ES2645012T3 - Método para potenciar la proliferación y/o supervivencia de las células precursoras mesenquimales (MPC) - Google Patents

Abstract

Un método para mejorar la proliferación y/o supervivencia de las células comprometidas específicas de tejido STRO-1dim mesenquimales (TSCC) in vitro, comprendiendo el método cultivar células precursoras mesenquimales (MPC) STRO-1bright que expresan SDF con las TSCC STRO-1dim, donde las TSCC se cultivan en presencia de más del 5 % de MPC STRO-1brigh.

Description

Método para potenciar la proliferación y/o supervivencia de las células precursoras mesenquimales (MPC)

5 CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden células precursoras mesenquimales (MPC) y/o células precursoras derivadas de las mismas y a métodos para potenciar la proliferación y/o supervivencia de estas células in vitro o in vivo. La presente invención también se refiere a métodos para la formación ex vivo o in vivo de

10 hueso en mamíferos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La remodelación ósea es un proceso fisiológico continuo que tiene lugar en un esqueleto adulto en el que la

15 reabsorción ósea va seguida de una nueva formación ósea, manteniendo la resistencia mecánica y la estructura. Las células óseas que son responsables de este proceso acoplado incluyen las células de resorción ósea (osteoclastos, que se derivan de células hematopoyéticas del linaje de monocitos/macrófagos) y las células formadoras de hueso (osteoblastos, que son de origen mesenquimatoso). El proceso de reabsorción ósea está involucrado en muchas situaciones clínicas relevantes para el trabajo de los reumatólogos, tal como la destrucción ósea focal o la erosión en

20 la AR y otras artritis inflamatorias, y la pérdida ósea difusa que se encuentra en la osteoporosis.

La activación de osteoclastos es un proceso celular crítico para la reabsorción ósea patológica, tal como las erosiones en la artritis reumatoide (AR) o la pérdida ósea generalizada. Entre muchos factores que desencadenan una actividad excesiva de osteoclastos, las citocinas tal como IL-1 o el factor de necrosis tumoral (TNF)-α

25 desempeñan un papel principal. Más recientemente, se ha demostrado que el factor 1 derivado de células estromales de quimiocina (SDF-1) promueve el reclutamiento, desarrollo y supervivencia quimiotácticos de osteoclastos humanos (Wright et al., Bone 36: 840-853, 2005; Zannettino et al., Cancer Res 65(5): 1700-1709, 2005; Grassi et al., J. Cell. Physiol. 199:244-251, 2004).

30 Las quimioquinas son una superfamilia de proteínas quimioatrayentes que regulan una diversidad de respuestas biológicas y promueven el reclutamiento de linajes múltiples de leucocitos y linfocitos a un tejido orgánico del cuerpo. Las quimioquinas se pueden clasificar en dos familias según la posición relativa de los dos primeros residuos de cisteína en la proteína. En una familia, las primeras dos cisteínas están separadas por un residuo aminoacídico, las quimiocinas CXC, y en la otra familia, las primeras dos cisteínas son adyacentes, las quimioquinas CC. En seres

35 humanos, los genes de las quimiocinas CXC se agrupan en el cromosoma 4 (con la excepción del gen SDF-1, que se ha localizado en el cromosoma 10) y los de las quimioquinas CC en el cromosoma 17.

Las dianas moleculares para las quimiocinas son receptores de la superficie celular. Uno de tales receptores es el receptor de quimioquinas CXC 4 (CXCR4), que es una proteína 7 transmembrana, acoplado a G1 y anteriormente se

40 denominó LESTR (Loetscher et al., (1994) J. Biol. Chem, 269: 232-237, 1994), HUMSTR (Federsppiel et al., Genomics 16, 707-712, 1993) y Fusin (Feng et al., Science 272: 872-877, 1996). CXCR4 se expresa ampliamente en células de origen hematopoyético, y es un co-receptor principal con CD4+ para el virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) (Feng et al., Science 272: 872-877, 1996).

45 Actualmente, el único ligando natural conocido para CXCR4 es SDF-1. El factor 1 derivado de células estromales alfa (SDF-1 alfa) y el factor 1 derivado de células estromales (SDF-1 beta) son proteínas estrechamente relacionadas (en conjunto denominadas en el presente documento como SDF-1). Las secuencias de aminoácidos nativas de SDF-1 alfa y SDF-1 beta se conocen, al igual que las secuencias genómicas que codifican estas proteínas (Pat. de Estados Unidos N.º 5.563.048 y Pat. de Estados Unidos N.º 5.756.084).

50 Se ha descrito la estructura cristalográfica tridimensional de SDF-1 (Crump et al., EMBO J. 16: 6996-7007, 1997). El análisis de estructura-actividad de SDF-1 indica que aunque los residuos N-terminales 1-8 o 1-9 están implicados en la unión al receptor, los péptidos 1-8 y 1-9 en solitario no mostraron actividad in vitro indicativa de la unión al receptor, que apoya la conclusión indicada de que los péptidos no asumen la conformación necesaria para unirse al

55 receptor. Este resultado se pretende implicar que el resto del andamiaje proteico, y/o diversos sitios de unión al receptor de consenso en otra parte de la proteína son importantes para mediar los requisitos conformacionales para la unión N-terminal al receptor (Crump et al., EMBO J. 16: 6996-7007, 1997). En base a estos resultados, se ha propuesto un modelo de dos sitios para la unión de SDF-1 a CXCR4, que implica dos sitios de unión en los residuos 1-17, un sitio N-terminal y un sitio RFFESH aguas arriba (Crump et al., EMBO J. 16: 6996-7007, 1997). Los dos

60 sitios de unión putativos están unidos por el motivo CXC que caracteriza a toda la familia de quimiocinas CXC. Estas

dos regiones de unión putativa se han identificado como importantes en otras quimiocinas CC y CXC (Crump et al., EMBO J. 16: 6996-7007, 1997). Esto es consistente con el hallazgo de que aunque las regiones N-terminales de una amplia diversidad de quimiocinas son críticas para la activación del receptor, se ha notificado que los péptidos Nterminales de las quimiocinas distintas de SDF-1 carecen de actividad de unión al receptor y no son agonistas del

5 receptor (Crump et al., EMBO J. 16: 6996-7007, 1997).

Las células madre estromales del estroma de la médula ósea (BMSSC) o las células precursoras mesenquimales (MPC) posnatales tienen la capacidad de regenerar un órgano de médula ósea de soporte hematopoyético y hueso trabecular asociado cuando se trasplantan en ratones inmunocomprometidos (Friedenstein et al. Exp Hematol. 6:

10 440-444, 1978; Kuznetsov et al. J Bone Miner Res. 12: 1335-1347, 1997; Pittenger et al. Science 284: 143-147, 1999; Bianco et al., Stem Cells 19: 180-192, 2001; Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003). Estudios recientes también informaron que las BMSSC son más plásicas de lo que se descubrió por primera vez, en virtud de su capacidad para desarrollar diversos linajes celulares tal como estroma mielosoportivo, osteoblastos, condrocitos, adipocitos, mioblastos, hepatocitos, cardiomiocitos y células neurales (Liechty et al. Nat Med. 6: 1282-1286, 2000;

15 Zhao et al. Exp Neurol. 174: 11-20, 2002; Verfaillie et al. Ann N Y Acad Sci. 996: 231-234, 2003). Estos desarrollos han llevado a investigaciones sobre el posible uso de poblaciones de BMSSC expandidas ex vivo para la regeneración ósea. Sin embargo, el progreso de estos estudios se ha restringido en gran medida debido a la falta de comprensión de los factores críticos que regulan el crecimiento y la supervivencia de las BMSSC humanas multipotenciales y el eventual desarrollo de estas células en el hueso.

20 Zvaifler et al (Arthritis Res. 2(6): 477-488 2000) describe el cultivo de células precursoras mesenquimales encontradas en sangre (BMPC) que se encontraron adheridas al plástico y al vidrio y que proliferaban logarítmicamente en DMEM-suero fetal bovino al 20 %. Las BMPC cultivadas expresan SDF-1.

25 RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han identificado ahora SDF-1 como un gen expresado diferencialmente que está altamente expresado por BMSSC purificadas antes del cultivo. En particular, los presentes inventores han descubierto que las células preosteogénicas inmaduras cultivadas in vitro expresaban mayores niveles de SDF-1 en comparación con

30 los tipos celulares maduros representativos de osteoblastos y osteocitos/células de revestimiento óseo. Además, la expresión de SDF-1 se redujo rápidamente cuando las BMSSC se cultivaron en condiciones osteoinductivas.

También se demostró que las BMSSC expresaban receptores de SDF-1 de superficie celular funcional (CXCR4). Las líneas de BMSSC transducidas, que secretan altos niveles de SDF-1, mostraron una capacidad mejorada para

35 formar hueso ectópico in vivo, en comparación con las líneas control de BMSSC. Además, las BMSSC que expresan altos niveles de SDF-1 mostraron una mayor capacidad de crecimiento celular y protección contra la apoptosis inducida por interleucina-4. De forma similar, las unidades formadoras de colonias de fibroblastos (CFU-F) también mostraron un mayor crecimiento y resistencia a la apoptosis inducida por α-interferón-2a, en sinergia con el factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (PDGF-BB) y SDF-1 in vitro.

40 Estos hallazgos indican que la quimiocina SDF-1 desempeña un papel en la proliferación, la supervivencia y la capacidad osteogénica de las poblaciones inmaduras de BMSSC.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para aumentar la proliferación y/o supervivencia de

45 células comprometidas específicas de tejido STRO-1dim(TSCCc), comprendiendo el método cultivar células precursoras mesenquimales (MPC) STRO-1bright que expresan SDF con TSCC STRO-1dim, donde las TSCC se cultivan en presencia de más del 5 % de MPC STRO-1bright.

La presente invención también proporciona un método en el que las TSCC STRO-1dim expresan CXCR4.

50 La presente invención también proporciona un método donde los TSCC STRO-1dim y las MPC STRI-1bright son cultivos en condiciones que desvían la diferenciación a un tipo de tejido específico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

55 Figura 1. Perfil de expresión génica de células que expresan STRO-1bri o STRO-1dim derivadas de MPC cultivada. Las suspensiones celulares individuales de MPC de médula ósea expandida ex vivo se prepararon mediante tratamiento con tripsina/EDTA. Las células se tiñeron con el anticuerpo STRO-1 que se reveló posteriormente mediante incubación con isotiocianato de IgM-fluoresceína anti-cabra murino. El ARN celular total se

60 preparó a partir de poblaciones purificadas de células que expresan STRO-1dim o STRO-1bri , después de la

clasificación celular activada por fluorescencia (A). Utilizando el método de extracción RNAzolB, y los procedimientos estándar, se aisló el ARN total de cada subpoblación y se usó como plantilla para la síntesis de ADNc. La expresión de diversos transcritos se evaluó mediante amplificación por PCR, utilizando un protocolo estándar como se describió previamente (Gronthos et al. J Cell Sci. 116:1827-1835, 2003). Los conjuntos de cebadores utilizados en

5 este estudio se muestran en la Tabla 2. Después de la amplificación, cada mezcla de reacción se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 %, y se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio (B). La expresión génica relativa para cada marcador celular se evaluó con referencia a la expresión del gen de mantenimiento, GAPDH, usando el software ImageQant (C).

10 Figura 2. Patrón de expresión inmunofenotípico de células expandidas ex vivo derivadas de MPC de médula ósea. Se prepararon suspensiones celulares individuales de MPC de médula ósea derivadas de células expandidas ex vivo por separación de tripsina/EDTA y posteriormente se incubaron con el anticuerpo STRO-1 junto con anticuerpos que identifican una amplia gama de marcadores asociados al linaje celular. Se identificó STRO-1 usando un isotiocianato de IgM-fluoresceína de cabra anti-murino, mientras que todos los demás marcadores se identificaron

15 usando una IgG-ficoeritrina de cabra anti-ratón o anti-conejo. Para aquellos anticuerpos que identifican antígenos intracelulares, las preparaciones celulares se marcaron primero con el anticuerpo STRO-1, se fijaron con etanol frío al 70 % para permeabilizar la membrana celular y luego se incubaron con anticuerpos específicos de antígeno intracelulares. Los anticuerpos de control de isotipo coincidentes se usaron en idénticas condiciones. Se realizó un análisis de citometría de flujo de color dual con un citómetro de flujo COULTER EPICS y se recopilaron los datos en

20 modo de lista. Los gráficos de puntos representan 5.000 eventos en modo de lista que indican el nivel de intensidad de fluorescencia para cada marcador de celda de linaje (eje y) y STRO-1 (eje x). Los cuadrantes verticales y horizontales se establecieron con referencia a los anticuerpos de control negativo emparejados con isotipo.

Figura 3. Desarrollo adipogénico in vitro. Las suspensiones celulares individuales se generaron mediante

25 digestión con tripsina/EDTA de cultivos secundarios de células expandidas ex vivo, derivadas de células de médula ósea clasificadas STRO-1bri/VCAM-1+. Las células expandidas se aislaron a continuación de acuerdo con su expresión de STRO-1 usando la clasificación de células activadas por fluorescencia de un solo color como se muestra en la Figura 1A. Las células derivadas de MPC clasificadas STRO-1bri y STRO-1dim se pusieron después en placas durante una noche, en placas de 6 pocillos, a una densidad de 1 x 105 células por pocillo en medio de

30 crecimiento regular. Al día siguiente, el medio de cultivo se reemplazó con medio inductivo adipogénico como se describe en los métodos. Los cultivos se alimentaron dos veces a la semana posteriormente durante un período total de tres semanas, momento en el que las células se fijaron y se tiñeron con rojo aceite O. Se muestran aumentos de potencia bajos (4x) y altos (20x) que representan tinción con rojo aceite O de adipocitos que contienen lípidos esparcidos por las capas estromales adherentes. De media, se identificaron 22 ± 5 adipocitos positivos a rojo aceite

35 O en los cultivos de STRO-1bri (por unidad de área a 20x, n = 9 campos) en comparación con 7 ± 2 adipocitos (por unidad de área a 20x, n = 9 campos) en los cultivos STRO-1dim .

Figura 4. Desarrollo osteogénico in vitro. Las suspensiones celulares individuales se generaron mediante digestión con tripsina/EDTA de cultivos secundarios de células expandidas ex vivo, derivadas de células de médula 40 ósea clasificadas STRO-1bri/VCAM-1+. Las células expandidas se aislaron a continuación de acuerdo con su expresión de STRO-1 usando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de un solo color como se muestra en la Figura 1A. Las células aisladas por FACS STRO-1bri y STRO-1dim se pusieron después en placas durante una noche, en placas de 48 pocillos, a una densidad de 0,3 x 105 células por pocillo en medio de crecimiento regular (cuatro réplicas por condición. Al día siguiente, el medio de cultivo se reemplazó con medio inductivo 45 osteogénico como se describe en los métodos. Los cultivos se alimentaron dos veces a la semana a continuación durante un período total de tres semanas, momento en el que se lavaron las células y luego se trataron con HCl 0,6 N para extraer el calcio dentro de los depósitos mineralizados. Las muestras se hicieron reaccionar con complejo de o-cresol-ftaleína y la reacción colorimétrica se leyó a 570 nm. La concentración absoluta de calcio se determinó de acuerdo con una curva estándar de calcio. (A) Las mediciones de calcio mostraron que los cultivos de STRO-1bri

50 sintetizaron significativamente (*; p<0,05; prueba t) más mineral en comparación con los cultivos de STRO-1dim. Los cultivos replicados se fijaron y se tiñeron para determinar la tinción con rojo de Alizarina que representaba niveles típicos de depósitos mineralizados en las capas adherentes de los cultivos de STRO-1bri(B) y STRO-1dim (C).

Figura 5. Desarrollo condrogénico in vitro. Las suspensiones celulares individuales se generaron mediante

55 digestión con tripsina/EDTA de cultivos secundarios de células expandidas ex vivo, derivadas de células de médula ósea clasificadas STRO-1bri/VCAM-1+. Las células expandidas se aislaron a continuación de acuerdo con su expresión de STRO-1 usando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de un solo color como se muestra en la Figura 1A. Las células aisladas por FACS STRO-1bri y STRO-1dim se sedimentaron a continuación en tubos de polipropileno a una densidad de 2,5 x 105 células por tubo y se cultivaron en medio inductivo

60 condrogénico. Los cultivos se alimentaron dos veces por semana posteriormente durante un período total de tres

semanas. Los sedimentos de células se recuperaron y se usaron para el examen histológico o preparación para ARN total como se describe en los métodos. Ambas poblaciones de células STRO-1bri (A) y STRO-1dim (B) fueron capaces de formar sedimentos celulares que contenían células de tipo condrocito. El análisis de RT-PCR indicó que la población STRO-1bri (SB) demostró niveles más altos de los genes asociados al cartílago colágeno tipo X y

5 agrecano en comparación con la población de células STRO-1dim (SD) (C).

Figura 6. Las células STRO-1Bri inducen la proliferación de células STRO-1dim . Las suspensiones celulares individuales de MPC de médula ósea expandida ex vivo se prepararon mediante tratamiento con tripsina/EDTA. Las células se tiñeron con el anticuerpo STRO-1 y se clasificaron en poblaciones de STRO-1dim o poblaciones de células 10 cultivadas que expresan STRO-1bri como se describe en la Figura 1. Las células se marcaron con CFSE como se describe en los métodos. Se utilizaron células sin marcar para establecer un control negativo (autofluorescencia). Se usó Colcemid® (100 ng/ml) para inhibir la división celular y proporcionó un índice de etiquetado de entrada (Generación 0). STRO-1bri sin marcar se añadieron posteriormente de nuevo a las células STRO-1dim marcadas con CFSE a una relación de (A) 0 células STRO-1bri: 1 x 105 células STRO-1dim (0 %); (B) 0,05 x 105 células STRO-1bri: 15 0,95 x 105 células STRO-1dim (5 %); (C) 0,1 x 105 células STRO-1bri: 0,9 x 105 células STRO-1dim (10 %); (D) 0,2 x 105 células STRO-1bri: 0,8 x 105 células STRO-1dim (20 %); (E) 0,5 x 105 células STRO-1bri: 0,5 x 105 células STRO1dim (50 %). Las mezclas adicionales se cultivaron durante un período de 7 días, se recogieron y se analizaron por citometría de flujo como se describe en los métodos. La proliferación celular se analizó usando el ModFit LT para win 32 (Versión 2.0). Se descubrió que las células STRO-1bri (R1) estimulaban la proliferación de células STRO-1dim de

20 una manera dependiente de la dosis.

Figura 7. Las citocinas y los agentes osteotrópicos aumentan el número de células STRO-1bri en cultivo. Los cultivos establecidos de MPC se cultivaron en medio basal complementado con FCS al 10 % (A), o un rango de factores, incluyendo 1 x 10-8 1α,25-dihidroxivitamina D3 (1,25D) (B), 10 ng/ml Factor de crecimiento derivado de

25 plaquetas (PDGF) (C), 10 ng/ml Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (D); 10 ng/ml de interleucina-1β (IL-1β (E) y 30 ng/ml de factor derivado del estroma 1-alfa (SDF-1α) (F), durante 5 días, se tiñeron con STRO-1 mAb y se analizaron como se describe anteriormente. Se encontró que estos factores aumentan el número de MPC STRO-1bri . Los resultados que se muestran son un ejemplo representativo de 3 experimentos independientes.

30 Figura 8. Ratas atímicas sin pelo se sometieron a ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) y se les inyectó 48 horas más tarde con solución salina, 1 x 106 células Stro-1dim humanas, 1 x 106 células Stro-1bri humanas o 1 x 106 células mononucleares de médula ósea con depleción de Stro-1 humanas. Dos semanas más tarde, se sacrificaron los animales, se fijaron los tejidos cardiacos y se tiñeron concomitantemente con dos anticuerpos monoclonales: siendo el primero reactivo selectivamente con el antígeno Ki67 de rata, pero no de

35 humano, y siendo el segundo reactivo con el marcador de cardiomiocitos troponina I. Se detectaron células teñidas duales, indicativas de la proliferación de cardiomiocitos de rata, mediante técnica de inmunoperoxidasa. Los animales que recibieron 1 x 106 células humanas Stro-1bri demostraron 2,5-5 veces mayor número de cardiomiocitos de rata en proliferación en comparación con los animales de control que recibieron solución salina o 1 x 106 células humanas Stro-1dim (p <0,05).

40 Figura 9. A ratas atímicas sin pelo se les inyectó por vía subcutánea células tumorales de glioblastoma de rata, que secretan constitutivamente VEGF. Dos semanas después, las ratas recibieron inyecciones intra-tumorales con solución salina, 0,5 x 106 células Stro-1dim humanas o 0,5 x 106 células Stro-1bri humanas. Una semana más tarde, se sacrificaron los animales, se fijaron los tejidos tumorales y se tiñeron concomitantemente con dos anticuerpos

45 monoclonales: siendo el primero reactivo con el antígeno de actina alfa-músculo liso expresado por células de músculo liso y siendo el segundo reactivo con el antígeno vWF expresado por células endoteliales vasculares. Se detectaron estructuras teñidas duales, indicativas de arteriolas y arterias que contenían tanto endotelio como músculo liso, mediante técnica de inmunoperoxidasa. Los animales que recibieron 0,5 x 106 células humanas Stro

1bri

demostraron un número de arteriolas y arterias de 3,5-8 veces mayor en el sitio de inyección celular en los

50 tumores en comparación con los animales de control que recibieron solución salina o 1 x 106 células humanas de Stro-1dim (p <0,05). No se observaron diferencias en los sitios distales en los que se habían inyectado las células humanas.

Figura 10. IL-1β aumenta el potencial proliferativo de células expandidas a partir de MPC. Las células se

55 marcaron con CFSE como se describe en los métodos. Las células se cultivaron posteriormente en presencia de 10 ng/ml de IL-1β durante 5 días, se tiñeron con STRO-1 y ALK PHOS mAb y se analizaron como se ha descrito anteriormente. (A) Los cultivos no tratados (NT) y (B) tratados con IL-1β muestran un aumento en el número de células positivas para STRO-1bri/ALP. Este aumento en la expresión de STRO-1 va acompañado de un aumento en la proliferación celular como se muestra en (C) donde los cultivos no tratados han sufrido cuatro divisiones celulares,

60 mientras que (D) los cultivos tratados con IL-1β muestran un aumento en el número de divisiones celulares al

aumentar el número de células osteoprogenitoras STRO-1bri . Los resultados que se muestran son un ejemplo representativo de 3 experimentos independientes. También se obtuvieron resultados similares y se usaron 1,25D, PDGF-BB, TNF-α, IL-1 β y SDF-1 α para estimular las MPC.

5 Figura 11. IL-1β estimula la proliferación de MPC y mejora su potencial de formación de hueso en presencia del agente osteoinductor, dexametasona. La progenie humana (A) expandida ex vivo de MPC se sembró en placas de 96 pocillos a una densidad celular de 2.000 células/pocillo y se cultivó en α-MEM-10. Los cultivos se complementaron con IL-1β a las concentraciones indicadas y el número de células y la viabilidad se cuantificaron en d7 usando WST-1, como se describe en los métodos. IL-1β a una concentración de 0,01 ng/ml aumentó

10 significativamente el número de células a 136,6 ± 1,2 % de los cultivos de control no tratados (D, P = 0,000003, prueba t de Student). Se consiguió un efecto de meseta a concentraciones superiores a 0,1 ng/ml. Los valores representan las medias ± SEM de los cultivos por triplicado de cada concentración. (B y C) Se sembraron progenies expandidas ex vivo de MPC en placas de 24 pocillos a una densidad celular de 5 x 104/pocillo por triplicado, y se cultivaron en condiciones osteoinductivas, como se describe en los métodos. Las células se trataron con IL-1β a una

15 concentración de 10 ng/ml y los cultivos se "alimentaron" semanalmente con medio recién preparado que contenía IL-1β. La liberación de calcio libre de la matriz se logró tratando las capas de células adherentes en condiciones ácidas como se describe en los métodos. Las muestras se hicieron reaccionar con complejo de o-cresol-ftaleína y la reacción colorimétrica se leyó a 570 nm. La concentración absoluta de calcio se determinó de acuerdo con una curva estándar de calcio. Los resultados mostraron que la deposición mineral se aumentó en las células tratadas con IL-1β

20 (C) en comparación con las células no tratadas (B). El nivel de calcio en las células tratadas con IL-1β fue significativamente mayor que en las células no tratadas en la semana 4 (**P = 0,00009, prueba t de Student) y la semana 6 (**P = 0,00004, prueba t de Student) (D). Los resultados que se muestran son un ejemplo representativo de 3 experimentos independientes, utilizando células estromales derivadas de tres donantes diferentes.

25 Figura 12. IL-1β estimula la proliferación y MPC STRO-1bri , mientras que la dexametasona induce la expresión de la fosfatasa alcalina (ALP). Se sembraron cultivos establecidos de MPC humano en una placa de 24 pocillos a una densidad celular de 3 x 104/pocillo en medio completo complementado con (A) nada (NT), (B) 10 ng/ml de IL-1β o (C) 1 x 10-8 M de dexametasona y (D) 10 ng/ml de IL-1β y 1 x 10-8 M de dexametasona. Las células se cultivaron durante 21 días como se describe en los métodos. Los resultados sugieren que la acción mitógena de IL

30 1β sirve para aumentar el número de MPC STRO-1bri (B), que a su vez estimula la proliferación de las células STRO1dim (véase la Figura 6). Además, las MPC adquieren la expresión de ALP en respuesta al FCS y ascorbato-2-fosfato presente en el medio de crecimiento que se potencia en respuesta al glucocortico-esteroide, dexametasona (dex) (D). La acción combinada de IL-1β y dex sirve para potenciar la formación ósea como se ve en la Figura 11. Los experimentos se realizaron tres veces y se observó una tendencia similar en las MPC derivadas de tres donantes

35 diferentes.

Figura 13. Efecto del PDGF sobre formación ósea in vivo. Se cultivaron cultivos secundarios semi-confluentes de células expandidas ex vivo, derivadas de células de médula ósea clasificadas STRO-1bri/VCAM-1+, en presencia o ausencia de PDGF-BB (10 ng/ml) durante cinco días. Las suspensiones celulares individuales se generaron 40 mediante digestión con tripsina/EDTA, luego se incubaron con 40 mg de partículas de hidroxipapita/fosfato tricálcico (HA/TCP) para su implantación en ratones inmunocomprometidos como se describe en los métodos. Después de ocho semanas, los trasplantes cosechados se fijaron y se procesaron para su examen histológico. El análisis de la nueva formación de hueso se determinó utilizando el software Scion Imaging por área superficial (20 x) a partir de tres trasplantes repetidos (A). Los cultivos pretratados con PDGF-BB demostraron significativamente (*; p <0,05;

45 prueba t) más formación ósea ectópica en comparación con los cultivos de control no tratados. Se muestran imágenes típicas que representan huesos ectópicos teñidos con hematoxilina/eosina en secciones transversales representativas de trasplantes no tratados (B) y tratados con PDGF (C).

Figura 14. BMSSC expresan altos niveles de SDF-1. (A) Las preparaciones aisladas de MACS de BMMNC STRO

50 1+ se dividieron en diferentes subconjuntos de STRO-1 de acuerdo con las regiones, STRO-1bright y STRO-1dull usando FACS. El ARN total se preparó a partir de cada subpoblación STRO-1 y se usó para construir una biblioteca de hibridación de sustracción de STRO-1bright como se describe en "Materiales y métodos". (B-C) Filtros de nitrocelulosa repetidos, que se han representado con productos representativos de PCR amplificados a partir de clones bacterianos transformados con ADNc sustraído de STRO-1bright. Los filtros se sondaron después con ADNc

55 sustraído de STRO-1bright (B) o STRO-1dull (C) etiquetado con trifosfato de desoxicitidina [32P] (dCTP). Las flechas indican la expresión diferencial de 1 clon que contiene un fragmento de ADNc correspondiente a SDF-1 humano. (D) Análisis de transcriptasa inversa (RT) -PCR que demuestra la expresión relativa de SDF-1 y transcritos de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) en ARN total preparado a partir de nuevas poblaciones de STRO1 de BMMNC aisladas por MACS/FACS antes del cultivo. pb indica par de bases.

Figura 15. Las BMSSC inmaduras expresan niveles más altos de SDF-1 que las poblaciones más maduras.

(A) El gráfico de puntos representa el análisis citométrico de flujo doble de suspensiones de células individuales de BMSSC expandidas ex vivo que examinan la expresión de la superficie celular de los antígenos STRO-1 y AP después del cultivo en medios estándar. Las diferentes subpoblaciones clasificadas STRO-1/AP se aislaron por 5 FACS de acuerdo con las regiones de clasificación R1, R2, R3 y R4. (B) El gráfico representa el análisis semicuantitativo de RT-PCR de la expresión relativa de SDF-1 en comparación con el gen de mantenimiento GAPDH, en ARN total preparado a partir de poblaciones de BMSSC cultivadas no clasificadas y aisladas por FACS de acuerdo con su expresión en la superficie celular de STRO-1 y AP. La población de precursores osteogénicos más inmaduros (STRO-1+/AP-) expresó niveles más altos que los preosteoblastos (STRO-1+/AP+), seguido de

10 poblaciones más maduras de osteoblastos (STRO-1-/AP+) y osteocitos (STRO-1-/AP-). Los datos representan los valores medios ± errores estándar de 2 experimentos independientes, utilizando cultivos de BMSSC secundarios establecidos a partir de 2 donantes de médula ósea sanos diferentes.

Figura 16. El SDF-1 se reduce por las BMSSC después de la osteoinducción. (A) RT-PCR semicuantitativa de la

15 expresión de SDF-1 relativa a GAPDH por BMSSC cultivadas en presencia de medios osteoinductivos a lo largo del tiempo. Los valores medios ± errores estándar representan 4 experimentos independientes. Las condiciones osteoinductivas frente a los controles correspondientes se analizaron usando la prueba t pareada en cada punto de tiempo con un valor de significación (*) de P < 0,05. (B) El gráfico de puntos representa el análisis de citometría de flujo de doble color de las suspensiones de células individuales de BMSSC expandidas ex vivo, cultivadas durante

20 48 horas en presencia de medios de inducción osteogénicos, en base a la expresión de superficie celular de antígenos de STRO-1 y fosfatasa alcalina.

Figura 17. Las BMSSC expresan receptores de SDF-1 funcionales. (A) Análisis de RT-PCR que demuestra la expresión relativa de transcritos de CXCR4 y GAPDH en ARN total aislado de cultivos de BMSSC primarios o la 25 línea celular de osteosarcoma humano, MG63. (B) Las suspensiones de células individuales de BMSSC cultivadas se incubaron con un anticuerpo CXCR4 anti-humano de ratón o el anticuerpo control emparejado con isotipo, 1A6.11 seguido de un anticuerpo conjugado con FITC IgG1 de cabra anti-ratón. Un histograma representativo representa el nivel de expresión de la superficie celular de CXCR4 (línea continua) por las BMSSC en relación con las muestras de control (línea discontinua) según lo evaluado mediante análisis de citometría de flujo. (C) El gráfico muestra los

30 niveles de calcio intracelular medidos en cultivos primarios de BMSSC a lo largo del tiempo después de la adición de SDF-1α recombinante humano (30 ng/ml).

Figura 18. La expresión forzada de SDF-1 por las BMSSC aumenta su potencial osteogénico. (A) La línea de empaquetamiento retroviral PT67 se usó para transducir cultivos de BMSSC secundarios, derivados de 3 aspirados 35 de médula ósea diferentes, con una construcción pLNCX2 que contenía ADNc de SDF-1 humano o vector en solitario. Se generaron BMSSC de alta expresión de SDF-1 derivativas de múltiples colonias estables y líneas de control correspondientes después de la selección de G418. Las muestras triplicadas del sobrenadante de cultivo tisular se evaluaron para determinar los niveles de SDF-1α usando un kit ELISA disponible comercialmente. Los datos representan los valores medios ± errores estándar generados a partir de 3 diferentes líneas celulares de 40 BMSSC de alta expresión de SDF-1 diferentes frente a los controles correspondientes. (B) Las suspensiones de células individuales de cada una de las líneas de BMSSC transducidas se mezclaron con partículas de hidroxiapatita (HA/TCP) y luego se implantaron por vía subcutánea en ratones NOD/SCID. Las imágenes representan secciones transversales de trasplantes cosechados de 8 semanas de hueso nuevo (b) formados por BMSSC (SDF-1) de alta expresión de SDF-1 y líneas celulares de control (LNCX2) teñidas con hematoxilina y eosina (x 200). Las imágenes 45 se capturaron con un microscopio óptico Olympus BX50 (Olympus, Tokio, Japón) equipado con una cámara digital Olympus D11. Ampliación x200. (C) Cada gráfico representa una línea de BMSSC de alta expresión de SDF-1 diferente y la correspondiente línea celular de control derivada de 3 donantes de médula ósea diferentes. El nivel de formación de hueso nuevo se expresa como un porcentaje del área superficial total del tejido analizada a partir de 12 secciones de tejido representativas, utilizando el software Scion Imaging. Los datos representan los valores medios

50 ± errores estándar de trasplantes duplicados. Las diferencias estadísticas (*) de P < 0,05 entre las líneas de BMSSC de alta expresión de SDF-1 y los controles correspondientes se determinaron utilizando la prueba de t no apareada.

Figura 19. La expresión forzada de SDF-1 por las BMSSC mejora la supervivencia celular. (A) Los estudios de proliferación se realizaron colocando en placas BMSSC de alta expresión de SDF-1 y líneas celulares de control de 55 vectores en pocillos triplicados a una densidad de 5 x 103 células/pocillo en placas de 96 pocillos en medio de crecimiento regular durante 5 días. Las suspensiones de células individuales se prepararon luego mediante digestión con tripsina/EDTA y se contaron para evaluar el número total de células. (B) Se establecieron cultivos paralelos en presencia de interleucina 4 (IL-4; 30 ng/ml), y el porcentaje de células apoptóticas se midió mediante el uso de exclusión de azul de tripano. (C) El histograma representa el nivel de tinción de anexina V de la superficie celular 60 (línea continua) por líneas celulares de control en comparación con el anticuerpo de control emparejado con isotipo

(línea discontinua) cultivado en presencia de IL-4. Se muestra una imagen representativa de la intensidad de la tinción de fluorescencia en células vivas in situ (x 100). (D) El histograma representa el nivel de tinción de anexina V de la superficie celular (línea continua) mediante líneas de BMSSC de alta expresión de SDF-1 en comparación con el control de isotipo coincidente (línea discontinua) cultivado en presencia de IL-4. Se muestra una imagen

5 representativa de la intensidad de la tinción de fluorescencia en células vivas in situ (x 100). Los datos representan los valores medios ± errores estándar de los experimentos por triplicado. Las diferencias estadísticas (*) de P < 0,05 entre las líneas de BMSSC de alta expresión de SDF-1 y los controles correspondientes se determinaron utilizando la prueba de t no apareada.

10 Figura 20. SDF-1 promueve el crecimiento y la supervivencia de UFC-F. Se enumeró el número total de colonias UFC-F derivadas de BMMNC STRO-1bright aisladas por MACS/FACS colocadas en placas en medio libre de suero en presencia de diferentes combinaciones de citocinas. Se usaron PDGF-BB humano recombinante, SDF-1α y αinterferón 2a a las concentraciones óptimas de 5 ng/ml, 30 000 IU/ml y 30 ng/ml, respectivamente. Los datos representan los valores medios ± errores estándar de los pocillos por triplicado. Se obtuvieron resultados similares

15 mediante el uso de 3 aspirados diferentes de médula ósea. La significación estadística (P <0,01) se determinó mediante el uso de ANOVA unidireccional para todos los tratamientos. La prueba de Fisher se usó entonces para determinar las diferencias entre todos los grupos. Se encontraron diferencias significativas (P <0,05) entre todos los tratamientos en comparación con PDGF-BB en solitario (*), y PDGF + IFN (interferón) frente a PDGF + SDF-1 + IFN (**) con una significancia de P <0,05.

20 Figura 21. SDF-1 protege la formación de UFC-F contra los efectos apoptóticos de IFN-alfa de una manera dependiente de la dosis. Las células mononucleares de médula ósea humanas seleccionadas por MACS STRO-1 se pusieron en placas en medios privados de suero en presencia de PDGF (5 ng/ml) en solitario o PDGF e IFN-alfa (30,000 i.u./ml) o PDGF e IFN-alfa y SDF-1 (0,1-100 ng/ml). Después de 14 días de cultivo, las placas se fijaron y se

25 tiñeron como se describe en los Métodos para la enumeración de colonias de UFC-F.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han realizado el descubrimiento sorprendente de que la quimiocina SDF-1 juega un papel 30 en la proliferación, la supervivencia y la capacidad osteogénica de las poblaciones inmaduras de BMSSC.

En consecuencia, la presente invención proporciona un método para potenciar la proliferación y/o supervivencia de células precursoras mesenquimales (MPC) o progenie derivadas de las mismas, comprendiendo el método exponer las MPC o progenie a SDF-1 o un análogo del mismo.

35 Como se usa en el presente documento, las MPC son células progenitoras no hematopoyéticas que son capaces de formar grandes cantidades de colonias de células multipotenciales.

En un ejemplo preferido de la presente invención, las MPC son positivas para al menos un marcador seleccionado 40 del grupo que consiste en STRO-1bright, VCAM-1bright, THY-1bright, CD146bright y STRO-2bright.

El término "bright", cuando se usa en el presente documento, se refiere a un marcador en una superficie celular que genera una señal relativamente alta cuando está marcada de forma detectable. Sin desear quedar limitado por la teoría, se propone que las células "bright" expresen más de la proteína marcadora diana (por ejemplo, el antígeno 45 reconocido por STRO-1) que otras células de la muestra. Por ejemplo, las células STRO-1bright producen una señal fluorescente mayor, cuando se marcan con un anticuerpo STRO-1 conjugado con FITC según lo determinado por el análisis FACS, que las células no bright (STRO-1dull/neg). Preferiblemente, las células "bright" constituyen al menos aproximadamente el 0,1 % de las células mononucleares de médula ósea más fuertemente marcadas contenidas en la muestra inicial. En otras realizaciones, las células "bright" constituyen al menos aproximadamente el 0,1 %, al 50 menos aproximadamente el 0,5 %, al menos aproximadamente el 1 %, al menos aproximadamente el 1,5 %, o al menos aproximadamente el 2 % de las células mononucleares de médula ósea más fuertemente marcadas contenidas en la muestra inicial. Preferiblemente, las células "bright" son células STRO-1bright VCAM-1bright, THY1bright, STRO-2bright y/o CD146bright. Como se analiza en el documento WO 01/04268, una subpoblación de células seleccionadas sobre la base de la intensidad de la etiqueta, tales como células STRO-1bright, tienen una mayor

55 proporción de MPC que subpoblaciones seleccionadas únicamente en una identificación positiva/negativa del marcador celular.

En un ejemplo preferido adicional de la presente invención, las MPC llevan al menos dos marcadores seleccionados del grupo de marcadores superficiales específicos para células precursoras mesenquimales que consisten en STRO60 1bri, LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-selectina, L-selectina, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29,

CD49d/CD29, CD29, CD18, CD61, beta-1 integrina, 6-19, trombomodulina, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, Leptina-R, (STRO-2 = Leptina-R), RANKL y CD146 o cualquier combinación de estos marcadores.

5 En un ejemplo preferido adicional de la presente invención, las MPC son negativas para al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en CD34, CD14, CD45, CBFA-1, colágeno tipo II, PPARγ2 y glicoforina A.

Los métodos para preparar poblaciones enriquecidas de MPC se describen en los documentos WO01/04268 y WO2004/085630.

10 En un contexto in vitro, las MPC raramente estarán presentes como una preparación absolutamente pura y generalmente estarán presentes con otras células que son células comprometidas específicas de tejido (TSCC). El documento WO01/04268 se refiere a la recolección de tales células de la médula ósea a niveles de pureza de aproximadamente el 0,1 % al 90 %. Los métodos de recolección alternativos pueden dar como resultado

15 proporciones de MPC que están presentes en niveles más bajos.

La población que comprende MPC a la que se aplica el método de la invención se puede extraer directamente de una fuente de tejido, o como alternativa, puede ser una población que ya se ha expandido ex vivo.

20 Por ejemplo, el método de la invención se puede aplicar a una población recolectada, no expandida, de MPC sustancialmente purificadas, que comprende al menos aproximadamente el 0,1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o el 95 % de las células totales de la población en la que están presentes. Este nivel puede conseguirse, por ejemplo, seleccionado células que son positivas para al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en STRO1bright, VCAM-1bright, THY-1bright, CD146bright y STRO-2bright.

25 Las MPC pueden derivarse de uno o más tipos de tejidos establecidos en los documentos WO01/04268 o WO2004/085630 concretamente, médula ósea, células de pulpa dentaria, tejido adiposo y piel, o quizás más ampliamente de tejido adiposo, dientes, pulpa dental, piel, hígado, riñón, corazón, retina, cerebro, folículos pilosos, intestino, pulmón, bazo, ganglio linfático, timo, páncreas, hueso, ligamento, médula ósea, tendón y músculo

30 esquelético.

La fuente preferida de tales células es humana, sin embargo, se espera que la invención también sea aplicable a animales, incluidos animales agrícolas tales como vacas, ovejas, cerdos y similares, animales domésticos tales como perros y gatos, animales de laboratorio tales como ratones, ratas, hámsteres y conejos o animales que se

35 usen para el deporte tales como los caballos.

El término "progenie" como se usa en el presente documento pretende referirse a células derivadas de MPC. La progenie pueden ser células precursoras o células totalmente diferenciadas (como las células óseas).

40 En una realización preferida, la progenie es una célula precursora.

Como se usa en el presente documento, una "célula precursora" derivada de una MPC es una célula comprometida parcialmente específica o específica para el tejido (TSCC) que divide y da lugar a células diferenciadas. Aunque una célula precursora está comprometida con una ruta de diferenciación, generalmente no expresa los marcadores de o

45 funciona como una célula madura, completamente diferenciada. Por lo tanto, las células precursoras dan lugar a tipos de células relacionadas, pero en su estado normal no generan una amplia variedad de tipos de células. Las células precursoras tienden a estar comprometidas con un tipo de linaje celular o tisular, sin embargo, pueden ser bipotenciales, es decir, capaces de diferenciarse adicionalmente en uno de dos tipos diferentes de células o tejidos.

50 Los ejemplos no limitantes de los linajes a los que pueden comprometerse las células precursoras incluyen células precursoras de hueso; progenitores de hepatocitos, que son pluripotentes para las células epiteliales del conducto biliar y los hepatocitos; células restringidas neurales, que pueden generar precursores de células gliales que progresan a oligodendrocitos y astrocitos; precursores neuronales que progresan a neuronas; precursores para músculo cardiaco y cardiomiocitos, líneas celulares beta pancreáticas que secretan insulina sensibles a la glucosa.

55 Otras células precursoras comprometidas incluyen, pero sin limitación, condrocitos, odontoblastos, productores de dentina y condrocitos, y células precursoras de las siguientes: células epiteliales del pigmento de la retina, fibroblastos, células de la piel tales como queratinocitos, células dendríticas, células del folículo piloso, células epiteliales del conducto renal, células de músculo liso y musculoesqueléticas, progenitores testiculares, células endoteliales vasculares, células de tendón, ligamento, cartílago, adipocito, fibroblasto, estroma de médula, músculo

60 cardiaco, músculo liso, músculo esquelético, pericito, vascular, epitelial, glial, neuronal, astrocito y oligodendrocito.

Las células precursoras también incluyen aquellas que conducen específicamente al tejido conectivo, incluyendo los tejidos conectivos adiposos, areolares, óseos, cartilaginosos, elásticos y fibrosos.

En un ejemplo preferido de la presente invención, las células precursoras son células precursoras de hueso.

5 Como se usa en el presente documento, una "célula precursora de hueso" es cualquier célula que sea capaz de diferenciarse o expandirse en una célula osteoblástica. Las células precursoras óseas preferidas incluyen células osteoprogenitoras y células preosteoblásticas.

10 La proliferación mejorada realizada por el método de la invención puede dar como resultado aumentos en los números de MPC mayores del 10, 20, 30, 40 o el 50 % con respecto a los controles no estimulados. Como alternativa, los aumentos pueden ser de 1, 2 o más veces.

En un ejemplo preferido de la presente invención, el análogo de SDF-1 es un ligando que activa la señalización de

15 CXCR4. El análogo de SDF-1 puede ser, por ejemplo, un fragmento biológicamente activo, una variante o derivados de SDF-1 de origen natural.

En un ejemplo preferido adicional de la presente invención, el análogo de SDF-1 se selecciona del grupo que consiste en la proteína de recubrimiento de VIH-1 gp120, AMD3100 (AnorMED Inc, British Columbia, Canadá) y

20 ALX40-4C (Allelix Biopharmaceuticals Inc, Canadá).

En un ejemplo preferido adicional de la presente invención, las MPC o la progenie derivada de las mismas también están expuestas a un factor estimulador seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento derivado de plaquetas exógeno (PDGF), factor de células madre (SCF), ligando de ajuste 3 (FL), factor estimulador de colonias

25 de granulocitos (G-CSF), interleucina-3 (IL-3), interleucina-6 (IL-6), 1α,25-dihidroxivitamina D3 (1,25D), factor de necrosis tumoral α ( TNF-α) e interleucina-1β (IL-1β).

Generalmente, se contempla que el método de la invención tenga aplicabilidad en el cultivo in vitro de células, por ejemplo, en relación con cultivos expandidos recientemente recolectados o ex vivo, sin embargo, la invención

30 también puede tener aplicabilidad cuando las MPC o la progenie derivada de las mismas están in situ en un sitio de tejido corporal y SDF-1 exógeno o un análogo del mismo se entrega al sitio. Tal entrega tipo puede ser adecuada, sin embargo, la entrega espaciada temporalmente puede proporcionar un beneficio acelerado o mayor.

El SDF-1 exógeno o análogo del mismo, se puede administrar al sujeto en la forma de un polipéptido o en forma de

35 un ácido nucleico que se puede expresar para producir un polipéptido. Por ejemplo, el SDF-1 exógeno o análogo del mismo se puede administrar en forma de una composición que contiene ácido nucleico o en forma de una célula huésped que se ha modificado genéticamente para sobreexpresar el SDF-1 o análogo del mismo.

En el contexto de la administración in vivo, también podría ser deseable administrar (al mismo tiempo que el SDF-1 o

40 análogo del mismo) una composición que comprende MPC o progenie derivada de las mismas. Por ejemplo, en el caso de una lesión en un hueso, un músculo cardíaco, un tejido vascular o células endoteliales, la progenie que se suministra está preferiblemente comprometida, al menos parcialmente, con un tipo de célula relevante (por ejemplo, un osteoblasto, un cardiomiocito o un células endoteliales). Estos pueden proporcionarse como parte de un cultivo de células precursoras mixtas o en una forma más purificada, por ejemplo, clasificándose para marcadores que se

45 sabe que están presentes en el tipo de célula comprometida específica del tejido. Como alternativa o adicionalmente, la composición que se suministra puede incluir uno o más factores estimuladores de la diferenciación para diferenciar MPC presentes en la composición o presente in situ en el sitio objetivo para uno o más tipos de tejido de interés.

50 La presente invención también proporciona un método para desarrollar una población celular comprometida específica de tejido, comprendiendo el método exponer las MPC o la progenie derivada de las mismas a SDF-1 exógeno o un análogo del mismo para potenciar la proliferación y/o la supervivencia de las MPC o progenie, y someter a la población proliferada a condiciones que desvían la diferenciación de las MPC o progenie derivada de las mismas a un tipo de tejido específico.

55 El tipo de tejido puede seleccionarse del grupo que consiste en músculo cardiaco, un tejido vascular, osteoblasto, odontoblasto, osteocito, célula de revestimiento óseo y célula endotelial. Las condiciones ilustradas para el desarrollo in vitro de estos tipos de tejidos y para la promoción in vivo de estos tipos de tejidos serán conocidas por los expertos en la técnica.

El método anterior puede aplicarse a la generación o reparación de músculo esquelético, músculo cardíaco, hueso, dientes o tejido vascular. En particular, el método se puede aplicar a la generación o reparación de células o tejidos seleccionados del grupo que consiste en músculo cardiaco, cardiomiocitos, condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, odontoblastos, condrocitos productores de dentina, osteocitos, células de revestimiento óseo, células de músculo

5 esquelético, células endoteliales vasculares, estroma de médula, osteoclastos y estroma de apoyo hemopoyético, músculo cardiaco, músculo esquelético, células endoteliales y una célula vascular.

En un ejemplo particular, la presente invención proporciona un método para generar hueso ex vivo, comprendiendo el método exponer las MPC o la progenie derivada de las mismas a SDF-1 exógeno o un análogo del mismo para

10 potenciar la proliferación y/o la supervivencia de las MPC o progenie, y someter a la población proliferada a condiciones que desvían la diferenciación de las MPC a las células precursoras de hueso, o a las condiciones que desvían la diferenciación de las células precursoras de hueso al hueso.

Las condiciones que favorecen la diferenciación de las MPC o las células precursoras de hueso derivadas de la

15 mismas al hueso pueden implicar, por ejemplo, el cultivo en αMEM complementado con FCS al 10 %, L-ascorbato-2fosfato 100 µM, dexametasona 10-7 M y fosfato inorgánico 3 mM. Se ha demostrado que estas condiciones inducen a las células estromales BM humanas a desarrollar una matriz ósea mineralizada in vitro (Gronthos et al., Blood. 84:4164-73, 1994).

20 En un ejemplo alternativo, el método puede implicar diferenciar las células precursoras de hueso en osteoblastos cultivando las células precursoras de hueso en presencia de colágeno de tipo I, fibrinógeno, fibrina, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, osteocalcina u osteonectina. En un ejemplo particular, las células precursoras de hueso se cultivan en presencia de colágeno de tipo I, fibrinógeno y fibrina. En un ejemplo alternativo, las células precursoras de hueso se cultivan en presencia de colágeno de tipo I, fibrinógeno, fibrina, osteocalcina y

25 osteonectina. En el contexto de este método, el colágeno tipo I, fibrinógeno, fibrina, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, osteocalcina u osteonectina puede usarse en solitario o en presencia de un factor de crecimiento. Se entenderá que cualquier combinación de los compuestos enumerados anteriormente en este párrafo se contempla por la presente invención.

30 La presente invención también proporciona una composición que comprende MPC aisladas o progenie derivada de las mismas y SDF-1 o un análogo del mismo.

En un ejemplo preferido, la composición comprende MPC sustancialmente purificadas o progenie, que comprenden al menos aproximadamente el 0,1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o el 95 % de las células totales de la

35 composición.

En un ejemplo preferido adicional, el SDF-1 o análogo del mismo está presente en la composición a una concentración de aproximadamente 0,1 nM-0,1 M, 0,1 nM-0,05 M, 0,05 nM-15 µM o 0,01 nM-10 µM.

40 La presente invención también proporciona una MPC o célula precursora derivada de la misma que se ha modificado genéticamente para sobreexpresar SDF-1.

En un ejemplo, la MPC o célula precursora derivada de la misma se transfecta con un polinucleótido que codifica SDF-1.

45 En otro ejemplo, el genoma de la MPC o célula precursora derivada de la misma se modifica para producir una sobreexpresión de la proteína SDF-1. En un ejemplo, se modifica una región reguladora del gen SDF-1 de la MPC o célula precursora derivada de la misma para producir una sobreexpresión de la proteína SDF-1.

50 La presente invención también proporciona una composición que comprende una población de MPC transfectadas de la presente invención.

La composición de la presente invención puede comprender además uno o más factores estimuladores adicionales. Por ejemplo, el factor estimulador adicional puede seleccionarse del grupo que consiste en PDGF, SCF, FL, G-CSF,

55 IL-3, IL-6, 1,25D, TNF-α e IL-1β.

La presente invención incluye sistemas de administración en los que una composición de la presente invención (por ejemplo, una composición que comprende MPC modificada genéticamente) se administra por vía sistémica o local para colonizar un tipo seleccionado de tejido, por ejemplo, un tejido lesionado. Por ejemplo, una composición de la 60 presente invención se puede inyectar directamente en el tejido diana. El sitio de inyección está preferiblemente en un

sitio de lesión, o cerca del tejido dañado. Como alternativa, la MPC genéticamente modificada que expresa SDF-1 y un ligando o receptor recombinante específico se puede introducir en el sujeto y luego las células dirigidas a un tejido diana deseado induciendo la expresión del compañero de unión análogo en el tejido diana.

5 Se apreciará que las composiciones de la presente invención son útiles para mejorar la supervivencia de MPC injertadas o células derivadas de las mismas usadas para reparar o regenerar tejido, por ejemplo, cardiomiocitos que experimentan apoptosis debido a una lesión relacionada con isquemia o reperfusión; condrocitos después de una lesión traumática del hueso, ligamento, tendón o cartílago; o hepatocitos en un hígado cirrótico inducido por alcohol.

10 En un ejemplo particular, las composiciones de la invención son útiles para potenciar la supervivencia de MPC injertadas o células derivadas de las mismas usadas para reparar o regenerar huesos. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden comprender además una matriz tal como gelatina absorbible, celulosa o colágeno. La composición puede usarse en forma de una esponja, tira, polvo, gel o banda.

15 La presente invención también proporciona un método para generar hueso en un sujeto, comprendiendo el método exponer la MPC o la progenie derivada de la misma en el sujeto a SDF-1 exógeno o un análogo del mismo.

La presente invención también proporciona un método para generar huesos en un sujeto, comprendiendo el método administrar una composición de la invención al sujeto en el sitio de generación de hueso deseado.

20 Este método se puede usar, por ejemplo, en la reparación de huesos, y como tal, se puede introducir una composición de la presente invención y, opcionalmente, un soporte adecuado en un sitio que requiere formación de hueso. Por lo tanto, por ejemplo, los defectos esqueléticos causados por una lesión ósea o la eliminación de secciones de hueso infectadas con un tumor pueden repararse mediante la implantación de composiciones de la

25 presente invención en el sitio del defecto. Dichos defectos incluyen, por ejemplo, defectos óseos segmentarios, no uniones, uniones defectuosas o uniones retrasadas, quistes, tumores, necrosis o anomalías en el desarrollo. Otras condiciones que requieren el aumento óseo, tales como la reconstrucción articular, la reconstrucción cosmética o la fusión ósea, tal como la fusión espinal o la fusión articular, se pueden tratar en un individuo mediante la administración en el sitio de hueso que necesita aumento, de una composición de la presente invención. La

30 composición puede estar en combinación con, por ejemplo, un biopolímero reabsorbible tal como gelatina, celulosa o medio a base de colágeno, o en un vehículo de cerámica de fosfato cálcico hasta una extensión suficiente para aumentar la formación ósea a partir de los mismos. El biopolímero reabsorbible puede estar en forma de un polvo o esponja, y es preferiblemente una gelatina derivada de la piel porcina. El vehículo cerámico puede estar en forma de partículas o puede tener la forma de un implante tridimensional estructuralmente estable. El implante tridimensional

35 estructuralmente estable puede ser, por ejemplo, un cubo, cilindro, bloque o una forma anatómica apropiada. La composición también puede contener uno o más componentes que se degradan, reabsorben o remodelan a velocidades que se aproximan a la formación de un nuevo tejido. Para métodos y técnicas apropiadas, véase Caplan et al. en Patente de Estados Unidos 5.226.914 y Patente de Estados Unidos 5.837.539.

40 Este método también puede usarse para ayudar a anclar dispositivos protésicos. Por lo tanto, la superficie de un dispositivo protésico tal como los usados en el reemplazo de cadera, rodilla y hombro, se puede revestir con una composición de la presente invención antes de la implantación. La MPC o progenie derivada de la misma en la composición puede entonces diferenciarse en células osteogénicas para acelerar así el proceso de crecimiento óseo e incorporación del dispositivo protésico (véase Caplan et al. en la patente de Estados Unidos 5.226.914 y patente

45 de Estados Unidos 5.837.539).

Los métodos anteriores pueden comprender además administrar al individuo al menos un factor bioactivo que induce

o acelera la diferenciación de MPC o progenie derivada de la misma en el linaje osteogénico. El factor bioactivo puede ser, por ejemplo, un glucocorticoide sintético, tal como dexametasona, o una proteína morfogénica ósea, tal

50 como BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-6 o BMP-7. La proteína morfogénica ósea puede estar en un vehículo líquido o semisólido adecuado para inyección intramuscular, intravenosa, intramedular o intraarticular.

La presente invención también proporciona un método para generar tejido vascular en un sujeto, comprendiendo el método exponer la MPC o la progenie derivada de la misma en el sujeto a SDF-1 exógeno o un análogo del mismo.

55 La presente invención también proporciona un método para generar tejido vascular en un sujeto, comprendiendo el método administrar una composición de la invención al sujeto en el sitio de generación de tejido vascular deseado.

La presente invención también proporciona un método para generar músculo cardiaco o músculo liso en un sujeto, 60 comprendiendo el método exponer la MPC o la progenie derivada de la misma en el sujeto a SDF-1 exógeno o un

análogo del mismo.

La presente invención también proporciona un método para generar músculo cardiaco o músculo liso en un sujeto, comprendiendo el método administrar una composición de la invención al sujeto en el sitio de generación de 5 músculo cardiaco o músculo liso.

A lo largo de esta memoria descriptiva, la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa indicada, o un grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro elemento, numero entero o etapa, o grupo

10 de elementos, números enteros o etapas.

Factor derivado del estroma-1 y análogos del mismo.

El factor derivado del estroma-1 (SDF-1) también se conoce en la técnica como el ligando del motivo de quimiocina

15 CXC 12 (CXCL12) y el factor estimulador del crecimiento de linfocitos pre-B (PBSF). Los factores derivados de células estromales 1-alfa y 1-beta son pequeñas citocinas que pertenecen a la familia intercrina, cuyos miembros activan los leucocitos y con frecuencia son inducidas por estímulos proinflamatorios tal como el lipopolisacárido, el TNF o la IL-1. Los intercrinas se caracterizan por la presencia de 4 cisteínas conservadas que forman 2 enlaces disulfuro. Se pueden clasificar en 2 subfamilias. En la subfamilia CC, los residuos de cisteína están adyacentes entre

20 sí. En la subfamilia CXC, están separados por un aminoácido intermedio. Las proteínas SDF-1 pertenecen al último grupo.

Como se ha indicado anteriormente, hay al menos dos isoformas conocidas de SDF-1 conocidas como SDF-1 alfa y SDF-1 beta. Shirozu et al. (Genomics, 28:495, 1995) identificaron clones genómicos SDF-1 humanos y mostraron

25 que las isoformas alfa y beta son una consecuencia del corte y empalme alternativo de un único gen. La forma alfa se deriva de los exones 1-3 mientras que la forma beta contiene una secuencia adicional del exón 4. El gen humano completo tiene aproximadamente 10 kb y se encuentra en el cromosoma 10q11.1.

A menos que se establezca lo contrario, el término "SDF-1", como se usa en el presente documento, se refiere al

30 menos a la isoforma alfa y/o beta. Este término también incluye fragmentos, variantes y derivados biológicamente activos de las moléculas de origen natural que mantienen al menos alguna actividad de tal forma que son útiles para los métodos de la invención. En una realización preferida, la invención se refiere al uso de la isoforma alfa.

Se conoce la secuencia aminoacídica de una serie de proteínas alfa y/o beta SDF-1 de mamífero nativas diferentes,

35 incluyendo humanas, de rata, de ratón y de gato (véase, por ejemplo, Shirozu et al., Genomics, 28:495, 1995; Tashiro et al., Science 261:600, 1993; Nishimura et al., Eur. J. Immunogenet. 25:303, 1998); y N.º d acceso al GenBank AF189724). La secuencia de aminoácidos de la isoforma alfa humana se proporciona como la SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos de la isoforma beta humana se proporciona como SEQ ID NO: 2. Una forma preferida de la proteína SDF-1 es una proteína SDF-1 nativa purificada que tiene una secuencia de aminoácidos

40 idéntica a una de las proteínas SDF-1 de mamífero anteriores, u ortólogos de las mismas obtenidas de otras especies.

Los fragmentos biológicamente activos de SDF-1 correspondientes a uno o más motivos y/o dominios particulares o a tamaños arbitrarios, por ejemplo, de al menos 5, 10, 25, 50 o 75 aminoácidos de longitud están dentro del alcance

45 de presente invención. Los fragmentos pueden producirse (de forma recombinante o mediante síntesis química) y ensayarse para identificar aquellos fragmentos de peptidilo que pueden funcionar como análogos de la proteína SDF-1 nativa.

Las variantes de SDF-1 tienen una secuencia peptídica que difiere de una proteína SDF-1 nativa en uno o más

50 aminoácidos. La secuencia peptídica de tales variantes puede presentar una deleción, adición o sustitución de uno o más aminoácidos de una proteína SDF-1 nativa. Las inserciones de aminoácidos son preferiblemente de aproximadamente 1 a 4 aminoácidos contiguos, y las deleciones son preferiblemente de aproximadamente 1 a 10 aminoácidos contiguos.

55 Las variantes de SDF-1 se pueden generar a través de diversas técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, las variantes de SDF-1 se pueden hacer por mutagénesis, tal como introduciendo mutaciones puntuales discretas, o por truncamiento. La mutación puede dar lugar a una variante de SDF-1 que tiene sustancialmente la misma actividad funcional de la proteína SDF-1 nativa. En particular, se pueden generar formas agonistas de la proteína que expresan constitutivamente una o más de las actividades funcionales de una proteína SDF-1 nativa. Otras variantes

60 de la proteína SDF-1 que se pueden generar incluyen aquellas que son resistentes a la escisión proteolítica, como,

por ejemplo, debido a mutaciones que alteran las secuencias diana de la proteasa. Si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un péptido da como resultado una variante que tiene una o más actividades funcionales de una proteína SDF-1 nativa se puede determinar fácilmente probando la variante para una actividad funcional de la proteína SDF-1 nativa, por ejemplo, probando la capacidad de la variante para estimular la proliferación de MPC

5 como se describe en el presente documento.

En la técnica se conocen una amplia gama de técnicas para cribar productos génicos de bibliotecas combinatorias hechas por mutaciones puntuales o truncamiento, y para cribar bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una cierta propiedad. Dichas técnicas serán generalmente adaptables para el cribado rápido de las genotecas

10 generadas por la mutagénesis combinatoria de las variantes del gen SDF-1. Las técnicas más utilizadas para el cribado de genotecas grandes típicamente comprenden clonar la genoteca en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento relativamente fácil del vector que codifica el gen cuyo producto fue detectado.

15 Actualmente, el SDF-1 es el único agonista de origen natural conocido del receptor transmembrana CXCR4 siete acoplado en G (también conocido en la técnica como fusina o LESTR). Además, se ha demostrado que las MPC expresan el receptor CXCR4 (molécula humana proporcionada como SEQ NO: 3). Por lo tanto, los efectos biológicos de SDF-1 descritos en el presente documento son medidos con más probabilidad a través del receptor de

20 quimiocinas CXCR4. Por consiguiente, los análogos de SDF-1 útiles para los métodos de la invención también pueden ser agonistas de CRCX4. Sin embargo, la presente invención no excluye la posibilidad de que las MPC expresen un receptor distinto de CXCR4 a través del cual las actividades biológicas descritas en el presente documento están mediadas total o conjuntamente con otro receptor tal como CRCX4.

25 Como se usa en el presente documento, la expresión "análogo de SDF-1" se refiere a cualquier molécula que esté relacionada estructural o funcionalmente con SDF-1 y sea adecuada para su uso en los métodos de la invención. Preferiblemente, el análogo de SDF-1 es un antagonista de la unión de SDF-1 a CXCR4. Los análogos de SDF-1 incluyen fragmentos, variantes y derivados biológicamente activos de SDF-1 de origen natural, como se ha descrito anteriormente.

30 Los ejemplos de análogos de SDF-1 incluyen moléculas descritas en los documentos US 20050065064, US 20050059584, y Pelus et al., Exp. Hematol. 33:295, 2005. Además, la evidencia sugiere que la proteína de recubrimiento de VIH-1 gp120 actúa como un análogo de SDF-1 (Tran et al., J. Neuroimmunol. 160,68 2005). Además, los estudios han demostrado que AMD3100 (AnorMED Inc, British Columbia, Canadá) y ALX40-4C (Allelix

35 Biopharmaceuticals Inc, Canadá) pueden actuar como agonistas del receptor CXCR4 (Zhang et al., J. Biol. Chem. 277,24515 2002).

Se pueden hacer una diversidad de análogos de proteína SDF-1 peptídicos o miméticos (incluyendo peptidomiméticos) utilizando técnicas convencionales. Por ejemplo, se pueden hacer anticuerpos o fragmentos de

40 anticuerpos contra receptores (tales como CXCR4) que se unen a SDF-1, y después se criban para identificar aquellos que actúan como análogos de una proteína SDF-1 nativa. Además, los análogos de SDF-1 pueden identificarse seleccionando bibliotecas de otras moléculas (tales como moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas) identificando aquellas que se unen a receptores de proteína SDF-1 tales como CXCR4. Los identificados pueden caracterizarse además como agonistas en función del tipo de señales que inducen o se previenen en las células.

45 Los análogos de SDF-1 útiles para los métodos de la invención también pueden identificarse y/o verificarse usando el Ensayo CXCR4 Receptor Agonist Redistribution™(BioImage A/S, Soeberg, Dinamarca).

Otros ejemplos de análogos de SDF-1 son compuestos que contienen estructuras correspondientes a diversas

50 regiones o porciones de SDF-1. En una realización, el análogo comprende una región N-terminal y una región Cterminal unidas entre sí por medio de un enlazador. En otras realizaciones, los residuos de aminoácidos de SDF-1 se ciclan, por ejemplo, por eterificación de residuos de lisina y serina o por otros medios conocidos en la técnica. En aún otras realizaciones, el análogo de SDF-1 comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de quimiocinas de tipo silvestre pero con una o más de las cisteínas reemplazadas con otro aminoácido. Otras

55 realizaciones incluyen análogos de quimiocina que comprenden una región N-terminal, una región interna que contiene hasta tres láminas β antiparalelas, una región C-terminal que contiene una estructura α-helicoidal, una combinación de las regiones en el extremo N y C unidas entre sí directamente, una combinación de una región Nterminal e interna, o una combinación de una región interna y una región C-terminal, o finalmente una combinación de regiones N-terminal, interna y C-terminal. Las regiones seleccionadas de las regiones N-terminal, interna y C

60 terminal pueden tener de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 41, o 45 aminoácidos de

longitud.

Los análogos de SDF-1 útiles para los métodos de la invención pueden incluir derivados tales como derivados hidroximetílicos C-terminales, derivados modificados con O (por ejemplo, hidroximetil bencil éter C-terminal),

5 derivados modificados en N-terminal que incluyen amidas sustituidas tales como alquilamidas e hidrazidas y compuestos en los que un residuo de fenilalanina C-terminal se reemplaza por un análogo de fenetilamida (por ejemplo, Ser-Ile-fenetilamida como un análogo del tripéptido Ser-Ile-Phe), derivados de quimiocinas glicosiladas, derivados modificados con polietilenglicol, o derivados biotinilados.

10 Los análogos de SDF-1 útiles para los métodos de la invención pueden acoplarse directa o indirectamente al menos a un grupo modificador. La expresión "grupo modificador" pretende incluir estructuras que se unen directamente a la estructura peptídica (por ejemplo, mediante unión covalente o acoplamiento covalente), así como aquellas que se unen indirectamente a la estructura peptídica (por ejemplo, mediante una asociación de enlace estable no covalente

o mediante acoplamiento covalente a través de un enlazador a residuos de aminoácidos adicionales). La expresión

15 "grupo modificador" también puede referirse a miméticos, análogos o derivados de los mismos, que pueden flanquear la estructura peptídica del núcleo de SDF-1. Por ejemplo, el grupo modificador puede acoplarse al extremo amino o extremo carboxi de una estructura peptídica SDF-1, o a una región peptídica o peptidomimética que flanquea la estructura central. Como alternativa, el grupo modificador puede acoplarse a una cadena lateral de al menos un residuo aminoacídico de una estructura peptídica de SDF-1, o a una región peptídica o peptidomimética

20 que flanquea el dominio principal (por ejemplo, a través del grupo épsilon amino de uno o más residuos lisilo; a través del grupo carboxilo de uno o más residuos de ácido aspártico o uno o más residuos de ácido glutámico; a través de un grupo hidrixo de uno o más residuos tirosilo, uno o más residuos serina o uno o más residuos treonina;

o cualquier otro grupo reactivo adecuado en una cadena lateral aminoacídica). Los grupos modificadores acoplados

covalentemente a la estructura peptídica se pueden unir por medios y usando métodos ya conocidos en la técnica 25 para unir estructuras químicas, incluyendo, por ejemplo, enlaces de amida, alquilamino, sulfuro, carbamato o urea.

En algunas realizaciones, el grupo modificador puede comprender un grupo cíclico, heterocíclico o policíclico. La expresión "grupo cíclico", como se usa en el presente documento, incluye un grupo cíclico saturado o insaturado (es decir, aromático) que tiene de 3 a 10; de 4 a 8; o 5, 6 o 7 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos cíclicos no 30 aromáticos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y ciclooctilo. La expresión "grupo heterocíclico" incluye estructuras cíclicas de tres a ocho miembros, saturadas o insaturadas, opcionalmente sustituidas en las que uno o más átomos esqueléticos son oxígeno, nitrógeno, azufre o combinaciones de los mismos. Los grupos cíclicos

o los grupos heterocíclicos pueden estar sin sustituir o sustituidos en una o más posiciones anulares. Un grupo cíclico puede estar sustituido, por ejemplo, con halógenos, alquilos, cicloalquilos, alquenilos, alquinilos, arilos, 35 heterociclos, hidroxilos, aminos, nitros, tioles aminas, iminas, amidas, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos, éteres, tioéteres, sulfonilos, sulfonatos, selenoéteres, cetonas, aldehídos, ésteres, --CF3, --CN. El grupo cíclico también puede estar unido a un sustituyente, tal como halógenos, alquilos, cicloalquilos, alquenilos, alquinilos, arilos, heterociclos, hidroxilos, aminos, nitros, tioles aminas, iminas, amidas, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos, éteres, tioéteres, sulfonilos, sulfonatos, selenoéteres, cetonas, aldehídos, ésteres, -CF3, --CN por

40 medio de una cadena saturada o insaturada de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más carbono átomos; adicionalmente, uno o más de los átomos de carbono pueden reemplazarse por átomos de oxígeno, nitrógeno o azufre.

Los análogos de SDF-1 útiles para los métodos de la invención pueden modificarse mediante la adición de polietilenglicol (PEG). La modificación de PEG puede conducir a un tiempo de circulación mejorado, a una

45 solubilidad mejorada, a una resistencia mejorada a la proteólisis, a una antigenicidad y una inmunogenicidad reducidas, a una biodisponibilidad mejorada, a una toxicidad reducida, a una estabilidad mejorada y a una formulación más fácil. La PEGilación también puede dar como resultado una reducción sustancial en la bioactividad.

Los análogos de SDF-1 útiles para los métodos de la invención pueden prepararse en una forma "profármaco",

50 donde el propio compuesto no actúa como un análogo de SDF-1, sino que es capaz de transformarse, tras el metabolismo in vitro y/o in vivo, en un análogo de SDF-1. Por ejemplo, en este tipo de compuesto, el grupo modificador puede estar presente en una forma de profármaco que es capaz de convertirse en el metabolismo en forma de un análogo de SDF-1 activo. Tal forma de profármaco de un grupo modificador se denomina en el presente documento como un "grupo modificador secundario". Se conocen en la técnica una diversidad de estrategias para

55 preparar profármacos peptídicos que limitan el metabolismo con el fin de optimizar la administración de la forma activa del fármaco a base de péptidos.

Las diversas características y realizaciones de la presente invención, a las que se hace referencia en las secciones individuales anteriores, se aplican, según corresponda, a otras secciones. En particular, las características 60 especificadas en una sección se pueden combinar con características especificadas en otras secciones, según

corresponda.

Producción de células modificadas genéticamente

5 En un aspecto adicional de la invención, las células MPC o precursoras derivadas de las mismas, se modifican genéticamente para producir SDF-1, o análogos peptídicos de las mismas. Típicamente, las células se modificarán genéticamente de tal forma que SDF-1, o su análogo peptídico, se segrega de las células.

Las células modificadas genéticamente se pueden cultivar en presencia de al menos una citocina en una cantidad

10 suficiente para soportar el crecimiento de las células modificadas. Las células modificadas se seleccionan entonces donde el polipéptido codificado se sobreexpresa. Las células genéticamente modificadas así obtenidas pueden usarse inmediatamente (por ejemplo, en trasplante), cultivarse y expandirse in vitro, o almacenarse para usos posteriores. Las células modificadas pueden almacenarse por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, congelados en nitrógeno líquido.

15 La modificación genética, como se utiliza en el presente documento, incluye cualquier método de modificación genética que implica la introducción de un polinucleótido exógeno o extraño en una MPC o célula precursora derivada de la misma o modificación de un gen endógeno dentro de una MPC o célula precursora derivada de la misma. La modificación genética incluye, pero sin limitación, la transducción (transferencia viral mediada del ADN del

20 huésped de un huésped o donante a un receptor, ya sea in vitro o in vivo), transfección (transformación de células con genomas de ADN viral aislado), transferencia mediada por liposomas, electroporación, transfección de fosfato de calcio o coprecipitación y otros. Los métodos de transducción incluyen el co-cultivo directo de células con células productoras (Bregni et al., Blood 80:1418-1422, 1992) o el cultivo con sobrenadante vírico en solitario con o sin factores de crecimiento y policationes apropiados (Xu et al., Exp. Hemat. 22:223-230, 1994).

25 Típicamente, se introduce un polinucleótido que codifica SDF-1, o un análogo de péptido del mismo, en una célula huésped en un vector. El vector típicamente incluye los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Los métodos usados para construir tales vectores son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las técnicas para construir vectores de expresión adecuados se describen en detalle en Sambrook et

30 al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (3ª Ed., 2000); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1999).

Los vectores pueden incluir, pero sin limitación, vectores víricos, tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados y virus del herpes simple; cósmidos; vectores plasmídicos; vectores sintéticos; y otros vehículos de

35 recombinación usados típicamente en la técnica. Los vectores que contienen tanto un promotor como un sitio de clonación en el que se puede unir operativamente un polinucleótido son bien conocidos en la técnica. Dichos vectores son capaces de transcribir ARN in vitro o in vivo, y están disponibles comercialmente en fuentes tales como Stratagene (La Jolla, California) y Promega Biotech (Madison, Wis.). Los ejemplos específicos incluyen pSG, pSV2CAT, pXtl de Stratagene; y pMSG, pSVL, pBPV y pSVK3 de Pharmacia.

40 Los vectores preferidos incluyen vectores retrovíricos (véase, Coffin et al., "Retroviruses", Capítulo 9 págs; 437-473, Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1997). Los vectores útiles en la invención pueden producirse de manera recombinante mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los documentos WO94/29438, WO97/21824 y WO97/21825 describen la construcción de plásmidos de empaquetamiento retrovíricos y líneas

45 celulares de empaquetamiento. Los vectores ejemplares incluyen los vectores de expresión de mamíferos pCMV, tales como pCMV6b y pCMV6c (Chiron Corp.), pSFFV-Neo y pBluescript-Sk+. Los ejemplos no limitantes de vectores retrovíricos útiles son aquellos derivados de retrovirus murinos, aviares o de primates. Los vectores retrovirales comunes incluyen los basados en el virus de la leucemia murina de Moloney (vector MoMLV). Otros vectores derivados de MoMLV incluyen, Lmily, LINGFER, MINGFR y MINT (Chang et al., Blood 92:1-11, 1998). Los

50 vectores adicionales incluyen los basados en el virus de la leucemia del gibón (GALV) y el virus del sarcoma murino de Moloney (MOMSV) y el virus formador del foco del bazo (SFFV). Los vectores derivados del virus de la célula madre murina (MESV) incluyen MESV-MiLy (Agarwal et al., J. of Virology, 72:3720-3728, 1998). Los vectores retrovíricos también incluyen vectores basados en lentivirus, y los ejemplos no limitantes incluyen vectores basados en virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2).

55 En la producción de construcciones de vector retroviral, las secuencias gag, pol y env víricas pueden eliminarse del virus, creando espacio para la inserción de secuencias de ADN extrañas. Los genes codificados por ADN extraño generalmente se expresan bajo el control de un fuerte promotor vírico en la repetición terminal larga (LTR). La selección de las secuencias reguladoras de control apropiadas depende de la célula huésped utilizada y la selección

60 está dentro de la habilidad de un experto en la técnica. Se conocen numerosos promotores además del promotor de

la LTR. Los ejemplos no limitantes incluyen el promotor PL de fago lambda, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV); el promotor de la región U3 del virus del sarcoma murino de Moloney (MMSV), el Virus del sarcoma de Rous (RSV) o el virus de formación del enfoque del bazo (SFFV); promotor de granzima A; y el promotor de granzima B. Adicionalmente se pueden usar elementos de control inducibles o múltiples. La selección

5 de un promotor adecuado será evidente para los expertos en la técnica.

Tal construcción se puede empaquetar en partículas víricas de manera eficiente si las funciones gag, pol y env se proporcionan en trans mediante una línea celular de empaquetamiento. Por lo tanto, cuando se introduce la construcción del vector en la célula de empaquetamiento, las proteínas gag-pol y env producidas por la célula, se 10 ensamblan con el ARN vectorial para producir viriones infecciosos que se secretan en el medio de cultivo. El virus así producido puede infectar e integrarse en el ADN de la célula diana, pero no produce partículas víricas infecciosas ya que carece de secuencias de empaquetamiento esenciales. La mayoría de las líneas celulares de empaquetamiento actualmente en uso se han transfectado con plásmidos separados, cada uno de los cuales contiene una de las secuencias codificantes necesarias, de manera que son necesarios múltiples eventos de 15 recombinación antes de que pueda producirse un virus competente en la replicación. Como alternativa, la línea celular de empaquetamiento alberga un provirus. El provirus se ha paralizado de manera que aunque puede producir todas las proteínas necesarias para ensamblar virus infecciosos, su propio ARN no puede ser empaquetado en virus. El ARN producido a partir del virus recombinante se empaqueta en su lugar. Por lo tanto, la reserva de virus liberada de las células de empaquetamiento contiene solamente virus recombinante. Los ejemplos no limitantes de

20 líneas de empaquetamiento retrovirales incluyen PA12, PA317, PE501, PG13, PSI.CRIP, RDI 14, GP7C-tTA-G10, ProPak-A (PPA-6), y PT67. Se hace referencia a Miller et al., Mol. Cell Biol. 6:2895, 1986; Miller et al., Biotechniques 7:980, 1989; Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460, 1988; Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:83928396, 1993; y Finer et al., Blood 83:43-50, 1994.

25 Otros vectores adecuados incluyen vectores adenovirales (véase Frey et al., Blood 91:2781, 1998; y el documento WO 95/27071) y vectores víricos adeno-asociados. Estos vectores se conocen bien en la técnica, por ejemplo, como se describe en Chatterjee et al., Current Topics in Microbiol. e Immunol., 218:61-73, 1996; Stem cell Biology and Gene Therapy, eds. Quesenberry et al., John Wiley & Sons, 1998; y las Pat. de Estados Unidos N.º 5.693.531 y

5.691.176. El uso de vectores derivados de adenovirus puede ser ventajoso en ciertas situaciones porque no son

30 capaces de infectar células que no se dividen. A diferencia del ADN retrovírico, el ADN adenovírico no está integrado en el genoma de la célula diana. Además, la capacidad para transportar ADN extraño es mucho mayor en vectores adenovíricos que en vectores retrovíricos. Los vectores víricos adeno-asociados son otro sistema de administración útil. El ADN de este virus puede integrarse en células que no se dividen, y se han introducido con éxito varios polinucleótidos en diferentes tipos celulares utilizando vectores virales adeno-asociados.

35 En algunas realizaciones, la construcción o el vector incluirá dos o más secuencias de polinucleótidos heterólogas; a) la secuencia de ácido nucleico que codifica SDF-1 o un análogo peptídico de la misma, y b) una o más secuencias de ácido nucleico adicionales. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico adicional es un polinucleótido que codifica un marcador selectivo, un gen estructural, un gen terapéutico, un receptor CXCR4 o un

40 gen de citocina/quimiocina adicional.

Se puede incluir un marcador selectivo en la construcción o vector con el fin de controlar la modificación genética exitosa y para la selección de las células en las que se ha integrado el ADN. Los ejemplos no limitantes incluyen marcadores de resistencia a fármacos, tales como G148 o higromicina. Adicionalmente, se puede usar una selección 45 negativa, por ejemplo, donde el marcador es el gen HSV-tk. Este gen hará que las células sean sensibles a agentes tales como el aciclovir y el ganciclovir. El gen NeoR (resistencia a neomicina/G148) se usa comúnmente pero se puede usar cualquier gen marcador conveniente cuyas secuencias de genes no estén presentes en la célula diana. Los ejemplos no limitantes adicionales incluyen el factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (NGFR), la proteína verde fluorescente potenciada (EFGP), el gen dihidrofolato reductasa (DHFR), el gen bacteriano hisD,

50 CD24 murino (HSA), CD8a(lyt) murino, genes bacterianos que confieren resistencia a puromicina o fleomicina, y βglactosidasa.

La secuencia o secuencias polinucleotídicas adicionales se pueden introducir en la célula huésped en el mismo vector que la secuencia de polinucleótido que codifica el SDF-1 o análogo peptídico del mismo, o la secuencia

55 polinucleotídica adicional se puede introducir en las células huésped en un segundo vector. En una realización preferida, un marcador selectivo se incluirá en el mismo vector que el polinucleótido que codifica SDF-1 o análogo peptídico del mismo.

La presente invención también incluye la modificación genética de la región promotora del gen endógeno SDF-1 de 60 tal forma que la expresión del gen endógeno se aumenta dando como resultado el aumento de la producción de

SDF-1 en comparación con una MPC de tipo silvestre o célula precursora derivada de la misma.

Administración del factor derivado del estroma 1 (SDF-1) y análogos del mismo

5 Los métodos de la presente invención pueden implicar la administración de SDF-1 o un análogo del mismo a un sujeto para potenciar la proliferación y/o supervivencia de MPC o progenie derivada de la misma in situ.

Estos métodos pueden implicar la administración de SDF-1 o un análogo de la misma de forma tópica, sistemática o local tal como dentro de un implante o dispositivo.

10 En una realización particular, la invención proporciona un método para potenciar la proliferación y/o supervivencia de MPC o progenie derivada de la misma en un sujeto que lo necesita mediante la administración sistémica al sujeto de SDF-1 o un análogo del mismo. Por ejemplo, el SDF-1 o análogo del mismo se puede administrar mediante inyección subcutánea o intramuscular.

15 Esta realización de la invención puede ser útil para el tratamiento de enfermedades degenerativas sistémicas donde es deseable un aumento de la proliferación y/o supervivencia de MPC en tejidos particulares. Los ejemplos de enfermedades degenerativas sistémicas que pueden ser tratadas de esta manera incluyen osteoporosis o fracturas, enfermedades degenerativas de cartílago, aterosclerosis, enfermedades de la arteria periférica o enfermedades

20 cardiovasculares y similares.

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, las composiciones que comprenden SDF-1 o un análogo del mismo en una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz se pueden usar para tratar enfermedades o trastornos seleccionados del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes, inflamación crónica aguda, cáncer,

25 enfermedad cardiovascular, enfermedad infecciosa y trastornos inflamatorios que incluyen artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal crónica, enfermedad pélvica inflamatoria crónica, esclerosis múltiple, asma, artrosis, aterosclerosis, psoriasis, rinitis, autoinmunidad y rechazo al trasplante de órganos. En un ejemplo, dichas composiciones incluyen SDF-1 o un análogo del mismo en una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz suficiente para ser utilizada para ayudar a estimular la producción de células específicas de tejido.

30 Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr una proliferación y/o supervivencia mejoradas de MPC o progenie derivada de la misma.

Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en dosis y durante periodos de tiempo

35 necesarios, para alcanzar el resultado profiláctico deseado, tal como prevenir o inhibir la muerte de MPC o progenie derivada de la misma.

En realizaciones particulares, un intervalo preferido para cantidades terapéutica o profilácticamente eficaces de SDF1 o un análogo del mismo puede ser 0,1 nM-0,1 M, 0,1 nM-0,05 M, 0,05 nM-15 µM o 0,01 nM-10 µM. Debe

40 apreciarse que los valores de dosificación pueden variar con la gravedad de la afección a aliviar. Para cualquier tema particular, los regímenes de dosificación específicos pueden ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones. Los intervalos de dosificación establecidos en el presente documento son solo ejemplares y no limitan los intervalos de dosificación que pueden ser seleccionados por los médicos.

45 La cantidad de SDF-1 o un análogo del mismo en la composición puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del individuo. Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente

50 según lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Puede ser ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. "Forma de dosificación unitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado junto con el vehículo farmacéutico

55 requerido.

Se apreciará que el SDF-1 o análogo del mismo se puede administrar en forma de una composición que comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

60 Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" incluye cualquiera y

todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. En una realización, el vehículo es adecuado para la administración parenteral. Como alternativa, el vehículo puede ser adecuado para administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, sublingual u oral. Los vehículos farmacéuticamente

5 aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones.

10 Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral pueden incluir liposomas. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de administración o vehículos que son especialmente útiles para fármacos hidrófobos. Dependiendo de la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, se pueden emplear estrategias adicionales para la estabilización de proteínas. Además, se puede administrar el fármaco en un sistema

15 de administración de fármacos dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico de diana. Los liposomas se unirán a la proteína diana y serán absorbidos selectivamente por la célula que expresa la proteína diana.

Las composiciones terapéuticas típicamente deberían ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y

20 almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula

25 requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición.

La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo mediante la inclusión en la

30 composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Además, el SDF-1 o análogo del mismo se puede administrar en una formulación de liberación en el tiempo, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biocompatibles

35 biodegradables, tales como acetato de etileno y vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros polilácticos y poliglicólicos (PLG). Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o se conocen en general por los expertos en la técnica.

Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos de la invención se pueden preparar como suspensiones

40 oleosas apropiadas para inyección. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo; o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos; o liposomas. Las suspensiones a usar para inyección también pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la

45 preparación de soluciones altamente concentradas.

Se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en 50 un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos se secan al vacío y se liofilizan lo que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada previamente estéril del mismo. De acuerdo con un aspecto alternativo de la invención, SDF-1 o un análogo del mismo se puede formular con uno o

55 más compuestos adicionales que potencian la solubilidad del SDF-1 o análogo.

Si los compuestos de la invención se administran por inhalación, pueden administrarse convenientemente en forma de una presentación de pulverización en aerosol a partir de paquetes presurizados o un nebulizador; junto con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido 60 de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol a presión, la unidad de dosificación puede determinarse

proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y los cartuchos de gelatina, por ejemplo, para su uso en un inhalador pueden formularse conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como almidón o lactosa.

5 Administración de composiciones celulares de la presente invención

Las composiciones celulares de la presente invención que comprenden MPC y/o progenie derivada de la misma pueden ser útiles para la regeneración de tejidos de diversos tipos, incluyendo hueso, cartílago, tendón, ligamento, músculo, piel y otro tejido conectivo, así como tejido nervioso, cardiaco, de hígado, pulmón, riñón, páncreas, cerebro

10 y otros orgánicos.

En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención pueden administrarse junto con una matriz apropiada, por ejemplo, para soportar la MPC y/o la progenie derivada de la misma, y proporcionar una superficie para el hueso, el cartílago, el músculo, el nervio, la epidermis y/u otro crecimiento de tejido conectivo. La matriz 15 puede estar en forma de biomateriales matriciales tradicionales. La matriz puede proporcionar la liberación lenta de la proteína expresada y las células diferenciadas y/o el entorno apropiado para su presentación. En algunas realizaciones, se espera que diversas proteínas de colágeno y no colagenosas se aumenten y se secreten de la MPC o progenie derivada de la misma. Este fenómeno acelera la regeneración del tejido mejorando la deposición de la matriz. Las proteínas de la matriz también se pueden expresar en las células genéticamente modificadas y

20 mejorar el injerto y la unión de las células trasplantadas en el área de trasplante.

La elección del material de matriz se basa en la biocompatibilidad, la biodegradabilidad, las propiedades mecánicas, el aspecto cosmético y las propiedades de la interfaz. La aplicación particular de las composiciones a base de células definirá la formulación apropiada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser sulfato de 25 calcio, fosfato tricálcico, hidroxiapatita, ácido poliláctico y polianhídridos biodegradables y químicamente definidos. Otros materiales potenciales son biodegradables y biológicamente bien definidos, tal como el hueso o el colágeno dérmico. Las matrices adicionales están compuestas por proteínas puras o componentes de la matriz extracelular. Otras matrices potenciales no son biodegradables y están definidas químicamente, tales como hidroxiapatita sinterizada, biovidrio, aluminatos u otras cerámicas. Las matrices pueden estar compuestas por combinaciones de

30 cualquiera de los tipos de materiales mencionados anteriormente, tales como ácido poliláctico e hidroxiapatita o colágeno y fosfato tricálcico. La biocerámica puede alterarse en la composición, tal como en el aluminato-fosfato de calcio y el procesamiento para alterar el tamaño de poro, el tamaño de partícula, la forma de la partícula y la biodegradabilidad.

35 Las composiciones celulares de la invención se pueden usar para tratar pacientes que requieren la reparación o el reemplazo de cartílago o tejido óseo resultante de una enfermedad o trauma o el fallo del tejido para desarrollarse normalmente, o para proporcionar una función cosmética, tal como para aumentar los rasgos faciales u otras características del cuerpo. El tratamiento puede implicar el uso de las células de la invención para producir nuevo tejido de cartílago o tejido óseo. Por ejemplo, las composiciones que comprenden células precursoras

40 indiferenciadas o inducidas por la diferenciación condrogénica pueden usarse para tratar una afección del cartílago, por ejemplo, artritis reumatoide u osteoartritis o una lesión traumática o quirúrgica del cartílago. Como otro ejemplo, las composiciones que comprenden células precursoras de hueso se pueden usar para tratar afecciones óseas, incluyendo enfermedades óseas metabólicas y no metabólicas. Los ejemplos de afecciones óseas incluyen desgarros de menisco, fusión espinal, eliminación de disco espinal, reconstrucción espinal, fracturas óseas,

45 deformación ósea/espinal, osteosarcoma, mieloma, displasia ósea, escoliosis, osteoporosis, enfermedad periodontal, pérdida ósea dental, osteomalacia, raquitismo, osteítis fibrosa , distrofia ósea renal y enfermedad de Paget del hueso.

Las composiciones celulares de la invención pueden administrarse en solitario o como mezclas con otras células.

50 Las células que se pueden administrar junto con las composiciones de la presente invención incluyen, pero sin limitación, otras células multipotentes o pluripotentes o condrocitos, condroblastos, osteocitos, osteoblastos, osteoclastos, células de revestimiento óseo, células madre o células de médula ósea. Las células de diferentes tipos pueden mezclarse con una composición de la invención inmediatamente o poco antes de la administración, o pueden co-cultivarse conjuntamente durante un período de tiempo anterior a la administración.

Las composiciones celulares de la invención pueden administrarse con otros fármacos beneficiosos o moléculas biológicas (factores de crecimiento, factores tróficos). Cuando la MPC y/o la progenie derivada de la misma se administran con otros agentes, pueden administrarse juntos en una única composición farmacéutica, o en composiciones farmacéuticas separadas, simultánea o secuencialmente con los otros agentes (antes o después de 60 la administración de los otros agentes). Los factores bioactivos que pueden coadministrarse incluyen agentes anti

apoptóticos (por ejemplo, EPO, mimeticuerpo de EPO, TPO, IGF-I e IGF-II, HGF, inhibidores de la caspasa); agentes antiinflamatorios (por ejemplo, inhibidores de MAPK p38, inhibidores de TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 e IL-1, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMUS, y AINE (fármacos antiinflamatorios no esteroideos, por ejemplo TEPOXALINA, TOLMETINA, SUPROFENO); agentes 5 inmunosupresores/inmunomoduladores (por ejemplo, inhibidores de la calcineurina, tal como ciclosporina, tacrolimus; inhibidores de mTOR (por ejemplo, SIROLIMUS, EVEROLIMUS); antiproliferativos (por ejemplo, azatioprina, micofenolato mofetil); corticosteroides (por ejemplo, prednisolona, hidrocortisona); anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales del receptor anti-IL-2Ralfa (por ejemplo, basiliximab, daclizumab), anticuerpos policlonales anti-linfocitos T (por ejemplo, globulina anti-timocitos (ATG); globulina anti-linfocitos (ALG); anticuerpo 10 monoclonal anti-linfocitos T OKT3)); agentes antitrombogénicos (por ejemplo, heparina, derivados de heparina, urocinasa, PPack (dextrofenilalanina prolina arginina clorometilcetona), compuestos de antitrombina, antagonistas del receptor de plaquetas, anticuerpos antitrombina, anticuepros del receptor antiplaquetario, aspirina, dipiridamol, protamina, hirudina, inhibidores de prostaglandinas, e inhibidores plaquetarios); y antioxidantes (por ejemplo, probucol, vitamina A, ácido ascórbico, tocoferol, coenzima Q-10, glutatión, L-cisteína, N-acetilcisteína), así como

15 anestésicos locales. Como otro ejemplo, las células pueden co-administrarse con factor inhibidor de cicatrices como se describe en la Pat. de Estados Unidos N.º 5.827.735.

En una realización, las composiciones celulares de la invención se administran como células indiferenciadas, es decir, como cultivadas en medio de crecimiento. Como alternativa, las composiciones celulares pueden

20 administrarse después de la exposición en cultivo a condiciones que estimulan la diferenciación hacia un fenotipo deseado, por ejemplo, un fenotipo osteogénico.

Las composiciones celulares de la invención pueden implantarse, inyectarse, suministrarse quirúrgicamente (por ejemplo, por medio de un catéter o jeringa), o de otro modo administrarse directa o indirectamente al sitio que 25 necesita reparación o aumento. Las células se pueden administrar por medio de una matriz (por ejemplo, un andamio tridimensional). Las células pueden administrarse con vehículos convencionales farmacéuticamente aceptables. Las rutas de administración de las células de la invención o composiciones o componentes (por ejemplo, ECM, lisado celular, medio acondicionado) de las mismas incluyen la administración intramuscular, oftálmica, parenteral (incluyendo intravenosa), intraarterial, subcutánea, oral y nasal. Las vías particulares de administración

30 parenteral incluyen, pero sin limitación, vías de administración intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intracerebral, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal, intracisternal, intraespinal y/o peri-espinal.

Cuando las células se administran en dispositivos semisólidos o sólidos, la implantación quirúrgica en una ubicación precisa en el cuerpo es típicamente un medio de administración adecuado. Sin embargo, las composiciones

35 farmacéuticas líquidas o fluidas pueden administrarse a una ubicación más general (por ejemplo, a lo largo de un área afectada de manera difusa, por ejemplo), desde donde migran a una ubicación particular, por ejemplo, respondiendo a señales químicas.

Otras realizaciones incluyen métodos de tratamiento mediante la administración de composiciones farmacéuticas

40 que comprenden componentes celulares (por ejemplo, lisados celulares o componentes de los mismos) o productos (por ejemplo, matriz extracelular, factores tróficos y otros factores biológicos producidos mediante modificación genética).

Las formas y regímenes de dosificación para administrar las composiciones celulares descritas en el presente

45 documento se desarrollan de acuerdo con una buena práctica médica, teniendo en cuenta la afección del paciente individual, por ejemplo, la naturaleza y la extensión de la afección que se está tratando, la edad, el sexo, el peso corporal y afección médica general y otros factores conocidos por los médicos. Por lo tanto, la cantidad eficaz de una composición farmacéutica que se administrará a un paciente se determina por estas consideraciones como se conoce en la técnica.

50 En algunas realizaciones de la invención, puede no ser necesario o deseable inmunosuprimir a un paciente antes del inicio de la terapia con composiciones celulares de la presente invención. Por consiguiente, el trasplante con MPC alogénicas o incluso xenogénicas o progenie derivada de las mismas puede tolerarse en algunos casos.

55 Sin embargo, en otros casos, puede ser deseable o apropiado inmunosuprimir farmacológicamente a un paciente antes de iniciar la terapia celular. Esto puede lograrse mediante el uso de agentes inmunosupresores sistémicos o locales, o puede lograrse administrando las células en un dispositivo encapsulado. La MPC o la progenie derivada de la misma puede encapsularse en una cápsula permeable a los nutrientes y el oxígeno requeridos por la célula, y los factores terapéuticos de la célula son aún impermeables a los factores y células humorales inmunes.

60 Preferiblemente, el encapsulante es hipoalergénico, está situado de manera fácil y estable en un tejido diana, y

proporciona protección adicional a la estructura implantada. Estos y otros medios para reducir o eliminar una respuesta inmune a las células trasplantadas se conocen en la técnica. Como alternativa, la MPC o la progenie derivada de la misma puede modificarse genéticamente para reducir su inmunogenicidad.

5 La supervivencia de MPC trasplantadas o progenie derivada de las mismas en un paciente vivo puede determinarse mediante el uso de una diversidad de técnicas de exploración, por ejemplo, exploración por tomografía axial computarizada (CAT o CT), imágenes por resonancia magnética (IRM) o exploración por tomografía por emisión de positrones (PET). La determinación de la supervivencia del trasplante también se puede hacer post mortem eliminando el tejido diana y examinándolo visualmente o mediante un microscopio. Como alternativa, las células

10 pueden tratarse con manchas que son específicas para las células de un linaje específico. Las células trasplantadas también pueden identificarse mediante la incorporación previa de colorantes trazadores tales como microesferas marcadas con rodamina o fluoresceína, azul rápido, bisbenzamida, micropartículas férricas o productos de genes informadores introducidos genéticamente, tales como beta-galactosidasa o beta-glucuronidasa.

15 La integración funcional de la MPC trasplantada o progenie derivada de la misma en un sujeto puede evaluarse examinando la restauración de la función dañada o enferma, por ejemplo, la restauración de la función articular u ósea, o el aumento de la función.

Las composiciones celulares de la invención pueden incluir uno o más factores bioactivos, por ejemplo, pero sin

20 limitación, un factor de crecimiento, un factor inductor de la diferenciación, un factor de supervivencia celular tal como el inhibidor de la caspasa, un agente antiinflamatorio tal como un inhibidor de cinasa p38, o un factor angiogénico tal como VEGF o bFGF. Algunos ejemplos de factores bioactivos incluyen PDGF-bb, EGF, bFGF, IGF-1 y LIF.

25 Como alternativa, la MPC o la progenie derivada de la misma a trasplantar pueden modificarse genéticamente para expresar dichos factores de crecimiento, antioxidantes, agentes antiapoptóticos, agentes antiinflamatorios o factores angiogénicos.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender poblaciones homogéneas o heterogéneas de

30 MPC o progenie derivada de la misma, matriz extracelular o lisado celular de la misma, o medio acondicionado de la misma en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables para las células de la invención incluyen sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas adecuadas que no reaccionan perjudicialmente con las células de la invención o composiciones o componentes de las mismas. En la medida en que sean biocompatibles, los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen agua, solución salina (tal

35 como solución de Ringer), alcoholes, aceites, gelatinas y carbohidratos, tales como lactosa, amilosa o almidón, ésteres de ácidos grasos, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidina. Tales preparaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares tales como lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones y colorantes. Los vehículos farmacéuticos adecuados para su uso en la presente invención se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en

40 Pharmaceutical Sciences (17ª Ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa.) y el documento WO 96/05309.

Se pueden añadir uno o más componentes a las células trasplantadas, incluyendo componentes de matriz extracelular seleccionados, tales como uno o más tipos de colágeno conocidos en la técnica, y/o factores de crecimiento, plasma rico en plaquetas y fármacos. Como alternativa, las células de la invención pueden modificarse

45 genéticamente para expresar y producir para factores de crecimiento. Los detalles sobre la ingeniería genética de las células de la invención se proporcionan en el presente documento.

En una realización no limitante, se prepara una formulación que comprende las células de la invención para su administración directamente al sitio donde se desea la producción de tejido nuevo, tal como tejido óseo. Por ejemplo, 50 y no a modo de limitación, la MPC o progenie derivada de la misma puede suspenderse en una solución de hidrogel para inyección. Los ejemplos de hidrogeles adecuados para su uso en la invención incluyen péptidos autoensamblados, tal como RAD16. Como alternativa, la solución de hidrogel que contiene las células puede endurecerse, por ejemplo en un molde, para formar una matriz que tiene células dispersas en las mismas antes de la implantación. O, una vez que la matriz se ha endurecido, las formaciones celulares se pueden cultivar para que las 55 células se expandan mitóticamente antes de la implantación. El hidrogel es un polímero orgánico (natural o sintético) que se reticula a través de enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno para crear una estructura reticular tridimensional abierta que atrapa las moléculas de agua para formar un gel. Los ejemplos de materiales que pueden usarse para formar un hidrogel incluyen polisacáridos tales como alginato y sales de los mismos, péptidos, polifosfatas y poliacrilatos, que están reticulados iónicamente, o polímeros en bloque tales como copolímeros en 60 bloque de óxido de polietileno-propilenglicol que están reticulados por temperatura o pH, respectivamente. En

algunas realizaciones, el soporte para la MPC o progenie derivado de la misma es biodegradable.

En algunas realizaciones de la invención, la formulación comprende un gel polimerizable in situ, como se describe, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2002/0022676; Anseth et al., J. Control 5 Release, 78(1-3): 199-209 (2002); Wang et al., Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003).

En algunas realizaciones, los polímeros son al menos parcialmente solubles en soluciones acuosas, tales como agua, soluciones salinas tamponadas, o soluciones acuosas de alcohol, que tienen grupos laterales cargados, o una sal iónica monovalente de los mismos. Los ejemplos de polímeros con grupos laterales ácidos que se pueden hacer 10 reaccionar con cationes son poli(fosfazenos), poli(ácidos acrílicos), poli(ácidos metacrílicos), copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, poli(acetato de vinilo) y polímeros sulfonados, tales como como poliestireno sulfonado. También se pueden usar copolímeros que tienen grupos laterales ácidos formados por reacción de monómeros o polímeros de ácido acrílico o ácido metacrílico y éter vinílico. Los ejemplos de grupos ácidos son grupos de ácido carboxílico, grupos de ácido sulfónico, grupos de alcohol halogenados (preferiblemente fluorados), grupos OH

15 fenólicos y grupos OH ácidos.

Los ejemplos de polímeros con grupos laterales básicos que se pueden hacer reaccionar con aniones son poli(vinil aminas), poli(vinil piridina), poli(vinil imidazol) y algunos polifosfacenos sustituidos con imino. La sal de amonio o cuaternario de los polímeros también puede formarse a partir de los nitrógenos de la cadena principal o grupos imino

20 colgantes. Los ejemplos de grupos laterales básicos son los grupos amino e imino.

El alginato se puede reticular iónicamente con cationes divalentes, en agua, a temperatura ambiente, para formar una matriz de hidrogel. Debido a estas condiciones suaves, el alginato ha sido el polímero más comúnmente utilizado para la encapsulación de células de hibridoma, como se describe, por ejemplo, en la Pat. de Estados

25 Unidos N.º 4.352.883 de Lim. En el proceso de Lim, una solución acuosa que contiene los materiales biológicos a encapsular se suspende en una solución de un polímero soluble en agua, la suspensión se forma en gotitas que se configuran en microcápsulas discretas por contacto con cationes multivalentes, después la superficie de las microcápsulas está reticulado con poliaminoácidos para formar una membrana semipermeable alrededor de los materiales encapsulados.

30 Los polifosfacenos son polímeros con cadenas principales que consisten en nitrógeno y fósforo separados por enlaces sencillos y dobles alternos. Cada átomo de fósforo está unido covalentemente a dos cadenas laterales.

Los polifosfacenos adecuados para reticulación tienen una mayoría de grupos de cadenas laterales que son ácidos y

35 capaces de formar puentes de sal con cationes di-o trivalentes. Los ejemplos de grupos laterales ácidos preferidos son grupos de ácido carboxílico y grupos de ácido sulfónico. Los polifosfacenos hidrolíticamente estables están formados por monómeros que tienen grupos laterales de ácido carboxílico que están reticulados por cationes divalentes o trivalentes tales como Ca2+ o Al3+. Se pueden sintetizar polímeros que se degradan por hidrólisis mediante la incorporación de monómeros que tienen grupos laterales de imidazol, éster de aminoácido o glicerol.

40 Por ejemplo, se puede sintetizar un poli[bis (carboxitofenoxi)]fosfazeno polianiónico (PCPP), que se reticula con cationes multivalentes disueltos en medios acuosos a temperatura ambiente o inferior para formar matrices de hidrogel.

Los polifosfacenos biodegradables tienen al menos dos tipos diferentes de cadenas laterales, grupos laterales

45 ácidos capaces de formar puentes salinos con cationes multivalentes, y grupos laterales que se hidrolizan bajo condiciones in vivo, por ejemplo, grupos de imidazol, ésteres de aminoácidos, glicerol y glucosilo.

La hidrólisis de la cadena lateral da como resultado la erosión del polímero. Los ejemplos de cadenas laterales hidrolizantes son imidizoles y ésteres de aminoácidos no sustituidos y sustituidos, en los cuales el grupo está unido 50 al átomo de fósforo a través de un enlace amino (polímeros de polifosfazeno en los que ambos grupos R están unidos de esta manera se conocen como poliaminofosfazenos). Para los poliimidazolfosfacenos, algunos de los grupos "R" en la cadena principal de polifosfaceno son anillos de imidazol, unidos a fósforo en la cadena principal a través de un átomo de nitrógeno en el anillo. Otros grupos "R" pueden ser residuos orgánicos que no participan en la hidrólisis, tales como los grupos metilfenoxi u otros grupos que se muestran en el artículo científico de Allcock et al.,

55 Macromolecule 10:824 (1977). Los métodos de síntesis de los materiales de hidrogel, así como los métodos para preparar dichos hidrogeles, son conocidos en la técnica.

Otros componentes también pueden incluirse en la formulación, incluyendo, pero sin limitación, cualquiera de los siguientes: (1) tampones para proporcionar un pH e isotonicidad apropiados; (2) lubricantes; (3) materiales viscosos 60 para retener las células en o cerca del sitio de administración, incluyendo, por ejemplo, alginatos, ácaros y gomas de

plantas; y (4) otros tipos de células que pueden producir un efecto deseado en el sitio de administración, tal como, por ejemplo, mejora o modificación de la formación de tejido o sus características fisicoquímicas, o como soporte para la viabilidad de las células, o inhibición de inflamación o rechazo. Las células pueden estar cubiertas por un recubrimiento de heridas apropiado para evitar que las células salgan del sitio. Dichos recubrimientos de heridas se

5 conocen por los expertos en la materia.

Formulación de un parche de tejido óseo

El cultivo o co-cultivos de MPC o progenie derivados de la misma en un pocillo preformado permite la fabricación de

10 un parche de tejido de espesor y volumen predeterminados. El volumen del parche de tejido resultante depende del volumen del pocillo y del número de MPC o progenie que se deriva de la misma en el pocillo. El tejido del volumen predeterminado óptimo puede prepararse mediante experimentación de rutina alterando uno o ambos de los parámetros mencionados anteriormente.

15 La superficie de contacto de la célula del pocillo puede estar recubierta con una molécula que evita la adhesión de MPC o progenie derivada de la misma a la superficie de contacto de la célula. Los reactivos de recubrimiento preferidos incluyen reactivos a base de silicio, es decir, reactivos a base de diclorodimetilsilano o politetrafluoroetileno, es decir, TEFLON. Los procedimientos para recubrir materiales con reactivos a base de silicio, específicamente diclorodimetilsilano, son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989)

20 "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press. Se aprecia que otros reactivos biocompatibles que evitan la unión de células a la superficie del pocillo pueden ser útiles en la práctica de la presente invención.

Como alternativa, el pocillo se puede moldear a partir de un material biocompatible moldeable o flexible que no

25 permite la unión de células per se. Los materiales preferidos que impiden dicha unión celular incluyen, pero sin limitación, agarosa, vidrio, plástico de cultivo celular no tratado y politetrafluoroetileno, es decir, TEFLON. Los plásticos de cultivo celular no tratados, es decir, los plásticos que no han sido tratados con o fabricados de materiales pesados que tienen una carga electrostática están disponibles comercialmente, y pueden adquirirse, por ejemplo, en Falcon Labware, Becton-Dickinson, Lincoln Park, NJ. Los materiales mencionados anteriormente, sin

30 embargo, no pretenden ser limitantes. Se aprecia que cualquier otro material biocompatible flexible o moldeable que desaliente intrínsecamente la unión de MPC o progenie derivada de la misma puede ser útil en la práctica de la presente invención.

La MPC o progenie derivada de la misma en suspensión se puede sembrar y cultivar en el pocillo preformado. La

35 MPC o progenie derivada de la misma puede inducirse para diferenciarse en un fenotipo condrogénico u osteogénico en cultivo en el pocillo o puede haberse inducido para diferenciarse antes de la siembra en el pocillo. Las células se pueden diluir mediante la adición de medio de cultivo a una densidad celular de aproximadamente 1 x 105 a 1 x 109células por mililitro.

40 Las células pueden formar un tapón cohesivo de células. El tapón cohesivo de las células puede extraerse del pocillo e implantarse quirúrgicamente en el defecto tisular. Se anticipa que las MPC indiferenciadas o la progenie derivada de las mismas pueden diferenciarse in situ para formar así el tejido in vivo.

Los defectos óseos pueden identificarse de manera inferencial mediante el uso de tomografía asistida por ordenador

45 (exploración CAT); examen de rayos X, imágenes por resonancia magnética (MRI), análisis de líquido sinovial o marcadores séricos o por cualquier otro procedimiento conocido en la técnica. Los defectos en los mamíferos también son fácilmente identificables visualmente durante un examen artroscópico que ordena la cirugía abierta de la articulación. El tratamiento de los defectos se puede realizar durante un procedimiento quirúrgico artroscópico o abierto usando los métodos y composiciones descritos en el presente documento.

50 Por consiguiente, una vez que se ha identificado el defecto, el defecto puede tratarse mediante las siguientes etapas de (1) implantar quirúrgicamente en el sitio predeterminado un parche de tejido preparado por las metodologías descritas en el presente documento, y (2) permitir que el parche de tejido se integre un sitio predeterminado.

55 El parche de tejido tiene un tamaño y una forma óptimos de tal forma que cuando el parche se implanta en el defecto, los bordes del tejido implantado entran en contacto directamente con los bordes del defecto. Además, el parche de tejido se puede fijar en su lugar durante el procedimiento quirúrgico. Esto puede realizarse mediante la fijación quirúrgica del parche en el defecto con suturas biodegradables y/o aplicando un bioadhesivo a la región que interconecta el parche y el defecto.

En algunos casos, el tejido dañado se puede extirpar quirúrgicamente antes de la implantación del parche de tejido.

Trasplante de MPC o progenie derivada dela misma usando andamios.

5 Las composiciones celulares de la invención o co-cultivos de las mismas se pueden sembrar sobre o en un andamio tridimensional e implantarse in vivo, donde las células sembradas proliferarán en el armazón y formarán un tejido de reemplazo, tal como tejido óseo, in vivo en cooperación con las células del paciente.

Por ejemplo, pero no a modo de limitación, el andamio puede estar diseñado de tal forma que la estructura del

10 andamio: (1) soporta las células sembradas sin degradación posterior; (2) soporta las células desde el momento de la siembra hasta que el trasplante de tejido es remodelado por el tejido del huésped; (2) permite que las células sembradas se adhieran, proliferen y se desarrollen en una estructura de tejido que tenga suficiente integridad mecánica para mantenerse in vitro, en cuyo punto, el andamio se degrada. Se proporciona una revisión del diseño del andamio por Hutmacher, J. Biomat. Sci. Polymer Edn., 12(1):107-124 (2001).

15 Los andamios de la invención pueden administrarse junto con uno o más factores de crecimiento, células, por ejemplo, células madre, células de médula ósea, condrocitos, condroblastos, osteocitos, osteoblastos, osteoclastos, células de revestimiento óseo o sus precursores, fármacos u otros componentes descritos anteriormente que estimulan la formación de tejido o potencian o mejoran de otro modo la práctica de la invención. La MPC o progenie

20 derivada de la misma para sembrarse en los andamios puede modificarse genéticamente para expresar factores de crecimiento o fármacos.

Las células de la invención pueden usarse para producir tejido nuevo in vitro, que luego se puede implantar, trasplantar o insertar de otro modo en un sitio que requiere la reparación, el reemplazo o el aumento de tejido en un

25 paciente.

En una realización no limitante, las células de la invención se usan para producir una construcción de tejido tridimensional in vitro, que después se implanta in vivo. Como un ejemplo de la producción de construcciones de tejido tridimensionales, véase la Pat. de Estados Unidos N.º 4.963.489. Por ejemplo, las células de la invención se

30 pueden inocular o "sembrar" en un armazón o andamio tridimensional, y se proliferan o se cultivan in vitro para formar un tejido vivo que se puede implantar in vivo.

Las células de la invención se pueden cultivar libremente en un recipiente de cultivo a una subconfluencia o confluencia, se pueden separar del cultivo y se pueden inocular en un armazón tridimensional. La inoculación del

35 armazón tridimensional con una alta concentración de células, por ejemplo, aproximadamente de 106 a 5 x 107 células por mililitro, dará como resultado el establecimiento del soporte tridimensional en periodos de tiempo relativamente más cortos.

Los ejemplos de andamios que se pueden usar en la presente invención incluyen esteras no tejidas, espumas

40 porosas o péptidos autoensamblables. Las esteras no tejidas pueden formarse, por ejemplo, usando fibras que comprenden un copolímero absorbible sintético de ácidos glicólico y láctico (PGA/PLA), vendido bajo el nombre comercial VICRYL (Ethicon, Inc., Somerville, N.J.). Las espumas, compuestas, por ejemplo, por copolímero de poli(épsilon-caprolactona)/poli(ácido glicólico) (PCL/PGA), formadas por procesos tales como secado por congelación, o liofilizadas, como se analiza en la Pat. de Estados Unidos N.º 6.355.699, también son posibles

45 andamios.

También se pueden usar hidrogeles tales como péptidos autoensamblantes (por ejemplo, RAD16). Estos materiales se utilizan con frecuencia como soportes para el crecimiento del tejido.

50 El armazón tridimensional puede estar hecho de materiales cerámicos que incluyen, pero sin limitación: mono-, di-, tri-, alfa-tri-, beta-tri-, y tetra-fosfato de calcio, hidroxiapatita, fluoroapatitas, sulfatos de calcio, fluoruros de calcio, óxidos de calcio, carbonatos de calcio, fosfatos cálcicos de magnesio, lentes biológicamente activos tales como BIOGLASS (Universidad de Florida, Gainesville, Florida) y mezclas de los mismos. Existe una serie de materiales cerámicos porosos biocompatibles adecuados actualmente disponibles en el mercado comercial tales como

55 SURGIBON (Unilab Surgibone, Inc., Canadá), ENDOBON (Merck Biomaterial France, Francia), CEROS (Mathys, A. G., Bettlach, Suiza), e INTERPORE (Interpore, Irvine, Calif., Estados Unidos), y productos de injerto óseo de colágeno mineralizado tales como HEALOS (Orquest, Inc., Mountain View, Calif.) y VITOSS, RHAKOSS, y CORTOSS (Orthovita, Malvern, Pa.). El armazón puede ser una mezcla, fusión o compuesto de materiales naturales y/o sintéticos. En algunas realizaciones, el andamio está en la forma de una jaula. En una realización preferida, el

60 andamio está recubierto con colágeno.

De acuerdo con una realización preferida, el armazón es un fieltro, que puede estar compuesto por un hilo multifilamento hecho de un material bioabsorbible, por ejemplo, copolímeros o mezclas de PGA, PLA, PCL, o ácido hialurónico. El hilo se transforma en un fieltro utilizando técnicas estándar de procesamiento textil que consisten en

5 engaste, corte, cardado y punción.

En otra realización preferida, las células de la invención se siembran sobre andamios de espuma que pueden ser estructuras compuestas. Además, el armazón tridimensional se puede moldear en una forma útil, tal como la de la parte externa de la oreja, un hueso, una articulación u otra estructura específica en el cuerpo a reparar, reemplazar o

10 aumentar.

En otra realización preferida, las células se siembran sobre un armazón que comprende un dispositivo protésico para implantación en un paciente, como se describe en la Pat. de Estados Unidos N.º 6.200.606. Como se describe en la misma, se han desarrollado una diversidad de dispositivos protésicos clínicamente útiles para su uso en

15 procedimientos de injerto de hueso y cartílago. (véase, por ejemplo, Bone Grafts and Bone Substitutions. Ed. M. B. Habal & A. H. Reddi, W. B. Saunders Co., 1992). Por ejemplo, los dispositivos eficaces de reemplazo de rodilla y cadera han sido y continúan siendo ampliamente utilizados en el entorno clínico. Muchos de estos dispositivos se fabrican usando una diversidad de materiales inorgánicos que tienen baja actividad inmunogénica, que funcionan de manera segura en el cuerpo. Los ejemplos de materiales sintéticos que se han ensayado y probado incluyen

20 aleaciones de titanio, fosfato de calcio, hidroxiapatita de cerámica y una diversidad de aleaciones de acero inoxidable y cromo-cobalto. Estos materiales proporcionan soporte estructural y pueden formar un andamiaje en el cual pueden producirse la vascularización del huésped y la migración celular.

El armazón se puede tratar antes de la inoculación de las células de la invención con el fin de mejorar la unión

25 celular. Por ejemplo, antes de la inoculación con las células de la invención, las matrices de nylon pueden tratarse con ácido acético 0,1 molar e incubarse en polilisina, PBS y/o colágeno para recubrir el nylon. El poliestireno puede tratarse de manera similar usando ácido sulfúrico.

Además, las superficies externas del armazón tridimensional pueden modificarse para mejorar la unión o el

30 crecimiento de las células y la diferenciación del tejido, tal como, por ejemplo, mediante el recubrimiento de plasma del armazón o la adición de una o más proteínas (por ejemplo, colágenos, fibras elásticas, fibras reticulares), glicoproteínas, glicosaminoglicanos (por ejemplo, sulfato de heparina, sulfato de condroitina 4, sulfato de condroitina 6, sulfato de dermatano, sulfato de queratina), una matriz celular y/u otros materiales tales como, pero sin limitación, gelatina, alginatos, agar, agarosa y gomas vegetales, entre otros.

35 En algunas realizaciones, el armazón está compuesto o se trata con materiales que lo hacen no trombogénico. Estos tratamientos y materiales también pueden promover y sostener el crecimiento endotelial, la migración y la deposición de la matriz extracelular. Los ejemplos de estos materiales y tratamientos incluyen, pero sin limitación, materiales naturales tales como proteínas de membrana basal tales como laminina y colágeno de tipo IV, materiales sintéticos

40 tales como ePTFE y siliconas de poliuretanourea segmentadas, tal como PURSPAN (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, California). Estos materiales se pueden tratar adicionalmente para hacer que el andamio no sea trombogénico. Dichos tratamientos incluyen agentes antitrombóticos tales como heparina, y tratamientos que alteran la carga superficial del material tal como recubrimiento de plasma.

45 En algunas realizaciones, la superficie del armazón está texturizada. Por ejemplo, en algunos aspectos de la invención, el andamio está dotado de un patrón ranura y cresta. Las ranuras son preferiblemente menores de aproximadamente 500 micrómetros, más preferiblemente menores de aproximadamente 100 micrómetros, y mucho más preferiblemente entre aproximadamente 10 nanómetros y 10 micrómetros. Dichas "microrranuras" permiten a las células alinearse y/o migrar guiadas por las ranuras superficiales.

50 En algunas realizaciones, es importante recrear en cultivo el microentorno celular encontrado in vivo, de tal forma que el grado en que las células de la invención se desarrollen antes del implante in vivo o el uso in vitro pueda variar. Además, los factores de crecimiento, los agentes inductores de la diferenciación condrogénica, los agentes inductores osteogénicos, y los factores angiogénicos pueden añadirse al medio de cultivo antes, durante o después

55 de la inoculación de las células para desencadenar la diferenciación y la formación de tejido por la MPC o la progenie derivada de la misma o co-cultivos de la misma.

El armazón tridimensional puede modificarse de manera que se potencie el crecimiento de las células y la producción de tejido en el mismo, o de manera que se reduzca el riesgo de rechazo del implante. Por lo tanto, uno o

60 más compuestos biológicamente activos, incluyendo, pero sin limitación, antiinflamatorios, inmunosupresores o

factores de crecimiento, se pueden añadir al armazón.

Usos terapéuticos para la matriz extracelular o lisados celulares

5 Como alternativa a la implantación de las células de la invención, o el tejido vivo producido a partir de las mismas, un sujeto que necesite reparación, reemplazo o aumento tisular puede beneficiarse de la administración de un componente o producto de MPC o progenie derivado de la misma (particularmente cuando se han modificado genéticamente), tal como la matriz extracelular (ECM) o el lisado celular producido por esas células.

10 En algunas realizaciones, después de que las células de la invención se hayan cultivado in vitro, tal como, por ejemplo, usando un sistema de armazón tridimensional descrito en el presente documento, de tal forma que se haya secretado una cantidad deseada de ECM sobre el armazón. Una vez que la ECM se secreta en el armazón, las células pueden eliminarse. La ECM puede procesarse para su posterior uso, por ejemplo, como una preparación inyectable.

15 En algunas realizaciones, las células se eliminan y los restos celulares (por ejemplo, membranas celulares) se eliminan del marco. Este proceso puede realizarse de diferentes maneras. Por ejemplo, el tejido vivo puede congelarse instantáneamente en nitrógeno líquido sin un crioconservante, o el tejido puede sumergirse en agua destilada estéril para que las células estallen en respuesta a la presión osmótica. Una vez que las células han sido

20 eliminadas, las membranas celulares se pueden romper y los desechos celulares se pueden eliminar mediante el tratamiento con un aclarado de detergente suave, tal como EDTA, CHAPS o un detergente zwitteriónico. Una ventaja de usar un aclarado de detergente suave es que solubiliza las proteínas unidas a la membrana, que a menudo son altamente antigénicas.

25 Como alternativa, el tejido puede digerirse y/o extraerse enzimáticamente con reactivos que descomponen las membranas celulares. Los ejemplos de dichas enzimas incluyen, pero sin limitación, hialuronidasa, dispasa, proteasas y nucleasas (por ejemplo, desoxirribonucleasa y ribonucleasa). Los ejemplos de detergentes incluyen detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, alcohol de alquilarilpoliéter (TRITON™ X-100), octilfenoxi polietoxietanol (Rohm y Haas Philadelphia, Pa.), BRIJ-35, un polietoxietanol lauril éter (Atlas Chemical Co., San

30 Diego, Calif.), Polisorbato 20 (TWEEN 20™), un monolaureato de polietoxietanol sorbitán (Rohm y Haas), polietil lauril éter (Rohm y Haas); y detergentes iónicos tales como, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio, alcoholes alifáticos superiores sulfatados, alcanos sulfonados y alquilarenos sulfonados que contienen de 7 a 22 átomos de carbono en una cadena ramificada o no ramificada.

35 Los andamios que comprenden la ECM se pueden usar terapéuticamente como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, la ECM se puede recolectar del andamio. La recolección de la ECM se puede realizar de diferentes maneras, dependiendo, por ejemplo, de si el andamio es biodegradable o no biodegradable. Por ejemplo, si el armazón no es biodegradable, la ECM se puede eliminar sometiendo el armazón a sonicación, chorros de agua a alta presión, raspado mecánico o un tratamiento suave con detergentes o enzimas, o cualquier combinación de los

40 anteriores.

Si el armazón es biodegradable, la ECM se puede recoger, por ejemplo, permitiendo que el armazón se degrade o se disuelva en solución. Como alternativa, si el armazón biodegradable está compuesto por un material que puede inyectarse junto con la ECM, el armazón y la ECM pueden procesarse completamente para su posterior inyección.

45 Como alternativa, la ECM puede eliminarse del armazón biodegradable mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente para la recolección de ECM de un armazón no biodegradable. Todos los procesos de recogida están diseñados preferiblemente para no desnaturalizar la ECM o el lisado celular producido por las células de la invención.

50 Las realizaciones de la presente invención se describirán ahora en detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS

55 MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS Sujetos y cultivo celular

Los aspirados de médula ósea (BM) se obtuvieron de la cresta ilíaca posterior de voluntarios adultos sanos (19-35 60 años) después del consentimiento informado, según procedimientos aprobados por el comité de ética del Royal

Adelaide Hospital, Australia del Sur. Las células mononucleares de médula ósea (BMMNC) se prepararon como se ha descrito previamente (Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003). Los cultivos primarios de BMSSC se establecieron en α-MEM (medio esencial mínimo) complementado con suero fetal de ternera al 20 %, L-glutamina 2 mM y L-ascorbato-2-fosfato 100 μM como se ha descrito previamente (Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835,

5 2003). Las líneas celulares clonales de BMSSC se generaron mediante la dilución limitante de las colonias del día 14 derivadas de las células clasificadas STRO-1bri/VCAM-1+ como se describe a continuación, después del subcultivo en medio repleto de suero para proliferación, RT-PCR, imunohistoquímica y estudios de desarrollo.

Clasificación de células activadas magnéticamente (MACS).

10 Esto se realizó como se ha descrito previamente (Gronthos et al., Isolation, Purification and In Vitro Manipulation of Human Bone Marrow Stromal Precursor Cells. In Marrow Stromal Cell Culture. Owen M. y Beresford J.N. (eds). Cambridge University Press UK, Capítulo 3, pág. 26-42, 1998; Gronthos y Simmons, Blood 85(4): 929-940, 1995). En resumen, se incubaron secuencialmente aproximadamente 1-3 x 108 células mononucleares normales de médula

15 ósea humana con sobrenadante de STRO-1, anti-IgM-biotina, microperlas de estreptavidina y finalmente estreptavidina FITC (Caltag Laboratories, Burlingame, CA) antes de separarse en una columna magnética Mini MACS (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA) según las instrucciones del fabricante.

Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

20 Las células aisladas por MACS STRO-1+ se marcaron con FITC conjugado con estreptavidina, luego se incubaron con anticuerpo anti-CD106 (VCAM-1) purificado 6G10 o con anticuerpo anti-CD146 (MUC-18) o control de isotipo 1B5 (10 μg/ml) durante 30 minutos en hielo, se lavaron y se incubaron con anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con ficoeritrina (PE) (1/50; Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) durante 20 minutos

25 adicionales en hielo. Las células se clasificaron usando un citómetro de flujo FACStarPLUS (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Las células STRO-1bri/CD106+ o STRO-1bri/CD146+ se cultivaron en alfa-modificación de medio Eagle complementado con suero de ternera fetal al 20 %, L-glutamina 2 mM, ascorbato-2-fosfato (100 μM) para iniciar el cultivo primario en CO2 al 5 %, a una atmósfera humidificada a 37 ºC.

30 Análisis citométrico de flujo de dos colores utilizando inmunofluorescencia indirecta.

Este procedimiento se ha informado previamente (Gronthos et al., Isolation, Purification and In Vitro Manipulation of Human Bone Marrow Stromal Precursor Cells. In Marrow Stromal Cell Culture. Owen M. y Beresford J.N. (eds). Cambridge University Press UK, Capítulo 3, pág. 26-42, 1998). En resumen, los cultivos primarios de MPC o células

35 derivadas de MPC se liberaron mediante digestión con tripsina/EDTA y luego se incubaron durante 30 minutos en hielo. Se lavaron aproximadamente 2 x 105 células y luego se resuspendieron en 200 µl de cóctel de anticuerpo primario durante 1 h en hielo. El cóctel primario de anticuerpos consistió en saturar las concentraciones del anticuerpo monoclonal IgM de ratón STRO-1 y un anticuerpo monoclonal IgG de ratón o IgG de conejo para cada tubo (Tabla 1). Para la tinción con anticuerpos reactivos con antígenos intracelulares, las células se lavaron primero

40 con PBS y luego se permeabilizaron mediante tratamiento con etanol al 70 % en hielo durante diez minutos y luego se lavaron antes de la tinción. Los Mabs de control negativos para IgM e IgG de isotipo de ratón se trataron en las mismas condiciones. Después de la incubación con anticuerpos primarios, las células se lavaron y se expusieron a niveles de saturación de FITC específica de μ-cadena IgM anti-ratón de cabra (dilución 1/50) y PE específica de IgG γ anti-ratón de cabra (dilución 1/50) o PE específica de Ig anti-conejo (dilución 1/50) (Southern Biotechnology

45 Associates) en un volumen final de 100 μl. Las células se incubaron durante 45 minutos en hielo, luego se lavaron dos veces y después se fijaron en FAX FIX (PBS complementado con D-glucosa al 1 % (v/v), 2 % (p/v), azida de sodio al 0,01 %). Después, las células se analizaron en un citómetro de flujo Epics®-XL-MCL (Beckman Coulter, Hialeah, FL).

50 Etiquetado de succinimidil éster diacetato de carboxifluoresceína (CFSE).

El colorante basado en fluoresceína permeable a las células CFSE se usó para estudiar los cambios fenotípicos y funcionales relacionados con la división durante el desarrollo celular derivado de MPC. El CFSE se une covalentemente a los componentes citoplásmicos de las células, dando como resultado una fluorescencia brillante

55 uniforme, que tras la división celular se distribuye por igual entre las células secundarias. Esta técnica permite la resolución de hasta ocho ciclos de división celular mediante citometría de flujo. Las suspensiones de células individuales de células derivadas de MPC expandidas ex vivo se lavaron una vez, se volvieron a suspender en 1 ml de PBS/BSA al 0,1 % y se añadieron 2 μl de CFSE 5 mM (10 μM final) antes de la incubación a 37 ºC durante 10 minutos. La tinción se inactivó mediante la adición de 5 volúmenes de medio de cultivo enfriado con hielo α-MEM-10

60 y se incubó en hielo durante 5 minutos. Las células se lavaron tres veces en el medio de cultivo y luego se pusieron

en placas a baja densidad 1 x 105 en matraces de cultivo (T-25). En diversos momentos, las células se separaron mediante tripsina-EDTA y se analizaron mediante análisis de citometría de flujo.

Análisis de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).

5 Los cultivos derivados de MPC primarias se liberaron mediante tratamiento con tripsina/EDTA y luego se tiñeron con sobrenadante de STRO-1 como se ha descrito anteriormente. Después del lavado, las células se incubaron con anticuerpo IgM anti-ratón de cabra conjugado con ficoeritrina (PE) (1/50; Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) durante 20 minutos más sobre hielo. Las células se clasificaron usando un citómetro de flujo

10 FACStarPLUS (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). El ARN celular total se preparó a partir de 2 x 106 células primarias clasificadas STRO-1bri o STRO-1dim, sedimentos de condrocitos y otros cultivos inducidos y se lisaron usando el método de extracción RNAzolB (Biotecx Lab. Inc., Houston, TX), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ARN aislado de cada subpoblación se utilizó entonces como una plantilla para la síntesis de ADNc, preparado usando un kit de síntesis de ADNc de primera cadena (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). La

15 expresión de diversos transcritos se evaluó mediante amplificación por PCR, utilizando un protocolo estándar como se describió previamente (Gronthos et al., J. Bone and Min. Res. 14:48-57, 1999). Los conjuntos de cebadores utilizados en este estudio se muestran en la Tabla 2. Después de la amplificación, cada mezcla de reacción se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 %, y se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. La integridad del ARN se evaluó por la expresión de GAPDH.

Diferenciación de CFU-F in vitro.

Se han indicado previamente las condiciones para la inducción de células estromales de BM humanas para desarrollar una matriz ósea mineralizada in vitro cultivada en αMEM complementado con FCS al 10 %, L-ascorbato25 2-fosfato 100 μM, dexametasona 10-7 M y Fosfato inorgánico 3 mM (Gronthos et al., Blood. 84: 4164-4173, 1994). Los depósitos minerales se identificaron por tinción von Kossa positiva. La adipogénesis se indujo en presencia de metilisobutilmetilxantina 0,5 mM, hidrocortisona 0,5 μM e indometacina 60 μM como se ha descrito anteriormente (Gimble, J. M. Marrow stromal adipocytes. En Marrow stromal cell culture. Owen M. y Beresford J.N. (eds). Cambridge: Cambridge University Press UK. Capítulo 5, pág. 67-87, 1998). Se usó tinción rojo aceite O para

30 identificar las células grasas cargadas de lípidos. La diferenciación condrogénica se evaluó en cultivos agregados tratados con 10 ng/ml de TGF-β3 como se describe (Pittenger et al., Science, 284:143-147, 1999).

Ensayo in vivo de formación ósea.

35 Las células adherentes derivadas de células STRO-1bri/VCAM-1+ en el paso 2-3 se tripsinizaron, se mezclaron con 40 mg de partículas cerámicas de hidroxiapatita/fosfato tricálcico (Zimmer Corporation, Varsovia, IN) y luego se implantaron en bolsas subcutáneas en el superficie dorsal de ratones SCID de dos meses como se ha descrito previamente (Gronthos et al., Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 97 (25): 13625-13630, 2000). Estos procedimientos se realizaron de acuerdo con las especificaciones de un protocolo animal aprobado (Adelaide

40 University AEC# M/079/94). Los implantes se recuperaron después de 6-8 semanas, se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 2 días y luego se descalificaron durante diez días más en EDTA al 10 % antes de incrustarse en parafina. Para el análisis histológico, se prepararon secciones de 5 μm de los implantes y se tiñeron con hematoxilina y eosina (Gronthos et al., Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 97 (25): 1362513630, 2000).

45 Desarrollo de tejido neural. Los cultivos monocapa se cultivan en medio Neuroblast A (Invitrogen/GIBCO) + suero de caballo al 5 %, suero fetal de ternera al 1 %, L-glutamina (2 mM), transferrina (100 μg/ml), insulina (2 μg/ml), ácido retinoico 0,5 mM, factor neurotrófico derivado del cerebro (10 ng/ml).

50 Desarrollo de grasa. Los cultivos monocapa se cultivan en alfa-Modificación del medio Eagle (JRH) complementado con suero de ternero fetal al 10 %, L-glutamina 2 mM, ascorbato-2-fosfato (100 μM), metilisobutilxantina 0,5 mM, hidrocortisona 0,5 mM, indometicina 60 mM.

Desarrollo de cartílago: Los cultivos de sedimentos en tubos de polipropileno se cultivan en alfa-Modificación de

55 medio Eagle complementado con albúmina de suero bovino al 1 %, transferrina (100 μg/ml), insulina (2 μg/ml), Lglutamina (2 mM), ascorbato-2-fosfato (100 μM/ml), dexametasona (10-8 M), con BMP-7 (50 ng/ml), TGFβ3 (10 ng/ml).

Desarrollo de músculo esquelético/cardiaco. Los cultivos monocapa se cultivan en alfa-modificación de medio Eagle 60 complementado con suero fetal de ternera al 10 %, L-glutamina (2 mM), ascorbato-2-fosfato (100 µM/ml), y 5

azacitodina (5 µM/ml).

Desarrollo epitelial. Los cultivos monocapa se cultivan en medio basal de queratinocitos (Clontenics) complementado con extracto de pituitaria bovina (50 µg/ml), factor del crecimiento epidérmico (10 ng/ml), hidrocortisona (0,5 µg/ml), 5 Insulina (5 µg/ml).

Desarrollo de osteoblastos, tendón, ligamento u odontoblastos. Los cultivos monocapa se cultivan en alfamodificación de medio Eagle complementado con suero fetal de ternera al 10 %, L-glutamina 2 mM, ascorbato-2fosfato (100 µM), Dexametasona (10-7 M) y BMP-2 (50 ng/ml)

10 Desarrollo de pericitos o células de músculo liso. Los cultivos de 20.000 MPC cultivadas ex vivo por pocillo se cultivan en alfa-modificación de medio Eagle complementado con suero fetal de ternera al 10 %, L-glutamina 2 mM, ascorbato-2-fosfato (100 µM), factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (10 ng/ml) suspendido sobre 200 □l de matrigel en placas de 48 pocillos.

Anticuerpos primarios.

Los anticuerpos primarios usados en este estudio fueron como se indica a continuación: STRO-1 (IgM de ratón [inmunoglubolina M]) (Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003), anticuerpo fosfatasa alcalina anti-humano

20 (B4-78, IgG1 de ratón, Hybridoma Studies Bank, Universidad de Iowa, Ames), anticuerpo CXCR4 anti-humano (IgG2b de ratón; Chemicon International, Temecula, CA) y anticuerpo anexina V anti-humano (IgG1 de ratón; Chemicon) se usaron como el sobrenadante del cultivo de tejidos diluido 1:2 o como 10 μg/ml de inmunoglobulina purificada, respectivamente. Los anticuerpos monoclonales de ratón de control de isotipo coincidente utilizados en este estudio incluían 1A6.12 (IgM), 1B5 (IgG1), y 1A6.11 (IgG2b) (proporcionado amablemente por el Prof L.K.

25 Ashman, University of Newcastle, NSW, Australia).

Purificación de BMSSC.

Esto se realizó básicamente como se ha descrito previamente (Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003;

30 Gronthos y Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995). En resumen, se incubaron aproximadamente 1 to 3 x 108 BMMNC humanas adultas con tampón de bloqueo (solución salina equilibrada de Hanks [HBSS] complementada con suero humano al 1 %, albúmina sériva bovina al 1 %, y suero fetal bovino al 5 %), después se incubaron secuencialmente con sobrenadante de STRO-1, anti-IgM-biotina, microperlas de estreptavidina (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), y finalmente isotiocianato de estreptavidina fluoresceína (FITC; Caltag Laboratories, Burlingame, CA) antes de

35 separarse en una columna magnética de clasificación de células activadas magnéticamente Mini (MACS) (Miltenyi Biotec), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células mononucleares de médula ósea STRO-1+ aisladas por MACS se ordenaron posteriormente usando un citómetro de flujo FACStar (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA), en función de su expresión de STRO-1 alta (STRO-1bright) o baja (STRO-1dull) (Figura 1A).

40 Aislamiento de subpoblaciones de BMSSC STRO-1/fosfatasa alcalina.

Se prepararon cultivos secundarios de BMSSC humanas como suspensiones de células individuales mediante digestión con tripsina/EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) y luego se incubaron con anticuerpos que identificaban STRO-1 y la fosfatasa alcalina (AP) del antígeno asociado al hueso, B4-78, como se describe por Gronthos et al., J

45 Bone Miner Res. 14: 47-56, 1999. Se incubaron aproximadamente 2 x 107 células con anticuerpos reactivos a STRO-1 y fosfatasa alcalina (B4-78) durante 1 hora sobre hielo. Los tubos replicados se incubaron con el color único correspondiente y los anticuerpos de control negativo. Después del lavado, las muestras se incubaron con anticuerpos IgG1-FITC e IgM-PE (ficoeritrina) de cabra anti-ratón (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) como agentes de detección secundarios durante 45 minutos en hielo. Después del lavado, las células se

50 clasificaron posteriormente en pureza por doble clasificación, utilizando un citómetro de flujo FACStar (Becton Dickinson), basado en las 4 subpoblaciones de BMSSC STRO-1/AP (Gronthos et al., J Bone Miner Res. 14: 47-56, 1999; Pan et al., Bone 34(1):112-23, 2004; y Atkins et al., J Bone Miner Res. 18(6):1088-98, 2003).

Ensayos de flujo de calcio.

55 Se resuspendieron suspensiones de células individuales de cultivos de BMSSC secundarias separadas por tripsina a una concentración de 1 x 10-6 células/ml en HBSS complementado con suero de ternera fetal al 1 % (FCS) y CaCl2 1,25 mM. Las células se incubaron con fura-2-AM 2 μM (fura-2 acetoximetil éster; Molecular Probes, Eugene, OR) durante 30 minutos a 37 ºC. El exceso de fura-2-AM se eliminó lavando las células dos veces, y las células se

60 volvieron a suspender en 2 ml de HBSS que contenía FCS al 1 % y CaCl2 1,25 mM a una concentración final de 1 x

106 células/ml. Se midió [Ca2+]i usando un espectrofluorómetro (espectrómetro de luminiscencia LS55, Perkin Elmer, Boston, MA), con excitación alterna de 340 y 380 nm y emisión de fluorescencia a 510 nm. Después de establecer un nivel de línea basal de [Ca2+]i, las células se trataron con 30 ng/ml de SDF-1α. Cuando se consiguió un pico estable de [Ca2+]i en respuesta a SDF-1α, las BMSSC se permeabilizaron con digitonina 0,1 mM, y se

5 añadió etilenglicol de ácido tetracético (EGTA) a una concentración final de 5 mM. Las mediciones de digitonina y EGTA se usaron para calibrar [Ca2+]i con respecto a fluorescencia fura 2-AM en cada muestra usando una ecuación de calibración como se ha descrito previamente (Grynkiewicz et al., J Biol Chem. 260: 3440-3450, 1985)

Ensayos de eficiencia de colonias.

10 Los ensayos formadores de colonias se realizaron usando BMMNC STRO-1bright aisladas por MACS/FACS y después se pusieron en placas a una densidad de 5 x 104 por pocillo en placas de 24 pocillos en condiciones privadas de suero como se ha descrito previamente (Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003; Gronthos y Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995). Las células se pusieron en placas en presencia de diferentes combinaciones

15 de citocinas. Los factores de crecimiento usados en este estudio incluían α-interferón 2a (30 000 IU/ml; F Hoffmann-La Roche, Basel, Suiza), factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (5 ng/ml), interleucina 4 (30 ng/ml) y factor derivado del estroma 1 (30 ng/ml; CytoLab/PeproTech, Rehovot, Israel). Los cultivos se terminaron el día 14, y el número de UFC-F se enumeró después de la tinción con azul de toluidina al 0,1 % (peso/volumen) en paraformaldehído al 1 %. Los agregados de más de 50 células se puntuaron como colonias derivadas de UFC-F.

Análisis de citometría de flujo.

Los cultivos de BMSSC se prepararon mediante digestión con tripsina/EDTA, luego se resuspendieron en tampón de bloqueo durante 30 minutos. Las suspensiones de células individuales se incubaron entonces con anticuerpo anti25 CXCR4 o 1A6.11 a una concentración de 10 μg/ml durante 1 hora en hielo. De manera similar, se prepararon líneas celulares de BMSSC de expresión alta de SDF-1 y de control de vector mediante tratamiento con tripsina/EDTA, se bloquearon y luego se incubaron con anticuerpo anti-anexina V o con el anticuerpo de control de isotipo correspondiente, 1D4.5. Después del lavado, las células se incubaron con los reactivos de detección secundarios, anticuerpos conjugados por FITC IgG1 o IgG2b de cabra anti-ratón (1/50; Southern Biotechnology Associates)

30 durante 45 minutos en hielo. Después del lavado, las muestras se analizaron usando un citómetro de flujo Epics-XL-MCL (Beckman Coulter, Hialeah, FL).

Análisis por RT-PCR.

35 Se preparó ARN total a partir de 2 x 104 células mononucleares de médula ósea clasificadas por STRO-1bright, STRO-1dull, y STRO-1negativo; subpoblaciones cultivadas de BMSSC clasificadas por STRO-1/fosfatasa alcalina; o la línea celular de osteosarcoma humano, MG63, usando el sistema RNA STAT-60 (TEL-TEST, Friendswood, TX). El ARN total aislado de cada subpoblación se utilizó entonces como una plantilla para la síntesis de ADNc, preparado usando un kit de síntesis de ADNc de primera cadena (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). La expresión de

40 diversos transcritos se evaluó mediante amplificación por PCR, utilizando un protocolo estándar como se ha descrito previamente. Los conjuntos de cebadores utilizados en este estudio fueron los siguientes: SDF-1 (directo, 5'gacccgcgctcgtccgcc-3'; inverso, 5'-gctggactcctactgtaaggg-3'); CXCR4 (directo, 5'-tctggagaaccagcggttac-3'; inverso, 5'-gacgccaacatagaccacct-3'); GAPDH (directo, 5'-catggagaaggctggggctc-3'; inverso, 5'-cactgacacgttggcagtgg-3'). Los productos amplificados se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % y se visualizaron mediante

45 tinción con bromuro de etidio. El análisis semicuantitativo de la abundancia de la transcripción se evaluó en relación con la expresión de GAPDH usando el software ImageQant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Generación de líneas de BMSSC transducidas.

50 Se generaron construcciones de expresión retroviral con el vector retroviral pLNCX2 (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) que codificada el ADNc de SDF-1 humano de longitud completa amplificado usando el conjunto de cebadores de PCR directo (5'-aataactcgagacccgcgctcgtccgcc-3') e inverso (5'-aattaagcggccgctggactcctactgtaaggg3') (subrayado), construido con los sitios de restricción XhoI y NotI (negrita), respectivamente. La línea celular de empaquetamiento PT67 se transfectó con las construcciones que contenían SDF-1 o el vector pLNCX2 en solitario

55 usando reactivo Fugene-6 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania), luego se seleccionó con 800 μg/ml de G418 (Sigma, Castle Hill, NSW, Australia). Se usó sobrenadante recolectado que contenía partículas infecciosas de líneas PT67 estables para transducir BMSSC cultivadas en presencia de 5 μg/ml de polibreno (Sigma). Se establecieron BMSSC derivadas de multicolores estables que expresaban altos niveles de SDF-1α y líneas celulares de control después de la selección con 800 μg/ml de G418. Las concentraciones secretadas de SDF-1α se midieron

60 a partir del sobrenadante filtrado a través de un filtro de 0,2 μm usando un kit estándar de ensayo inmunoabsorbente

ligado a enzimas (ELISA) de SDF-1 de acuerdo con las especificaciones del fabricante (R & D Systems, Minneapolis, MN).

Construcción de una biblioteca de hibridación de sustracción de ADNc de BMSSC.

5 En estudios preliminares, se aislaron células de médula de expresión de STRO-1dull (glóbulos rojos nucleados con glicoforina A+) y células de expresión de STRO-1bright (población de UFC-F) mediante el procedimiento MACS/FACS como se describe en "Purification of BMSSCs." El ARN total se preparó a partir de células STRO1bright y STRO-1dull agrupadas a partir de 5 muestras de médula diferentes (2 hombres y 3 mujeres, de entre 19 y

10 32 años) utilizando el sistema RAT STAT-60 (TEL-TEST). La sintetización de primera cadena se realizó usando el kit de síntesis de ADNc SMART (Clontech Laboratories). El híbrido resultante de ARNm/ADNc monocatenario se amplificó mediante PCR a larga distancia (kit Advantage 2 PCR; Clontech) utilizando sitios de cebadores específicos en los extremos de cebador 3' y 5' formados durante el proceso de RT inicial de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Después de la digestión con RsaI del ADNc de STRO-1bright, se usaron 2 alícuotas para ligar diferentes

15 oligonucleótidos adaptadores específicos usando el kit de sustracción de ADNc de PCR-Select de Clontech. Se realizaron dos rondas de hibridación sustractiva utilizando el ADNc de STRO-1bright (probador) y STRO-1dull (controlador), y viceversa, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Este procedimiento también se realizó en sentido inverso usando el ADNc del probador STRO-1dull hibridado contra el ADNc del controlador STRO-1bright.

20 Cribado diferencial de la biblioteca de sustracción de BMSSC.

Para identificar genes expresados de manera única por la población de BMSSC STRO-1bright, el ADNc restado de STRO-1bright se ligó en un vector de clonación T/A (kit de clonación por PCR AdvaTAge, Clontech) y luego se transformó en Escherichia coli DH5α. Se amplificaron doscientos clones bacterianos resistentes a la ampicilina 25 seleccionados al azar mediante PCR usando el Kit de selección diferencial PCR-select de Clontech según las especificaciones del fabricante. En resumen, el ADNc se usó para construir réplicas de filtros de micromatrices de baja densidad (membranas Zeta-probe GT, BioRad, Hercules, CA) usando un sistema de vacío de colector de formato BRL Hybri-dot de 96 pocillos según las recomendaciones del fabricante. El ADNc sustraído de STRO-1bright y sustraído de STRO-1dull se desnaturalizó a 95 ºC y después se marcaron con 50 µCi (1,85 MBq) de α-[32P] dCTP

30 (3000 Ci [1.85 MBq]/mmol; ICN Radiochemicals, Irvine, CA) usando la enzima Klenow (exo-; 5 U) durante 40 minutos a 37 ºC. Las sondas de ADN se hibridaron para replicar filtros durante una noche a 72 ºC, usando Clontech Express Hyb. Los filtros se lavaron 4 veces con 2 x citrato de solución salina estándar (SSC)/dodecil sulfato sódico al 0,5 % (SDS) y 2 veces con 0,2 x SSC/SDS al 0,5 % a 68 ºC, después se exploraron usando un PhosphoImager y se analizaron usando el software ImageQuant (Molecular Dynamics).

Diferenciación de CFU-F in vitro.

Se han indicado previamente las condiciones para la inducción de células estromales de BM humanas para desarrollar una matriz ósea mineralizada in vitro cultivada en α-MEM complementado con FCS al 10 %, L-ascorbato

40 2-fosfato 100 μM, dexametasona 10-7 M y Fosfato inorgánico 3 mM (Gronthos et al., Blood. 84: 4164-4173, 1994).

Ensayo de formación ósea ectópica.

Las células adherentes derivadas de células mononucleares de médula ósea clasificadas por STRO-1bright en el

45 paso 2 a 3 se tripsinizaron, se mezclaron con 40 mg de partículas cerámicas de hidroxiapatita/fosfato tricálcico (Zimmer, Varsovia, IN) y luego se implantaron en bolsas subcutáneas en el superficie dorsal de ratones diabéticos no obesos/inmunodeficientes combinados graves (NOD/SCID) de 8 semanas de edad como se ha descrito previamente (Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003). Estos procedimientos se realizaron de acuerdo con las especificaciones de un protocolo animal aprobado (The University Adelaide AEC n.º M29/2002). Los implantes se

50 recuperaron después de 8 semanas, se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 2 días y luego se descalificaron durante diez días más en EDTA al 10 % antes de incrustarse en parafina. Cada trasplante se cortó en 2 piezas, luego se colocó la superficie cortada hacia abajo para su inclusión en parafina. Para el análisis histológico, se prepararon secciones de 5 μm de los implantes y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) representativas del medio y del extremo de cada trasplante, de aproximadamente 3 a 4 mm de longitud. La cantidad de formación de

55 hueso nuevo se calculó como un porcentaje del área superficial total presente en 12 secciones de tejido. La medición de la nueva formación de hueso se evaluó utilizando el software Scion Imaging (Frederick, MD) como se ha descrito previamente (Shi et al. Nat Biotechnol. 20: 587-591, 2002).

Estadística.

La prueba t de Student se usó para comparaciones por parejas como se indica. La significación estadística se dio en P menor de 0,05. Se usó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparaciones múltiples como se indicó. La significación estadística entre los grupos se determinó utilizando la prueba de diferencia de menor importancia proyectada de Fisher en P menor de 0,05.

EJEMPLO 1: Las células cultivadas Stro-1dim están más comprometidas, mientras que las células Stro-1bri son células precursoras menos comprometidas.

Se ha indicado previamente que las células precursoras mesenquimales multipotenciales (MPC) pueden purificarse

10 a partir de células mononucleares de médula ósea humana adulta en función del fenotipo STRO-1bri/VCAM-1 (CD106)+ o STRO-1bri/MUC-18 (CD146)+ (Gronthos et al. J. Cell Sci 116:1827-1835, 2003; Shi y Gronthos JBMR 18(4): 696-704, 2003; documento PCTAU2004/000416). La población de MPC puede expandirse fácilmente in vitro en condiciones de cultivo definidas (Gronthos et al. J. Cell Sci 116:1827-1835, 2003). Ahora se presentan datos que caracterizan a la progenie de MPC expandida ex vivo en función de los marcadores asociados con diferentes linajes

15 celulares, tanto a nivel de ARNm como de proteína, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) y el análisis de citometría de flujo, respectivamente. Mientras, todas las MPC de médula ósea recién aisladas expresan STRO-1 a niveles altos (Stro-1bri), la mayoría de las células redulen la expresión de STRO-1 (Stro-1dim) después de la expansión ex vivo (Gronthos et al. J. Cell Sci 116:1827-1835, 2003). En la primera serie de experimentos, se empleó un análisis semi-cuantitativo de RT-PCR para examinar el perfil de

20 expresión génica de diversos genes asociados al linaje expresados por las poblaciones de STRO-1dim o STRO-1bri , aislados mediante clasificación celular activada por fluorescencia (Figura 1A). La expresión génica relativa para cada marcador celular se evaluó con referencia a la expresión del gen de mantenimiento, GAPDH, usando el software ImageQant (Figura 1B, C). Además, se utilizó el análisis de citometría de flujo de doble color para examinar el perfil de expresión de proteínas de MPC expandida ex vivo en función de su expresión de un rango más amplio de

25 marcadores asociados al linaje celular junto con el anticuerpo STRO-1 (Figura 2). En la Tabla 3 se presenta un resumen del fenotipo general basado en la expresión génica y de proteínas de las células cultivadas STRO-1dim y STRO-1bri. Los datos indican que las MPC STRO-1bri expandidas ex vivo muestran una expresión diferencialmente mayor de marcadores asociados con células perivasculares, incluyendo angiopoyetina-1, VCAM-1, SDF-1, IL-1β, TNFα y RANKL. Por el contrario, las células expandidas ex vivo STRO-1dim expresaron niveles más altos de nestina,

30 GFAP, osterix, osteocalcina, SOX9, GATA-4, leptina y cadena pesada de miosina de músculo liso. Por lo tanto, parece que las MPC STRO-1bri expandidas ex vivo muestran un fenotipo similar más inmaduro y de tipo perivascular en comparación con las células STRO-1dim que muestran un fenotipo característico de tipos de células precursoras más comprometidas que incluyen condroblastos, osteoblastos, adipoblastos, células epiteliales, progenitores neurales y cardiomioblastos. Las comparaciones entre la proteína y los perfiles de expresión génica de las células

35 STRO-1dim y STRO-1bri cultivadas se resumen en las Tablas 3 y 4.

EJEMPLO 2: Capacidad diferencial de las células cultivadas STRO-1dim y STRO-1bri para diferenciarse in vitro.

40 A continuación, se examinó si las diferencias observadas en los perfiles de expresión génica y de proteínas de las células STRO-1dim y STRO-1bri cultivadas era un reflejo de cualquier diferencia funcional en su capacidad para diferenciarse en múltiples linajes celulares. Los cultivos de células derivadas de STRO-1bri/CD146+ expandidas ex vivo se aislaron por FACS en base a su expresión del antígeno STRO-1 como se ha descrito anteriormente. Las células cultivadas STRO-1dim y STRO-1bri aisladas por FACS se pusieron en placas posteriormente en condiciones

45 inductivas para formación de grasa (Figura 3), hueso (Figura 4) y cartílago (Figura 5). En todos los casos, las células cultivadas STRO-1bri mostraron una mayor capacidad para formar grasa, hueso y cartílago bajo las condiciones especificadas en comparación con las células cultivadas STRO-1dim. Los datos de estos experimentos, corroboran los resultados de la expresión génica y de proteínas obtenidos anteriormente, lo que demuestra que las células cultivadas con STRO-1bri son una población primitiva que contiene una alta proporción de células precursoras menos

50 comprometidas que pueden influirse para diferenciarse hacia cualquier linaje celular especificado en las condiciones de cultivo apropiadas (Figuras 3, 4, 5) y se pueden denominar MPC. Por el contrario, las células cultivadas STRO

1dim

contienen una alta proporción de células comprometidas representativas de diversos linajes y pueden denominarse TSCC. Se propone que la población de Stro-1dim sea heterogénea y comprenda células comprometidas por separado en un rango de diferentes tipos de tejidos.

55 EJEMPLO 3: Las células STRO-1bri pueden modificar el potencial de crecimiento de células comprometidas específicas de tejido in vitro e in vivo.

La identificación de las dos poblaciones de células derivadas de MPC expandidas ex vivo diferentes representativas 60 de diferentes fases de desarrollo tiene implicaciones significativas en el uso de preparaciones cultivadas completas

derivadas de células Stro-1bri para terapias clínicas. Los estudios iniciales se diseñaron para examinar la influencia de MPC cultivadas primitivas, menos comprometidas STRO-1bri en el crecimiento de TSCC cultivadas STRO-1dim más maduras y comprometidas. Los experimentos se diseñaron para añadir porcentajes crecientes de MPC cultivadas STRO-1bri aisladas por FACS con TSCC cultivadas STRO-1dim aisladas por FACS, previamente marcadas 5 con una etiqueta fluorescente, CFSE. La Figura 6 muestra que la proliferación de células STRO-1dim marcadas se realiza mediante la presencia de células STRO-1bri sin marcar. Cuando una célula marcada con CFSE se divide, las dos células secundarias contienen la mitad de la fluorescencia de la célula precursora. Por lo tanto, las diferentes generaciones de células secundarias se representan como distribuciones fluorescentes con una intensidad de fluorescencia proporcionalmente decreciente, donde la curva en el extremo derecho del histograma (cruzada por la 10 línea vertical) representa el punto de la población inicial de STRO-1dim (Figura 6). Los datos demostraron que se estimuló una mayor proporción de células STRO-1dim para aumentar sus tasas de proliferación, donde se demostró que más células experimentaban al menos 3 a 4 divisiones, después de la adición de más del 5 % de células STRO1bri. Por lo tanto, se deduce que para obtener una expansión ex vivo sostenible y eficiente de células derivadas de MPC no fraccionadas, los cultivos requieren la presencia de más del 5 % de células STRO-1bri dentro de la

15 población.

Se realizaron más investigaciones para determinar si las MPC cultivadas STRO-1bri más primitivas y menos comprometidas también pueden influir en la capacidad de proliferación de TSCC in vivo. Se utilizaron dos modelos in vivo para abordar esta cuestión. El primer modelo empleó ratas atímicas sin pelo que habían sido sometidas a 20 ligadura de la arteria coronaria descendente anterior (LAD) y se les inyectó 48 horas más tarde solución salina, células STRO-1dim y STRO-1bri humanas cultivadas aisladas por FACS y aspirados recién preparados de células mononucleares de médula ósea de hueso con depleción de STRO-1 (Figura 7). Después de dos semanas, se sacrificaron los animales, se fijaron los tejidos cardiacos y se tiñeron concomitantemente con dos anticuerpos monoclonales: siendo el primero reactivo selectivamente con el antígeno Ki67 de rata, pero no de humano, y siendo

25 el segundo reactivo con el marcador de cardiomiocitos troponina I. Se detectaron células teñidas duales, indicativas de la proliferación de cardiomiocitos de rata, mediante técnica de inmunoperoxidasa. Los animales que recibieron células humanas STRO-1bri demostraron 2,5-5 veces mayor número de cardiomiocitos de rata en proliferación en comparación con los animales de control que recibieron solución salina o células humanas STRO-1dim (Figura 7).

30 El segundo modelo utilizó ratas atímicas sin pelo inyectadas por vía subcutánea con células tumorales de glioblastoma de rata, que secretan constitutivamente VEGF. Dos semanas después, las ratas recibieron inyecciones intratumor con solución salina, células humanas STRO-1dim o STRO-1bri aisladas por FACS (Figura 8). Una semana más tarde, se sacrificaron los animales, se fijaron los tejidos tumorales y se tiñeron concomitantemente con dos anticuerpos monoclonales: siendo el primero reactivo con el antígeno de actina alfa-músculo liso expresado por

35 células de músculo liso y siendo el segundo reactivo con el antígeno vWF expresado por células endoteliales vasculares. Se detectaron estructuras teñidas duales, indicativas de arteriolas y arterias que contenían tanto endotelio como músculo liso, mediante técnica de inmunoperoxidasa. Los animales que recibieron células humanas STRO-1bri demostraron un número de arteriolas y arterias de 3,5-8 veces mayor en el sitio de inyección celular en los tumores en comparación con los animales de control que recibieron solución salina o células humanas de STRO-1dim

40 (Figura 8). No se observaron diferencias en los sitios distales en los que se habían inyectado las células humanas.

EJEMPLO 4: Aumento del número de MPC STRO-1bri MPC en cultivos celulares derivados de células positivas para STRO-1.

45 Después de demostrar la capacidad de las MPC cultivadas STRO-1bri para aumentar la proliferación de más TSCC, a continuación se examinó el efecto de un rango de factores de crecimiento para aumentar la proporción de MPC STRO-1bri expandido ex vivo (Figura 9). Se cultivaron cultivos establecidos derivados de células de médula ósea STRO-1bri/CD146+ aisladas en medio basal suplementado con FCS al 10 % (A) o un rango de factores, incluyendo 1 x 10-8 1α,25-dihidroxivitamina D3 (1,25D) (B), 10 ng/ml Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (C), 10

50 ng/ml Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (D); 10 ng/ml de interleucina-1β (IL-1β (E) y 30 ng/ml de factor derivado del estroma 1-alfa (SDF-1α) (F), durante 5 días, se tiñeron con STRO-1 mAb. (Figura 9). Se encontró que estos factores mejoran en gran medida el número de MPC STRO-1bri in vitro.

Para investigar los mecanismos de cómo estos factores potenciaron el porcentaje de células que expresan STRO

55 1bri después de la expansión ex vivo, las Stro-1bri cultivadas se marcaron con CFSE como se describe en el método y luego se expusieron a los diversos factores. La Figura 10 muestra un experimento representativo, donde IL-1β aumentó el potencial proliferativo de MPC marcado con CFSE como se describe en los métodos. Las células se cultivaron en presencia de 10 ng/ml de IL-1β durante 5 días, se tiñeron con STRO-1 mAb y se analizaron como se ha descrito anteriormente. Se encontró que IL-1β potenciaba el número de divisiones de MPC aumentando el

60 número de células osteoprogenitoras STRO-1+. También se obtuvieron resultados similares y se usaron 1,25D,

PDGF-BB, TNF-α, IL-1 β y SDF-1 α para estimular las MPC.

EJEMPLO 5: El aumento de la proliferación de células Stro-1bri también aumenta el número de células Stro

1dim .

5 La capacidad de potenciar la proporción de MPC cultivadas STRO-1bri en presencia de diversos factores también se correlacionó con un aumento en el número de células Stro-1dim. Por ejemplo, las células STRO-1bri/Alk Phos+ (Figura 10B), un fenotipo consistente con las células pre-osteoblásticas (Gronthos et al., J Bone Miner Res. 14: 47-56, 1999; Pan et al., Bone 34(1):112-23, 2004). Por lo tanto, se examinó si este cambio en el fenotipo también se correlaciona

10 con una mayor capacidad de las MPC STRO-1bri para diferenciarse en células formadoras de hueso, osteoblastos. La Figura 11 muestra que IL-1β no solo estimuló la proliferación de MPC positivas para STRO-1, sino que también mejoró su potencial de formación de hueso en presencia del agente osteoinductor, dexametasona. IL-1β a una concentración de 0,01 ng/ml aumentó significativamente el número de MPC a 136,6 ± 1,2 % de los cultivos de control no tratados (Figura 11A). Se consiguió un efecto de meseta a concentraciones superiores a 0,1 ng/ml. Se

15 sembró la progenie expandida ex vivode MPC en placas de 24 pocillos en presencia de condiciones osteoinductoras, como se describe en los métodos. Las células también se trataron con IL-1β a una concentración de 10 ng/ml y los cultivos se "alimentaron" semanalmente con medio recién preparado que contenía IL-1β. La concentración de calcio de la matriz extracelular absoluta se determinó de acuerdo con los métodos. Los resultados mostraron que la deposición mineral se aumentó en las células tratadas con IL-1β (Figura 11C) en comparación con las células no

20 tratadas (Figura 11B). El nivel de calcio en las células tratadas con IL-1β fue significativamente mayor que en las células no tratadas tanto en la semana 4 como la semana 6.

Los datos presentados en la Figura 12 sugieren que IL-1β estimuló la proliferación y MPC STRO-1Bri, dando como resultado una expansión de oetoprogenitores, mientras que la posterior adición de un agente de diferenciación 25 secundario, dexametasona, indujo la expresión de fosfatasa alcalina (ALP) y la pérdida de la expresión de STRO-1 mejoró de manera eficaz el número de osteoblastos funcionales in vitro. El concepto de que diferentes factores pueden expandirse y regular la población de MPC STRO-1Bri se ensayó adicionalmente in vivo. Se cultivaron cultivos secundarios semi-confluentes de MPC Stro-1bri expandidas ex vivo, en presencia o ausencia de PDGF-BB (10 ng/ml), un factor adicional conocido por mejorar el número de MPC SCO-1Bri expandidas ex vivo (véase la figura 9C).

30 Las preparaciones de células inducidas por PDGF y no inducidas se co-transplantaron posteriormente con partículas de hidroxipapita/fosfato tricálcico (HA/TCP) en ratones inmunocomprometidos como se describe en los métodos. Después de ocho semanas, el examen de los trasplantes cosechados mostró que los cultivos tratados previamente con PDGF-BB mostraban significativamente más formación de hueso ectópico (Figura 13C) en comparación con los cultivos de control no tratados (Figura 13B) según lo cuantificado por Scion Imaging (Figura 13A).

EJEMPLO 6: Las BMSSC humanas purificadas expresan altos niveles de SDF-1.

Se ha usado previamente la hibridación por sustracción para aumentar la frecuencia de genes expresados diferencialmente en poblaciones celulares raras (Xu et al., Cancer Res. 60: 1677-1682, 2000; Kingsley et al., Dev 40 Growth Differ. 43: 133-143, 2001). En el presente estudio, STRO-1dull (glóbulos rojos nucleados con glicoforina-A+) y la fracción menor de células de médula de expresión de STRO-1bright (que incluye todas las BMSSC formadoras de colonias) se aislaron, usando un procedimiento combinado MACS/FACS como se ha descrito previamente (Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003) (Figura 14A). Para cada población de STRO-1 ordenada, se preparó RNA total a partir de 5 donantes individuales de médula ósea y se agruparon. Siguiendo la síntesis de la primera cadena, 45 el ADNc de STRO-1bright y STRO-1dull se sometió a una serie de etapas de hibridación sustractiva como se describe en "Materiales y métodos". Para identificar los genes expresados de manera única por la población de BMSSC STRO-1bright, se usó ADNc sustraído de STRO-1bright para construir réplicas de filtros de micromatrices de baja densidad que comprendían 200 clones bacterianos seleccionados al azar transformados con los ADNc sustraídos de STRO-1bright ligados a un vector de clonación T/A. La micromatrices se sondaron posteriormente con ADNc marcado 50 con [32P] dCTP sustraído de STRO-1bright o STRO-1dull (Figura 14B-C). El cribado diferencial identificó un total de 44 clones, que se expresaron de manera muy diferencial entre las subpoblaciones de STRO-1dull y STRO-1bright. La secuenciación de ADN de todos los clones expresados diferencialmente reveló que únicamente 1 clon era representativo de un mitógeno de células estromales conocido; concretamente, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (Gronthos y Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995). Curiosamente, se encontró que 6 de los 44

55 clones contenían inserciones de ADN correspondientes a la quimiocina, factor 1 derivado del estroma (SDF-1). La alta abundancia de transcritos de SDF-1 en BMSSC humanas se confirmó mediante RT-PCR semicuantitativa del ARN total, preparado a partir de subpoblaciones de médula ósea de STRO-1bright, STRO-1dull, y STRO-1negativas recientemente clasificadas (Figura 14D).

60 EJEMPLO 7: SDF-1 se expresa preferencialmente por poblaciones estromales inmaduras in vitro.

A continuación se examinó si la expresión de SDF-1 se correlacionó con la fase de desarrollo de BMSSC in vitro. Los niveles de expresión de SDF-1 se evaluaron en diferentes poblaciones estromales utilizando un modelo in vitro establecido de diferenciación osteogénica, basado en la expresión de la superficie celular de STRO-1 y fosfatasa 5 alcalina (AP) (Gronthos et al., J Bone Miner Res. 14: 47-56, 1999; Stewart et al., J Bone Miner Res. 14: 1345-1356, 1999; Pan et al., Bone. 34(1):112-23, 2004). Se usó FACS de dos colores para dividir las diferentes subfracciones de BMSSC STRO-1/AP de acuerdo con las regiones de clasificación (R1-R4) representadas en la Figura 15A. Cada subfracción STRO-1/AP se ordenó por duplicado para obtener una pureza superior al 99,9 %. La RT-PCR semicuantitativa que examina la expresión de SDF-1 se realizó posteriormente sobre el ARN total aislado de cada

10 población clasificada STRO-1/AP. El análisis reveló que la población del estroma más inmadura STRO-1+/AP(osteoprogenitores) seguida de STRO-1+/AP+ (preosteoblastos) expresó niveles más altos de SDF-1 en comparación con las poblaciones celulares más maduras, STRO-1-/AP+ (osteoblastos) y STRO-1-/AP-(osteocitos, células de revestimiento óseo) cuando se normalizó con respecto al gen de mantenimiento GAPDH (Figura 15B).

15 En experimentos paralelos, los cultivos secundarios de BMSSC, complementados con medios inductivos osteogénicos (complementados con L-ascorbato-2-fosfato, dexametasona y fosfato inorgánico), demostraron una disminución en la expresión de SDF-1 de una manera dependiente del tiempo (Figura 16A). Los datos revelaron que los niveles más bajos de expresión de SDF-1 se correlacionaron con una mayor proporción de células tipo preosteoblasto (STRO-1+/AP+), después de 48 horas de estimulación con medio de inducción osteogénico (Figura

20 16B).

EJEMPLO 8: Las BMSSC expresan el receptor de SDF-1, CXCR4.

Para determinar si SDF-1 podría actuar como un factor autocrino, los experimentos preliminares que usaron el

25 análisis de RT-PCR confirmaron que las BMSSC de hecho expresan el receptor SDF-1, CXCR4 (Figura 17A). El examen de la expresión de CXCR4 por BMSSC cultivadas normales y la línea celular de osteosarcoma humano, MG63, revelaron una expresión variable del producto esperado de PCR de 568 pares de bases y una segunda banda más grande. El análisis de la secuencia de ADN confirmó que la banda inferior correspondía a la isoforma de CXCR4 humana normal, mientras que la banda más grande correspondía a una variación de corte y empalme

30 alternativa informada previamente (Gupta y Pillarisetti, J Immunol. 163: 2368-2372, 1999). También se demostró que las BMSSC expresaban constitutivamente bajos niveles de proteína CXCR4 en la superficie celular como se muestra mediante el análisis de citometría de flujo (Figura 17B). Se realizaron estudios de movilización de calcio para determinar si CXCR4 expresado por las BMSSC eran funcionalmente activos. Las BMSSC cargadas con FURA-2 se estimularon con 30 ng/ml de SDF-1α humano recombinante (rhSDF-1α), dando como resultado un aumento rápido y

35 robusto de los niveles de calcio intracelular característicos de la señalización SDF-1/CXCR4 (Figura 17C).

EJEMPLO 9: La sobreexpresión de SDF-1 aumenta el potencial de las BMSSC para formar hueso ectópico in vivo.

40 Para determinar si SDF-1 tenía algún papel funcional en el desarrollo de células estromales, se usaron construcciones de expresión retroviral que contenían el ADNc de SDF-1 humano de longitud completa para transfectar la línea celular de empaquetamiento PT67 como se describe en "Materiales y métodos". El sobrenadante recogido que contenía partículas infecciosas se usó entonces para generar líneas celulares de BMSSC derivadas de múltiples colonias estables que expresaban altos niveles de SDF-1α y líneas celulares de control correspondientes

45 transducidas con el vector pLNCX2 vacío (Figura 18A).

Se implantaron líneas celulares derivadas de 3 aspirados individuales de médula ósea en ratones inmunocomprometidos junto con partículas de hidroxiapatita/fosfato tricálcico, como se describe en "Materiales y métodos". El análisis de Scion Imaging de las secciones histológicas de los implantes cosechados mostró niveles

50 significativamente mayores (P <0,05, prueba t) de la formación ósea ectópica por área en aquellos trasplantes que contenían líneas de BMSSC de expresión de SDF-1 en comparación con los controles vectoriales (Figura 18C )

Se realizaron estudios paralelos para identificar los mecanismos potenciales de la capacidad de formación ósea mejorada mediada por SDF-1 observada. Sorprendentemente, no pudimos detectar ninguna diferencia estadística 55 en la capacidad de las BMSC de alta expresión de SDF-1 para formar depósitos mineralizados de hidroxiapatita in vitro por encima de las líneas celulares de control del vector (datos no mostrados). Además, no se detectaron diferencias consistentes en la expresión de varios genes asociados a los huesos (BMP2, BMP4, CBFA1, osterix, osteocalcina, fosfatasa alcalina [AP]) entre las líneas de BMSSC de alta expresión de SDF-1 y de control vectorial correspondiente (datos no mostrados). Colectivamente, estos datos sugerían que SDF-1 impuso un efecto indirecto

60 sobre la formación ósea in vivo.

EJEMPLO 10: SDF-1 media el crecimiento y la supervivencia de las BMSSC.

A continuación, se examinó la posibilidad de que la sobreexpresión de SDF-1 pueda proporcionar una ventaja de

5 crecimiento o supervivencia a las BMSSC transducidas. Esta noción fue respaldada por estudios de proliferación que demostraron que las BMSSC de alta expresión de SDF-1 mostraron un aumento moderado pero no significativo en su capacidad de crecimiento por encima de las líneas celulares de control de vector de las BMSSC (Figura 19A). Además, las líneas de BMSSC que sobreexpresaban SDF-1 también mostraron una mayor resistencia a los efectos inductores de la apoptosis de la citocina inflamatoria, IL-4, que previamente se había demostrado que inhibía el

10 crecimiento de las BMSSC in vitro (Gronthos y Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995), según lo evaluado por el método de captación de azul de tripano (Figura 19B). De acuerdo con estos hallazgos, los cultivos vivos de sobreexpresión de BMSSC SDF-1 también mostraron una disminución de la tinción de la superficie celular del marcador de apoptosis temprana, anexina V, cuando se estimuló con IL-4 (Figura 19C-D).

15 Los experimentos comparativos se realizaron posteriormente para determinar los efectos de SDF-1 exógeno en el crecimiento de BMSSC normales. Las células de médula ósea positivas para STRO-1 purificadas se cultivaron en condiciones privadas de suero, previamente demostraron que mejoraban la formación de las células precursoras mesenquimales identificables más tempranas, (UFC-F, unidad formadora de colonias fibroblásticas), en presencia de PDGF-BB a niveles comparables a los cultivos repletos de suero (Gronthos et al. J Cell Sci. 116: 1827-1835, 2003;

20 Gronthos y Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995). Si bien el rhSDF-1α exógeno no mostró capacidad inherente para estimular la producción de colonias en solitario, se observó un aumento en el número de UFC-F en combinación con PDGF-BB (Figura 20). Además, la adición del conocido inhibidor de UFC-F, α-interferón 2a (Gronthos y Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995; Wang et al., Am J Hematol. 40: 81-85. 1992) demostró un declinación típica en la formación de colonias inducida por PDGF-BB, que se demostró que era parcialmente reversible en presencia de

25 SDF-1. Se encontró que la respuesta observada en presencia de SDF-1 era óptima a 30 ng/ml en un rango de concentración de 0,1 a 100 ng/ml (Figura 21). Colectivamente, estos datos sugieren que SDF-1 desempeña un papel en la promoción de la capacidad de autorrenovación y supervivencia de las BMSSC.

Análisis

30 El presente estudio demuestra por primera vez que las BMSSC detectables más tempranas aisladas directamente de aspirados de médula ósea humana expresan altos niveles de SDF-1 antes del cultivo. Se ha informado previamente que las BMSSC multipotenciales están localizadas dentro del microambiente de la médula ósea entre las células perivasculares de los vasos sanguíneos grandes (Shi y Gronthos, J Bone Miner Res. 18: 696-704, 2003).

35 Estas observaciones se corresponden con el patrón de distribución publicado de SDF-1 en la médula ósea humana, donde los niveles más altos de SDF-1 se expresan por las células que rodean los vasos sanguíneos, incluyendo las regiones periarteriales y los capilares sanguíneos del hueso, y por algunas células de estroma de médula ósea cercanas al endostio en sitios de mielopoyesis temprana y desarrollo de linfocitos B (Ponomaryov et al., J Clin Invest.

106: 1331-1339, 2000; Petit et al., Nat Immunol. 3: 687-694, 2002; Salvucci et al., Blood 99: 2703-2711, 2002). Es

40 importante destacar que las poblaciones de células osteogénicas maduras ubicadas en las superficies óseas, u osteocitos dentro de la matriz ósea, parecen carecer de expresión de SDF-1 in situ (Ponomaryov et al., J Clin Invest.

106: 1331-1339, 2000).

El trabajo anterior de Stewart et al (Stewart et al., J Bone Miner Res. 14: 1345-1356, 1999) y el laboratorio de los

45 inventores (Gronthos et al., J Bone Miner Res. 1999; 14: 47-56, 1999; Pan et al., Bone. 34(1):112-23, 2004) ha demostrado que las células pre-osteogénicas tempranas existen en cultivos estromales normales que expresan el marcador mesenquimal de células madre, STRO-1, pero carecen de la expresión del marcador asociado a osteoblastos, fosfatasa alcalina. La progresión de estas poblaciones de células precursoras hacia un fenotipo osteoblástico maduro y funcional se correlaciona con la pérdida de la expresión de STRO-1 y una adquisición de la

50 expresión de la superficie celular de AP (Gronthos et al., J Bone Miner Res. 1999;14: 47-56, 1999; Stewart et al., J Bone Miner Res. 14: 1345-1356, 1999). Usando este modelo in vitro de diferenciación celular osteogénica, se ha demostrado que las células BMSSC cultivadas, representativas de las poblaciones osteogénicas comprometidas, mostraron niveles disminuidos de SDF-1 en comparación con más fracciones inmaduras de BMSSC STRO-1+ inmaduras. Además, hubo una disminución significativa de la expresión de SDF-1 después del tratamiento de

55 BMSSC con medios de inducción osteogénicos, lo que proporcionaba una evidencia adicional de que la alta expresión de SDF-1 está vinculada con una etapa más primitiva y menos comprometida de diferenciación preosteogénica. Colectivamente, nuestros datos sugieren que SDF-1 puede actuar para localizar poblaciones de BMSSC primitivas no comprometidas dentro de su nicho perivascular hasta que se requiera la proliferación y diferenciación en respuesta a señales ambientales que pueden actuar para interrumpir las interacciones de SDF

60 1/CXCR4.

Aunque se cree que SDF-1 es crítico en la hematopoyesis normal, la inflamación y la metástasis de diversos tumores, se sabe poco sobre el papel de SDF-1 en el crecimiento o la diferenciación de BMSSC.

5 SDF-1 media sus efectos a través de su receptor, CXCR4, una glicoproteína transmembrana, perteneciente a la familia de moléculas acopladas a proteínas G, donde CXCR4 también actúa como el principal co-receptor del virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 (Bleul et al., Nature 382: 829-833, 1996; Oberlin et al., Nature 382: 833-835, 1996; Ma et al., Proc Natl Acad Sci USA. 95: 9448-9453, 1998). De manera interesante, se observaron 2 variantes de corte y empalme de CXCR4 tanto en BMSSC cultivadas normales como en la línea celular de osteosarcoma

10 humano, MG63. El análisis de la secuencia de ADN confirmó que la variante de corte y empalme más pequeña correspondía al ADNc de CXCR4 humano normal que incluía los exones 1 y 2, la forma abundante encontrada en BMSSC normales. Por el contrario, la variante de corte y empalme más grande, que se encontró que era muy abundante en células MG63, correspondía a una variación de corte y empalme alternativa previamente descrita, generada a través de la inclusión de la secuencia de ADN transcrita del intrón de cruce, dando como resultado la

15 adición de otros 9 aminoácidos (Bleul et al., Nature 382:(Gupta et al., J Immunol. 163: 2368-2372, 1999). Los estudios de distribución de tejidos demostraron que la transcripción más pequeña era la isoforma predominante de CXCR4 encontrada en tejidos normales, mientras que la transcripción más grande estaba altamente expresada en diversas líneas celulares leucémicas y de carcinoma (Gupta et al., J Immunol. 163: 2368-2372, 1999). Aunque ambas variantes de corte y empalme están activas, aún no se ha determinado la importancia funcional de la

20 transcripción CXCR4 más grande, pero puede relacionarse con la importancia de SDF-1/CXCR4 en el desarrollo como mecanismo para compensar cualquier error que pueda producirse en el corte y empalme de CXCR4 durante el desarrollo embrionario.

En el presente estudio, se demostró que las BMSSC expresaron constitutivamente bajos niveles de superficie celular

25 de la proteína funcional CXCR4 como se muestra mediante análisis de citometría de flujo y estudios de movilización de calcio. Por lo tanto, la señalización de SDF-1/CXCR4 puede desempeñar un papel crítico en la regulación del crecimiento y la migración de BMSSC.

En el presente estudio también se demostró que la mayoría de las BMSSC expandidas ex vivo comienzan a

30 experimentar una diferenciación osteogénica parcial, lo que se correlaciona con una disminución en la expresión de SDF-1. Esta maduración pareció aumentar la susceptibilidad de las BMSSC a factores que inducen la apoptosis. Nuestros estudios mostraron que las líneas de BMSSC que sobreexpresaban SDF-1 mostraron una mayor protección contra los efectos apoptóticos de IL-4, que previamente demostraron una inhibición del crecimiento de BMSSC in vitro (Gronthos y Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995). Experimentos similares demostraron que las

35 líneas de BMSSC de alta expresión de SDF-1 fueron más resistentes a la inducción de la apoptosis temprana en presencia de IL-4.

El presente estudio confirmó la ventaja de la supervivencia y el crecimiento transmitida por SDF-1 en las células precursoras mesenquimales identificables más tempranas, células de médula ósea STRO-1bright recién aisladas que 40 contienen la población UFC-F. Si bien el rhSDF-1α exógeno no mostró capacidad inherente para estimular la producción de colonias en solitario, se observó un aumento en el número de UFC-F cuando se añadió junto con PDGF-BB. El efecto variado de SDF-1 en las tasas de crecimiento entre diferentes poblaciones de BMSSC puede deberse a diferencias en la fase de desarrollo de las BMSSC primitivas recién aisladas frente a células estromales expandidas ex vivo más maduras. Por lo tanto, PDGF y SDF-1 pueden actuar en sinergia para promover la

45 autorrenovación y la capacidad de supervivencia de las BMSSC.

Cualquier análisis de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares que se ha incluido en la presente memoria descriptiva tiene únicamente el fin de proporcionar un contexto para la presente invención. No debe interpretarse como una admisión de que cualquiera o todos estos asuntos forman parte de la base de la

50 técnica anterior o eran de conocimiento general común en el campo relevante para la presente invención tal como existía antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

Tabla 1. Anticuerpos usados en esta patente

TIPO DE CÉLULA

ANTÍGENO FUENTE ISOTIPO DILUCIÓN

Musculoesquelética

Myo D Santa Cruz Conejo Ig 1/50

Desmina

DAKO IgG1 10 ug/ml

Músculo liso

SMMHC Sigma mIgG1 Acitos 1/500

SMHC -FAST

Sigma mIgG1 l0 ug/ml

alfaSMAC

DAKO mlgG2a 10 ug/ml

PDGF-R

Pharmigen mlgG 10 ug/ml

Vimentina

DAKO mIgG1 10 ug/ml

Condrocitos

Colágeno de tipo II Chemicon mIgG1 10 ug/ml

Colágeno IX

Chemicon mIgG2A 10 ug/ml

Agrecano

Chemicon mIgG1 10 ug/ml

Proteína de unión

DSHB ratón IgG2b 10 ug/ml

S-100

Chemicon conejo Ig 1/100

Biglicano

Dr. Larry Fisher NIH CONEJO Ig 1/500

Fibroblastos basales

Laminina Chemicon mIgG1 10 ug/ml

Colágeno de tipo IV

DAKO mIgG1 10 ug/ml

Versicano

DHSB 12C5 IgG1 10 ug/ml

Células endoteliales

vWF DAKO IgG1 ratón

VCAM-1

Chemicon IgG1 6G10 10 ug/ml

Endoglina

BD IgG1 10 ug/ml

MUC18

Interno CC9 IgG2a 10 ug/ml

CD31

DAKO IgG 10 ug/ml

CD34

DAKO mIgG1 10 ug/ml

SDF-1

R&D IgG1 10 ug/ml

Cardiomiocitos

calponina Chemicon IgG1 10 ug/ml

Troponina I

Accurate Chem y Sci Corp IgG1 10 ug/ml

Troponina C

Chemicon mIgG2a 10 ug/ml

Neuronas

NCAM DAKO IgG2a 10 ug/ml

GFAP

DAKO mIgG1 10 ug/ml

Neuroanalasa

DAKO CONEJO Ig 1/200

Neurofilamento

DAKO IgG1 10 ug/ml

Hueso

AP DSHB mIgG1 10 ug/ml

Colágeno de tipo I

CHEMICON ratón IgG 10 ug/ml

CBFA 1

Alpha Diagnostic CONEJO Ig 1/200

OCN

Chemicon CONEJO Ig 1/200

OPG

R&D IgG2b 10 ug/ml

RANKL

R&D IgG2a 10 ug/ml

Anexina II

Santa Cruz CONEJO Ig 1/100

Grasa

CEPBalfa Santa Cruz CONEJO Ig 1/200

PPARgamma

Santa Cruz CONEJO Ig 1/200

Leptina

Chemicon IgG 10 ug/ml

Células epiteliales

Keratina 14 DAKO mIgG 10 ug/ml

Citokeratina 10+13

DAKO mIgG2a 10 ug/ml

EGFR

Pharmingen mIgG 10 ug/ml

Fibroblasto

Colágeno III Chemicon mIgG1 10 ug/ml

NGFR

Santa Cruz mIgG1 10 ug/ml

Marcador de fibroblasto

SIGMA mIgG 10 ug/ml

Hematopoyética

CD14 DAKO IgG2a 10 ug/ml

CD45

DAKO IgG1 10 ug/ml

Glicoforina-A

DAKO IgG 10 ug/ml

Tabla 2. Cebadores de RT-PCR y condiciones para la amplificación específica de ARNm humano

Gen diana

Secuencias de cebador de sentido/antisentido (5'3') Tamaño del producto

GAPDH

417

SDF-1

364

IL-1β

151

FLT-1

380

TNF-α

361

KDR

450

RANKL

538

Leptina

492

CBFA-1

632

PPARγ2

341

OCN

289

MyoD

270

SMMHC

150

GFAP

370

Nestina

460

SOX9

598

Colágeno de tipo X

387

Agrecano

184

Tabla 3. Resumen de la expresión génica relativa en las poblaciones STRO-1Bri y STRO-1Dim. Se presenta una lista de genes que muestran expresión mensurable y diferencial entre las poblaciones STRO-1Bri y STRO-1Dim según se determina mediante PCR de transcripción inversa. Los valores representan la expresión génica relativa con referencia al gen de mantenimiento, GAPDH.

Expresión génica relativa a GAPDH

Tejido

Marcador STRO-1Bri STRD-1Dim

Neuronas

GFAP (Proteína ácida fibrilar glial) 0,1 0,7

Hueso

OCN (Osteocalcina) 1,1 2,5

OSX (Osterix)

0,4 1,3

CBFA-1 (Proteína de unión al factor nuclear 1)

0,3 0,6

RANKL (Receptor activador del factor nuclear κ B)

1,6 0,3

Grasa

Leptina 3,1 4,2

Cardiomiocitos

GATA-4 1,1 2,9

Células endoteliales

Ang-1 (Angiopoyetina-1) 1,5 0,8

SDF-1-alfa (Factor derivado del estroma 1-alfa)

3,2 0,1

Condrocitos

Sox 9 0,3 1,1

COL X (Colágeno X)

3,5 2,8

Citocinas proinflamatorias

TNF-alfa (Necrosis tumoral alfa) 1,7 0,9

Tabla 4. Resumen de la expresión de proteínas relativa en las poblaciones STRO-1Bri y STRO-1Dim. Se presenta una lista de proteínas que muestran expresión diferencial entre las poblaciones STRO-1Bri y STRO-1Dim según se determina mediante citometría de flujo. Los valores representan la intensidad de fluorescencia media relativa de la tinción como se describe en la figura 2.

Intensidad de fluorescencia media

Tejido

Marcador STRD-1Bri STRO-1Dim

Neuronas

Neurofilamento 1,7 20,5

Hueso

ALK PHOS (Fosfatasa alcalina) 5,7 44,5

RANKL (Receptor activador del factor nuclear κ B)

658,5 31,0

Células epiteliales

CitoKeratina 10+13 1,2 23,3

Citokeratina 14

1,8 8,8

Músculo liso

α-SMA (Actina del músculo liso alfa) 318,0 286,0

Condrocitos

Biglicano 84,4 65,9

Fibroblasto basal

Tenascina C 22,2 6,9

Cardiomiocito

Troponina C 2,5 15,0

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Angioblast Systems, Inc.

<120> Regeneración ósea 10 <130> 503173

<150> US 60/613.021

<151>

<160> 3

<170> PatentIn versión 3.3 15 <210> 1

<211> 89

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1 20

<210> 2

<211> 93 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 352

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 3

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para mejorar la proliferación y/o supervivencia de las células comprometidas específicas de tejido STRO-1dim mesenquimales (TSCC) in vitro, comprendiendo el método cultivar células precursoras

   5 mesenquimales (MPC) STRO-1bright que expresan SDF con las TSCC STRO-1dim, donde las TSCC se cultivan en presencia de más del 5 % de MPC STRO-1brigh.
2. 2. Un método según la reivindicación 1, donde las TSCC STRO-1dim expresan CXCR4.

   10 3. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde las TSCC STRO-1dim y las MPC STRO-1bright se cultivan en condiciones que desvían la diferenciación a un tipo de tejido específico.