFR(low-affinity Nerve Growth Factor), EFGP(enhanced fluorescent green protein), DHFR(dihydrofolate reductase gene), 세균 hisD 유전자, 쥐과의 CD24(HSA), 쥐과의 CD8a(lyt), 퓨로마이신이나 플레오마이신에 내성을 부여하는 세균성 유전자, 및 β-갈락토시다제가 있다.
추가적인 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 SDF-1 또는 그의 펩티드 유사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열처럼, 동일한 벡터상에서 숙주 세포로 도입될 수 있으며, 또한, 추가적인 폴리뉴클레오티드 서열은 제2의 벡터상에서 숙주 세포로 도입될 수 있다. 바람직한 예에서, 선별 마커는 SDF-1 또는 그것의 펩티드 유사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 동일한 벡터상에 포함될 것이다.
또한, 본 발명은 외인성 유전자의 발현이 상향 조절되어 야생형 MPC 또는 그로부터 유래된 전구세포에 비해 SDF-1의 생산이 증가되도록, 외인성 SDF-1 유전자의 프로모터 영역을 유전자 변형하는 것을 포함한다.
SDF -1 및 그 유사체의 투여
본 발명의 방법은 MPC 또는 그로부터 유래된 전구체의 자체(in situ) 증식 및/또는 생존을 증강시키기 위해, SDF-1 또는 그 유사체를 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
이러한 방법은 이식물 또는 장치내와 같이 국소로, 전신으로 또는 국지적으로(topically) SDF-1 또는 그의 유사체를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 특정 예에서, 본 발명은 SDF-1 또는 그 유사체를 대상체에 전신 투여함으로써, 이를 필요로 하는 대상체에서 MPC 또는 그로부터 유래된 자손의 증식 및/또는 생존을 증강시키는 방법을 제공한다. 예컨대, SDF-1 또는 그 유사체는 피하 또는 근육재 주입에 의해 투여할 수 있다.
본 발명의 예는 특정 조직에서 MPC 증식 및/또는 생존 증가가 바람직한 전신 퇴행성 질병 치료에 이용될 수 있다. 이러한 방식으로 치료가능한 전신 퇴행성 질환의 예로는, 골다공증 또는 골절, 연골의 퇴행성 질환, 아테롬성 동맥경화증, 말초 동맥 질환 또는 심혈관 질환 등이 있다.
따라서, 본 발명에 있어서, SDF-1 또는 그 유사체를 치료학적 유효량 또는 예방학적 유효량으로 포함하는 조성물은 자가면역 질환, 급성 만성 염증, 암, 심혈관 질환, 감염성 질환 및 류마티스 관절염, 만성 염증성 대장 질환, 만성 염증성 복막 질환, 다발성 경화증, 천식, 골관절염, 죽상동맥경화증, 건선, 비염, 자가면역 및 기관 이식 거부 반응을 포함하여, 염증성 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병 또는 장애 치료에 사용할 수 있다. 일 예에서, 이러한 조성물은 조직 특이 세포의 생산 자극 보조에 사용되기에 충분한 치료학적 유효량 또는 예방학적 유효량으로 SDF-1 또는 그 유사체를 포함한다.
"치료학적 유효량"은 MPC 또는 그 자손의 증식 및/또는 생존의 증강을 달성하기에 필요한 투약 및 시간동안, 유효한 함량을 의미한다.
"예방학적 유효량"은 MPC 또는 그 자손의 죽음을 예방 또는 저해하는 것과 같은 원하는 예방 결과를 달성하기에 필요한 투약 및 시간동안, 유효한 함량을 의미한다.
특정 예에서, SDF-1 또는 그 유사체의 치료학적 또는 예방학적 유효량의 바람직한 범위는 0.1 nM-0.1 M, 0.1 nM-0.05 M, 0.05 nM-15 μM 또는 0.01 nM-10 μM일 수 있다. 투여량 수치는 경감되는 증상의 중증에 따라 변경할 수 있음을 유념한다. 임의의 특정 대상체의 경우, 특정 투약 요법은 개별적인 필요성과 조성물의 대상체 투여에 대한 전문가의 판단이나 감독에 따라 시간에 따라 조절될 수 있다. 투약 범위는 의학 실무자가 선택할 수 있는 투약 범위가 일 예일 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
조성물내 SDF-1 또는 그 유사체의 함량은 질병 상태, 연령, 성별 및 대상체의 체중과 같은 인자들에 따라 변경할 수 있다. 투약 요법은 최적인 치료 반응을 제공하도록 조절할 수 있다. 예로, 일회(bolus)만을 투여하거나, 여러번 분할하여 경시적으로 투여하거나, 또는 투여량은 치료 상태의 위급성에 따라 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여 용이성 및 투약 균일성에 있어서 투약 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 이로울 수 있다. "투약 단위 형태"는 본원에서 처리되는 대상체에게 단일 투약으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 필요한 약학적 담체와 조합하여 원하는 치료 효과를 형성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 함량을 포함한다.
SDF-1 또는 그 유사체는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형체를 포함하는 조성물의 형태로 투여할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서, "약학적으로 허용가능한 담체" 또는 "부형체"는 생리적으로 상용가능한, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균제, 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 대안적으로, 상기 담체는 정맥내, 복막내, 근육내, 설하 또는 경구 투여에 적합할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수용액이나 분산물, 및 멸균성 주사용 용액 또는 분산물의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성 물질에 대한 상기 매질 및 물질의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 종래 매질 또는 물질이 활성 화합물과 혼용가능하지 않는 경우를 제외하고는, 본 발명의 약학 조성물내 이들의 사용이 포함된다. 또한, 보충적인 활성 화합물을 상기 조성물에 혼입할 수 있다.
비경구 투여용 약학 제형은 리포좀을 포함할 수 있다. 리포좀 및 에멀젼은 소수성 약물에 특히 이용가능한 전달 비히클 또는 담체로 잘 알려진 예이다. 치료 반응제의 생물학적 안정성에 따라, 단백질 안정화를 위한 추가적인 전략을 채택할 수 있다. 또한, 표적화된 약물 전달 시스템, 예컨대 표적 특이적인 항체로 코팅된 리포좀 형태로 약물을 투여할 수 있다. 리포좀은 표적 단백질에 결합할 것이며, 표적 단백질을 발현하는 세포에 의해 선택적으로 흡수될 것이다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건에서 멸균 상태이고 안정적이어야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 약물 고농도에 적합한 그외 고도화된 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적정 혼합물을 함유하고 있는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예컨대 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산의 경우에 필수 입자 크기를 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해, 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 많은 경우들에서, 등장성 물질, 예컨대, 당, 만니톨과 같은 폴리알코올, 소르비톨 또는 소듐 클로라이드를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다.
주사용 조성물의 흡수 지연은, 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 이룰 수 있다. 또한, SDF-1 또는 그 유사체는 시간 방출 제형, 예컨대 서방형 폴리머를 포함하는 조성물로 투여할 수 있다. 활성 화합물은 조절성 방출 제형과 같이 화합물이 신속하게 방출되지 않도록 보호하는 담체와 제조될 수 있으며, 이식물 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함한다. 생분해성, 생체적합한 폴리머, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 및 폴리락틱, 폴리글리콜릭 공중합체(PLG)를 사용할 수 있다. 이러한 제형의 제조하기 위한 다수의 방법들이 특허되어 있으며, 당업자들에게 일반적으로 공지되어 있다.
또한, 본 발명의 화합물 현탁물은 주사에 적합한 오일성 현탁물로서 제조할 수 있다. 적합한 친지질성 용매 또는 비히클로는 참기름과 같은 지방 오일, 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀을 포함한다. 또한, 주사로 사용되는 현탁물은 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁물의 점성을 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 선택적으로, 현탁물은 또한 고도로 농축화된 용액의 제조를 허용하기 위해 화합물의 용해성을 증가시키는 물질이나 적합한 안정화제를 포함할 수 있다.
멸균 주사용 용액은 적정 용매중에 필수량의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 수많은 성분들 중 하나 또는 그 조합과 혼합하고, 이후 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산물은 활성 화합물을, 기본 분산 매질과 상기 다수 성분들로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클과 혼합함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액 제조를 위한 멸균 분말 경우에, 바람직한 제조 방법은 이미 멸균-여과한 용액으로부터 활성 성분과 원하는 부가적인 성분의 분말을 도출하는, 진공 건조 및 동결 건조이다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, SDF-1 또는 그 유사체는 SDF-1 또는 그 유사체의 용해도를 증가시키는 하나 이상의 부가적인 화합물과 함께 제형화될 수 있다.
본 발명의 화합물을 흡입에 의해 투여하는 경우, 이는 적합한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 그외 적정 가스를 함께 사용하여, 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 제시(spray presentation) 형태로 일반적으로 전달할 수 있다. 가압 에어로졸 경우, 투약 단위는 측정된 양을 전달하기 위한 밸브를 장착함으로써 결정할 수 있다. 흡입기에 사용하기 위한, 전분 또는 락토스와 같은 적정 분말 베이스와 화합물의 분말 믹스를 포함하는 젤라틴 캡슐 및 카트리지를 제형화할 수 있다.
본 발명의 세포 조성물의 투여
MPC 및/또는 그 자손을 포함하는 본 발명의 세포 조성물은 골, 연골, 힘줄, 인대, 근육, 피부 및 그외 연결 조직 뿐만 아니라, 신경, 심장, 간, 폐, 신장, 췌장, 뇌 및 그외 다른 기관 조직을 포함하여, 다양한 종류의 조직 재생에 유용할 수 있다.
일부 예에서, 본 발명의 조성물은 예컨대 MPC 및/또는 그 자손을 지지하고, 골, 연골, 근육, 신경, 상피 및/또는 그외 연결 조직 성장을 위한 표면을 제공하기 위하여, 적절한 매트릭스와 조합하여 투여할 수 있다. 상기 매트릭스는 전통적인 매트릭스 생물질의 형태일 수 있다. 매트릭스는 발현된 단백질 및 분화된 세포 및/또는 그의 존재를 위한 적합한 환경의 느린 방출을 제공할 수 있다. 일부 예에서, 다양한 콜라겐성 및 비-콜라겐성 단백질은 상향 조절되어 MPC 또는 그 자손으로부터 방출되는 것으로 예상된다. 이러한 현상은 매트릭스 침착(deposition)을 증강함으로써 조직 재생을 가속화시킨다. 또한, 매트릭스 단백질은 유전자 조작된 세포에서 발현시킬 수 있으며, 이식 부위로 형질전환된 세포의 생착 및 부착을 증강시킬 수 있다.
매트릭스 재료의 선택은 생체적합성, 생분해성, 기계적 특성, 표면 외양(cosmetic appearance) 및 인터페이스 특징을 기초로 한다. 세포성 조성물의 특정한 적용은 적합한 제형을 제한할 것이다. 조성물에 대해 사용가능한 매트릭스는 생분해성이며, 화학적으로 칼슘 설페이트, 트리칼슘 포스페이트, 하이드록시아파티트, 폴리락트산 및 폴리안하이드라이드로 규정될 수 있다. 그외 가능성 있는 물질은 생분해성이며, 골 또는 진피 콜라겐과 같이 생물학적으로 잘 규정된 것이다. 다른 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 구성되어 있다. 그외 가능성 있는 매트릭스는 비-생분해성이며, 소결된 하이드록시아파티트, 바이오글라스, 알루미네이트 또는 다른 세라믹류와 같이 화학적으로 규정된다. 매트릭스는 폴리락트산 및 하이드록시아파티트 또는 콜라겐 및 트리칼슘 포스페이트와 같이, 전술한 타입의 물질의 임의 조합으로 구성될 수 있다. 바이오세라믹류는 칼슘-알루미네이트-포스페이트와 같은 조성물중에서 변형될 수 있으며, 이를 가공하여 기공 크기, 입자 크기, 입자 형태 및 생분해성을 변경시킬 수 있다.
본 발명의 세포 조성물을 사용하여 질병이나 외상, 또는 조직의 정상적인 발생 부전으로 유발되는 연골 또는 골조직의 복구 또는 치환이 필요한 환자를 치료할 수 있으며, 또는 안면이나 신체의 다른 부분을 늘리기 위한 미용 기능을 제공할 수 있다. 치료는 본 발명의 세포를 새로운 연골 조직이나 골 조직을 형성하는 용도를 수반할 수 있다. 예로, 미분화된 또는 연골형성 분화-유발된 전구세포를 포함하는 조성물을 사용하여 연골 증상, 예컨대 류마티스 관절염 또는 골관절염이나, 외상성 또는 수술로 인한 연골 상처를 치료할 수 있다. 다른 예로서, 골 전구세포를 포함하는 조성물을 사용하여, 대사성 및 비-대사성 골 질환을 포함한 골 증상들을 치료할 수 있다. 골 증상의 예로는 반월상 연골 손상(meniscal tear), 척추골 융합, 척추 디스크 제거, 척추 재건, 골절, 골/척추 변형, 골육종, 골수종, 골 형성장애(bone dysplasia), 척추 만곡(scoliosis), 골다공증, 치주질환, 치아 골 감소(dental bone loss), 골연화증, 구루병, 섬유성 골염(fibrous osteitis), 신장 골 부전(renal bone dystophy), 및 파제트 골 질환을 포함한다.
본 발명의 세포 조성물은 단독으로 또는 다른 세포와 혼합물로서 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 투여할 수 있는 세포는, 그외 다잠재력 또는 다능성 세포, 연골세포, 연골모세포, 골세포, 골모세포, 파골세포, 골 라이닝 세포, 줄기세포 또는 골수세포가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 여러가지 타입의 세포는 투여하기 바로 전 또는 곧 본 발명의 조성물과 혼합할 수 있으며, 또는 이는 투여하기전에 기간동안 함께 배양할 수 있다.
본 발명의 세포 조성물은 다른 유익한 약물이나 생물 분자(성장 인자, 영양 인자)함께 투여할 수 있다. MPC 및/또는 그 자손을 다른 물질와 함께 투여하였을때, 이들은 단일 약학 조성물로 함께 또는 개별적인 약학 조성물로, 다른 물질과 동시에, 또는 연속적으로(다른 물질의 투여 전 또는 후) 투여할 수 있다. 함께 투여할 수 있는 생활성 인자로는 항-세포사멸제(예, EPO, EPO 항체모방체(mimetibody), TPO, IGF-I 및 IGF-II, HGF, 카스파제 저해제); 항-염증제(예, p38 MAPK 저해제, TGF-beta 저해제, 스타틴, IL-6 및 IL-1 저해제, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMUS, 및 NSAID(비스테로이드성 항-염증제; 예, TEPOXALIN, TOLMETIN, SUPROFEN); 면역억제제/면역조절제(예, 사이클로스포린, 타크롤리무스와 같은 칼시뉴린(calcineurin) 저해제; mTOR 저해제(예, SIROLIMUS, EVEROLIMUS); 항-증식제(예, 아자티오프린(azathioprine), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)); 코르티코스테로이드(예, 프레드니솔론(prednisolone), 하이드로코르티손(hydrocortisone)); 단일클론 항-IL-2Rα 리셉터 항체와 같은 항체(예, 바실릭시맵(basiliximab), 다클리주맵(daclizumab)), 다클론성 항-T- 세포 항체(예, 항-흉선 세포 글로불린(ATG); 항-림프구 글로불린(ALG); 단일클론 항-T 세포 항체 OKT3)); 항-혈전제(anti-thrombogenic agents)(예, 헤파린, 헤파린 유도체, 유로키나제, PPack(덱스트로페닐알라닌 프롤린 아르기닌 클로로메틸케톤), 항트롬빈 화합물, 혈소판 리셉터 길항제, 항-트롬빈 항체, 항-혈소판 리셉터 항체, 아스피린, 디피리다몰, 프로타민, 히루딘, 프로스타글란딘 저해제 및 혈소판 저해제); 및 항-산화제(예, 프로부콜(probucol), 비타민(vitamin) A, 아스코르브산, 토코페롤, 코엔자임 Q-1O, 글루타티온, L-시스테인, N-아세틸시스테인) 뿐만 아니라 국소 마취제를 포함한다. 다른 예로서, 세포는 미국 특허 제 5,827,735호에 언급된 바와 같이, 흉터 저해 인자와 함께 공동 투여할 수 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 예에서, 본 발명의 세포 조성물은 미분화된 세포로서, 즉 배양 배지내 배양한 것으로서 투여된다. 대안적으로, 세포 조성물은 원하는 표현형, 예컨대 골형성 표현형으로 분화를 자극하는 조건으로 배양물을 노출시킨 다음 투여할 수 있다.
본 발명의 세포 조성물은 복구 또는 확대가 필요한 부위에, 수술을 통해 이식, 주사, 전달(예, 카테터나 또는 주사 바늘을 이용하여)하거나, 그렇지 않다면 직접 또는 간접적으로 투여할 수 있다. 세포는 매트릭스에 의해 투여될 수 있다(예, 3차원의 골격(scaffold)). 세포는 기존의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 세포, 그의 조성물 또는 성분(예, ECM, 세포 융해물, 적응용 배지(conditioned medium))의 투여 경로는 근육내, 눈, 비경구(정맥내 포함), 동맥내, 피하, 경구 및 코 투여를 포함한다. 비경구 투여의 특정 경로로는 근육내, 피하, 복막내, 뇌내, 뇌실내(intraventricular), 대뇌뇌실내(intracerebroventricular), 경막내, 수조내(intracisternal), 척추내 및/또는 말초-척추 투여 경로가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
세포를 반고형 또는 고형 장치내에 투여하는 경우에는, 신체에 정확한 위치에 외과 이식하는 것이 전형적으로 적합한 투여 방식이다. 그러나, 액체 또는 유체상 약학 조성물은 이들이 예컨대 화학적 신호에 대한 반응으로 특정 위치로 이동하는 1곳 이상의 일반적인 위치(예, 확산시키는 부위를 통해)에 투여할 수 있다.
다른 예는 세포 조성물(예, 세포 융해물 또는 그 성분) 또는 산물(예, 유전자 변형을 통해 생산된 세포외 매트릭스, 영양인자 및 그외 생물학적 인자)를 포함하는 약학 조성물의 투여에 의한 치료 방법을 포함한다.
본원에 개시된 세포 조성물을 투여하기 위한 투약 형태 및 요법은 각 환자의 상태, 예로 치료중인 증상의 특성 및 정도, 연령, 성별, 체중 및 일반적인 의학적인 상태와, 의료 실무자들에게 공지되어 있는 그외 인자를 고려하는, 우수한 의학 실무에 따라 개발된다. 따라서, 환자에게 투여되는 약학 조성물의 유효량은 당업계에 공지된 바와 같이 이러한 고려사항에 따라 결정된다.
본 발명의 일부 예에서, 본 발명의 세포 조성물을 이용한 치료 개시 전에, 환자의 면역을 억제하는것이 필수적이거나 또는 바람직하지 않을 수 있다. 따라서, 동종이형 또는 이종의 MPC 또는 그 자손의 이식은 일부 경우에서는 허용될 수 있다.
그러나, 다른 경우에서는, 세포 요법을 개시하기 전에 환자의 면역을 약물학적으로 억제하는 것이 바람직하거나 적절할 수 있다. 이는 전신성 또는 국소 면역억제제를 이용하여 달성할 수 있으며, 또는 캡슐화된 장치를 통해 세포를 전달함으로써 수행할 수 있다. MPC 또는 그 자손은 세포가 필요로하는 영양분 및 산소와 치료 인자가 투과가능하지만, 면역 체액성 인자 및 세포에는 비투과성인 캡슐에 캡슐화될 수 있다. 바람직하게는, 캡슐화제는 저자극성이며, 표적 조직에 용이하고 안정적으로 위치시킬 수 있으며, 이식된 구조물에 대한 방어를 제공한다. 이식된 세포에 대한 면역반응을 감소 또는 없애기 위한 이러한 및 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다. 대안적으로, MPC 또는 그 자손은 유전자 변형시켜 그들의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
이식된 MPC 또는 그 자손의 살아있는 환자에서의 생존성은 CAT(computerized axial tomography) 또는 CT 스캔, MRI(magnetic resonance imaging), 또는 PET(positron emission tomography) 스캔과 같이 다양한 스캐닝 기법을 이용하여 결정할 수 있다. 또한, 이식물의 생존 측정은 사후 표적 조직을 축출하여 이를 가시화하거나 또는 현미경으로 검경하여 주사할 수 있다. 대안적으로는, 세포를 특정 계통의 세포에 특이적인 염료로 처리할 수 있다. 이식된 세포는 또한 로다민- 또는 플루오레세인-표지된 미세구, 패스트 블루, 비스벤즈아미드, 페릭 마이크로파티클과 같은 트레이서 염색제의 전처리나, 또는 β-갈락토시다제 또는 β-글루코로니다제와 같이 유전자 도입된 리포터 유전자 산물에 의해 동정할 수 있다.
대상체에 이식된 MPC 또는 그 자손의 기능적 통합(functional integration)은 손상 또는 질병에 걸린 기능의 회복, 예컨대 관절이나 골 기능 회복 또는 기능 증대를 조사함으로써 평가할 수 있다.
본 발명의 세포 조성물은 하나 이상의 생활성 인자를 포함할 수 있으며, 그 예로는 성장 인자, 분화-유도 인자, 카스파제 저해제와 같은 새포 생존 인자, p38 키나제 저해제와 같은 항-염증제, VEGF 또는 bFGF와 같은 혈관신생 인자가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 생활성 인자의 일부 예로 PDGF-bb, EGF, bFGF, IGF-1 및 LIF를 포함한다.
대안적으로 이식되는 MPC 또는 그 자손은 성장 인자, 항산화제, 항- 세포사멸제, 항-염증제 또는 혈관신생 인자를 발현하기 위해 유전자 변형될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체내에 동질적인 또는 이종적인 MPC 또는 그 자손 집단, 그의 세포외 기질이나 세포 융해물, 또는 적응용 배지를 포함할 수 있다. 본 발명의 세포에 대한 약학적으로 허용가능한 담체로는 본 발명의 세포, 그 조성물 또는 성분과 유해하게 반응하지 않는 적합한 유기 또는 유기 담체 물질을 포함한다. 생체이용가능한 범위에서, 적합한 약학적으로 허용가능한 담체로는 물, 염 용액(링거액), 알코올, 오일, 젤라틴 및 락토스, 아밀로스 또는 전분과 같은 탄수화물, 지방산 에스테르, 하이드록시메틸셀룰로스 및 폴리비닐 피롤리돈이 있다. 이러한 조제물들은 멸균할 수 있으며, 적절한 경우에 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 에멀젼화제, 삼투압을 위한 염, 완충액 및 발색제와 같은 보조제와 혼합할 수 있다. 본 발명에 이용하기 적합한 약학 담체는 당업계에 공지되어 있으며, 예로 Pharmaceutical Sciences(17.sup.th Ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa.) 및 WO 96/05309에 개시되어 있으며, 이들은 각각 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
그외 하나 이상의 성분을 이식된 세포에 첨가할 수 있으며, 상기 성분은 당업계에 공지된 한가지 타입 이상의 콜라겐과 같은 선택된 세포외 기질 성분, 및/또는 성장 인자, 혈소판이 풍부한 혈장 및 약물을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 세폰는 성장 인자 발현 및 생산을 위해 유전자 조작될 수 있다. 본 발명의 세포의 유전자 조작에 대한 구체적인 내용은 본원에 기재되어 있다.
비제한적인 예에 있어서, 본 발명의 세포를 포함하는 제형은 골 조직과 같이 새로운 조직 형성을 원하는 부위에 직접 투여하기 위해 제조된다. 예컨대, 비제한적으로, MPC 또는 그 자손은 주사용 하이드로겔 용액에 현탁할 수 있다. 본 발명에 이용하기에 적합한 하이드로겐의 예로는, 자가-조립성 펩티드, 예컨대 RAD16이 있다. 대안적으로, 세포를 포함하는 하이드로겔 용액은 예컨대 몰드에서 경화되어, 이식하기 전에 세포가 분산되어 있는 매트릭스를 제조할 수 있다. 또한, 매트릭스가 경화된 후, 세포 형성물은 이식전에 세포가 유사분열하도록 배양할 수 있다. 하이드로겔은 공유, 이온 또는 수소 결합을 통해 가교되어 물 분자를 포획하여 젤을 형성하는, 3차원의 개방형 격자 구조를 형성하는, 유기 폴리머(천연 또는 합성)이다. 하이드로겔 형성에 사용할 수 있는 물질의 예로는 알기네이트 및 그의 염과 같은 다당류, 펩티드, 폴리포스파진 및 각각 온도 또는 pH에 의해 가교된 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블럭 공중합체와 같이 이온 가교된 폴리머 또 블록 폴리머인 리아크릴레이트가 있다.
본 발명의 일부 예에 있어서, 제형은 미국 특허 특허 공개번호 2002/0022676; Anseth et al, J. Control Release, 78(1-3): 199-209(2002); Wang et al., Biomaterials, 24(22):3969-80(2003)에 기술된 바와 같이, 자체(in situ) 중합성 겔(polymerizable gel)을 포함한다.
일부 예들에서, 폴리머는 하전된 측기 또는 그의 1가 이온성 염을 가지는 물, 완충화된 염 용액 또는 수계 알코올 용액과 같은 수용액중에 일부분 이상 가용적이다. 양이온과 반응할 수 있는 산성 측기를 가지는 폴리머의 예로는 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 아크릴산과 메타크릴산의 공중합체, 폴리(비닐 아세테이트) 및 설폰화된 폴리스티렌과 같은 설폰화된 폴리머가 있다. 아크릴 또는 메타크릴산과 비닐 에테르 모노머 또는 폴리머의 반응에 의해 형성된 산성 측기를 가지는 공중합체도 사용할 수 있다. 산성기의 예로는 카르복시산기, 솔폰산기, 할로겐화된(바람직하기로는 플루오르화된) 알코올기, 페놀의 OH기, 및 산성 OH기가 있다.
음이온과 반응할 수 있는 염기 측기를 가지는 폴리머의 예는, 폴리(비닐 아민), 폴리(비닐 피리딘), 폴리(비닐 이미다졸) 및 일부 이미노 치환된 폴리포스파젠이다. 폴리머의 암모늄 또는 4차염은 벡본 니트로겐 또는 달린 이미노기로부터 형성할 수 있다. 염기 측기의 예는 아미노 및 이미노기이다.
알기네이트는 이가 양이온들과, 수중에서, 실온에서 이온 가교하여, 하이드로겔 매트릭스를 형성할 수 있다. 이러한 온화한 조건으로 인해, 알기네이트는 Lim의 미국 특허 제 4,352,883호에 개시된 바와 같이, 하이브리도마 세포의 캡슐화에 가장 일반적으로 사용되는 폴리머이다. 방법으로, 캡슐화되는 생물 물질을 포함하고 있는 수용액을 수용성 폴리머 용액 중에 현탁하고, 현탁물을 소적(droplet)으로 만든 다음, 다가 양이온과의 접촉에 의해 개별적인 미세캡슐로 변환시켜, 이후 미세캡슐 표면을 폴리아미노산과 가교시켜 캡슐화된 물질 주변의 반투과성 막을 형성시킨다.
폴리포스파젠은 양자 택일의 단일 결합 및 이중 결합에 의해 떨어져 있는 니트로겐 및 포스포로스로 구성된 백본을 가지는 폴리머이다. 각 포스포러스 원자는 2개의 측쇄와 공유 결합되어 있다.
가교에 적합한 폴리포스파젠은 2가 또는 3가 양이온으로 염 브릿지를 형성할 수 있으며 산성인 측쇄기 대부분을 가지고 있다. 바람직한 산성 측기의 예는 카르복시산기 및 설폰산기이다. 가수분해적으로 안정적인 폴리포스파젠은 Ca2 + 또는 Al3+과 같은 2가 또는 3가 양이온에 의해 가교된 카르복시산 측기를 가지고 있는 모노머들로 형성된다. 이미다졸, 아미노산 에스테르 또는 글리세롤 측기를 가지는 모노머들의 통합에 의해 가수분해로 분해되는 폴리머를 합성할 수 있다. 예컨대, 폴리양이온성 폴리[비스(카르복실아토페녹시)]포스파젠(PCPP)을 합성할 수 있으며, 이는 실온 또는 실온 보다 낮은 온도에서 수계 매질중에 용해된 다가 양이온과 가교하여, 하이드로겔 매트릭스를 형성한다.
생분해성 폴리포스파젠은 2 이상의 상이한 타입의 측쇄, 다가 양이온과 염 브릿지를 형성할 수 있는 산성기 및 생체내 조건에서 예컨대 이미다졸 기, 아미노산 에스테르, 글리세롤 및 글루코실을 가수 분해하는 측기를 가지고 있다
측쇄의 가수 분해로 폴리머는 마멸(erosion)된다. 가수 분해성 측쇄의 예는 비치환된 및 치환된 이미디졸, 및 기가 아미노 연결을 통해 포스포러스 원자에 결합되어 있는 아미노산 에스테르이다(R 기 둘다가 이러한 방식으로 부착된 폴리포스파젠 폴리머는 폴리아미노포스파젠이라함). 폴리이미다졸포스파젠의 경우, 폴리포스파젠 벡본상의 "R" 기들중 일부는 고리의 질소 원자를 통해 ㅂ벡터의 포스포러스에 부착되어 있는 이미다졸 고리이다. 그외 "R"기는 메틸 페녹시기 또는 Allcock et al, Macromolecule 10:824(1977)의 과학 논문에 기재된 다른 기와 같이, 가수 분해에 관여하지 않는 유기 잔기일 수 있다. 하이드로겔 물질의 합성 방법과 이러한 하이드로겔 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.
또한, 제형에 다른 성분들이 포함될 수 있으며, 비제한적으로, (1) 적합한 pH 및 등장성을 제공하기 위한 완충제; (2) 윤활제; (3) 투여부위나 근처에서 세포를 보유하기 위한, 예컨대 알기네이트, 아가 및 식물성 검을 포함한 점성 물질; 및 (4) 투여 부위에 원하는 효과, 예컨대 조직 형성 또는 물리화학적 특징의 증강 또는 변형, 세포의 생존 능력 지지로서, 또는 감염 또는 거부 반응 저해를 형성할 수 있는 다른 타입의 세포들 중 임의 것을 포함한다. 세포가 상기 부위외로 나가는 것을 방지하기 위한, 적합한 상처 커버링으로 피복될 수 있다. 상기 상처 커버링은 당업계에게 공지되어 있다.
골 조직 패치의 제형
미리 모양을 잡아둔 웰에서 MPC 또는 그 유래 자손의 배양 또는 공동 배양으로 미리 결정된 두께 및 체적의 조직 패치를 제조할 수 있다. 제조되는 조직 패치의 체적은 웰의 체적과 MPC 또는 그 유래 자손의 수에 의존적이다. 미리 결정된 최적 체적을 갖춘 조직은 전술한 파라미터중 하나 또는 둘다를 변형시켜, 일반적인 실험으로 제조할 수 있다.
웰 표면에 접촉하고 있는 세포는 MPC 또는 그 유래 자손의 표면에 접촉하고 있는 세포 부착을 방해하는 분자로 코팅할 수 있다. 바람직한 코팅제는 실리콘 기반의 시약, 즉 디클로로디메틸실란 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 기반의 시약, 즉 TEFLON을 포함한다. 실리콘 기반의 시약, 특히 디클로로디메틸실란으로 물질을 코팅하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, Sambrook et al.(1989) "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 그외 세포가 웰 표면에 부착되는 것을 예방하는 생체적합한 시약은 본 발명의 실시에 사용할 수 있음을 이해한다.
대안적으로, 웰은 그 자체가 세포의 부착을 허용하지 않는 유연한 또는 형태를 만들 수 있는 생체적합한 물질로부터 만들 수 있다. 이러한 세포 부착을 방지하는 바람직한 물질은 아가로스, 유리, 무처리 세포 배양 플라스틱, 및 폴리테트라플루오로에틸렌, 즉 TEFLON을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 무처리 세포 배양 플라스틱, 즉 전정기적 전하를 띄지 않는 물질로 처리되저나 또는 만들어지지 않은 플라스틱은 시중에서 구입가능하며, 예컨대 Falcon Labware, Becton-Dickinson, Lincoln Park, NJ에서 구입할 수 있다. 그러나, 전술한 물질로 한정되는 것은 아니다. MPC 또는 그 유래 자손의 부착을 본래 방해하는 다른 유연하거나 또는 형태를 만들 수 있는 생체적합한 임의 물질이 본 발명의 실시에 이용할 수 있는 것으로 이해된다.
MPC 또는 그 유래 자손은 현탁액 중에서, 미리 형태를 만들어 둔 웰에 접종하여 배양하였다. MPC 또는 그 유래 자손은 웰 배양시 연골형성 또는 골형성 표현형으로 분화하도록 유도될 수 있으며, 또는 웰에 접종하기 전에 분화를 유도할 수 있다. 세포는 mL당 약 1 x 105 내지 1 x 109 세포 밀도로 배양 배지에 첨가함으로써 희석할 수 있다.
세포는 세포의 점착 플러그(cohesive plug)를 형성할 수 있다. 세포의 점착 플로그를 웰에서 취하여, 조직 결손부로 수술에 의해 이식할 수 있다. 미분화된 MPC 또는 그 유래 자손은 자체에서 분화하여 생체내에서 조직을 형성할 수 있을 것으로 생각된다.
골 결손은 CAT(computer aided tomography) 스캐닝: X-레이 시험, MRI(magnetic resonance imaging), 활액(synovial fluid) 또는 혈청 마커 분석, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 공정을 이용하여 추론으로 동정할 수 있다. 또한, 포유류에서 결손은 관절경 검사 또는 관절의 개복 수술 중에 시각적으로 쉽게 동정가능하다. 결손 치료는 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물을 이용하여 관절경 검사 또는 개복 수술 중에 수행될 수 있다.
따라서, 결손이 동정되면, 결손은 (1) 본 명세서에 기재된 방법으로 제조된 조직 패치를 미리 결정한 부위에 수술로 이식하는 단계; 및 (2) 상기 조직 패치를 미리 결정한 부위에 삽입하는 단계로, 치료될 수 있다.
조직 패치는 선택적으로 패치가 결손부에 이식되었을때 이식된 조직의 가장자리는 결손부의 가장자리와 직접 접촉하는, 크기와 모양을 갖추고 있다. 또한, 조직 패치는 수술 중에 바른 위치에 고정할 수 있다. 이는 패치를 생분해성 봉합사로 수술로 고정하거나 및/또는 생점착제를 패치와 결손부가 접촉하는 부위에 적용함으로써, 달성할 수 있다.
일부 예에서, 손상된 조직은 조직 패치를 이식하기 전에 외과적으로 적출할 수 있다.
스캐폴드를 이용한 MPC 또는 그 유래 자손의 이식
본 발명의 세포 조성물 또는 그의 공동-배양물은 3차 구조의 스캐폴드 상에 또는 내에 접종하여, 접종된 세포가 프레임워크상에서 증식하여 환자의 세포와 공동으로 골 조직과 같은 대체 조직을 생체내에서 형성하게 될 부위에 생체내 이식할 수 있다.
예컨대, 스캐폴드는 스캐폴드 구조가 (1) 분해되지 않고 접종된 세포를 유지하고; (2) 조직 이식물이 숙주 세포 조직에 의해 리모델링될 때까지 접종후 세포를 유지하고; (3) 접종한 세포가 스캐폴드가 분해된 시점에 시험관내에서 스스로를 지탱하는데 충분한 기계적 보존성(mechanical integrity)을 가지는 조직 구조로 부착, 증식 및 발생하도록 설계될 수 있다. 이러한 스캐폴드 설계 재검토는 Hutmacher, J. Biomat. Sci. Polymer Edn., 12(l):107-124(2001)에 의해 이루어졌다.
본 발명의 스캐폴드는 조직 형성을 자극하거나 그렇지 않으면 본 발명의 실시를 증강 또는 개선시키는, 하나 이상의 성장 인자, 세포, 예컨대 줄기세포, 골수세포, 연골세포, 연골모세포, 골세포, 골모세포, 파골세포, 골 라이닝 세포 또는 이들의 전구체, 약물 또는 본원에 개시된 다른 성분들과 병용 투여할 수 있다. 스캐폴드상에 접종한 MPC 또는 그 유래 자손은 성장 인자나 약물을 발현하도록 유전자 변형될 수 있다.
본 발명의 세포를 사용하여 시험관내에서 새로운 조직을 제조한 다음, 조직 복구, 대체 또는 확대를 원하는 부위에 이식(implant), 이식(transplant) 또는 삽입할 수 있다.
비제한적인 예에 있어서, 본 발명의 세포를 사용하여 시험관내에서 3차 구조의 조직 구조체를 제조한 다음, 생체내에 이식한다. 3차 구조의 조직 구조체의 제조 예로 미국 특허 제 4,963,489호를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 예로, 본 발명의 세포는 3차 구조의 프래임워크나 스캐폴드에 분주 또는 접종하여 시험관내에서 증식 또는 성장시켜, 생체내 이식할 수 있는 살아있는 조직을 형성할 수 있다.
본 발명의 세포는 서브-컨플루언스 또는 컨플루언스로 배양 용기에서 자유롭게 성장시키고, 배양물에서 떠서 3차 구조의 프래임워크상에 분주할 수 있다. 3차 구조 프래임워크에 세포를 고농도로, 예컨대 mL 당 약 106 내지 5 x 107 세포수로 분주함으로써, 비교적 짧은 기간에 3차 구조 지지체를 만들 수 있을 것이다.
본 발명에서 사용할 수 있는 스캐폴드의 예는, 부직포 매트, 다공성 폼 또는 자가 조립성 펩티드를 포함한다. 부직포 매트는 예컨대 상표명 VICRYL(Ethicon, Inc., Somerville, N. J.)로 판매되고 있는 글리콜산 및 락트산(PGA/PLA)의 흡착성 합성 공중합체로 구성된 섬유를 이용하여 제조할 수 있다. 예컨대 미국 특허 제 6,355,699호에서 논의된 바와 같이, 동결-건조 또는 동결건조와 같은 공정으로 제조한 폴리(엡실론-카ㅡ롤락톤)/폴리(글리콜산)(PCL/PGA) 공중합체로 구성된 폼 역시 가능한 스캐폴드이다. 자가-조립성 펩티드(예, RAD16)과 같은 하이드로겔을 또한 사용할 수 있다. 이들 물질은 조직 성장의 지지체로서 흔히 사용된다.
3차 구조의 프래임워크는 모노-, 디-, 트리-, α-트리-, β-트리-, 및 테트라-칼슘 포스페이트, 하이드록시아파티트, 플루오로아파티트, 칼슘 설페이트, 칼슘 플루오라이드, 칼슘 옥사이드, 칼슘 카르보네이트, 마그네슘 칼슘 포스페이트, BIOGLASS(University of Florida, Gainesville, FIa.)와 같은 생물학적으로 활성인 유리, 및 이들의 조합을 비제한적으로 포함하는, 세라믹 물질로 제조할 수 있다. 현재, 상품명 SURGIBON(Unilab Surgibone, Inc., Canada), ENDOBON(Merck Biomaterial France, France), CEROS(Mathys, A. G., Bettlach, Switzerland), 및 INTERPORE(Interpore, Irvine, Calif., United States)의 시중에서 구입할 수 있는 적정 다공성 생체적합한 세리믹 물질과, HEALOS(Orquest, Inc., Mountain View, Calif.) 및 VITOSS와 같은 미네랄화된 콜리겐 골 이식 제품, RHAKOSS, 및 CORTOSS(Orthovita, Malvern, Pa.)가 다수개 있다. 프래임워크는 천연 및/또는 합성 물질의 혼합물, 블랜드 또는 복합물(composite)일 수 있다. 일부 예에서, 스캐폴드는 케이지(cage) 형태이다. 바람직한 예에서, 스캐폴드는 콜라겐으로 코딩되어 있다.
바람직한 예에 있어서, 프래임워크는 펠트(felt)이며, 생체흡수성 물질, 예컨대 PGA, PLA, PCL 공중합체 또는 블랜드, 또는 히알루론산으로 제조된 다중필라멘트 얀으로 구성될 수 있다. 얀은 크림핑(crimping), 커팅(cutting), 소모(carding) 및 꿰매기(needling)로 이루어진 표준 직물 가공 기법을 이용하여 펠트로 제조된다.
본 발명의 다른 바람직한 예에 있어서, 본 발명의 세포는 복합 구조일 수 있는 폼 스캐폴드상에 접종된다. 또한, 3차 구조 프래임워크는 귀, 골, 관절 또는 그외 복구, 대체 또는 확대가 필요한 신체 특정 구조의 외부 구조와 같이 유용한 모양으로 몰딩할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 세포는 미국 특허 제 6,200,606호에 개시된 바와 같이, 환자 이식용 보형 장치를 포함하는 프래임워크상에 접종되며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 언급되어 있는 바와 같이, 골 및 연골 이식 과정에 이용하기 위한 임상적으로 유용한 다양한 보형 장치가 개발되었다(예, Bone Grafts and Bone Substitutions. Ed. M. B. Habal & A. H. Reddi, W. B. Saunders Co., 1992). 예컨대, 유효한 무릎 및 엉덩이 대체 장치는 계속적으로 임상 환경에 널리 사용되고 있다. 신체에서 안전하게 기능하는 다수의 이들 장치들은 면역원성이 낮은 다양한 무기 물질을 이용하여, 제조된다. 시도되고 입증된 합성 물질의 예로는 티타늄 합금, 칼슘 포스페이트, 세라믹 하이드록시아파티트, 및 다양한 스테인레스 스틸 및 코발트-크롬 합금이 있다. 이러한 물질은 구조 지지체를 제공하며, 숙주의 가시화 및 세포 이동을 발생시킬 수 있는 스캐폴딩을 형성할 수 있다.
프래임워크는 본 발명의 세포 분주전에 세포 부착을 증강시키기 위해 처리될 수 있다. 예로, 본 발명의 세포 분주 전에 나일론 매트릭스를 0.1 몰 아세트산으로 처리하고, 폴리라이신, PBS 및/또는 콜라겐 중에 배양하여 나일론을 코팅할 수 있다. 폴리스티렌은 황산을 이용하여 이와 유사하게 처리할 수 있다.
또한, 3차 구조 프래임워크의 외표면을, 프래임워크의 플라즈마 코팅 또는 하나 이상의 단백질(예, 콜라겐, 탄력 섬유, 아교 섬유), 당단백질, 글리코사미노글리칸(예, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 더마탄 설페이트, 케라틴 설페이트), 세포 기질 및/또는 비제한적으로 젤라틴, 알기네이트, 아가, 아가로스 및 식물성 검과 같은 다른 물질의 첨가에 의해, 세포의 부착 또는 성장 및 조직 분화를 개선시키기 위해 변형할 수 있다.
일부 예에서, 스캐폴드는 이에 비-혈전 형성력을 부여하는 물질로 구성되거나, 또는 처리된다. 또한, 이러한 처리제 및 물질은 내피 세포 성장, 이동 및 세포외 기질 침착을 촉진 및 유지할 수 있다. 이러한 물질 및 처리제의 예로는, 기저 막 단백질, 예컨대 라미닌 및 IV형 콜라겐과 같은 천연 물질, ePTFE와 같은 합성 물질, 및 PURSPAN(The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif.)과 같은 분할된 폴리유레탄유레아 실리콘(segmented polyurethaneurea silicone)이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이들 문질은 스캐폴드를 비-혈전형성형으로 하기 위해 추가적으로 처리될 수 있다. 이러한 처리제는 헤파린과 같은 항-혈전제와, 플라즈마 코팅과 같은 물질의 표면 전하를 바꾸는 처리제를 포함한다.
일부 예에서, 스캐폴드의 표면은 짜서 만든다(textured). 예컨대, 본 발명의 일부 측면에서, 스캐폴드는 그로브(groove) 및 리지(ridge) 패턴으로 제공된다. 그로브는 바람직하기로는 약 500 ㎛ 미만이고, 더 바람직하기로는 약 100 ㎛ 미만이고, 가장 바람직하기로는 약 10 nm 내지 10 ㎛이다. 이러한 "마이크로그로브"는 세포가 표면 그로브에 의해 정렬 및/또는 이동되게 한다.
일부 예에서, 본 발명의 세포를 생체내 이식 또는 시험관내에서 사용하기 전까지 성장하는 정도는 바뀔 수 있어, 생체내에서 나타나는 세포의 미세환경을 배양시에 재창출하는 것이 중요하다. 또한, 성장 인자, 연골 분화 유도제, 골 유도제 및 혈관신생 인자를, 세포의 분주 전에, 도중에 또는 이후에 배양 배지에 첨가하여, MPC 또는 그로부터 유래된 자손이나 이의 공동 배양에 의해 분화 및 조직 형성을 촉발시킬 수 있다.
3차 구조의 프래임워크를 변형하여, 세포의 성장 및 그로부터 조직 형성을 증강시키거나, 또는 임플란트의 거부 위험성을 낮출 수 있다. 따라서, 비제한적으로, 항-염증제, 면역억제제, 또는 성장 인자를 포함하는 하나 이상의 생물학적으로 활성인 화합물을 프래임워크에 첨가할 수 있다.
세포외 기질 또는 세포 융해물의 치료 용도
본 발명의 세포 또는 그로부터 생산된 살아있는 조직 이식의 대안적인 방법으로서, 세포외 기질(ECM) 또는 세포에 의해 제조된 세포 융해물과 같은,(특히 유전자 변형된) MPC 또는 그로부터 유래된 자손의 성분 또는 산물을 투여함으로써, 조직 회복, 대체, 또는 확대가 필요한 대상체에게 이로울 수 있다.
일부 예에서, 본 발명의 세포를 예컨대 본원에 개시된 3차 구조의 스캐폴드 시스템을 이용하여 시험관내에서 배양하면, 원하는 함량의 ECM가 프래임워크상에 분비된다. ECM이 프래임워크상에 분비되면, 세포는 제거할 수 있다. ECM은 예컨대 주사용 조제물로서 추후에 사용하기 위해 처리할 수 있다.
일부 예에서, 세포은 사멸되며, 세포 파편(예, 세포 막)은 프래임워크에서 제거된다. 이 과정은 다수의 여러가지 방식으로 수행할 수 있다. 예컨대, 살아있는 조직은 동결보존제를 사용하지 않고 액체 질소 중에 급속-동결할 수 있으며, 또는 조직을 멸균한 증류수에 침지하여 세포가 삼투압에 의해 파열될 수 있다. 세포가 사멸되면, 세포 막은 파괴되고 세포 파편은 EDTA, CHAPS 또는 양쪽이온성 세정제와 같은 온화한 세정제로 헹구어 제거할 수 있다. 온화한 세정제 린스를 이용하는 경우의 장점은 종종 항원성이 높은 막-결합 단백질을 가용화한다는 것이다.
대안적으로, 조직은 효소에 의해 분해하거나 및/또는 세포 막을 파괴하는 시약을 이용하여 추출할 수 있다. 이러한 효소의 예로는, 히알루로니다제, 디스파제, 프로테아제 및 뉴클레아제(예, 데옥시리보뉴클레아제 및 리보뉴클레아제)가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 세정제의 예로는, 예컨대, 알킬아킬 폴리에테르 알코올(TRITON X-1OO), 옥틸페녹시 폴리에톡시-에탄올(Rohm and Haas Philadelphia, Pa.), BRIJ-35, 폴리에톡시에탄올 라우릴 에테르(Atlas Chemical Co., San Diego, Calif.), 폴리소르베이트 20(TWEEN 20), 폴리에톡시에탄올 소르비탄 모노라우레이트(Rohm and Haas), 폴리에틸렌 라우릴 에테르(Rohm and Haas)와 같은 비-이온성 세정제; 및 예컨대 소듐 도데실 설페이트, 황산화된 지방족 고급 알코올, 설폰화된 알칸 및 7 내지 22개의 탄소 원자를 함유하고 있는 분지쇄 또는 비-분지쇄의 설폰화된 알킬아렌과 같은 이온성 세정제가 있다.
ECM을 포함하는 스캐폴드는 전술한 바와 같이 치료적으로 사용할 수 있다. 대안적으로, ECM은 스캐폴드로부터 수집할 수 있다. ECM 수집은 스캐폴드가 생분해성 또는 비-생분해성인지에 따라 다양한 방식으로 달성할 수 있다. 예컨대, 프래임워크가 비-생분해성인 경우, ECM은 프래임워크를 초음파분해, 고압 워터 젯, 기계적 스크랩핑 또는 세정제나 효소를 이용한 가벼운 처리, 또는 이들의 임이 조합에 의해 제거할 수 있다.
프래임워크가 생분해성인 경우, ECM은 예컨대 프래임워크가 분해 또는 용액에 용해되게 함으로써, 모을 수 있다. 대안적으로, 생분해성 프래임워크가 그자체가 ECM과 함께 주입될 수 있는 물질로 구성된 경우, 프래임워크와 ECM은 이후 주입을 위해 전부 가공할 수 있다. 대안적으로, ECM은 비-생분해성 프래임워크로부터 ECM을 모으기 위한 상기 임의 방법에 의해, 생분해성 프래임워크로부터 제거할 수 있다. 모든 수집 과정은 바람직하기로는 본 발명의 세포에 의해 형성된 ECM 또는 세포 융해물을 변성시키지 않도록 설계된다.
본 발명은 간엽 전구세포(MPC) 및/또는 그로부터 유래된 전구세포를 SDF-1 또는 그 유사체에 노출시키는 것을 포함하는, MPC 또는 그 자손의 증식 및/또는 생존성을 증강시키는 시험관내 또는 생체내 방법, 분리된 MPC 또는 그 자손과, SDF-1 또는 그 유사체를 포함하는 조성물, 이러한 방법 및 조성물을 포유류에서 골을 생성하는 생체내 또는 생체외(ex vivo) 방법을 제공한다.
도 1. 배양 MPC 유래의 STRO -1 bri 또는 STRO -1 dim 발현 세포의 유전자 발현 프로파일. 생체외 증폭된(ex vivo expanded) 골수 MPC의 단일 세포 현탁물을 트립신/EDTA 처리에 의해 제조하였다. 세포는 이후 염소-항 뮤라인 IgM-플루오레세인 이소티오시아네이트와의 인큐베이션에 의해 발색되는 STRO-1 항체로 염색하였다. 총 세포 RNA를 TRO-1bri 또는 STRO-1dim 발현 세포로부터 준비하였고, 이후 형광 활성화 세포 분류(A)를 수행하였다. RNAzolB 추출 방법과 표준적인 방법으로, 각 서브집단으로부터 총 RNA를 분리하여, cDNA 합성의 주형으로 사용하였다. 다양한 전사체 발현은 종래에 개시된 표준 프로토콜을 이용하여, PCR 증폭으로 분석하였다(Gronthos et al. J Cell Sci. 116:1827-1835, 2003). 본 연구에서 사용한 프라이머 세트는 표 2에 나타낸다. 증폭한 후, 각 반응 혼합물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동으로 분석하고, EtBt 염색(B)으로 가시화하였다. 각 세포 마커의 상대적인 유전자 발현은 하우스-키핑 유전자, GAPDH 발현을 참조하여, ImageQant software로 분석하였다(C).
도 2. 골수 MPC 유래 생체외 증폭한 세포의 면역표현형 발현 패턴. 생체외 증폭한 골수 MPC의 단일 세포 현탁물을 트립신/EDTA 탈착으로 제조한 다음, 광범위의 세포 계통-관련 마커를 동정하는 항체와 조합하여 STRO-1 항체와 인큐베이션하였다. STRO-1은 항-뮤라인 IgM-플루오레세인 이소티오시아네이트를 이용하여 동정하였으며, 다른 모든 마커는 염소 항-마우스 또는 항-토끼 IgG-피코에리트린 중 어느 하나를 사용하여 동정하였다. 세포내 항원을 동정하는 이러한 항체의 경우, 세포 준비물은 STRO-1 항체로 먼저 표지하고, 차가운 70% 에탄올로 고정하여, 세포 막을 투과가능한 상태로 만든 다음, 세포내 항원 특이적인 항체와 인큐베이션하였다. 이소타입이 일치되는 대조군 항체를 동일한 조건하에서 사용하였다. 2가지 색의 유세포 분석을 COULTER EPICS 유세포기로 수행하였고, 리스트 모드(list mode) 데이타를 수집하였다. 점 그래프는 5,000건의 리스트 모드를 나타내며, 이는 각 계통 세포 마커(y 축) 및 STRO-1(X축)에 대한 형광 강도 정도를 나타낸다. 수직 및 수평 사분면을 이소타입이 일치되는 음성 대조군 항체에 대하여, 확립하였다.
도 3. 시험관내 지방 세포 분화. STRO-1bri/VCAM-I+로 분류되는 골수세포로부터 유래된, 생체외 증폭시킨 세포의 이차 배양물을 트립신/EDTA 분해로 탈착하여, 단일 세포 현탁물을 제조하였다. 증폭시킨 세포는 도 1a에 나타낸 바와 같이 단색 형광 활성화 세포 분류를 이용하여 그것의 STRO-1 발현에 따라 분리하였다. STRO-1bri 및 STRO-1dim으로 분류된 MPC 유래 세포를 6-웰 플레이트에 웰당 1 x 105 세포로 정해진 배양 배지하에서 하룻밤동안 두었다. 다음날, 배양 배지는 방법에서 언급한 바와 같이 지방 세포 유도 배지로 교체하였다. 세포를 고정하고 Oil red O로 염색하는 총 3주 동안 일주일에 두번 배양물에 공급하였다. 저배율(4x) 및 고배율(20x)에서 부착 기질층에 분포된 지방 세포를 함유하는 지질의 Oil red O 염색을 나타낸다. STRO-1dim 배양물에서 7 + 2(20 x에서 면적당, n=9)개의 지방 세포에 비해, STRO-1bri 배양물에서는 평균 22 + 5의 Oil red O 양성 지방 세포가 확인되었다.
도 4. 시험관내 골형성 분화. STRO-1bri/VCAM-I+의 골수세포로부터 유래된 생체외 증폭시킨 세포의 이차 배양물을 트립신/EDTA 분해로 탈착하여 단일 세포 현탁물을 준비하였다. 증폭시킨 세포는 도 1a에 나타낸 바와 같이 단색 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 이용하여 STRO-1 발현에 따라 분리하였다. STRO-1dim 및 STRO-1dim FACS 분리 세포는 이후 48웰 플레이트에 웰당 0.3 X 105 세포로 48웰 플레이트에 일정 성장 배지(각 배양마다 4세트)로 밤새 배양하였다. 다음날, 배양 배지는 방법 부분에 기재된 바와 같이 골형성 유도 배지로 교체하였다. 그후 배양물의 배지를 총 3주간의 기간동안 1주일에 2번씩 갈아주었고, 3주째에 세포를 0.6N HCl로 처리하여 미네랄 침착물(mineralized deposit)내 칼슘을 추출하였다. 샘플은 o-크레졸-프탈레인-컴플렉손과 반응시켜, 570 nm에서 색도계 반응을 읽었다. 절대 칼슘 농도는 칼슘의 표준 곡선에 따라 결정하였다. (A) 칼슘 측정 결과는 STRO-1bri 배양물이 STRO-1dim 배양물에 비해 현저하게 많은 미네랄을 합성함을 보였다(*; p<O.05; t-test). 리플리케이트 배양물을 고정하여 알리자린 레드 염색으로 염색한 결과, STRO-1bri(B) 및 STRO-1dim(c) 배양물의 부착층에 전형적인 수준의 미네랄 침착이 나타났다.
도 5. 시험관내 연골 분화. STRO-1bri/VCAM-I+의 골수세포로부터 유래된 생체외 증폭시킨 세포의 이차 배양물을 트립신/EDTA 분해로 탈착하여 단일 세포 현탁물을 준비하였다. 증폭시킨 세포는 도 1a에 나타낸 바와 같이, 단색 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 이용하여 STRO-1 발현에 따라 분리하였다. STRO-1dim 및 STRO-1dim FACS 분리 세포는 이후 폴리프로필렌 튜브에 튜브당 2.5 X 105 세포로 펠렛을 넣고, 연골유도성 배지로 배양하였다. 그후, 배양물의 배지를 총 3주간 1주일에 2번 갈아주었다. 세포 펠렛을 회수하여 조직 검사 또는 방법 부분에 기재된 바와 같이 총 RNA 준비에 사용하였다. STRO-1bri(A) 및 STRO-1dim(B) 세포 집단은 연골세포계 세포를 함유하고 있는 세포 펠렛을 형성할 수 있었다. RT-PCR 분석 결과는 STRO-1bri(SB) 집단이 STRO-1dim(SD) 세포 집단(C)에 비해 연골 관련 유전자들, 콜라겐 타입 X 및 어그레칸의 농도가 높음을 나타낸다.
도 6. STRO -1 bri 세포는 STRO -1 dim 세포의 증식을 유도한다. 생체외 증폭시킨 골수 MPC의 단세포 현탁물은 트립신/EDTA 처리로 준비하였다. 세포는 도 1에 나타낸 바와 같이, STRO-1 항체로 염색한 다음 STRO-1bri 또는 STRO-1dim 발현하는 배양 세포 집단으로 분류하였다. 세포를 방법 부분에 기재한 바와 같이 CFSE로 표지하였다. 비표지 세포는 음성 대조군(자동-형광)으로 사용하였다. Colcemid®(100 ng/ml)을 사용하여 세포 분열을 저해하였고, 입력 표지 인덱스(0 세대)를 제공하였다. 비표지 STRO-1bri를 다시 CFSE-표지된 STRO-1dim 세포에 (A) 0 STRO-1bri : 1 x 105 STRO-1dim(0%); (B) 0.05 x l05 STRO-1bri : 0.95 x 105 STRO-1dim(5%); (C) 0.1 x lO5 STRO-1bri : 0.9 x 105 STRO-1dim(10%); (D) 0.2 x 105 STRO-1bri : 0.8 x l05 STRO-1dim(20%); (E) 0.5 x 105 STRO-1bri : 0.5 x 105 STRO-1dim(50%) 비율로 첨가하였다. 상기 혼합물은 7일간 배양한 다음, 수확하여 방법 부분에 개시된 유세포기로 분석하였다. ModFit LT for win 32(Version 2.0)를 이용하여 세포 증식을 분석하였다. STRO-1bri 세포(R1)은 농도 의존적인 양상으로 STRO-1dim 세포(R1)의 증식을 자극하는 것으로 확인되었다.
도 7. 사이토카인 및 골영양성 물질( osteotropic agent)은 배양물내 STRO -1bri 세포의 수를 증가시킨다. 10% FCS(A), 또는 1 x 10-8M 1α,25-디하이드록시비타민 D3 (1,25D)(B), 1O ng/ml 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)(C), 10 ng/ml 종양 괴사 인자-α(TNF-α)(D); 10 ng/ml 인터루킨-1β(IL-1β)(E) 및 30 ng/ml 기질 유래 인자 1-α(SDF-lα)를 포함하여 여러가지 인자가 보강된 기본 배지에서, 확립된 MPC 배양물을 배양하였다. 이러한 인자들은 STRO-1bri MPC 수를 증가시키는 것으로 확인되었다. 결과는 3 세트의 독립적인 실험의 대표적인 예를 나타낸다.
도 8. 가슴샘이 없는 누드 랫의 LAD(left anterior descending) 관상 동맥을 결찰시키고, 48시간 후에 염수, 1 x 106 인간 STRO-1dim 세포 또는 1 x 106 인간 STRO-1bri 세포 또는 1 x 106 인간 Stro-1-결핍된 골수 단핵구 세포를 주사하였다. 2주일후에, 동물을 죽이고, 심장 조직을 고정하고, 2종의 단일클론 항체로 염색하였다: 첫번째 항체는 선택적으로 인간이 아닌 랫 Ki67 항원에 대해 반응하며, 두번째 항체는 심근 세포 마커 트로포닌 I과 반응함. 이중으로 염색된 세포, 즉 랫의 심근 세포 증식을 나타내는 세포를, 면역페록시다제 기법으로 검출하였다. 1 x 1O6 Stro-1bri 인간 세포를 투여받은 동물은, 염수나 1 x 106 인간 STRO-1dim 인간 세포를 투여받은 대조군 동물에 비해 랫의 증식성 심근 세포의 수가 2.5 - 5배 높았다(p<O.O5).
도 9. 가슴샘이 없는 누드 랫에 VEGF를 계속 분비하는 랫의 아교모세포종 종양 세포를 피하 주사하였다. 2일후에, 랫에 염수, 0.5 x 106 인간 STRO-1dim 세포 또는 0.5 x 106 인간 Stro-1bri 세포를 종양내 주사하였다. 1주일 후, 동물을 죽이고, 종양 조직을 고정한 다음 2종의 단일클론 항체로 염색하였다: 첫번째는 평활근 세포가 발현하는 α-평활근 액틴 항원에 반응하며, 두번째는 혈관 내피 세포에서 발현되는 vWF 항원에 반응함. 내피 및 평활근 모두를 포함하고 있는 세동맥 및 동맥을 나타내는 이중으로 염색된 구조는 면역페록시다제 기법으로 검출하였다. 0.5 x 106 인간 Stro-1bri 주사 동물은, 염수 또는 1 x 106 인간 STRO-1dim 인간 세포에 비해 종양에서 세포 주사부에 세동맥 및 동맥의 수가 3.5-8배 증가되었다(p<0.05). 인간 세포가 주사된 곳의 원위부에서는 차이가 관찰되지 않았다.
도 10. IL-1β는 MPC 로부터 증폭시킨 세포의 증식 잠재력을 증가시킨다. 세포를 방법 부분에 기재한 바와 같이 CFSE로 표지하였다. 이후, 세포를 5일간 lO ng/ml IL-1β의 존재하에 배양하고, STRO-1 및 ALP PHOS mAb로 염색한 다음, 상기와 같이 분석하였다. (A) 무처리(NT) 및 (B) IL-1β-처리한 배양물에서는 Stro-1bri/ALP 양성 세포의 수 증가를 보였다. 이러한 STRO-1 발현 증가는 (C) 4번 세포 분열한 무처리 배양물에서 나타난 바와 같이 세포 증식 증가에 의해 수반된 것이지만, (D) IL-1β 처리 배양물에서는 Stro-1bri 골전구세포의 수 증가에 의한 세포 분열 횟수 증가를 나타낸다. 그 결과는 3번의 독립적인 실험의 대표적인 예를 보인다. 또한, 유사한 결과를 1,25D, PDGF-BB, TNF-α, IL-1β 및 SDF-lα에서 볼 수 있었으며, 이는 MPC를 자극하였다.
도 11. IL-1β는 MPC 증식을 자극하고, 골유도제 , 덱사메타존의 존재시 골 형성 잠재력을 증대시킨다. 생체외 증폭시킨 인간 MPC 전구체(A)를 2,000 세포/웰 밀도로 96웰 플레이트에 접종하여, α-MEM-10으로 배양하였다. 배양물에 소정의 농도로 IL-1β를 보충 첨가하였고, 방법 부분에 기재되어 있는 바와 같이 WST-I을 이용하여 7일째에 세포 수 및 생존성을 정량화하였다. IL-1β는 0.Ol ng/ml 농도에서 무처리 대조 배양군의 136.6 + 1.2%로 세포수를 현저하게 증가시켰다(D, P=0.000003, Student t-test). 0.1 ng/ml 보다 높은 농도에서는 고원효과(plateau effect)가 나타났다. 수치는 각 농도에서 삼중으로 실시한 배양물의 평균값 + SEM으로 나타낸다. (B & C) 생체외 증폭시킨 MPC 전구체를 3세트로 5 x 104/웰 농도로 24웰 플레이트에 접종하고, 방법 부분에 기재된 바와 같이 골 유도 조건에서 배양하였다. 세포는 10 ng/ml 농도로 IL-1β를 처리하고, 매주 IL-1β를 포함하는 신선한 배지로 "갈아(fed)"주었다. 매트릭스로부터의 자유 칼슘 분비는, 방법에 기재한 바와 같이 산성 조건하에서 부착 세포 층을 처리함으로써 달성하였다. 샘플은 방법에 기재한 바와 같이 o-크레졸-프탈렌-컴플렉손과 반응시키고, 570 nm에서 색 반응을 기록하였다. 절대 칼슘 농도를 칼슘 표준 곡선에 따라 결정하였다. 그 결과, 미네랄 침전은 무처리 세포(B) 보다 IL-1β 처리 세포(C)에서 증가하였다. IL-1β 처리 세포내 칼슘 수준은 무처리 세포 보다 4주(**P=0.00009, Student t-test) 및 6주(**P=O.00004, Student t-test) 모두에서 현저하게 높았다(D). 이 결과는 3가지 다른 수용자 유래 기질 세포를 이용한 3 세트의 독립적인 실험의 대표적인 예이다.
도 12. IL-1β는 STRO -1 bri MPC 증식을 자극하지만, 덱사메타손은 알칼린 포스파타제(ALP) 발현을 유도한다. 인간 MPC의 확립한 배양물을 3 x 104/웰로, (A) 무첨가(NT), (B) 10 ng/ml IL- 1β 또는 (C) 1 x 10-8 M 덱사메타손 및 (D) 10 ng/ml IL-1β 및 1 x 10-8M 덱사메타손이 보충된 완전 배지가 있는 24-웰 플레이트에 접종하였다. 방법에 기재한 바와 같이 21일 동안 세포를 배양하였다. 그 결과, IL-1β의 분열촉진 작용이 STRO-1bri MPC의 수를 증가시키고, 이후 STRO-1dim 세포(도 6 참조) 증식을 자극함을 시사한다. 또한, MPC는 성장 배지에 있는 FCS 및 아스코르베이트-2-포스페이트에 대한 반응으로 ALP 발현을 획득하며, 이는 글루코코르티코 스테로이드, 덱사메타손(dex)에 대한 반응으로 증강된다(D). IL-1β와 dex의 조합 작용은 도 11에 나타난 바와 같이, 골 형성을 증강시킨다. 실험은 3회 실시하였으며, 3종의 다른 수용자로부터 수득한 MPC에서 유사한 경향이 관찰되었다.
도 13. 시험관내 골 형성에 대한 PDGF 효과. STRO-1bri/VCAM-I+ 종류의 골수세포 유래 생체외 증폭시킨 세포의 세미-컨플루언트 이차 배양물을 5일간 PDGF-BB(10 ng/ml) 존재 또는 부재하에 배양하였다. 이를 트립신/EDTA 분해로 탈착하여 단세포 현탁물을 제조한 다음, 방법 부분에 기재된 바와 같이, 면역약화된 마우스로 이식하기 위하여, 하이드록시아페티트/트리칼슘 포스페이트 입자(HA/TCP) 40 mg과 같이 배양하였다. 8주 후에, 수확한 이식편을 고정한 다음 조직학적 검경을 진행하였다. Scion 이미징 소프트웨어를 이용하여 삼중으로 준비된 이식편으로부터 표면적(2Ox) 당 신생 골 형성을 분석하였다(A). PDGF-BB 처리전 배양물은 무처리 대조 배양군에 비해 현저한 이소 골 형성을 보였다(*; p<0.05; t-test). 대표적인 이미지로 무처리(B) 및 PDGF 처리한 이식편(C)을 나타내는 단편에서 헤마토실린/에오신으로 염색된 이소 골을 나타낸다.
도 14. BMSSC 는 고수준으로 SDF -1을 발현한다. (A) STRO-1+ BMMNC의 MACS-분리 조제물은 FACS를 이용한 STRO-1bright 및 STRO-1dull 영역에 따라, 여러가지 STRO-1 서브세트로 나누었다. 각 STRO-1 하위 집단 각각으로부터 총 RNA를 준비하였고, "재료 및 방법"에 개시된 바와 같이, STRO-1bright 감쇄 혼성(subtraction hybridization) 라이브러리 구축에 사용하였다. (B-C) STRO-1bright 감쇄시킨 cDNA로 형질전환된 세균 클론으로부터 증폭시킨 대표적인 PCR 산물로 블롯한, 리플리케이트 니트로셀룰로스 필터. 이후, 상기 필터는 [32P] 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP)-표지된 STRO-1bright(B), 또는 STRO-1dull(C) 감쇄된 cDNA로 프로브 반응시켰다. 화살표는 인간 SDF-1에 해당되는 cDNA 절편을 함유하고 있는 1 클론의 차별적인 발현을 나타낸다. (D) 역전사효소(RT)-PCR 분석은 배양하기 전에 새롭게 MACS/FACS-로 분리한 BMMNC STRO-1 집단으로부터 준비한 총 RNA에서, SDF-1 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH) 전사체들의 상대적인 발현을 나타낸다.
도 15. 미성숙 BMSSC 는 보다 성숙한 집단 보다 SDF -1을 높은 수준으로 발현한다. (A) 점 그래프는 표준 배지에서 배양한 후, STRO-1 및 AP 항원의 표면 발현을 조사하는, 생체외 증폭시킨 BMSSC 단세포 현탁물의 이중 유세포 분석이다. 분류 영역 R1, R2, R3, 및 R4에 따라 FACS로 여러가지 종류의 STRO-1/AP 하위집단을 분리하였다. (B) 그래프는 무분류 및 FACS-분리한 배양한 BMSSC 집단으로부터 준비한 총 RNA에서, STRO-1 및 AR의 세포 표면 발현에 따라, SDF-1이 하우스 키핑 유전자인 GAPDH에 대한 상대적인 발현의 세미-정량 RT-PCR 분석 결과이다. 대부분의 미성숙 골형성 전구 집단(STRO-1+/AP-)은 전골모세포(preosteoblast)(STRO-1+/AP+) 보다 높은 수준으로 발현되며, 그 다음 순으로 성숙형 골모세포(STRO-1-/AP+)와 골세포(STRO-1-/AP-) 집단이 많이 발현된다. 데이타는 2명의 건강한 골수 수용자로부터 수득한 이차 BMSSC 배양물을 이용한 것으로, 평균값 + SEM로 나타낸다.
도 16. SDF -1은 골 유도 이후에 BMSSC 에 의해 하향 조절된다. (A) 골 유도 배지 존재하에 배양한 BMSSC에 의한, 경시적인 GAPDH에 상대적인 SDF-1 발현을 확인한 세미-정량 RT-PCR. 평균값 ± 표준 오차는 4번의 독립적인 실험의 결과이다. 골 유도 조건 대 대응되는 대조 조건은 P < .05 유의값(*)으로 각 시간대에 짝지은 t 테스트를 이용하여 분석하였다. (B) 점 그래프는 생체외 증폭된 BMSSC의 단일 세포 현탁물을 골 형성 유도 배지하에 48시간 배양한 후, STRO-1 및 알칼린 포스파타제 항원의 세포 표면 발현을 토대로, 2색 유세포로 분석한 것이다.
도 17. BMSSC 는 기능적 SDF -1 리셉터를 발현한다. (A) RT-PCR 분석은 일차 BMSSC 배양물 또는 인간 골육종 세포주, MG63 중 어느 하나로부터 분리한 총 RNA에서 CXCR4 및 GAPDH 전사체의 상대적인 발현을 나타낸다. (B) 배양한 BMSSC의 단세포 현탁물을 마우스 항-인간 CXCR4 항체 또는 이소타입이 일치되는 대조군 항체, 1A6.11 중 어느 하나와 인큐베이션한 다음, 염소 항-마우스 IgG1 FITC-접합된 항체와 인큐베이션하였다. 나타낸 조직 사진은 유세포 측정 분석으로 측정한 대조군 샘플(점선)에 상대적인 BMSSC에 의한 CXCR4(선)의 세포 표면 발현 수준을 나타낸다. (C) 그래프는 일차 BMSSC 배양물에서 인간 재조합 SDF-1α(30 ng/mL)의 첨가 후 측정한 경시적인 세포내 칼슘 수치를 나타낸다.
도 18. BMSSC 에 의해 실시된 SDF -1 발현은 그것의 골형성 가능성을 증강시킨다. (A) 레트로바이러스 패킹 세포주 PT67를 인간 SDF-1 cDNA 또는 벡터 단독 중 어느 하나를 포함하는 pLNCX2 구조체와 함께 이용하여 3종의 골수 흡인물로부터 유래된 이차 BMSSC 배양물을 형질감염시켰다. 안정적인 복수 콜로니 유래 SDF-1 고발현성 BMSSC 및 대응되는 대조군 세포주를 G418로 선별하여 준비하였다. 조직 배양 상층물 3세트 샘플의 SDF-1α 수준을 시중에서 구입한 ELISA 키트를 이용하여 분석하였다. 데이타는 3가지 상이한 SDF-1 고발현성 BMSSC 세포주 대 대응되는 대조군으로부터 수득한 평균값 ± 표준오차로 나타낸다. (B) 형질감염된 BMSSC 세포주 각각의 단일 세포 현탁물을 하이드록시아파티트(HA/TCP) 입자와 혼합하고, NOD/SCID 마우스에 피하 이식하였다. 이미지는 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한, SDF-1 고발현성 BMSSC(SDF-1) 및 대조군 세포주(LNCX2)에 의해 형성된, 새로 생성된 형질감염체(b)의 8주된 수확한 이식물의 단면이다(x 200). 이미지는 올림푸스 D11 디지탈 카메라 배율 X200이 장착된 올림푸스 BX50 광 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 찍은 것이다. (C) 각 그래프는 3종의 골수 수용자로부터 유래된 SDF-1 고발현성 BMSSC 세포주 및 대응되는 대조군 세포주를 나타낸다. 신생 골 형성 수준은 Scion Imaging software를 이용하여 12가지 조직 단편에서 분석한 총 조직 표면적 백분율로 나타내었다. 데이타는 2종의 형질감염체로부터 수득한 값의 평균값 ± 표준 오차로 나타낸다. SDF-1 고발현성 BMSSC 세포주와 대응되는 대조군 간의 통계학적 차이(*) P < .05는 unpaired t test로 결정하였다.
도 19. BMSSC 에 의한 SDF -1의 발현 수행은 세포 생존율을 개선시킨다 . (A) 증식 실험은 SDF-1 고발현성 BMSSC 및 벡터 대조군 세포주를 3세트로 96웰 플레이트에 웰당 5 X 103 세포 수로 접종하여 5일간 정해진 성장 배지에서 배양하여, 수행하였다. 이후, 단일 세포 현탁물은 트립신/EDTA 분해로 탈착하여 준비하고, 수를 측정하여 총 세포 수를 조사하였다. (B) 동일한 배양물을 인터루킨4(IL-4; 30 ng/mL)의 존재하에 확립하고, 트립펜 블루 배제법으로 세포사멸이 발생한 세포의 백분율을 측정하였다. (C) 히스토그램은 IL-4의 존재하에 배양한 이소타입이 동일한 대조군 항체(점선)와 비교한, 대조군 세포주에 의한 세포 표면 아넥신 V 염색 정도(선)를 나타낸다. 나타낸 이미지는 자체(x 100)에서 살아있는 세포의 형광 염색 세기를 나타낸다. (D) 히스토그램은 SDF-1 고발현성 BMSSC 세포주에 의한 세포 표면 아넥신 V 염색 정도(선)를 IL-4 존재하에 배양한 이소타입이 동일한 대조군(점선)과 비교한 것이다. 나타낸 이미지는 자체(x 100)에서 살아있는 세포의 형광 염색 세기를 나타낸다. 데이타는 3세트 실험의 평균값 ± 표준오차로 나타낸다. SDF-1 고발현성 BMSSC 세포주와 대응되는 대조군 간의 통계학적 차이(*) P < .05는 unpaired t test로 결정하였다.
도 20. SDF -1은 CFU -F의 성장 및 생존을 촉진한다. 여러가지 사이토카인 조합물의 존재하에 무혈청 배지에서 배양한, MACS/FACS-분리된 STRO-1bright BMMNC로부터 유래된 CFU-F의 총 콜로니 수를 확인하였다. 재조합 인간 PDGF-BB, SDF-1α 및 α-인터페론 2a를 각각 최적 농도 5 ng/mL, 30 000 IU/mL, 및 30 ng/mL로 사용하였다. 데이타는 3세트 실험의 평균값 ± 표준오차로 나타낸다. 3가지 상이한 골수 흡인물을 이용한 경우에도 유사한 결과를 수득하였다. 모든 처리군에서 통계학적 유의성(P < .01)은 one-way ANOVA로 결정하였다. 이후 Fisher test를 이용하여, 모든 그룹들간 차이를 결정하였다. 유의성 P < .05에서 모든 처리군은 PDGF-BB 단독(*)에 비해, 및 PDGF + IFN(인터페론) 대 PDGF + SDF-1 + IFN(**) 사이에, 통계학적 유의성(P < .05)이 있었다.
도 21. SDF -1은 농도 의존적인 방식으로 IFN -α의 세포사멸 효과에 대응하여 CFU-F 형성을 방지한다. 인간 골수 단핵구 세포에서 선택된 STRO-1 MACS를 PDGF(5 ng/ml) 단독 또는 PDGF 및 IFN-α(30,000 i.u./ml), 또는 PDGF 및 IFN-α 및 SDF-1(0.1 - lOO ng/ml) 중 어느 하나의 존재하에, 무혈청 배지에 접종하였다. 플레이트 배양 14일 후에, CFU-F 콜로니 계수 측정에 대한 방법에서와 같이 고정 및 염색하였다.
본 발명의 구현예들은 하기 비제한적인 실시예를 참조하여 구체적으로 설명될 것이다.
재료 및 방법
대상체 및 세포 배양
골수(BM) 흡인물은 사전 동의를 구한 후, Royal Adelaide Hospital, South Australia에서 승인한 과정에 따라 건강한 성인 지원자(19-34세)의 후장골능(posterior iliac crest)으로부터 수득하였다. 골수 단핵구 세포(BMMNC)는 종래에 개시된 바와 같이 준비하였다(Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003). 일차 BMSSC 배양은 20% 소태아혈청, 2 mM L-글루타민 및 100 μM L-아스코르베이트-2-포스페이트가 첨가된 α-MEM(Minimum Essential Media)에서, 종래와 같이 확립하였다(Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003). BMSSC 클론 세포주는, 혈청이 풍부한 증식용 배지에서 배양한 다음, RT-PCR, 면역조직화학 및 발생연구를 실시하여, 후술한 바와 같이 STRO-1bri/VCAM-I+으로 분류한 세포로부터 유래된 14개의 콜로리를 제한 희석으로 준비하였다.
MACS(Magnetic-Activated Cell Sorting)
이는 기존에 개시된 바에 따라 실시하였다((Gronthos et al., Isolation, Purification and In Vitro Manipulation of Human Bone Marrow Stromal Precursor Cells. In Marrow Stromal Cell Culture. Owen M. and Beresford J.N.(eds). Cambridge University 　　Press UK, Chapter 3, p. 26-42, 1998; Gronthos and Simmons, Blood 85(4): 929-940, 1995). 간략하게, 제조사의 지시에 따라 미니 MACS 자기 컬럼(Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA)으로 분리하기 전에, 약 1-3 x 108 개의 정상적인 인간 골수 단핵구 세포를 연속적으로 STRO-1 상층액, 항-IgM-비오틴, 스트렙타비딘 마이크로비드 및 마지막으로 스트렙타비딘 FITC(Caltag Laboratories, Burlingame, CA)로 배양하였다.
FACS (Fluorescence-activated cell sorting).
STRO-1+ MACS로 분리한 세포를 스트렙타비딘 접합된 FITC로 표지한 다음, 항-CD106(VCAM-I) 항체 6G10 또는 항-CD146(MUC-18) 항체 또는 이소형 대조군 1B5(10 ㎍/ml) 정제물 어느 하나와 얼음상에서 30분간 인큐베이션하고, 세정하여 염소 항-마우스 IgG 항체(1/50; Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)가 접합된 피코에리트린(PE)와 얼음위에서 20분 더 인큐베이션하였다. 세포는 FACStarPLUS 유세포측정기(Becton Dickinson, Sunnyvale, CA)로 분류하였다. STRO-1bri/CD106+ 또는 STRO-1bri/CD146+ 세포는 20% 소태아혈청, L-글루타민 2 mM, 아스코르베이트-2-포스페이트(100 μM)이 첨가된 α-MEM 배지에 배양하여, 5% CO2, 37 ℃ 습도 조건하에서 일차 배양을 개시하였다.
간접 면역형광법을 이용한 2색 유세포 분석
본 과정은 이미 보고되어 있다(Gronthos et al., Isolation, Purification and In Vitro Manipulation of Human Bone Marrow Stromal Precursor Cells. In Marrow Stromal Cell Culture. Owen M. and Beresford J.N.(eds). Cambridge University 　　Press UK, Chapter 3, p. 26-42, 1998). 간단하게는, MPC 또는 MPC 유래 세포의 일차 배양물을 트립신/EDTA로 분해시킨 다음 얼음상에 30분간 인큐베이션하였다. 이후, 세포 약 2 x 105를 세정한 다음 1시간동안 얼음상에서 일차 항체 칵테일 200 ㎕에 현탁하였다. 일차 항체 칵테일은 마우스 IgM 단일클론 항체 STRO-1 및 마우스 IgG 단일클론 항체 또는 토끼 IgG를 포화 농도로 각 튜브에 포함되어 있다(표 1). 세포내 항원과 반응하는 항체를 이용하여 염색하기 위해, 세포는 먼저 PBS로 세정한 다음, 10분간 얼음상에서 70% 에탄올로 처리하여 투과가능하게 만든 후, 염색하기 전에 세정하였다. 동일한 조건하에 마우스 이소형 IgM 및 IgG 음성 대조군 Mab를 처리하였다. 일차 항체와 인큐베이션한 다음, 세포는 세정하여 포화 농도의 염소 항-마우스 IgM μ-쇄 특이적인-FITC(1/50 희석)과 염소 항-마우스 TgG γ특이적인-PE(1/50 희석) 또는 항-토끼 Ig-특이적인 PE(1/50 희석)(Southern Biotechnology Associates) 중 어느 하나에 최종 부피 100 ㎕로 노출시켰다. 세포는 얼음위에서 45분간 인큐베이션한 다음 2번 세정하고, FAX FIX(1%(v/v), 2%(w/v) D-글루코스 및 0.01% 소듐 아지드를 첨가한 PBS)로 고정하였다. 이후, 세포는Epics®-XL-MCL 유세포측정기(Beckman Coulter, Hialeah, FL)로 분석하였다.
CFSE ( Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester) 표지
세포 침투성 플루오레세인계 염료인 CFSE를 사용하여 MPC 유래 세포의 발생동안 분열 관련 표현형 변화 및 기능적 변화를 연구하였다. CFSE는 공유결합으로 세포의 세포질 성분에 부착하여 균등한 밝은 형광을 나타내며, 이는 세포 분열시 동일하게 딸 세포로 분배된다. 이 기법으로 유세포 측정에 의해 최대 8번까지의 세포 분열을 구분할 수 있다. 생체외 증폭시킨 MPC 유래 세포의 단일 세포 현탁물을 1회 세정하여, 1 ml의 PBS/0.1% BSA 및 2 ml의 5 mM CFSE(최종 10 mM)에 재현탁한 다음 10분간 37℃에서 인큐베이션하였다. α-MEM-10의 빙수 배양 배지를 5 부피배로 첨가하여 염색을 퀀칭하였고, 얼음상에서 5분간 인큐베이션하였다. 세포는 배양 배지로 3번 세정한 다음 1 X 105으로 배양 플라스크(T-25)에 접종하였다. 다양한 시간대에, 트립신-EDTA로 탈착시켜, 유세포 분석으로 분석하였다.
RT- PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 분석
MPC 유래 일차 배양물은 트립신/EDTA 처리로 자유롭게 한 다음 전술한 바와 같이 STRO-1 상층액으로 염색하였다. 세포를 세정한 후, 염소 항-마우스 IgM 항체(1/50; Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)가 접합된 피코에리트린(PE)와 함께 얼음상에서 20분간 더 인큐베이션하였다. 세포는 FACStarPLUS 유세포 측정기(Becton Dickinson, Sunnyvale, CA)로 분류하였다. 2 x 106 STRO-1bri 또는 STRO-1dim으로 분류된 일차 세포, 연골세포의 펠렛 및 그외 유도 배양물 중 어느 하나로부터 총 세포 RNA를 준비한 다음, RNAzolB 추출 방법(Biotecx Lab. Inc., Houston, TX)으로, 제조사의 권고안에 따라 세포를 용해시켰다. 각 하위 집단으로부터 분리한 RNA를 cDNA 합성의 주형으로 사용하여, 제1 가닥 cDNA 합성 키트(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 이용하여 제조하였다. 다양한 전사체 발현은, 기존의 표준 프로토콜을 이용하여 PCR 증폭으로 분석하였다(Gronthos et al., J. Bone and Min. Res. 14:48-57, 1999). 이 실험에서 사용한 프라이머 세트는 표 2에 나타낸다. 증폭 후, 각 반응 혼합물은 1.5% 아가로스 젤 전기영동으로 분석하고, EtBr로 가시화하였다. RNA 완전성 여부는 GAPDH 발현으로 평가하였다.
생체내 CFU -F 분화
본 발명자들은 이전에 인간 BM 기질 세포를 시험관내에서 미네랄화된 골 매크릭스로 발생시키기 위한 유도 조건이 10% FCS, 100 μM L-아스코르베이트-2-포스페이트, 덱사메타손 10-7 M 및 3 mM 무기 인산이 첨가된 αMEM 배지에서 배양하는 것임을 보고한바 있다(Gronthos et al., Blood. 84: 4164-4173, 1994). 미네랄 침착은 양성 von Kossa 염색으로 동정하였다. 지방 세포형성은 기존에 공지된 바와 같이 0.5 mM 메틸이소부틸메틸크산틴, 0.5 μM 하이드로코르티손 및 60 μM 인도메타신의 존재하에 유도하였다(Gimble, J. M. Marrow stromal adipocytes. In Marrow stromal cell culture. Owen M. and Beresford J.N.(eds). Cambridge: Cambridge University Press UK. 　Chapter 5, p. 67-87, 1998). 오일 레드 O 염색을 실시하여, 지방-함유 지방 세포(lipid-laden fat cell)를 동정하였다. 연골세포 분화는 기언급된 바와 같이, 10 ng/ml TGF-β3으로 처리한 응집 배양물에서 조사하였다(Pittenger et al., Science, 284:143-147, 1999).
골 형성의 생체내 분석
2-3계대 배양한 STRO-1bri/VCAM-I+ 세포 유래 부착 세포를 트립신으로 처리하고, 40 mg의 하이드록시아파티트/트리칼슘 포스페이트 세라믹 입자(Zimmer Corporation, Warsaw, IN)와 혼합한 다음, 기언급된 바와 같이, 2달된 SCID 마우스의 등 피부의 피하 포켓에 이식하였다(Gronthos et al., Proceedings of the National Academy of Sciences(USA), 97(25): 13625-13630, 2000). 이러한 조작은 승인된 동물 프로토콜 내용에 따라 수행하였다(Adelaide University AEC# M/079/94). 6-8주 후에 임플란트를 제거하여 2일간 4% 파라포름알데하이드에 고정한 다음, 10% EDTA중에 10일간 탈회하고(decalcified), 파라핀으로 포매하였다. 조직 분석으로, 임플란트 5 ㎛ 단편을 준비하여 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다(Gronthos et al., Proceedings of the National Academy of Sciences(USA), 97(25): 13625-13630, 2000).
신경 조직의 발생. 단층 배양물을 신경모세포 A 배지(Invitrogen/GIBCO) + 5% 말 혈청, 1% FCS, L-글루타민(2mM), 트랜스페린(100 ㎍/ml), 인슐린(2 ㎍/ml), 레티노익산 0.5 mM, BDNF(brain-derived neurothrophic factor)(10 ng/ml)에서 배양하였다.
지방 발생. 단층 배양물은 10% 소태아혈청, 2 mM L-글루타민 100 μM 아스코르베이트-2-포스페이트, 0.5 mM 메틸이소부틸크산틴, 0.5 mM 하이드로코르티손 및 60 mM 인도메타신이 첨가된 α-MEM(JRH)에서 배양하였다.
연골 발생: 폴리프로필렌 큐브내의 펠렛 배양물은, 1% BSA, 트랜스페린(100 ㎍/ml), 인슐린(2 ㎍/ml), L-글루타민(2 mM), 아스콜베이트-2-포스페이트(100 μM/ml), 덱사메타손(10-8M)이 첨가된 α-MEM에서, BMP-7(50 ng/ml) 및 TGF-β3(10 ng/ml)과 함께 배양하였다.
골격/심장 근육 발생. 단층 배양물은 10% 소태아혈청, 2 mM L-글루타민, 100 μM 아스코르베이트-2-포스페이트 및 5 μM 5-아자사이토딘이 첨가된 α-MEM에서 배양하였다.
상피 세포 발생. 단층 배양물은 BPE(bovine pituitary extract)(50 ㎍/ml), 상피 세포 성장 인자(10 ng/ml), 하이드로코르티손(0.5 ㎍/ml) 및 인슐린(5 ㎍/ml)이 첨가된 각질형성 세포 기본 배지(Clontenics)에서 배양하였다.
골모세포 , 인대, 힘줄 또는 상아질모세포 발생. 단층 배양물은 10% 소태아혈청, 2 mM L-글루타민, 100 μM 아스코르베이트-2-포스페이트, 10-7 M 덱사메타손 및 50 ng/ml BMP-2가 첨가된 α-MEM에서 배양하였다.
혈관주위 세포 또는 평활근 세포 발생. 웰 당 20,000개의 생체외에서 증폭시킨 MPC 배양물은 48웰 플레이트에서 200 1 matrigel상에 현탁되어 있는 10% 소태아혈청, 2 mM L-글루타민, 100 μM 아스코르베이트-2-포스페이트, 10 ng/ml 혈소판 유래 성장 인자-BB가 첨가된 α-MEM에서 배양하였다.
일차 항체
본 실험에서 사용한 일차 항체는 다음과 같다: STRO-1(mouse IgM [immunoglobulin M])(Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003), 항-인간 알칼린 포스파타제 항체(B4-78, mouse IgG1; Hybridoma Studies Bank, University of Iowa, Ames), 항-인간CXCR4 항체(mouse IgG2b; Chemicon International, Temecula, CA), 및 항-인간 아넥신 V 항체(mouse IgG1; Chemicon)는 각각 1:2로 희석한 조직 배양 상층물로서 사용하거나 또는 정제한 면역글로불린 10 ㎍/mL으로서 사용하였다.
BMSSC 의 정제
기언급된 바를 기본으로 하는 수행하였다(Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003; Gronthos and Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995). 간단하게, 약 1 내지 3 x 108 성인 BMMNC를 블롯킹 완충액(Hanks balanced salt solution [HBSS], 1% 인간 혈청, 1% BSA 및 5% FBS 첨가됨)과 인큐베이션한 다음, STRO-1 상층액, 항-IgM-비오틴, 스트렙타비딘 마이크로비드(Miltenyi Biotec, Auburn, CA) 및 마지작으로 스트렙타비딘 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC; Caltag Laboratories, Burlingame, CA)으로 순차적으로 배양한 다음, 제조사의 권고안에 따라 미니 MACS(Mini magnetic-activated cell sorting) 마그네틱 컬럼(Miltenyi Biotec)으로 분리하였다. 이후, FACStar 유세포 측정기(Becton Dickinson, Sunnyvale, CA)를 이용하여, STRO-1의 높은(STRO-1bright) 또는 낮은(STRO-1dull) 발현을 토대로, MACS-분리한 STRO-1+ 골수 단핵구 세포를 분류하였다(도 1a).
STRO -1/알칼린 포스파타제 BMSSC 하위집단의 분리
인간 BMSSC의 이차 배양물은 트립신/EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 분해에 의해 단일 세포 현탁물로서 준비한 다음, Gronthos et al., J Bone Miner Res. 14: 47-56, 1999에 개시된 바와 같이, STRO-1 및 골 관련 항원 알칼린 포스파타제(AP), B4-78을 동정하는 항체와 인큐베이션하였다. 약 2 x 107 세포를 STRO-1 및 알칼린 포스파타제(B4-78)와 반응하는 항원과 얼음상에서 1시간 인큐베이션하였다. 리플리케이트 튜브를 대응되는 1색 및 음성 대조군 항체와 인큐베이션하였다. 세정한 다음, 세플을 이차 항체로서, 염소 항-마우스 IgG1-FITC 및 IgM-PE(phycoerythrin) 항체(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)와 얼음상에서 45분간 인큐베이션하였다. 세정한 다음, 4 STRO-1/AP BMSSC 하위 집단(Gronthos et al., J Bone Miner Res. 14: 47-56, 1999; Pan et al., Bone 34(1):112-23, 2004; and Atkins et al., J Bone Miner Res. 18(6):1088-98, 2003)을 토대로 FACStar 유세포 측정기(Becton Dickinson)를 이용하여, 2가지 분류로 순도를 분류하였다.
칼슘 유동성 분석
트립시 탈착시킨 이차 BMSSC 배양물의 단일 세포 현탁물을 1% FCS(fetal calf serum) 및 1.25 mM CaCl2가 보충된 HBSS 중에 1 x 106 cells/mL 농도로 현탁하였다. 세포는 2 μM fura-2-AM(fura-2 아세톡시메틸 에스테르; Molecular Probes, Eugene, OR)과 함께 37 ℃에서 30분 인큐베이션하였다. 세포를 2번 세정하여 과량의 fura-2-AM을 제거하고, 1% FCS 및 1.25 mM CaCl2를 함유하는 2 mL HBSS에 1 x 106 cells/mL에 재현탁하였다. 형광분광광도계(LS55 Luminescence spectrometer; Perkin Elmer, Boston, MA)를 이용하여, 교류 여기 340 및 380 nm와 형광 발광 510 nm으로, [Ca2+]i를 측정하였다. [Ca2+]i의 베이스라인 농도를 확정한 후, 세포를 30 ng/mL SDF-1α로 처리하였다. SDF-1α에 대한 반응으로 [Ca2+]i의 안정적인 피크가 이루어졌을때, 0.1 mM 디지토닌으로 BMSSC를 투과가능한 상태로 만들었고, 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA)을 최종 농도 5 mM로 첨가하였다. 디지토닌 및 EGTA 측정치는, 기언급된 바와 같이 보정식(calibration equation)을 이용하여 각 샘플의 fura 2-AM 형광에 대해 [Ca2+]i를 보정하는데, 사용하였다(Grynkiewicz et al., J Biol Chem. 260: 3440-3450, 1985)
콜로니 효과 분석
콜로니 형성 분석은 MACS/FACS-분리한 STRO-1bright BMMNC를 이용하여 수행하였고, 이후 기언급된 바와 같이(Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003; Gronthos and Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995) 혈청 결핍 조건하에서 24웰 플레이트의 각 웰당 5 x 104 밀도로 접종하였다. 세포는 여러가지 사이토카인 조합물 존재하에 접종하였다. 본 실험에 사용한 성장 인자는 α-인터페론 2a(30,000 IU/mL; F Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland), 혈소판 유래 성장 인자-BB(5 ng/mL), 인터루킨-4(30 ng/mL), 및 기질 유래 인자-1(30 ng/mL; CytoLab/PeproTech, Rehovot, Israel)이다. 배양은 14일째에 중지하였고, 1% 파라포름알데하이드 중의 0.1%(wt/vol) 톨루이딘 블루로 염색하여 CFU-F의 수를 측정하였다.
유세포 측정 분석
트립신/EDTA 분해로 BMSSC 배양물을 준비한 다음, 30분간 블롯킹 완충액에 재현탁하였다. 이후, 단일 세포 현탁물을 10 ㎍/mL의 농도로 얼음상에서 한시간동안 항-CXCR4 항체 또는 1A6.11 중 어느 하나와 인큐베이션하였다. 유사하게, SDF-1 고발현성 BMSSC 및 벡터 대조군 세포주는 트립신/EDTA 처리, 블로킹한 다음 항-아넥신 V 항체 또는 이소형이 동일한 대조군 항체, 1D4.5 중 어느 하나와 인큐베이션하여 준비하였다. 이를 세정한 다음, 이차 검출 시약, 염소 항-마우스 IgG1- 또는 IgG2b-FITC-접합된 항체(1/50; Southern Biotechnology Associates)과 얼음상에서 45분간 인큐베이션하였다. 이를 세정한 다음, Epics-XL-MCL 유세포 측정기(Beckman Coulter, Hialeah, FL)로 샘플을 분석하였다.
RT- PCR 분석
2 x 104 STRO-1bright-, STRO-1dull- 및 STRO-1negative분류된 골수 단핵구 세포; 배양한 BMSSC STRO-1/알칼린 포스파타제-분류된 하위집단; 또는 인간 골육종 세포주 MG63으로부터, RNA STAT-60 시스템(TEL-TEST, Friendswood, TX)으로 총 RNA를 준비하였다. 각 하위집다으로부터 분리한 총 RNA를 cDNA 합성의 주형으로 사용하였고, 제1 가닥 cDNA 키트(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 제조하였다. 본 실험에 사용한 5세트의 프라이머는 다음과 같다: SDF-1(정방향, 5'-gacccgcgctcgtccgcc-3'; 역방향, 5'-gctggactcctactgtaaggg-3'); CXCR4(정방향d, 5'-tctggagaaccagcggttac-3'; 역방향, 5'-gacgccaacatagaccacct-3'); GAPDH(정방향, 5'-catggagaaggctggggctc-3'; 역방향, 5'-cactgacacgttggcagtgg-3'). 증폭 산물은 1.5% 아가로스 젤 전기영동으로 분석하였고, EtBr 염색으로 가시화하였다. 전사체 수의 세미-정량 분석은 ImageQant software(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)을 이용하여 GAPDH 발현에 상대적으로 분석하였다.
형질감염된 BMSSC 세포주의 제조
레트로바이러스 발현 구조체는, PCR 정방향(5'-aataactcgagacccgcgctcgtccgcc-3') 및 역방향(5'-aattaagcggccgctggactcctactgtaaggg-3') 프라이머 세트(밑줄)로 증폭시킨 전장 인간 SDF-1 cDNA를 코딩하고 있는, XhoI 및 NotI(굵은체) 제한효소자리에 구축하여, 레트로바이러스 벡터 pLNCX2(Clontech Laboratories, Palo Alto, CA)로 제조하였다. 팩킹 세포주 PT67는 Fugene-6-reagent(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)를 이용하여, SDF-1 포함 구조체 또는 pLNCX2 벡터 단독 중 어느 하나로 형질감염시킨 다음, 800 ㎍/mL G418(Sigma, Castle Hill, NSW, Australia)으로 선별하였다. 안정적인 PT67 세포주 유래 감염성 입자를 포함하고 있는 수확한 상층액을 이용하여, 5 ㎍/mL 폴리브렌(Sigma)의 존재하에 배양한 BMSSC를 형질감염하였다. 800 ㎍/mL G418로 선별하여, SDF-1α를 높은 수준으로 발현하는 안정적인 다중콜로니 유래 BMSSC 및 대조군 세포주를 확립하였다. 분비된 SDF-1α 농도는 제조사의 설명서에 따라 표준적인 SDF-1 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA) 키트를 이용하여 0.2 ㎛ 필터로 여과한 상층액으로부터 측정하였다.
BMSSC cDNA 감쇄 혼성 라이브러리의 구축
예비 실험으로, STRO-1dull-발현성 골수세포(glycophorin-A+ nucleated red cells) 및 STRO-1bright-발현성 세포(CFU-F population)를, "BMSSC의 정제"에 언급한 바와 같이 MACS/FACS 과정으로 분리하였다. RNA STAT-60 시스템(TEL-TEST)을 이용하여, 5가지의 상이한 골수 샘플(남성 2, 여성 3, 19-32살)로부터 수득한 STRO-1bright 및 STRO-1dull 세포로부터 총 RNA를 준비하였다. 제1 가닥 합성은 SMART cDNA 합성 키트(Clontech Laboratories)를 이용하여 실시하였다. 제조되는 mRNA/단일가닥 cDNA 하이브리드는, 제조사의 설명에 따라 초기 RT 과정중에 형성된 3' 및 5' 프라임 말단에 특이적인 프라이머 부위를 이용하여 원거리 PCR(Advantage 2 PCR kit; Clontech)로 증폭하였다. STRO-1bright cDNA의 RsaI 절단한 다음 2개의 분획물은 Clontech PCR-선별 cDNA 감쇄 키트를 이용하여 여러가지 특이적인 어댑터 올리고뉴클레오티드를 연결하는데 사용하였다. 감쇄 혼성화 2라운드는 STRO-1bright(tester) 및 STRO-1dull(driver) cDNA, 및 반대로 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 또한, 이 과정은 STRO-1bright driver cDNA에 대해 혼성화된 STRO-1dull tester cDNA를 이용하여 반대로 수행하였다.
BMSSC 감쇄 라이브러리의 차별적 스크리닝
STRO-1bright BMSSC 집단에서 독특하게 발현되는 유전자를 동정하기 위해, STRO-1bright-감쇄한 cDNA를 T/A 클로닝 벡터(AdvaTAge PCR 클로닝 키트; Clontech)에 연결한 다음, DH5α Escherichia coli에 형질전환하였다. 무작위 선별한 200개의 암피실린 내성 세균 클론은 제조사의 설명에 따라 Clontech PCR-선별 차별적인 스크리닝 키트를 이용한 PCR로 증폭시켰다. 간략하게, cDNA는 BRL Hybri-dot 96-웰 포멧의 복합 진공 시스템을 이용하여 제조사의 권고에 따라 리플리케이트 저밀도 마이크로어레이 필터 (zeta-probe GT membranes; BioRad, Hercules, CA) 를 제조하기 위해 사용하였다. 감쇄시킨 STRO-1bright 및 감쇄시킨 STRO-1dull cDNA는 95 ℃에서 변성시킨 다음, 클레나우 효소(exo-; 5 U)를 이용하여 50 μCi(1.85 MBq) α-[32P] dCTP(3000 Ci [1.85 MBq]/mmol; ICN Radiochemicals, Irvine, CA)로 37 ℃에서 40분간 표지하였다. DNA 프로브는 Clontech Express Hyb을 이용하여 리플리케이트 필터와 72℃에서 철야 혼성화하였다. 필터는 2 x 표준 염수 사이트레이트(SSC)/0.5% 소듐 도데실 설페이트(SDS)로 4번 세정하였고, 0.2 x SSC/0.5% SDS로는 68 ℃에서 2번 세정한 다음, PhosphoImager로 스크리닝하고, ImageQuant 소프트웨어(Molecular Dynamics)로 분석하였다.
시험관내 CFU -F 분화
본 발명자들은 이전에 인간 BM 기질 세포를 시험관내에서 미네랄화된 골 매크릭스로 발생시키기 위한 유도 조건이 10% FCS, 100 μM L-아스코르베이트-2-포스페이트, 덱사메타손 10-7 M 및 3 mM 무기 인산이 첨가된 αMEM 배지에서 배양하는 것임을 보고한바 있다(Gronthos et al., Blood. 84: 4164-4173, 1994).
이소 골 형성 분석
2-3 계대 배양한 STRO-1bright-분류한 골수단핵구 세포 유래 부착 세포를 트립신 처리하고, 40 mg의 하이드록시아파티트/트리칼슘 포스페이트 세라믹 입자(Zimmer Corporation, Warsaw, IN)와 혼합한 다음, 기언급된 바와 같이, 8주령의 비-비만성 당뇨병/중증 조합 면역결핍(NOD/SCID) 마우스의 등 피부의 피하 포켓에 이식하였다(Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003). 이러한 조작은 승인된 동물 프로토콜 내용에 따라 수행하였다(The University Adelaide AEC no. M29/2002). 8주 후에 임플란트를 제거하여 2일간 4% 파라포름알데하이드에 고정한 다음, 10% EDTA중에 10일간 탈회하고(decalcified), 파라핀으로 포매하였다. 각 이식체를 2조각으로 잘라, 파라핀 포매를 위해 절단면을 아래로 두었다. 조직 분석으로, 임플란트 5 ㎛ 단편을 준비하여, 약 3-4 mm 길이의 각 이식체 중간 및 양 끝을 나타내는, 헤마톡실린과 에오신((H&E)으로 염색하였다. 신생 골 형성량은 12 조작 단편들의 총 표면적 %로 계산하였다. 신생 골 형성치는 기공지된 바와 같이(Shi et al. Nat Biotechnol. 20: 587-591, 2002), Scion 이미징 소프트웨어(Frederick, MD)로 조사하였다.
통계
언급한 바와 같이, 이원비교법(pairwise comparison)에 Student t test를 사용하였다. 통계 유의성은 P<.05에서 나타난다. 일원변량분석(one-way analysis of variance(ANOVA))를 다중 비교에 이용하였다. 그룹간 통계 유의성은 P < .05에서 피셔의 최소유의차 검정(Fisher projected least significance difference test)을 이용하여 결정하였다.
실시예 1: STRO -1 dim 배양 세포는 보다 강한 분화가 예정(committed)되어 있는 반면, STRO-1bri 세포는 보다 약한 분화가 예정된 전구세포이다.
본 발명자들은 다능성 간엽 전구세포(MPC)를 표현형 STRO-1bri/VCAM-I(CDlO0)+ 또는 STRO-lbri/MUC- 18(CD146)+(Gronthos et al. J. Cell Sci 116:1827-1835, 2003; Shi and Gronthos JBMR 18(4): 696-704, 2003; PCTAU2004/000416)을 기초로 성인 골수 단핵구 세포로부터 정제할 수 있음을 이전에 보고한바 있다. MPC 집단은 한정된 배양 조건하에서 시험관내에서 쉽게 증폭시킬 수 있다(Gronthos et al. J. Cell Sci 116:1827-1835, 2003). 본 발명자들은 현재 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 및 유세포 분석을 각각 이용하여 mRNA 및 단백질 수준으로 여러가지 세포 계통과 관련된 마커를 기초로 생체외 증폭시킨 MPC 자손을 특정화하는 데이타를 제시한다. 신선하게 분리한 골수 MPC 모두 생체외 증폭 이후에 고수준으로 STRO-1(STRO-1bri, 대부분의 세포는 STRO-1 발현을 하향 조절함(Stro-ldim))을 발현한다(Gronthos et al J. Cell Sci 116:1827-1835, 2003). 첫번째 실험에서, 세미-정량 RT-PCR 분석을 수행하여, 형광 활성화 세포 분류로 분리한 STRO-1dim 또는 STRO-1bri 집단에서 발현되는 다양한 계통 관련 유전자의 유전자 발현 프로파일을 조사하였다(도 1a). 각 세포 마커의 상대적인 유전자 발현은 ImageQant software를 이용하여 하우스 키핑 유전자의 발현과 비교하여 분석하였다(도 1b, C). 또한, 2중 색의 유세포 분석으로 STRO-1 항체와 조합하여 광범위한 범위의 세포 계통 관련 마커의 발현을 토대로, 생체외 증폭시킨 MPC의 단백질 발현 프로파일을 조사하였다(도 2). STRO-1dim 및 STRO-1bri 배양 세포의 유전자 및 단백질 발현을 근간으로한 일반적인 표현형은 표 3에 요약하였다. 데이타는 생체외 증폭시킨 STRO-1bri MPC가 차별적으로 안지오포이에틴-1, VCAM-I, SDF-I, IL-1β, TNFα 및 RANKL을 포함하여, 혈관주위 세포(perivascular cell) 관련 마커의 보다 높은 발현을 보임을 나타낸다. 반대로, STRO-1dim 생체외 증폭시킨 세포는 네스틴(nestin), GFAP, 오스테릭스(osterix), 오스테오칼신(osteocalcin), SOX9, GAT A-4, 렙틴 및 평활근 미오신 중쇄를 보다 높은 수준을 발현하였다. 따라서, 생체외 증폭시킨 STRO-1bri MPC는 연골모세포, 골모세포, 지방모세포, 상피 세포, 신경 전구체 또는 심근모세포를 포함하여, 더 많은 분화 예정 전구세포 타입의 표현형 특징을 나타내는 STRO-1dim 세포와 비교하여, 보다 덜 성숙하며 혈관주위형 표현형을 나타내는 것으로 보인다.
STRO-1dim 및 STRO-1bri 배양 세포의 단백질 및 유전자 발현 프로파일간의 비교는 표 3 및 4에 요약하였다.
실시예 2: STRO -1 dim 및 STRO -1 bri 배양 세포의 시험관내 분화 능력
본 발명자들은 다음으로 STRO-1dim 및 STRO-1bri 배양 세포의 유전자 및 단백질에서 관찰된 차이는 이들이 여러가지 세포 계통으로 분화하는 능력에 있어서의 임의의 기능적 차이를 반영하는 것인지를 조사하였다. 상기와 같이 STRO-1 항원의 발현을 근간으로 FACS로 생체외 증폭시킨 STRO-1bri/CD146+ 유래 세포 배양물을 분리하였다. FACS로 분리한 STRO-1dim 및 STRO-1bri 배양 세포는 이후 지방(도 3), 골(도 4) 및 연골(도 5) 형성 유도 조건하에서 접종하였다. 모든 경우들에서, STRO-1bri 배양 세포는 특정 조건하에서 STRO-1dim 배양 세포에 비해 지방, 골 및 연골 형성에 우수한 능력을 보였다. 이러한 실험들의 데이타는 상기에서 수득한 유전자 및 단백질 발현 결과를 증명하며, 이는 STRO-1bri 배양 세포가 적정 배양 조건(도 3, 4, 5)하에서 임의의 특이적인 세포 계통으로 분화하는데 영향을 받을 수 있는, 분화 예정 정도가 낮은 전구세포를 높은 비율로 함유하고 있는 원시 집단(primitive population)임을 의미하며, MPC로 언급될 수 있다. 반대로, STRO-1dim 증폭 세포는 다양한 계통을 나타내는 분화가 예정된 세포를 높은 비율로 포함하며, 이는 TSCC라고 언급될 수 있다. STRO-1dim 집단은 혼성(heterogenous)이며, 여러가지 범위의 조직 타입으로 분화가 예정된 세포를 포함하는 것으로 제시된다.
실시예 3: STRO -1 bri 세포는 시험관내 및 생체내에서 조직 특이적 분화가 예정된 세포의 성장 가능성을 변형시킬 수 있다.
2종의 생체외 증폭시킨 여러가지 발생 단계를 나타내는 세포 집단 유래의 MPC의 동정은, STRO-1bri 세포 유래 전체 배양 제조물의 임상 요법으로의 용도와 밀접한 관계를 갖는다. 첫번째 실험은 보다 성숙하고 분화가 예정된 STRO-1dim 배양한 TSCC 성장에 대한 원시적인 분화가 약하게 예정된 STRO-1bri 배양한 MPC의 영향을 조사하기 위해 설계되었다. 실험들은 형광 텍인 CFSE로 이미 표지한 FACS로 분리한 STRO-1dim 배양 TSCC에, FACS 분리한 STRO-1bri 배양 MPC의 백분율 증가를 합하도록 설계되었다. 도 6은 표지 STRO-1dim 세포의 증식은 표지되지 않은 STRO-1bri 세포의 존재에 의해 영향을 받음을 보인다. CFSE 표지된 세포가 분열될 때, 2개의 딸 세포는 모세포의 형광물질을 절반씩 포함한다. 따라서, 서로다른 세대의 딸 세포는 형광물질 분포로서 나타나며 형광 강도가 비례적으로 감소하며, 히스토그램의 최우측 곡선(수진선이 교차된)은 초기 STRO-1dim 집단을 나타낸다(도 6). 데이타는 보다 높은 비율의 STRO-1dim 세포가 그것의 증식율을 증가시키도록 자극받는다는 것을 나타내며, 많은 세포들이 TRO- 1bri를 5% 보다 많이 첨가한 다음 적어도 3 내지 4번의 분열을 거치는 것으로 입증되었다. 따라서, 미분획 MPC 유래 세포의 지속적이며 유효한 생체외 증폭을 얻기 위해, 배양시에는 집단내 5% 보다 높은 비율의 STRO-1bri 세포가 존재하여야 한다.
원시적이며, 분화 예정 정도가 낮은 STRO- 1bri 배양 MPC가 생체내 TSCC의 증식 능력에 영향을 미치는지를 결정하기 위해 추가적인 조사를 수행하였다. 2가지 생체내 모델을 사용하여 이 문제를 해결하였다. 첫번째 모델로는 LAD(left anterior descending) 관상 동맥이 결찰된 비흉선 누드 랫을 사용하였으며, 48시간 후에 염수, FACS 분리한 배양 인간 STRO-1dim 및 STRO-1bri 세포 및 STRO-1 고갈 골수 단핵구 세포의 신선한 흡인물을 주입하였다(도 7). 2주후에, 동물을 죽이고 심장 조직을 고정하고 2종의 단일클론 항체로 염색하였다: 인간이 아닌 랫 Ki67 항원에 선택적으로 반응적인 제1 항체, 및 심근 세포 마커 트로포닌 I에 반응성을 가지는 제2 항체. 이중으로 염색된 랫 심근 세포 증식을 나타내는 세포는 면역페록시다제 기법으로 검출하였다. STRO-1bri 인간 세포 투여 동물은 염수나 인간 STRO-1dim 세포를 투여한 동물에 비해 랫의 심근 세포 증식 수가 2.5-5 배 높았다(도 7)
제2 모델로는 랫 교아 세포종 종양 세포를 피하 주사한 비흉선 누드 랫을 이용하였으며, 이는 계속적으로 VEGF를 분비한다. 2주일 후에, 종양내에 염수, FACS로 분리한 인간 STRO-1dim 또는 STRO-1bri 인간 세포 중 어느 하나를 랫에 투여하였다(도 8). 1주일 후에, 동물을 죽여 종양 조직을 고정한 다음 2종의 단일클론 항체로 염색하였다: 평활근에서 발현되는 α-평활근 엑틴 항원에 반응하는 제1 항체, 및 혈관 내피 세포에서 발현되는 vWF 항원에 반응하는 제2 항체. 이중으로 염색된 세동맥 및 동맥을 나타내는 구조는 면역페록시다제 기법으로 검출하였다. STRO-1bri 인간 세포 투여 동물은 염수나 인간 STRO-1dim 세포를 투여한 동물에 비해 종양내 세포 주사 부위에 세동맥 및 동맥의 수가 3.5-8배 많았다(도 8).
실시예 4: STRO -1 양성 세포로부터 유래된 세포 배양물내 STRO -1 bri MPC 수 증가
STRO-1bri 배양 MPC의 TSCC 증식을 증가시키는 능력을 입증한 후, 다음으로 한 범주의 성장 인자의 생체외 증폭시킨 STRO-1bri MPC의 비율 증가 효과를 조사하였다(도 9). STRO-1bri/CD146+ 분리한 골수세포로부터 유래된 배양 확립물을 10% FCS(A) 또는 1x10-8M 1α,25-디하이드록시비타민 D3(1,25D)(B), lO ng/ml 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)(C), 10 ng/ml 종양 괴사 인자-α(TNF-α)(D), 10 ng/ml 인터루킨-1β(IL- 1β)(E) 및 30 ng/ml 기질 유래 인자 1-α(SDF-1α)(F)를 포함하는한 범주의 인자가 보강된 기본 배지에서 5일간 배양하였다. 이들 인자들은 시험관내 STRO-1bri MPC 수를 현저하게 증가시키는 것으로 확인되었다.
이들 인자들이 생체외 증폭 이후에 STRO-1bri 발현 세포의 백분율을 증강시키는 기작을 조사하기 위해, 배양한 STRO-1bri를 방법에 기술한 바와 같이 CFSE로 표지한 다음 다양한 인자에 노출시켰다. 도 10은 대표적인 예를 나타낸 것으로, IL-1β는 방법 부분에 기재된 바와 같이 CFSE로 표지된 MPC의 증식 잠재력을 증가시켰다. 전술한 바와 같이, 세포는 5일간 10 ng/ml의 IL-1β 존재하에 배양하여 STRO-1 mAb로 염색한 다음 분석하였다. IL-1β는 밝은 STRO-1+ 골전구세포의 수 증가에 의해 MPC 분열 횟수를 증대시키는 것으로 확인되었다. 또한, 유사한 결과가 수득되었으며, 1,25D, PDGF-BB, TNF-α, IL-1β 및 SDF-1α를 사용하여 MPC를 자극하였다.
실시예 5: STRO -1 bri 세포의 증식 증가는 또한 STRO -1 dim 세포의 수를 증가시킨다.
여러가지 인자 존재하에 배양한 STRO-1bri MPC의 비율을 증강시키는 능력은 또한 STRO-1dim 세포의 수 증가와 상호관련되어 있다. 예컨대, STRO-1bri/Alk Phos+ 세포(도 10B) 경우에, 표현형은 전-골모세포(pre-osteoblastic cell)와 일치된다(Gronthos et al., J Bone Miner Res. 14: 47-56, 1999; Pan et ah, Bone 34(1):112-23, 2004). 이에, 이러한 표현형 변화가 유도된 STRO-1bri MPC의 골 형성 세포, 골모세포로 분화하는 능력 증가와 상호관련 있는지를 조사하였다. 도 11은 IL-1β는 STRO-1 양성 MPC의 증식을 자극할 뿐만 아니라 골유도제, 덱사메타손의 존재하에 그것의 골 형성 잠재력을 증강시킴을 보인다. IL-1β는 0.01 ng/ml 농도에서 MPC 수를 무처리 대조군 배양물의 136.6 + 1.2%로 증가시켰다(도 11A). 고원 효과(plateau effect)는 0.1 ng/ml 보다 높은 농도에서 이루어졌다. MPC의 생체외 증폭시킨 자손을 방법에 개시한 바와 같이 골유도 조건에서 24웰 플레이트에 접종하였다. 또한, 세포에 10 ng/ml 농도로 IL-1β를 처리하였고, 배양물에는 주마다 IL-1β를 포함하는 신선한 배지를 제공하였다. 세포외 매트릭스의 칼슘 절대 농도는 상기 방법에 따라 결정하였다. 그 결과는, 미네랄 침착이 무처리 세포(도 11B)에 비해 IL-1β(도 11C) 처리 세포에서 증가됨을 보였다. IL-1β 처리 세포의 칼슘 수준은 4주 및 6주 모두에 무처리 세포에 비해 현저하게 증가되었다.
도 12의 데이타는 IL-1β가 증식 및 STRO-1Bri MPC를 자극하여 골전구세포의 증폭을 형성하지만, 이차 분화제, 덱사메타손의 첨가 후에 알칼린 포스파타제(ALP) 발현 및 STRO-1 발현 감소를 유도하여, 시험관내 기능적인 골모세포의 수를 효과적으로 증대시키는 것을 시사한다. 여러가지 인자들은 STRO-1bri MPC 집단을 증폭 및 조절할 수 있다는 생각을, 생체내에서 추가적으로 테스트하였다. STRO-1bri MPC로부터 생체외 증폭시킨 세미-컨플루언트의 이차 배양물을 생체외 증폭시킨 STRO-1bri MPC의 수를 증가시키는 것으로 공지된 부가적인 인자, PDGF-BB(10 ng/ml)의 존재 및 부재하에 배양하였다(도 9C에서 언급). PDGF-유도성 및 비-유도성 세포 집단을 하이드록시아페티트/트리칼슘 포스페이트 입자(HA/TCP)와 함께, 방법에 개시된 바에 따라, 면역약화된 마우스에 형질감염하였다. 8주후, 수확한 형질감염체를 조사한 결과, PDGF-BB를 전처리한 배양물은 Scion Imaging으로 정량한 바와 같이(도 13A), 무처리 대조 배양물(도 13B)과 비교하였을때 현저하게 더 많은 이소성 골 형성(도 13C)을 나타내는 것으로 나타났다.
실시예 6: 정제한 인간 BMSSC 는 SDF -1을 높은 수준으로 발현한다.
이전에 감쇄 혼성화 방법을 사용하여, 드문 세포 집단(rare cell population)에서 차별적으로 발현된 유전자의 빈도를 증가시켰다(Xu et al., Cancer Res. 60: 1677- 1682, 2000; Kingsley et al, Dev Growth Differ. 43: 133-143, 2001). 본 연구에서는, 기존에 개시된 바와 같이, MACS/FACS 조합 방법으로, STRO-1dull(glycophorin-A+ nucleated red cells) 및 STRO-1bright-발현성 골수(콜로니-형성 BMSSC를 모두 포함함)의 소수 분획을 분리하였다(Gronthos et al J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003)(도 14A). 분류한 각 STRO-1 집단의 경우, 5종의 골수 공여체로부터 총 RNA를 제조하여 모았다. 제1 가닥을 합성한 후, STRO-1bright 및 STRO-1du11 cDNA로 "재료 및 방법"에 기재된 바와 같이 일련의 감쇄 혼성화 단계를 수행하였다. STRO-1bright BMSSC 집단에서 독특하게 발현되는 유전자를 동정하기 위해, STRO-1bright-감쇄된 cDNA를 사용하여 T/A 클로닝 벡터에 삽입한 STRO-1bright 감쇄시킨 cDNA를 형질전환시킨 세균 클론에서 무작위로 선택한 200개 클론을 포함하는, 리플리케이트 저밀도 마이크로어레이 필터를 구축하였다. 마이크로어레이는 이후 [32P] dCTP-표지한 STRO-1bright 또는 STRO-1du11 감쇄 cDNA(도 14B-C) 중 어느 하나로 탐침하였다. 차별적인 스크리닝으로 TRO-1du11과 STRO-1bright 하위집단간에 매우 차별적으로 발현되는 총 44개의 클론을 동정하였다. 차별적으로 발현된 클론들 모두의 DNA 서열분석으로, 단지 클론 하나만 공지된 기질 세포 미토겐, 즉 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)를 나타내는 것으로 확인되었다(Gronthos and Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995). 흥미롭게는, 44개의 클론들중 6개가 케모카인인 기질 유래 인자-1(SDF-1)에 대응하는 DNA 삽입체를 포함하는 것으로 발견되었다. STRO-1bright, STRO-1du11, 및 STRO-1negative 로 새롭게 분류된 골수 하위 집단으로부터 준비한 총 RNA의 반-정량 RT-PCR로 인간 BMSSC에 SDF-1 전사체가 매우 많다는 것이 검증되었다(도 14D).
실시예 7: SDF -1은 시험관내 미성숙 기질 집단에서 선호적으로 발현된다.
다음으로, SDF-1 발현이 시험관내 BMSSC의 발생 단계와 상호관련있는지를 조사하였다. SDF-1 발현 수준은 STRO-1 및 알칼린 포스파타제(AP)의 세포 표면 발현을 토대로, 확립된 시험관내 골 분화 모델을 이용하여 여러가지 기질 집단에서 조사하였다(Gronthos et al, J Bone Miner Res. 14: 47-56, 1999; Stewart et al, J Bone Miner Res. 14: 1345-1356, 1999; Pan et al, Bone. 34(1):112-23, 2004). 2색 FACS를 이용하여, 도 15A의 정렬 영역(R1-R4)에 따라, 여러가지 BMSSC STRO-1/AP 공제(STRO-1/AP subtraction)를 분할하였다. 각 STRO-1/AP 공제는 이중 정렬하여 99.9% 보다 높은 순도로 하였다. 이후, 각 STRO-1/AP 정렬시킨 집단으로부터 분리한 총 RNA를 대상으로 SDF-1 발현을 조사하는 세미-정량 RT-PCR을 실시하였다. 분석을 통해, 하우스 키핑 유전자 GAPDH에 대해 표준화하였을 때, 대부분의 미성숙 기질 집단 STRO-1+/AP-(골전구세포)를 STRO-1+/AP+(preosteoblasts) 다음으로, 대부분의 성숙 세포 집단들, STRO-1-/AP+(골모세포) 및 STRO-1-/AP-(골세포, 골 라이닝 세포)에 비해, SDF-1을 보다 높은 수준을 발현하는 것으로 나타났다(도 15B).
병렬 실험에서, 골형성 유도 배지(L-아스코르베이트-2-포스페이트, 덱사메타손 및 무기 포스페이트가 보강됨)를 보충한, BMSSC 이차 배양물에서는, 시간 의존적인 양상의 SDF-1 발현 감소가 입증되었다(도 16A). 보다 낮은 수준의 SDF-1 발현은 골형성 유도 배지로 자극한 후 48시간 후에 골모전구세포계 세포(STRO-1+/AP+)의 보다 높은 비율과 관련있는 것으로 나타났다(도 16B).
실시예 8: BMSSC 는 SDF -1 리셉터 , CXCR4 를 발현한다.
SDF-1이 자가분지 인자로서 작용할 수 있는지를 결정하기 위해, RT-PCR 분석을 이용한 예비 실험으로, BMSS가 실제 SDF-1 리셉터, CXCR4를 발현하지 않음을 확인하였다.(도 17A) 정상 배양한 BMSSC에 의한 CXCR4 발현 및 인간 골육종 세포주인 MG63 조사를 통해, 568bp로 추정되는 PCR 산물과, 더 큰 두번째 밴드의 발현 변화가 나타났다. DNA 서열 분석으로 하단의 밴드를 정상적인 인간 CXCR4 이소폼에 해당되는 것으로서 검증하였고, 큰 밴드는 기존에 보고되었던 선택적 스플라이스 다변체(alternative splice variation)에 해당되었다(Gupta and Pillarisetti, J Immunol. 163: 2368-2372, 1999). 또한, BMSSC는 유세포 분석으로 확인된 바와 같이 세포 표면에서 CXCR4 단백질을 낮은 수준으로 계속적으로 발현하는 것으로 확인되었다(도 17B). 칼슘 동원(mobilization) 연구를 수행하여, BMSSC에 의해 발현된 CXCR4가 기능적으로 활성인지를 결정하였다. FURA-2-적재 BMSSC를 30 ng/mL의 재조합 인간 SDF-1α(rhSDF-lα)으로 자극하였고, 그 결과 SDF-1/CXCR4 시그널링의 세포내 칼슘 수준 특징이 신속하고 확실하게 증가되었다(도 17C).
실시예 9: SDF -1 과다 발현은 BMSSC 가 생체내에서 이소 골을 생성할 수 있는 잠재력을 증강시킨다.
SDF-1이 기질 세포 발생에 어떠한 기능적인 역할을 가지는지 확인하기 위해, 전장 인간 SDF-1 cDNA를 포함하고 있는 레트로바이러스 발현 구조체를 사용하여, "재료 및 방법"에 개시되어 있는 바와 같이, 팩킹 세포주 PT67을 형질감염시켰다. 감염성 입자가 포함된 수확한 상층물을 SDF-1α을 높은 수준으로 발현하고 있는 안정적이며 다중클로니 유래 BMSSC 세포주와 pLNCX2 비 벡터가 형질감염된 대응되는 대조군 세포주를 제조하는데 사용하였다(도 18A).
"재료 및 방법"에 언급된 바와 같이, 하이드록시아파티트/트리칼슘 포스페이트 입자와 함께 3개의 각각의 골수 흡인물로부터 유래된 세포주를 면역약화된 마우스에 이식하였다. 수확한 임플란트의 조직 단편을 Scion 이미징 분석한 결과, 벡터 대조군에 비해 SDF-1 고발현성 BMSSC 주를 포함하고 있는 형질감염체에서 면적당 이소 골 형성 수준이 현저하게 증가되었다(P < .05, ttest)(도 18C).
유사 실험을 수행하여, 관찰된 SDF-1 매개의 증강된 골 형성력의 잠재적인 메카니즘을 동정하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 SDF-1을 높은 수준으로 발현하고 있는 BMSSC의 시험관내 하이드록시아파티트의 미네랄화된 침작 형성 능력이 벡터 대조군 세포주 이상의 어떠한 통계적인 차이를 검출하지 못하였다(데이타 미기재). 또한, SDF-1 고발현 BMSSC 세포주와 부합되는 벡터 대조군 BMSSC 세포주 사이에, 다양한 골 관련 유전자(BMP2, BMP4, CBFAl, 오스테릭스, 오스테오칼신, 알칼린 포스파타제[AP]) 발현에 대한 어떠한 일관된 차이점을 검출하지 못하였다(데이타 미기재). 종합적으로, 이러한 데이타는 SDF-1이 생체내 골 형성에 대한 간접적인 효과를 가하는 것을 시사한다.
실시예 10: SDF -1은 BMSSC 성장 및 생존을 매개한다.
다음으로, SDF-1의 과다 발현으로 형질감염된 BMSSC에 성장 또는 생존 측면에서 이로움을 제공할 가능성을 조사하였다. 이는, SDF-1을 높은 수준으로 발현하는 BMSSC가 BMSSC 벡터 대조군 세포주 이상으로 그것의 성장 능력을 중간 수준, 그러나 유의적이진 않는 수준의 증가를 보이는 것을 입증하는 증폭 실험으로 뒷받침되었다(도 19A). 또한, 트립펜 블루 배제 방법에 의해, SDF-1을 과다 발현하는 BMSSC 역시 BMSSC의 성장을 시험관내에서 저해하는 것으로 기존에 입증된(Gronthos and Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995), 염증성 사이토카인, IL-4의 세포사멸 유도 작용에 대해 보다 높은 내성을 보였다(도 19B). 이러한 사실과 관련하여, SDF-1을 과다 발현하는 살아있는 배양물, BMSSC 또한 IL-4으로 자극하였을때 세포사멸 초기 마커인 아넥신 V의 세포 표면 염색 감소를 보였다(도 19C-D).
이후 비교 실험을 수행하여, 정상 BMSSC의 성장에 대한 외인성 SDF-1의 효과를 측정하였다. STRO-1 양성인 정제한 골수세포를 가장 초기에 동정가능한 간엽 전구세포,(CFU-F; fibroblastic colony-forming unit)의 형성을 증강시키는 것으로 기존에 보고된 혈청 고갈 조건에서, 혈청이 충분히 공급한 배양물과 유사한 수준의 PDGF-BB 존재하에, 배양하였다(Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003; Gronthos and Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995). 외인성 rhSDF-1α는 콜로니 생산을 자극하는데에는 타고난 능력을 보이지 않았지만, CFU-F 수 증가가 PDGF-B와의 병용에서 관찰되었다(도 20). 더욱이, 공지된 강력한 CFU-F 저해제, α-인터페론 2a(Gronthos and Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995; Wang et al, Am J Hematol. 40: 81-85. 1992) 첨가로, PDGF-BB-유도성 콜로니 형성의 전형적인 감소가 나타났으며, 이는 SDF-1의 존재시에 부분적으로 가역적인 것으로 입증되었다. SDF-1 존재시 관찰된 반응으로, 농도 범위 0.1 내지 100 ng/mL에서 30 ng/mL이 최적인 것으로 확인되었다(도 21). 종합적으로, 이러한 데이타는 SDF-1이 BMSSC의 자가-소생 및 생존 능력을 촉진하는데 있어 역할을 수행함을 시사한다.
결론
본 연구는, 인간 골수 흡인물에서 직접 분리한 가장 초기에 검출가능한 BMSSC가 배양전에 SDF-1을 높은 수준으로 발현함을 입증한다. 본 발명자들은 다잠재성 BMSSC가 큰 혈관의 말초혈관 세포들 중에서 골수 미세환경내에 위치된다는 것을 이미 보고한바 있다(Shi and Gronthos, J Bone Miner Res. 18: 696-704, 2003). 이러한 관찰 결과는 골의 말초동맥 영역과 모세 혈관을 포함한 혈관을 둘러싼 세포에서, 및 초기 골수형성 및 B-림프구 발생 부위의 골내막 근처 일부 골수 기질 세포에 의해, 가장 높은 수준으로 SDF-1을 발현하는 인간 골수내 SDF-1의 공지된 분포 패턴과 일치된다(Ponomaryov et al, J Clin Invest. 106: 1331-1339, 2000; Petit et al, Nat Immunol. 3: 687-694, 2002; Salvucci et al, Blood 99: 2703-2711, 2002). 중요한 것은, 골 표면에 위치한 성숙 골형성 세포 집단이나, 또는 골 매트릭스내 골세포는 정 위치에서 SDF-1 발현이 없는 것으로 보인다(Ponomaryov et al, J Clin Invest. 106: 1331-1339, 2000).
Stewart et al(Stewart et al, J. Bone Miner Res. 14: 1345-1356, 1999)와 본 발명자 실험실(Gronthos et al, J Bone Miner Res. 1999;14: 47-56, 1999; Pan et al, Bone. 34(1): 112-23, 2004)의 기존 작업으로, 초기 골모전구세포가 간엽 줄기세포 마커인 STRO-1을 발현하지만 골모-관련 마커, 알칼린 포스파타제의 발현이 없는 정상적인 기질 배양물에 존재한다는 것이 입증되었다. 이들 전구세포 집단이 성숙한 기능적인 골모세포 표현형으로의 전개되는 것은 STRO-1 발현 손실과 AP 세포-표면 발현 획득과 서로 관련있다(Gronthos et al, J Bone Miner Res. 1999;14: 47-56, 1999; Stewart et al, J Bone Miner Res. 14: 1345-1356, 1999). 시험관내 골형성 세포 분화 모델을 이용하여, 본 발명자들은 분화가 예정된 골형성 집단인 배양한 BMSSC 세포가 보다 미성숙 STRO-1+ BMSSC와 비교하였을때 SDF-1을 감소된 수준으로 나타난다는 것을 입증하였다. 더욱이, 골 형성 유도 배지로 BMSSC를 처리한 다음 SDF-1 발현의 현저한 감소가 있었으며, 이는 보다 원시적이며 분화가 예정 정도가 낮은 골전구세포 분화 단계와 연계되어 있다는 추가적인 증거이다. 종합적으로, 실험 결과는 SDF-1/CXCR4 상호작용을 파괴하는 것으로 작용할 수 있는 환경 신호에 반응하여 증폭 및 분화가 필요할 때까지, SDF-1이 작용하여 원시적인 비예정된 BMSSC 집단을 그것의 혈관말단 영역내에 위치시킬 수 있음을 시사한다.
SDF-1은 정상적인 조혈, 염증 및 다양한 종양의 전이에 중요한 것으로 여겨지지만, BMSSC의 성장 또는 분화에 있어서의 SDF-1의 역할에 대해선 거의 알려져 있지 않다. SDF-1은 그것의 리셉터, 즉, 인간 면역결핍 바이러스 타입-1에 대한 주된 공동-리셉터로서 작용하는 CXCR4, G 단백질-커플링된 분자 패밀리에 속하는 트랜스멤브레인 당단백질을 통해 그 작용을 매개한다(Bleul et al., Nature 382: 829-833, 1996; Oberlin et al., Nature 382: 833-835, 1996; Ma et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 95: 9448-9453, 1998). 본 발명자들은 놀랍게도 배양한 정상 BMSSC와 인간 골육종 세포주 MG63 둘다에서 2개의 CXCR4 스플라이스 변이체 모두를 관찰하였다. DNA 서열분석으로 정상적인 BMSSC에서 많이 발견되는 형태인 작은 스플라이스 변이체가 정상적인 인간 CXCR4 cDNA 스패닝 엑손에 해당되는 것으로 검증되었다. 반대로, MG63 세포에서 매우 많이 관찰되는 보다 큰 스플라이스 변이체는 교차성(intersecting) 인트론으로부터 전사된 DNA 서열을 제외시켜 제조된 기존에 알려진 양자 선택적 스플라이스 변이체에 해당되며, 9개의 아미노산이 추가되어 있다(Gupta et ah, J Immunol. 163: 2368-2372, 1999). 조직 분포 연구를 통해, 보다 작은 전사체가 정상 조직에서 발현되는 우세적인 CXCR4 이소폼이고, 큰 전사체는 다양한 백혈병 세포주 및 암종 세포주에서 현저하게 발현되는 것이 입증되었다(Gupta et al, J Immunol. 163: 2368-2372, 1999). 상기 스플라이스 변이체 둘다는 활성이지만, 보다 큰 CXCR4 전사체의 기능적 유의성은 아직 결정되지 않았으나 배아 발생동안에 CXCR4 스플라이싱에서 발생할 수 있는 임의 실수들을 보상하기 위한 메카니즘으로서, 발생에서의 SDF-1/CXCR4의 중대성과 관련있을 수 있다.
본 연구에서, 본 발명자들은 유세포 분석 및 칼슘 동원 연구로 확인된 바와 같이 BMSSC는 기능성 CXCR4 단백질을 세포 표면에서 낮은 수준으로 계속적으로 발현시킴을 입증하였다. 따라서, SDF-1/CXCR4 시그널링은 BMSSC 성장 및 이동 조절에 중요한 역할을 수행할 수 있다.
본 연구에서, 본 발명자들은 또한 생체내 증폭시킨 대다수의 BMSSC는 부분적인 골 분화를 진행하기 시작하며 SDF-1 발현 감소와 서로 관련있다. 이러한 성숙은 BMSSC가 세포사멸을 유도하는 인자에 대한 감소성을 증강시키는 것으로 보였다. 본 연구는 또한 SDF-1을 과다 발현하는 BMSSC 세포주가 기존에 시험관내에서 BMSSC의 성장을 저해하는 것으로 확인된 IL-4의 세포사멸 효과에 대한 방어를 증가시키는 것으로 나타났다(Gronthos and Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995). 유사한 실험에서도, SDF-1 고발현하는 BMSSC 세포가 IL-4 존재시에 초기세포사멸 유도에 더욱 내성적인 것으로 입증되었다.
본 연구에서, CFU-F 집단을 함유하는 STRO-1bright 골수세포에서 새롭게 분리된 가장 초기에 동정가능한 간엽 전구세포에 의한 생존 및 성장 장점이 확인되었다. 외인성 rhSDF-1α는 단독으로 콜로니 생산을 자극하는 고유 능력을 보이지 않았지만, PDGF-BB와의 조합으로 첨가하였을때 CFU-F의 수 증가가 관찰ㄹ되었다. 여러가지 BMSSC 집단들 사이의 생존율에 대한 SDF-1의 다양한 효과는, 보다 성숙한 생체외 증식시킨 기질 세포에 대한 신선하게 분리한 원시 BMSSC의 발생 단계 차이로 인한 것일 수 있다. 따라서, PDGF 및 SDF-1은 BMSSC의 자가-재생 및 생존 능력을 촉진하는데 상승적으로 작용할 있다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌, 작용, 물질, 장치, 기사 등은 단독으로 본 발명의 내용을 제시한다. 이건 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재된 바와 같이, 이러한 임의 또는 모든 내용이 종래 분야의 일부를 형성하거나, 또는 본 발명이 관련된 분야에서 주지된 것으로 인정되지 않는다.
당업자라면 가장 넓은 본 발명의 사상 또는 범위를 이탈하지 않고, 구체적인 예에 나타낸 바와 같이 본 발명에 대한 여러가지 변형 및/또는 수정을 갛할 수 있다. 따라서, 본 발명의 예는 예시된 모든 측면으로 고려되며, 한정되지 않는다.
항체
Figure 112015016750245-pat00001
인간 mRNA의 특이적인 증폭용 RT-PCR 프라이머 및 조건
표적 유전자 센스/안티센스(5' -3') 프라이머 서열 산물 크기
GAPDH CACTGACACGTTGGCAGTGG/
CATGGAGAAGGCTGGGGCTC		 417
SDF-1 GAGACCCGCGCTCGTCCGCC/
GCTGGACTCCTACTGTAAGGG		 364
IL-1b AGGAAGATGCTGGTTCCCTCTC/
CAGTTCAGTGATCGTACAGGTGC		 151
FLT-1 TCACTATGGAAGATCTGATTTCTTACAGT/
GGTATAAATACACATGTGCTTCTAG		 380
TNF-a TCAGATCATCTTCTCGAACC/
CAGATAGATGGGCTCATACC		 361
KDR TATAGATGGTGTAACCCGGA/
TTTGTCACTGAGACAGCTTGG		 450
RANKL AACAGGCCTTTCAAGGAGCTG/
TAAGGAGGGGTTGGAGACCTCG		 538
렙틴 ATGCATTGGGAACCCTGTGC/
GCACCCAGGGCTGAGGTCCA		 492
CBFA-1 GTGGACGAGGCAAGAGTTTCA/
TGGCAGGTAGGTGTGGTAGTG		 632
PPARg2 AACTGCGGGGAAACTTGGGAGATTCTCC/
AATAATAAGGTGGAGATGCAGGCTCC		 341
OCN ATGAGAGCCCTCACACTCCTC/
CGTAGAAGCGCCGATAGGC		 289
MyoD AAGCGCCATCTCTTGAGGTA/
GCGAGAAACGTGAACCTAGC		 270
SMMHC CTGGGCAACGTAGTAAAACC/
TATAGCTCATTGCAGCCTCG		 150
GFAP CTGTTGCCAGAGATGGAGGTT/
TCATCGCTCAGGAGGTCCTT		 370
네스틴 GGCAGCGTTGGAACAGAGGTTGGA/
CTCTAAACTGGAGTGGTCAGGGCT		 460
SOX9 CTCTGCCTGTTTGGACTTTGT/
CCTTTGCTTGCCTTTTACCTC		 598
콜라겐 타입 X AGCCAGGGTTGCCAGGACCA/
TTTTCCCACTCCAGGAGGGC		 387
어그레칸 CACTGTTACCGCCACTTCCC/
ACCAGCGGAAGTCCCCTTCG		 184
STRO- lBri 및 STRO- lDim 집단에서 상대적인 유전자 발현 요약. 역전사 PCR로 결정된 STRO- lBri 및 STRO- lDim 집단간의 측정가능하며 차별적인 발현을 나타내는 유전자 리스트를 나타낸다. 수치는 하우스 키핑 유전자인 GAPDH와 비교하여 상대적인 유전자 발현을 나타낸다.
조직 마커 GAPDH 에 상대적인 유전자 발현
STRO -1 Bri STRO -1 Dim
신경 GFAP ( Glial Fibrillary Acidic Protein) 0.1 0.7
뼈 OCN( Osteocalcin ) 1.1 2.5
OSX( Osterix ) 0.4 1.3
CBFA -1(Core Factor Binding Protein-1) 0.3 0.6
RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor κB) 1.6 0.3
지방 Leptin 3.1 4.2
심근세포 GATA -4 1.1 2.9
내피세포 Ang -1( Angiopoietin -1) 1.5 0.8
SDF -1-alpha( Stromal Derived factor-1-alpha) 3.2 0.1
연골세포 Sox 9 0.3 1.1
COL X(Collagen X) 3.5 2.8
전-염증성
사이토카인 		TNF -alpha( Tumour necrosis alpha) 1.7 0.9
STRO- lBri 및 STRO- lDim 집단에서 상대적인 유전자 발현 요약. 유세포 측정으로 결정된 STRO- lBri 및 STRO- lDim 집단간의 차별적인 발현을 나타내는 단백질 리스트를 나타낸다. 수치는 도 2와 같이 상대적인 형광 물질의 염색 강도를 나타낸다.
조직 마커 평균 형광 강도
STRO -1 bri STRO -1 dim
신경 Neurofilament 1.7 20.5
뼈 ALK PHOS(Alkaline Phophatase ) 5.7 44.5
RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor κB) 658.5 31.0
상피 세포 CytoKeratin 10+13 1.2 23.3
Cytokeratin 14 1.8 8.8
평활근 α- SMA (Alpha Smooth Muscle Actin) 318.0 286.0
연골세포 Byglycan 84.4 65.9
기저 섬유아세포 Tenascin C 22.2 6.9
심근세포 Troponin C 2.5 15.0
SEQUENCE LISTING <110> Angioblast Systems, Inc. <120> Bone regeneration <130> 503173 <150> US 60/613,021 <151> 2004-09-24 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ser Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys 20 25 30 Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys 35 40 45 Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys 50 55 60 Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln 65 70 75 80 Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys 85 <210> 2 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ser Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys 20 25 30 Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys 35 40 45 Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys 50 55 60 Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln 65 70 75 80 Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met 85 90 <210> 3 <211> 352 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met 1 5 10 15 Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu 20 25 30 Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile 35 40 45 Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly 50 55 60 Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu 65 70 75 80 Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val 85 90 95 Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val 100 105 110 His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala 115 120 125 Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser 130 135 140 Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Val Val Tyr Val Gly Val 145 150 155 160 Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn 165 170 175 Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr Pro Asn 180 185 190 Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu 195 200 205 Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser 210 215 220 Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr 225 230 235 240 Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr 245 250 255 Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln 260 265 270 Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu 275 280 285 Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe 290 295 300 Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val 305 310 315 320 Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly 325 330 335 His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser 340 345 350

Claims (53)

  1. 인비트로에서 STRO-1dim 조직 특이적 위탁 세포(tissue specific committed cells, TSCC)의 증식, 생존, 또는 증식 및 생존을 증강시키는 방법으로서,
    상기 방법은 SDF 발현 STRO-1bright 간엽 전구 세포(MPC)를 STRO-1dim TSCC와 함께 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 TSCC는 5%를 초과하는 STRO-1bright MPC의 존재하에서 배양되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 STRO-1dim TSCC는 CXCR4를 발현하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 STRO-1dim TSCC 및 STRO-1bright MPC는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 줄기 세포 인자(SCF), fit 3 리간드(FL), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-6(IL-6), 1α,25-디하이드록시비타민 D3(1,25D), 종양 괴사 인자 α(TNF-α) 및 인터루킨-1β(IL-1β)로 이루어진 군으로부터 선택되는 자극 인자의 존재 하에서 배양되는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 STRO-1dim TSCC 및 STRO-1bright MPC는 특이적인 조직 타입으로 분화를 편향시키는 조건 하에서 배양되는, 방법.
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