WO2009113733A1 - 根管充填材及び歯組織再生方法 - Google Patents

根管充填材及び歯組織再生方法 Download PDF

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WO2009113733A1
WO2009113733A1 PCT/JP2009/055541 JP2009055541W WO2009113733A1 WO 2009113733 A1 WO2009113733 A1 WO 2009113733A1 JP 2009055541 W JP2009055541 W JP 2009055541W WO 2009113733 A1 WO2009113733 A1 WO 2009113733A1
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root canal
dental pulp
positive
dental
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中島　美砂子
庵原　耕一郎
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財団法人ヒューマンサイエンス振興財団
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    • A61L2430/12—Materials or treatment for tissue regeneration for dental implants or prostheses

Definitions

  • the present invention relates to a root canal filling material and a method for regenerating tooth tissue using the root canal filling material.
  • the pulp has a role not only to block external stimuli due to the formation of repaired dentin, but also to suppress the progress of caries by perception, to give a sense of occlusion and to prevent the teeth from collapsing with a hard object .
  • the pulp also maintains dentin protein and water through metabolism, and further maintains the mechanical strength and properties of the dentin. It is also known that dental pulp has a defense mechanism against infection by immune function.
  • BMP protein administration or BMP gene is applied to dental pulp stem cells in vitro.
  • Non-Patent Document 2 in order to actually apply the above-described method to clinical practice, technological development to create a large amount of human dental pulp stem cells that do not cause immune rejection is underway. Many side population (SP) cells are collected, and the molecular biological characteristics of the stem cells are analyzed.
  • SP side population
  • the dentin regeneration method described above is considered effective. However, if there is pain due to irreversible pulpitis, it must be extracted.
  • the healing of dental pulp occurs frequently after transplantation for autotransplantation of unfinished human roots.
  • the dental pulp can be prevented from being broken with the closure of the pulpal cavity by the calcified tissue, the growth of the root and the closure of the apical foramen. If the dental pulp is necrotic but not infected, the remaining extracellular matrix may serve as a scaffold for the invasion of blood vessels and cells.
  • Non-Patent Document 3 even in a healthy tooth root of Inu, when the tooth is extracted after extraction, the root apex is cut and then transplanted, the pulp is regenerated with a blood clot. It is said that is seen.
  • Patent Document 1 and Patent Document 2 describe a root canal filling material formed of an artificial material. However, these root canal filling materials may peel or tear after root canal filling. In addition, these root canal fillers may cause apical periodontitis after several years.
  • Patent Document 1 JP 2006-00 1 9 1 0
  • Patent Document 2 JP 2002-029 9 1 1
  • Non-Patent Document 1 Nakashima and Reddi, 2003; Nakashima and Akamine, 2006 (PMID 12949568 doi 10.1038 / nbt864; PMID: 16186748)
  • Non-Patent Document 2 Iohara et al., 2006 (PMID: 16873765
  • Non-Patent Document 3 Laureys et al., 2001 (PMID: 11298308
  • the present invention has been made in view of such problems, and is a novel, original and appropriate root canal filling for filling a scaffold in a root canal after extraction of the root of a complete tooth root to regenerate the tooth tissue. It is an object of the present invention to provide a dental tissue regeneration method using such a material and such a root canal filling material.
  • a dental tissue regeneration method includes a cell containing pulp stem cells at the apical side of the root canal after extraction of the pulp or after root canal enlargement cleaning of the infected root canal, And an extracellular matrix to which cells including the dental pulp stem cells are attached. It is characterized by regenerating tooth tissue in the root canal by injecting the root canal filling material.
  • the pulp stem cell-containing cell is at least one of dental pulp SP cell, CD31 negative and CD146 negative cell, CD24 positive cell, CD105 positive cell, and CD150 positive cell Can also be included.
  • the dental pulp SP cells may be any of CD 31 negative and CD 146 negative, CD 24 positive, CD 105 positive, or CD 150 positive.
  • the root canal filling material attaches cells including dental pulp stem cells to the apical side of the root canal, and at least one of a cell migration factor, a cell growth factor, and a neurotrophic factor on the crown side of the root canal. It is preferred that a migratory factor containing one is attached.
  • the cell migration factor may be at least one of SDF1, VEGF, GCSF, MMP3, SIT and GMCSF.
  • the cell growth factor may be at least one of bFGF and PDGF.
  • the neurotrophic factor may be at least one of GDNF, BDNF, and NGF.
  • the extracellular matrix is collagen, artificial proteoglycan, gelatin, hyde mouth gel, fibrin, phosphophorin, heparan sulfate, heparin, laminin, fibronectin, alginic acid, hyaluronan, chitin, PLA, P LGA, PEG, PGA, PDLLA, PCL, Hydroxyapatite, j3—May consist of biocompatible material containing at least one of TCP, calcium carbonate, titanium and gold. Is possible.
  • the root canal before injecting the root canal filling material into the apical side of the root canal, the root canal can be enlarged to a predetermined size by expanding the root canal.
  • the content rate of the dental pulp stem cell in the extracellular matrix to which the cells including the dental pulp stem cell are attached may be 1 X 10 3 cells /; u 1 or more and 1 X 10 6 cells 1 or less It is.
  • a root canal filling material comprises a cell containing dental pulp stem cells and an extracellular matrix to which the cells containing dental pulp stem cells are attached.
  • the dental pulp stem cell-containing cell is at least one of dental pulp SP cell, CD 3 1 negative and CD 146 negative cell, CD 24 positive cell, CD 1 05 positive cell, and CD 1 50 positive cell. Can also be included. Further, the dental pulp SP cells may be any of CD 31 negative and CD 146 negative, CD 24 positive, CD 105 positive, or CD 150 positive.
  • the extracellular matrix is collagen, artificial proteoglycan, gelatin, hyde mouth gel, fibrin, phosphophorin, heparan sulfate, heparin, laminin, fibronectin, alginic acid, hyaluronan, chitin, PLA, P LGA, PEG, PGA, PDLLA, PCL, hydroxyapatite, j3—Made of biocompatible material containing at least one of TCP, calcium carbonate, titanium, and gold Is also possible.
  • the content rate of the dental pulp stem cells in the extracellular matrix to which the cells including the dental pulp stem cells are attached can be 1 ⁇ 10 3 cells 1 or more and 1 ⁇ 10 6 cells 1 or less.
  • the root canal filling material according to the present invention can be used after deep pulp extraction or root canal enlargement of infected root canals, even in the case of pulpitis due to deep caries or in the case of complete roots of apical periodontitis.
  • the tooth tissue was regenerated by filling the root canal after extensive cleaning.
  • the root canal filling material according to the present invention promotes regeneration of blood vessels and nerves, and promotes regeneration of dental pulp and recovery of pulp function by proliferation of dental pulp cells. Furthermore, when morphogenetic or dentinogenic factors such as BMPs were applied to the dental pulp, the differentiation of dental pulp cells into odontoblasts was promoted, and the dental crown was sealed with dentine. In addition, the apical hole was closed by adding cementum.
  • Figure 1A is a schematic diagram of the extracellular matrix.
  • FIG. 1B is a schematic diagram illustrating a root canal filling material formed by attaching cells including dental pulp stem cells to an extracellular matrix.
  • Fig. 1C is an explanatory diagram of the target pulpitis. .
  • FIG. 1D is a schematic diagram for explaining a root canal enlargement procedure after extraction.
  • Fig. 1E is a schematic diagram for explaining the injection of root canal filling material.
  • FIG. 1F is a schematic diagram for explaining the injection of sponzel (gelatin) and resin.
  • FIG. 1G is a schematic diagram illustrating reimplantation into the extraction fossa.
  • FIG. 1H is a schematic diagram showing dental pulp regeneration and blood vessel regeneration.
  • FIG. 1I is a schematic diagram for explaining the injection of a morphogenic factor and a resin.
  • Figure 1 J is a schematic diagram showing dentin regeneration.
  • Fig. 1K is a schematic diagram of apical periodontitis in which bacteria extend to the dentin and apical periodontal tissue of the root canal wall.
  • Figure 2A is a schematic diagram illustrating a root canal filling material in which cells containing dental pulp stem cells are attached to the apical side of the root canal and migratory factors are attached to the crown side of the root canal. is there.
  • Fig. 2B is a schematic diagram illustrating the injection of root canal filling material.
  • Fig. 2C is a schematic diagram illustrating reimplantation into the extraction socket.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining flow cytometry analysis of SP cells.
  • FIG. 4 shows the fractionation of SP cells labeled with CD31 and CD146 antibodies.
  • FIG. 5A is a diagram for explaining the proliferation activity of CD 3 1-; CD 146- S P cells in the control of 0.2% BSA.
  • FIG. 5B is a diagram illustrating the proliferation activity of CD 3 1; CD 1 46 -SP cells in 50 ng / ml VEGF.
  • FIG. 5C is a diagram for explaining the proliferation activity of CD 31-; CD 14 6 SP cells in 50 ng Zm lb FGF.
  • FIG. 5D is a diagram for explaining the proliferation activity of CD 3 1-; CD 146 1 SP cells in 50 ng Zm l EGF.
  • FIG. 5E is a diagram illustrating the proliferation activity of CD 3 1—; CD 14 6 ”SP cells in 50 ng / ml SDF 1.
  • FIG. 5F is a diagram illustrating the proliferation activity of CD 3 1; CD 14 6 1 SP cells in 50 ng ZmI I GF 1.
  • FIG. 6 is a diagram showing the migration ability of CD 3 1-; CD 146- SP cells when the VEGF concentration is changed.
  • FIG. 7 is a view showing the migration ability of CD 31-; CD 146 ⁇ SP cells when the migration factor is altered.
  • FIG. 8 is a diagram for explaining the proliferation activity of the culture supernatant of dental pulp CD 3 1—; CD 14 46 SP cells against HUVEC (vascular endothelial cells).
  • Figure 9 shows the results of flow cytometry of dying cells and cells by flow cytometry using H UVEC (vascular endothelial cells) that had undergone apoptosis by ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ staurosporine. It is a figure explaining the measurement of the ratio of an apoptotic cell.
  • H UVEC vascular endothelial cells
  • FIG. 10 is a view for explaining 14 days after autologous dental pulp CD 3 1-; CD 146- SP cells are transplanted onto a living dental pulp incision section.
  • Fig. 11 is a diagram illustrating 14 days after autologous dental pulp CD 3 1+; CD 146- S P cells were transplanted onto the living dental pulp incision section.
  • FIG. 12 is a diagram illustrating 14 days after transplanting mixed collagen, which is a mixture of type I collagen and type I I type I collagen, without cells, onto the living dental pulp cut surface.
  • FIG. 13 is an enlarged view illustrating 14 days after transplantation of CD 3 1-; CD 146 1 SP cells.
  • FIG. 14 is an enlarged view illustrating 14 days after transplantation of CD 3 1+; CD 146- SP cells.
  • FIG. 15 is a diagram for explaining that CD 3 1-; CD 146- SP cells are found at the bottom of the regenerated dental pulp.
  • FIG. 16 is a diagram illustrating the presence of CD 3 1+; CD 146- SP cells dispersed throughout the cavity.
  • Fig. 17 shows vascular endothelial cells stained with CD 146 antibody, and is a diagram illustrating the presence of DiI-labeled CD 31-; CD 146-SP cells adjacent to the new blood vessels. is there.
  • FIG. 18 is a diagram for explaining where odontoblast differentiation and tubule dentin formation can be seen in the portion of the crown that contacts the phosphate cement.
  • FIG. 19 shows a nerve axon that is stained with a neurofilament antibody and extends from the nerve of the cut root pulp into the regenerated pulp.
  • FIG. 20 is a diagram illustrating the nerve of the root pulp that has been cut and repaired in the remaining pulp.
  • Fig. 21 is a diagram illustrating 14 days after SDF 1 and autologous CD 3 1; CD 1 46—SP cells were adsorbed and injected into the root canal after medullary extraction. Yes, almost all of the root canal is regenerated with pulp tissue.
  • Fig. 22 is a diagram illustrating 14 days after SDF 1 is adsorbed on type I and type III collagen and injected into the root canal after extraction, and only a small part on the apical side in the root canal Regenerated in dental pulp tissue.
  • Fig. 23 is a diagram illustrating 14 days after CD 3 1-; CD 146- SP cells are adsorbed to type I and type III collagen and injected into the root canal after extraction, with very little pulp tissue. Is not playing.
  • FIG. 24 is a diagram illustrating 14 days after injection of only type I and type I I type I collagen, and almost no pulp tissue is regenerated.
  • FIG. 25 is a diagram illustrating high-magnification images of capillaries on the apical side 14 days after injection of SDF 1 and CD 3 1—; CD 146 -SP cells into type I and I I type I collagen.
  • FIG. 26 is a diagram illustrating a high-magnification image of capillaries on the crown side 14 days after injection of SDF 1 and CD 3 1—; CD 1 46—SP cells into type I and I I type I collagen.
  • FIG. 27 is a diagram for explaining vascular endothelial cell staining with B S-11 ect iin.
  • FIG. 28 is a diagram for explaining nerve axons by neurofilament immunostaining.
  • FIG. 29 is a diagram illustrating 14 days after injection of SDF 1 and CD 105 + cells into type I and type I I type I collagen, and almost all of the root canal is regenerated in the pulp tissue.
  • FIG. 30 is a diagram for explaining the flow cytometry of the third generation human dental pulp CD 31-; CD 146 ⁇ SP cells.
  • Figure 3 1 shows the third generation human dental pulp CD 3 1—; CD 146 — blood vessel induction of SP cells FIG.
  • FIG. 32 is a diagram for explaining the vascular induction of the third generation human dental pulp CD 10 5+ cells.
  • FIG. 33 is a diagram for explaining the vascular induction of the third generation human dental pulp CD 150+ cells.
  • FIG. 34 is a diagram for explaining the case of the third generation human total pulp cells, and blood vessels are hardly induced.
  • FIG. 35 is a diagram for explaining neural induction of human dental pulp CD 24+ cells.
  • Fig. 36 is a diagram illustrating a laser Doppler analysis of the third generation human dental pulp C D 3 1—; CD 146—SP cell transplantation, in which blood flow is restored.
  • Fig. 37 is a diagram for explaining laser Doppler analysis in the case of third-generation human dental pulp CD10 5+ cell transplantation, in which blood flow is restored.
  • FIG. 38 is a diagram illustrating laser Doppler angle analysis in the case of P B S injection control, and no recovery of blood flow is observed.
  • Figure 39 illustrates the laser Doppler analysis of human dental pulp total dental pulp cell transplantation, with little recovery of blood flow.
  • Fig. 40 illustrates the statistical analysis of laser Doppler measurement results of human dental pulp CD 3 1—; CD 1 46— SP cells, human dental pulp CD 105 cells, and human dental pulp total dental pulp cell transplantation .
  • FIG. 41 is a diagram for explaining the results of staining vascular endothelial cells with B S-11 ect iin after 14 days from transplantation of human dental pulp CD 31-; CD 146-SP cells.
  • FIG. 42 is a diagram for explaining the results of staining vascular endothelial cells with B S-11 ec t iin 14 days after P B S injection control.
  • the invention provides a dental tissue regeneration method for regenerating tooth tissue in a root canal. After pulp extraction or after cleaning the root canal of an infected root canal, a dental pulp stem cell is placed on the apical side of the root canal. Injecting a root canal filling material having cells containing, and an extracellular matrix to which cells containing dental pulp stem cells are attached.
  • the tooth tissues to be regenerated are, for example, blood vessels in the root canal, nerves, dental pulp, and dentin.
  • extraction and sterilization are performed, and the root apex is cut and opened to transplant the root canal filling material.
  • an artificial filling material or blood clot is not transplanted into a root canal that has been sterilized and hollowed, and mimics the dental pulp tissue.
  • Cells containing dental pulp stem cells are attached to a non-immunogenic scaffold and filled.
  • Root canal filling material Is preferably filled in 1Z4 to 2/5 of the apex, more preferably in the first 3 of the apex.
  • the extracellular matrix 2 10 is a so-called scaffold skid, a scaffold for fixing cells.
  • the shape of the extracellular matrix 210 is preferably a cylindrical shape or a substantially conical shape so that the root canal can be easily filled.
  • the shape is indefinite.
  • Extracellular matrix 2 10 is collagen, artificial proteolycan, gelatin, hydrogel, fipurin, phosphophorin, heparan sulfate, heparin, laminin, fibronectin, alginic acid, hyaluronic acid, chitin, PLA (polylactic acid), P LGA (Lactic acid glycolic acid copolymer), PEG (Polyethylene glycol), PGA (Polyglycolic acid), PDLLA (Poly-DL monolactic acid), PCL (Poly-strength prolatatone), Hydroxyapatite, ⁇ -TCP, Carbonic acid It is preferably composed of a biocompatible material containing at least one of calcium, titanium and gold.
  • Proteodarican is a type of complex carbohydrate in which a protein and a sugar chain (glycosaminodarlican) are covalently bonded.
  • a sponge-like three-dimensional structure made of a single nanofiber having a number average diameter of 1 nm to 1000 nm made of a polymer such as a thermoplastic polymer can also be used.
  • the porosity of such a three-dimensional structure is preferably 80% to 9.99%.
  • the collagen used as the extracellular matrix 210 is preferably a mixed collagen that is a mixture of type I collagen and type III collagen.
  • Type I collagen is basic collagen and is fibrous collagen.
  • Type III collagen forms a fine mesh-like structure called reticulated fibers, which is different from collagen fibers, and creates scaffolds for cells and the like.
  • the proportion of type III collagen it is preferable to be 3 0 by weight 0/0 over 5 0 wt% or less. This is because if the proportion of type III collagen exceeds 50% by weight, the mixed collagen may not be solidified.
  • the proportion of type III collagen is less than 30% by weight, the proportion of type I collagen increases, and vascularization as described later may occur, and dentin may be regenerated. It is. Particularly preferably, the mixing ratio of type I collagen and type III collagen is 1: 1.
  • the root canal filling material 200 is formed by attaching cells 2 20 containing dental pulp stem cells to the extracellular matrix 2 10.
  • the cells 220 containing dental pulp stem cells are attached to the apical side of the root canal of the root canal filling material 20.
  • the manufacturing method of root canal filling material 200 first, the total volume is 60 ⁇ l, and mixing 30 to 40 ⁇ l to pipetman's tip etc. Collagen (mixing ratio of type I collagen and type III collagen is 1: 1), then mixed collagen mixed with cells containing dental pulp stem cells is sucked into 20 ⁇ L to 30 ⁇ L .
  • a pipetman tip with a small inside diameter is preferable.
  • a tip with a bottom inside diameter of 0.5 to 0.7 mm can be used.
  • QSP's H — 0 1 0-9 6 RS microphone port You can use a single chip.
  • tooth extraction is performed on a tooth 100 that is a subject in which pulpitis has occurred.
  • FIG. 1D extraction of the target tooth 100 is performed.
  • the target tooth 100 is a dental pulp or root caused by bacterial infection due to caries, pulpitis, etc.
  • a tooth that has spread to the pulp. Extraction is the act of removing the pulp present inside the tooth.
  • the root canal of the target tooth 100 After extraction, it is desirable to enlarge the root canal of the target tooth 100 so that the root canal at the apex has a predetermined thickness. This is because, as will be described later, when filling the root canal with the root canal filling material, the root canal is expanded when the root canal is filled, and the apical periodontal tissue. This is because blood vessels and nerves easily enter.
  • the thickness d of the root canal at the apex is preferably 0.7 mm or more and 1.5 mm or less in the diameter of the root canal. If the root canal thickness d is less than 0.7 mm, it is difficult for blood vessels and nerves to enter the apical periodontal tissue, and filling the root canal filling material may be difficult. This is because if the root canal thickness d force S is greater than 1.5 mm, the target tooth 100 may be subjected to an unnecessarily heavy load and may be easily broken. After extraction of the target tooth 100, root canal filling material 200 is injected into the root canal with tweezers etc. as shown in FIG. 1E. Since root canal filling material 200 contains a biological material such as dental pulp SP cells, it can also be used as a biological root canal filling material. If the extracellular matrix 210 is in a gel form, it cannot be pinched with tweezers or the like.
  • the cells containing dental pulp stem cells may be autologous cells extracted from the subject animal itself undergoing dental tissue regeneration treatment, or may be allogeneic cells extracted from animals other than the subject animal subject to dental tissue regeneration treatment.
  • the dental pulp stem cell is a dental pulp stem cell derived from a permanent tooth or a deciduous tooth.
  • dental pulp cells derived from human deciduous teeth contain a large amount of CD 10 5 + at about 50%, (CD 10 5 + is about 20% in CD 3 1-SP cells derived from human permanent teeth.
  • Permanent tooth CD 1 0 5 + cells or SP cells, and pulp cells derived from deciduous teeth Induction, blood flow recovery at lower limb ischemia, and angiogenesis promoting effect.
  • CD 150+ is contained in 0.2% of deciduous dental pulp cells, and the content of permanent tooth CD 3 1-SP cells is higher than 0.1%.
  • pulp cells derived from human deciduous teeth have angiogenic capacity 2.2 times that of pulp cells derived from permanent human teeth.
  • the cells containing dental pulp stem cells include at least one of dental pulp SP cells, CD31 negative and CD146 negative cells, CD24 positive cells, CD105 positive cells, and CD150 positive cells. It is preferable.
  • human dental pulp SP cells have a high tissue regeneration ability such as angiogenic ability.
  • human dental pulp SP cells have 1.2 times the angiogenic potential compared with human primary dental pulp cells.
  • human dental pulp SP cells are 2.6 times more angiogenic than human permanent dental pulp cells. Furthermore, it has 5.7 times the angiogenic capacity compared to PB S control.
  • the apex refers to the end (the tip of the root) that is connected to the alveolar bone of the subject tooth 100.
  • SP cells are undifferentiated cells discovered by Goodel et al. (J. Exp. Med. Vol. 183, 1996), and a fluorescent dye called Hoechst33342 is incorporated into the cells by flow cytometric analysis. Different positions on the cytogram ("Hoechst Blue weak positive and Hoechst Red weak positive") from normal cells (cells other than undifferentiated cells) that fluoresce at 400 nm and 600 nm when excited with UV Cell population that appears in
  • the dental pulp SP cells are preferably either CD31 negative and CD146 negative, CD24 positive, CD105 positive, or CD150 positive.
  • the content rate of dental pulp stem cells in the root canal filling material is preferably 1 ⁇ 10 3 cells 1 or more and 1 ⁇ 10 6 cells 6 or less.
  • the content of dental pulp stem cells This is because if it is less than 1 ⁇ 10 3 cells / ⁇ 1, regeneration of the tooth tissue in the root canal may be insufficient.
  • the content of dental pulp stem cells is IX
  • the tooth tissue in the root canal is regenerated.
  • the regenerated tooth tissue is, for example, blood vessels 400 in the root canal and pulp tissue as shown in FIG.
  • the resin 6 20 is removed once, and a morphogenic factor 6 30 or dentinogenic factor such as BMP s is applied to the dental pulp of the crown, as shown in Fig. II. Cover with.
  • the morphogenic factor 6 30 or dentin forming factor is applied to the dental pulp, as shown in FIG. 1J.
  • nerve regeneration is also promoted.
  • the target tooth 100 is a tooth in which bacterial infection has spread to the crown pulp or root pulp due to caries, pulpitis, etc., but is not limited to this.
  • the target teeth 100 include those whose nerve function is reduced and the occlusal sensation is weakened. In such a case, the occlusal sensation can be improved by regenerating the dental pulp by injecting a root canal filling material after extraction.
  • the target tooth 10 0 has teeth that have bacterial infection spreading to the apical periodontal tissue (after the bacteria reach the pulp, the dentin and root of the root canal wall) It also includes teeth that extend over the periodontal tissue.
  • Such teeth often have apical periodontitis 110.
  • inject root canal filling material 200 After root canal expansion cleaning of the infected root canal, inject root canal filling material 200.
  • the infected root canal refers to the root canal when bacteria reach the pulp and reach the dentin of the root canal wall
  • expanded root canal cleaning refers to the infected root canal. This is after removing bacteria.
  • the tooth set regenerating method according to Embodiment 2 will be described with reference to FIGS.
  • a total collagen of 60 liters and mixed collagen (type I collagen and III As for the mixing ratio with type collagen, 1: 1) is sucked in 30 to 40 liters, and then mixed collagen mixed with cells containing dental pulp stem cells is sucked in 20 ⁇ l to 30 ju liters.
  • pipetman tips with a narrow inner diameter are preferred. In this way, the root canal filling material 200 shown in FIG.
  • the root canal filling material 200 attaches cells 220 containing dental pulp stem cells to the apical side of the root canal, and the crown side of the root canal (for example, the upper part 1 Z 2 to 2 of the root canal). / 3) is attached with a migration factor 230 containing at least one of cell migration factor, cell growth factor and neurotrophic factor.
  • the reason why cells 2 20 containing dental pulp stem cells are attached to the apical side of the root canal and migratory factor 2 3 0 is attached to the crown side of the root canal is the reason why cells 2 20 containing dental pulp stem cells are attached to the tooth of the root canal This is because even if attached to the coronal side, there is a possibility of necrosis without supplying nutrients from the tissue, and cells including dental pulp stem cells attached to the apical side of the root canal This is because tooth tissue regeneration is easily promoted by the migration factor adhering to the crown side. As shown in FIG. 2A, it is also possible to leave the extracellular matrix 210 on the crown side of the root canal of the root canal filling material 200.
  • a cell migration factor means a molecule that activates a signal transduction system involved in cell migration by binding to a receptor.
  • Cell growth factor means a molecule that activates a signal transduction system involved in cell growth by binding to a receptor.
  • Neurotrophic factor means a molecule that activates a signal transduction system involved in cell survival when it binds to a receptor.
  • the cell migration factor it is preferable to use at least one of SDF1, VEGF, GCSF, MMP3, Slit, and GMCSF.
  • MMP 3 has a high cell migration ability and can be suitably used.
  • bFGF and PDGF are preferable to use as the cell growth factor.
  • the neurotrophic factor is preferably at least one of GDNF, BDNF, and NGF.
  • the content of the migration factor in the extracellular matrix to which the migration factor is attached is preferably 0. I ng / 1 or more and 50 0 ⁇ g / ⁇ 1 or less. This is because if the content of the migration factor is less than 0.1 gnZ1, the degree of migration may be reduced. On the other hand, if the migration factor content is higher than 500 ng / ⁇ 1, an unexpected side effect may occur on the subject tooth 100.
  • the extracellular matrix is collagen, artificial proteoglycan, gelatin, hyde mouth gel, buiprine, phosphophorin, heparan sulfate, heparin, laminin, fibronectin, anoleic acid, hyaluronic acid, chitin , PLA, P LGA, PEG, PGA, PDL LA, PCL, hydroxyapatite, / 3— TC P from biocompatible material containing at least one of carbonic acid carbonate, titanium and gold It is preferable that it is configured.
  • the collagen is preferably a mixed collagen which is a mixture of type I collagen and type III collagen. Furthermore, the proportion of type III collagen in the mixed collagen is preferably 30% by weight or more and 50% by weight or less.
  • gelatin 6 10 is injected in the same manner as in FIG. 1F in Embodiment 1, and the resin 6 2 ° is rubbed, and the extracted tooth is extracted as shown in FIG. 2C. Re-implanted. Thereafter, as shown in FIG. 1H, the blood vessels 400 and pulp tissues in the root canal regenerate, but the regeneration rate is improved as compared with the first embodiment. Then, as shown in Fig. 1 I, morphogenic factors such as BMP s 6 30 or dentin-forming factors are applied to the dental pulp of the crown and dentine regeneration is performed as shown in Fig. 1 J. The playback rate is higher than that of Form 1.
  • the root canal filling material 200 can also be injected into the target tooth 100 after the root canal expansion cleaning of the infected root canal.
  • Example 1
  • Fig. 3 shows the results of an analysis of SP cell flow cytometry. SP cells from porcine pulp accounted for 0.2% of the total. As shown in Fig.
  • CD133 mRNA expressed in bone marrow-derived angioblasts was not found in dental pulp-derived CD31-; CD146-SP cells.
  • Table 3 shows a comparison of RNA expression between dental pulp-derived CD 3 1; CD 146—SP cells and dental pulp-derived CD 3 1+; CD 1 46—SP cells by microarray and Rea ⁇ time RT-PCR.
  • pro-vascular inducer VEGF—A
  • cytoforce-in G—CSF, GM—CSF, MCP 1 CCL 2, MDCF 1
  • MMP 1, MMP 3, Arginase 1 extracellular matrix degrading enzymes
  • Others GP 38K, CRS P
  • CD 3 1—; CD 1 46— SP cells showed a reticulated lumen structure after 24 hours. CD 3 1+ SP cells did not form a clear luminal structure.
  • CD 31-; CD 146 SP cells form a vascular-like structure inside Matrigel, and the cells surrounding the vascular-like structure are differentiated from endothelial cells of CE AC AMI, CD 146 and occludin mRNA. Kerr was expressed.
  • differentiation markers of endothelial cells such as CD31, vWF, and VE-cadherin were expressed on the 10th day.
  • CD 3 1-; CD 1 46- SP cells are responsible for the release of vWF by histamine, which is a functional property of endothelial cells. 1 showed LDL uptake ability.
  • CD 31-; CD 146-SP cells have multipotency and were induced to differentiate into cartilage, fat, nerve, and odontoblast in vitro.
  • CD 31-; CD 146-SP cells showed higher proliferative capacity upon stimulation with FGF and EGF compared to the other two fractions.
  • CD 3 1; CD 146-SP cells were induced by VEGF and SDF 1 and showed a 2-fold higher migration ability compared to the other two fractions.
  • Figure 5A is a control of 0.2% BSA
  • Figure 5B is SO ngZm l VEGF
  • Figure 5C is 50 ng / m 1 b FGF
  • Figure 5D is 5 O ng / ml EGF
  • FIG. 5 E is 50 ng gZm 1 SDF 1
  • FIG. 5 F is 50 ng / m 1 IGF 1.
  • Tetra-color one registered trademark
  • VEGF—A 0, 5, 10, 100 ng / m 1 was added to 24 we 1 1 medium, 5 ⁇ 10 4 cells were seeded on PET-membrane insert, Cells that passed through the membrane were forced after 24 hours. CD 3 1-; CD 146- SP cells had high migration ability, and the migration ability increased in a concentration-dependent manner. Average value of 4 samples plus or minus SD (* P ⁇ 0. 01). The experiment was repeated three times and a typical example was shown.
  • CD 3 1-; CD 146- SP cells is allowed to act for 48 hours in vitro on vascular endothelial cells (HUVE C), MMP 3 or VEGF acts at 50 ng Zm 1
  • the proliferation activity was almost the same as that of the case of the treatment.
  • CD 31-; CD 144-SP cells exhibited an apoptosis-inhibiting effect equivalent to MMP 3 or GM-CSF on vascular endothelial cells.
  • FIG. 8 shows the proliferation activity of the culture supernatant of dental pulp CD 3 1—; CD 1 46—SP cells against HUVE C. Comparisons with MMP 3, VEGF-A, G-CSF, GM-CSF and CD 3 1 +; CD 146-SP cell supernatant at 2, 12, 24, 36, 48 hours are shown. 'CD 3 1- at 36 and 48 hours; CD 1 46 "SP cell supernatant has proliferative activity similar to other cytokines, significantly higher than CD 3 1 +; CD 146- SP cell supernatant High life 'I ⁇ Life was seen (#P 0. 01) ** P 0. 01, * P 0. 05 V scontrol.
  • Fig. 9 shows the ratio of necrotic cells to apoptotic cells measured by flow cytometry using HU VEC in which apoptosis was caused by 100 nM staurosporine.
  • mice When SCID (Sevefe Combined ImmunoDef iciency) mice were prepared for the lower limb ischemia model and CD 3 1-; CD 146- SP cells were transplanted to the ischemic site of the lower limb, blood flow was restored one week later, CD 3 1+; CD 146—Stimulated neovascularization about 13 times compared to the SP cell transplant group.
  • SCID Sevefe Combined ImmunoDef iciency
  • CD 3 1- ⁇ Angiogenesis, nerve regeneration, dental pulp regeneration in the living dental pulp cutting model> CD 3 1-; CD 146 "SP cells were collected from the dental pulp tissue in the same manner as pigs, and about 10% of SP cells were collected.
  • This dental pulp-derived CD 3 1: 1 CD 146—SP cells 1 X 10 6 were added to collagen type I and type III collagen, and three-dimensionally cultured 24 hours later Self-transplanted onto the living dental pulp cut surface, filled with sponzel and phosphate cement at the top, and then sealed with chemical polymerization resin CD 3 1 + SP cells or type I collagen and type III collagen only as controls 1 4 days later, CD 3 1—; CD 146 ⁇ In the SP cell transplant group, the pulp was regenerated on the living pulp cut surface, and the new blood vessels were continuous, as shown in FIG.
  • FIG. 10 and FIG. See Fig. 10 and Fig. 13 in the type I and type III collagen. 14 days after autotransplantation after culture and transplanted with CD 3 1-; CD 1 46- SP cells Staining was performed using H-E staining. As shown in Fig. 10 and Fig. 13, the cavity on the cut surface of the pulp is filled with regenerated pulp tissue, and the capillaries extend to the vicinity of the site filled with phosphate cement. Kakuhaya is made.
  • FIGS. 15 and 17 the transplanted cells migrated and settled around the new blood vessels.
  • CD 3 1—; CD 1 46 ⁇ SP cells are found at the bottom of the regenerated pulp.
  • Fig. 17 shows vascular endothelial cells stained with CD 146. Di I-labeled CD 3 1-; CD 1 46- SP cells are present around the new blood vessels in the regenerated pulp tissue. Is understood It is.
  • the arrows indicate the positions of CD 31-; CD 144-SP cells, and the symbol V indicates a new blood vessel.
  • the dotted line indicates the neoplastic tissue boundary.
  • FIG. 11, Fig. 14 and Fig. 16 are transplanted with CD 3 1+; CD 1 46-SP cells.
  • CD 31 + ; CD 1 46-SP cell transplantation group showed the power of transplanted cells established No neovascularization was observed, cell migration It was not seen.
  • Figures 11 and 14 show that transplanted tissue colonization is seen in the cavity, but few capillaries are seen.
  • FIG. 16 shows that CD 3 1+; CD 1 46—SP cells are distributed throughout the cavity.
  • the arrow is the pulp cut surface.
  • the white line indicates the dentin wall.
  • the dotted line indicates the neoplastic tissue boundary.
  • Fig. 12 shows specimens in which only type I collagen and I I type I collagen were transplanted. As shown in Fig. 12, no tissue was found on the living pulp cut surface.
  • FIG. 19 nerve axons extending from the nerve of the cut root pulp were seen. As shown in FIG. 20, the cut and repaired nerves present in the remaining root pulp were shown. In addition, FIG. 19 and FIG. 20 are neurofilament immunostaining.
  • Example 2 shows dental pulp regeneration after innu extraction using CD 3 1-; CD 146- SP cells and cell migration factor S DF 1.
  • CD 31-; CD 146- SP cells were collected from porcine pulp tissue in the same manner as pigs. In addition, CD 10 5 + cells were collected. After removing the maxillary front teeth, The pith was removed and expanded to # 80 in the medium, and the thickness of the root canal at the root apex was increased to 0.8 mm or more. Within 30 minutes after removal, 1 X 10 6 CD 3 1; CD 1 46—SP cells are mixed with type I collagen and type III collagen 10 ⁇ 1 and injected into the apical side 1/3 of the root canal did. Further, 20 1 of type I collagen and type III collagen supplemented with SD F 1 (200 ng) were filled in 2 to 3 of the crown part of the root canal. Within 30 minutes, it was reimplanted into Inu's extraction cavity 300 and the upper part was sealed with phosphate cement and chemically polymerized resin. After 14 days, the tooth was extracted and a paraffin specimen was prepared.
  • Figure 21, Figure 25, Figure 26, Figure 27, and Figure 28 show SDF 1 (200 ng) and CD 3 1— and CD 146—SP cells injected into type I and type III collagen. is there.
  • CD 3 1—; CD 1 46—SP cells and SDF 1 were used as root canal filling materials
  • the root canal was fully filled with new dental pulp tissue after 14 days, as shown in Figure 21.
  • Figure 21 shows the H-E stain.
  • the symbol V indicates a capillary vessel.
  • Figure 27 shows vascular endothelial cell staining with BS-1 lectin.
  • Figure 28 shows neurofilament immunostaining.
  • FIG. 22 shows S D F 1 (200 ng) injected into type I and I I type I collagen.
  • FIG. 23 shows the injection of CD 3 1; CD 146-SP cells into type I and I I type I collagen. Furthermore, as shown in FIG. 24, almost no new dental pulp tissue was observed with only type I collagen and type II type I collagen.
  • Example 3 mainly shows angiogenesis using human permanent dental pulp C D 3 1 negative CD 4 146 negative S ⁇ cells and human 'permanent dental pulp CD 1 05 positive cells.
  • FIG. 30 shows flow cytometry of human CD 3 1—; CD 146—SP cells.
  • Table 4 shows human dental pulp CD 3 1—; CD 1 46-SP cells and human dental pulp CD 1 05 + SP cells, human total dental pulp cells, human total milk dental cells and porcine dental pulp CD 3 1—; CD 146— A comparison of SP cells is shown.
  • Vascular endothelial cell or vascular smooth muscle cell marker CD146 was negative for human CD31-SP cells and almost negative for human CD105 + cells.
  • CD 1 33 which is said to be positive in bone marrow-derived angioblasts and vascular endothelial progenitor cells in peripheral blood, is negative and similar to porcine pulp-derived CD 3 1—; CD 1 46—SP cells, but CD 134 Unlike Puta, it was negative. [Table 4]
  • human dental pulp CD 24 + cells were easily differentiated into nerves in vitro as shown in FIG.
  • Figure 36 shows transplantation of 3rd generation human pulp CD 3 1-; CD 16 "SP cells at the lower limb ischemic site.
  • Figure 3 7 shows the 3rd generation human pulp CD 105+ at the lower limb ischemic site.
  • Fig. 38 shows the PB at the lower limb ischemia site. S control was injected.
  • Fig. 39 shows the transplantation of total pulp cells from the third generation of human pulp in the ischemic region of the lower limbs.
  • Fig. 36, Fig. 37, Fig. 38, and Fig. 39 show the results of laser Doppler analysis
  • Fig. 40 shows the statistically significant difference of laser Doppler analysis. As shown in Fig. 36, Fig. 37, and Fig.
  • FIG. 41 shows the results of staining of vascular endothelial cells with BS-1 lectin in the case of human dental pulp CD31-; CD146-SP cell transplantation.
  • FIG. 42 shows the results of staining of vascular endothelial cells with BS-1 lectin in the case of the control of PBS injection. As shown in Figure 4 and Figure 42, it was revealed that human pulp CD 3 1-; CD 146-SP cells significantly promoted angiogenesis compared to the P B S injection control.
  • human dental pulp-derived CD 3 1 ⁇ ; CD 1 46 ⁇ SP cells and CD 1 05 + cells are effective for revascularization and pulp regeneration as in the case of Inu and Pig.
  • root canal filling material can be filled into the root canal after pulpectomy, dental tissue regeneration can be achieved, so even if pulpitis has occurred due to deep caries, it can be used to properly restore the pulp and restore the pulp function. Applicable.

Abstract

抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、歯組織の再生を図る新規かつ独創的な歯組織再生方法を提供する。対象となる歯１００に対して、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、根管の根尖側に、歯髄幹細胞を含む細胞２２０と、歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質２１０とを有する根管充填材２００を注入する。歯髄幹細胞を含む細胞は、歯髄SP細胞、CD３１陰性かつCD１４６陰性細胞、CD２４陽性細胞、CD１０５陽性細胞、若しくは、CD１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む。歯髄SP細胞は、例えば、CD３１陰性かつCD１４６陰性である。深いう蝕で歯髄炎を生じている場合でも、適切に歯髄再生及び歯髄機能の回復が可能である。

Description

明 細 書
根管充填材及び歯組織再生方法 技術分野
本発明は、 根管充填材、 及び、 その根管充填材を使用する歯組織再生方 法に関する。 背景技術 '
う蝕が深くて歯髄にまで達している場合、 う触の治療として一般に抜髄 が行われてきた。 しかし歯髄は、 修復象牙質形成による外来刺激の遮断と いうばかりでなく、 知覚によりう蝕の進行を抑え、 咬合感覚を与え硬いも のを嚙んで歯が破折することを防止する役割がある。 また、 歯髄は、 代謝 により象牙質蛋白質及び水分を維持し、 更に象牙質の機械的強度及び性質 を保つ。 歯髄は、 免疫機能による感染防御機構を有することも知られてい る。
歯内治療では根管形態の複雑性から、 N i T i合金製ロータリーフアイ ルが普及してきた。 しかし、 完璧な抜髄、 根管拡大、 及び根管充填は不可 能に近い。 そのため、 抜髄は後に根尖性歯周炎を導き、 結果として歯を失 う可能性も多いに秘めている。
歯の寿命を高めるには歯髄をできるだけ保存する方法を開発する必要が ある。 そのためには、 歯再生の 3要素と考えられる 1 ) 形態形成因子 （B M P s (骨形成因子） 等） 2 ) 歯髄組織幹細胞、 3 ) 微小環境 （足場、 細胞外基 質等） を駆使して、象牙質及び歯髄を再生させる新しいう蝕治療法の技術開発 が進められている。
まず、非特許文献 1に記載されているように、生体外細胞導入法又は遺伝子 導入法として、歯髄幹細胞に生体外で B M P蛋白質の投与又は B M P遺伝子を 導入し、三次元培養を行って分化した象牙芽細胞を露髄面上に移植し、早期且 つ大量の象牙質の再生手法がある。
また、非特許文献 2に記載されているように、上述の手法を実際臨床応用す るため、免疫拒絶反応を起こさないヒト歯髄幹細胞を大量に創生する技術開発 が進められており、 幹細胞を多く含む side population (SP)細胞を分取し、 そ の幹細胞の分子生物学的特徴の解析が行われている。
歯髄組織が偶発的露髄又は可逆性歯髄炎程度であれば、上述の象牙質の再生 手法は有効であると考えられる。しかし、不可逆性歯髄炎で疼痛がある場合は、 抜髄せざるを得ない。
これまで、 ヒ ト歯根未完成歯の自家移植に関しては、 移植後高頻度に歯 髄の治癒が生じることが知られている。 そして、 石灰化組織による歯髄腔 の閉鎖、 歯根の成長及び根尖孔の閉鎖を伴い、 歯根破折を防止できる。 歯 髄は壊死していても感染がなければ残った細胞外基質は血管及ぴ細胞の侵 入のための scaffoldとして働く可能性がある。
また、 移植時、 根尖部付近の細胞は生存しており、 移植後に歯冠部方向 に遊走、 増殖する可能性がある。
一方、 ィヌの歯根未完成歯では、 抜髄をした後に移植しても同様に歯髄 が再生される。根尖部に病変を伴う歯根未完成歯でも、徹底的な根管洗浄 · 消毒を行い、 3種抗菌剤の貼薬後、 セメント ·象牙境まで血餅を満たし Mineral trioxide aggregate (M T A) 及び Cavitで窩洞を完全封鎖する ことにより、 歯髄が再生されるとの報告がある。
また、 非特許文献 3に記載されているように、 ィヌの健全歯根完成歯に おいても、 抜歯後抜髄し、 根尖部を切断した後、 移植した場合には、 血餅 により歯髄再生がみられるといわれている。
しかしながら、 根管内歯髄再生の報告は、 根未完成歯についての報告が 大半である。 深いう蝕で歯髄炎を生じている場合又は根尖性歯周炎の歯根 完成歯の場合における歯組織再生方法及び歯組織再生のための根管充填材 の開発はなされていない。
特許文献 1及ぴ特許文献 2には、 人工物で形成されている根管充填材が 記載されている。 しかし、 これらの根管充填材は、 根管充填後に、 根管充 填材が剥離又は断裂する可能性がある。 更に、 これらの根管充填材は、 数 年後には根尖性歯周炎が発生する可能性もある。
特許文献 1 ：特開 2006— 00 1 9 1 0号公報
特許文献 2 :特開 2002— 029 9 1 1号公報
非特許文献 1 ： Nakashima and Reddi、 2003； Nakashima and Akamine、 2006 (PMID 12949568 doi 10.1038/nbt864;PMID: 16186748)
非特許文献 2 ： Iohara et al.， 2006 (PMID: 16873765
doi： 10.1634/stemcells, 2006-0161)
非特許文献 3 ： Laureys et al. , 2001 (PMID: 11298308
doi： 10.1067/mod.2001.113259) 発明の開示 発明が解決しょうとする課題
本発明は、 このような課題に鑑みなされたものであり、 歯根完成歯に対 して抜髄後の根管内に scaffold を充填して歯組織再生を図る新規で独創 的で適切な根管充填材、 及び、 そのような根管充填材を使用する歯組織再 生方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
上記目的を達成するため、 この発明の第 1の観点に係る歯組織再生方法 は、 抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、 根管の根尖側に、 歯髄幹細胞 を含む細胞と、 前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質とを有 する根管充填材を注入することで、 根管内の歯組織を再生することを特徴 とする。
また、 前記歯髄幹細胞を含む細胞は、 歯髄 S P細胞、 CD 3 1陰性かつ CD 146陰性細胞、 C D 24陽性細胞、 C D 1 0 5陽性細胞、 及び、 C D 1 50陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことも可能である。 また、 前記歯髄 S P細胞が、 C D 3 1陰性かつ C D 146陰性、 C D 2 4陽性、 C D 1 05陽性、 又は、 C D 1 50陽性の何れかであることも可 能である。
また、 前記根管充填材は、 歯髄幹細胞を含む細胞を根管の根尖側に付着 させるとともに、 根管の歯冠側に細胞遊走因子、 細胞増殖因子及び神経栄 養因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子を付着させていること が好ましい。
前記細胞遊走因子が、 SDF 1、 VEGF、 GC S F、 MMP 3、 S I i t及ぴ GMC S Fのうち少なくとも何れか一つであることも可能である。 前記細胞増殖因子が、 b FGF及び PDGFのうち少なくとも何れか一 つであることも可能である。
前記神経栄養因子が、 GDNF、 BDNF及び NGFのうち少なくとも 何れか一つであることも可能である。
また、 前記細胞外基質が、 コラーゲン、 人工プロテオダリカン、 ゼラチ ン、 ハイ ド口ゲル、 フイブリン、 フォスフォホリン、 へパラン硫酸、 へパ リン、 ラミニン、 フイブロネクチン、 アルギン酸、 ヒアル口ン酸、 キチン、 P LA、 P LGA、 PEG, PGA、 PDLLA、 PCL、 ハイドロキシ アパタイト、 j3— TCP、 炭酸カルシウム、 チタン及ぴ金のうち少なくと も何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることも可能である。 また、 前記根管充填材を前記根管の根尖側に注入する前 、 前記根管を 拡大することで根尖部の根管の太さを所定の大きさにすることも可能であ る。
また、 前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質における、 前 記歯髄幹細胞の含有率は、 1 X 1 03 セル/； u 1以上 1 X 1 06 セル 1以下であることも可能である。
上記目的を達成するため、 この発明の第 2の観点に係る根管充填材は、 歯髄幹細胞を含む細胞と、 前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外 基質とを有することを特徴とする。
また、 前記歯髄幹細胞を含む細胞は、 歯髄 S P細胞、 CD 3 1陰性かつ CD 146陰性細胞、 C D 24陽性細胞、 C D 1 05陽性細胞、 及ぴ、 C D 1 50陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことも可能である。 また、 前記歯髄 S P細胞が、 C D 3 1陰性かつ C D 146陰性、 C D 2 4陽性、 C D 105陽性、 又は、 C D 1 50陽性の何れかであることも可 能である。
また、 前記細胞外基質が、 コラーゲン、 人工プロテオダリカン、 ゼラチ ン、 ハイ ド口ゲル、 フイブリン、 フォスフォホリン、 へパラン硫酸、 へパ リン、 ラミニン、 フイブロネクチン、 アルギン酸、 ヒアル口ン酸、 キチン、 P LA、 P LGA、 PEG、 PGA, PDLLA、 PCL、 ハイ ドロキシ アパタイ ト、 j3— T C P、 炭酸カルシウム、 チタン及び金のうち少なく と も何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることも可能である。 また、 前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質における、 前 記歯髄幹細胞の含有率は、 1 X 1 03 セル 1以上 1 X 1 06 セル 1以下であることも可能である。 発明の効果
本発明に係る根管充填材は、 深いう蝕で歯髄炎を生じている場合又は根 尖性歯周炎の歯根完成歯の場合であっても、 抜髄後又は感染根管の根管拡 大清掃後に根管内に充填することにより歯組織再生を図ることができた。 本発明に係る根管充填材は、 血管及ぴ神経の再生を促進させ、 歯髄細胞の 増殖による歯髄再生及び歯髄機能の回復を促進させた。 さらに B M P s等 の形態形成因子又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布すると、 歯髄細胞 の象牙芽細胞への分化が促進され、 象牙質による歯冠部封鎖が行われた。 さらに、 根尖孔はセメント質添加により閉鎖された。 図面の簡単な説明
図 1 Aは、 細胞外基質の模式図である。
図 1 Bは、 細胞外基質に歯髄幹細胞を含む細胞を付着させて形成される 根管充填材を説明する模式図である。
図 1 Cは、 対象となる歯髄炎の説明図である。.
図 1 Dは、 抜髄後の根管拡大処置を行ったところを説明する模式図であ る。
図 1 Eは、 根管充填材を注入するところを説明する模式図である。
図 1 Fは、 スポンゼル (ゼラチン) 及びレジンを注入したところを説明 する模式図である。
図 1 Gは、 抜歯窩に再移植するところを説明する模式図である。
図 1 Hは、 歯髄再生及び血管再生を示す模式図である。
図 1 Iは、 形態形成因子及びレジンを注入したところを説明する模式図 である。
図 1 Jは、 象牙質再生を示す模式図である。
図 1 Kは、 細菌が根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる根尖性 歯周炎の模式図である。
図 2 Aは、歯髄幹細胞を含む細胞を根管の根尖側に付着させるとともに、 根管の歯冠側に遊走因子を付着させている根管充填材を説明する模式図で ある。
図 2 Bは、 根管充填材を注入するところを説明する模式図である。 図 2 Cは、 抜歯窩に再移植するところを説明する模式図である。
図 3は、 S P細胞のフローサイ トメ トリ一分析を説明する図である。 図 4は、 CD 3 1及ぴ CD 146抗体でラベルして S P細胞を分画する 図である。
図 5 Aは、 0. 2 %B S Aのコントロールにおいて、 CD 3 1— ； CD 146— S P細胞の増殖活性を説明する図である。
図 5 Bは、 50 n g/m l VEGFにおいて、 CD 3 1一 ； CD 1 4 6— S P細胞の増殖活性を説明する図である。
図 5 Cは、 50 n gZm l b FGFにおいて、 CD 3 1— ； CD 14 6一 S P細胞の増殖活性を説明する図である。
図 5 Dは、 50 n gZm l EG Fにおいて、 CD 3 1— ； CD 146 一 S P細胞の増殖活性を説明する図である。
図 5 Eは、 50 n g/m l SDF 1において、 CD 3 1— ； CD 14 6" S P細胞の増殖活性を説明する図である。
図 5 Fは、 50 n gZm l I GF 1において、 CD 3 1一 ； CD 14 6一 S P細胞の増殖活性を説明する図である。
図 6は、 CD 3 1— ； CD 146— S P細胞の遊走能を、 VEGF濃度 を変化させた場合に示す図である。
図 7は、 CD 3 1— ； CD 146~ S P細胞の遊走能を、 遊走因子を変 化させた場合に示す図である。
図 8は、 HUVEC (血管内皮細胞） に対する歯髄 CD 3 1— ； CD 1 4 6一 S P細胞の培養上清の増殖活性を説明する図である。
図 9は、 Ι Ο Ο ηΜ staurosporine によりアポトーシスを生じさせた H UVEC (血管内皮細胞） を用いたフローサイトメトリーによる壌死細胞及ぴ アポトーシス細胞の割合の測定を説明する図である。
図 1 0は、 自家歯髄 CD 3 1— ； CD 146— S P細胞をィヌ生活歯髄切 断面上に移植して 14日後を説明する図である。
図 1 1は、 自家歯髄 CD 3 1+ ； CD 146— S P細胞をィヌ生活歯髄切 断面上に移植して 14日後を説明する図である。
図 1 2は、 細胞を含まない、 I型コラーゲンと I I I型コラーゲンとの 混合である混合コラーゲンをィヌ生活歯髄切断面上に移植して 14日後を 説明する図である。
図 1 3は、 CD 3 1— ； CD 146一 S P細胞を移植して 14日後を説明 する拡大図である。
図 14は、 CD 3 1+ ； CD 146- S P細胞を移植して 14日後を説明 する拡大図である。
図 1 5は、 CD 3 1— ； CD 146- S P細胞が再生歯髄の底部に見られ るところを説明する図である。
図 1 6は、 CD 3 1+ ； CD 146- S P細胞が窩洞全体に分散して存在 するところを説明する図である。
図 1 7は、 血管内皮細胞を CD 146抗体で染色したものであり、 D i I ラベルされた CD 3 1- ； CD 146~ S P細胞が新生血管に隣接して存在 することを説明する図である。
図 1 8は、 歯冠部上部のリン酸セメントに接する部分で象牙芽細胞の分 化及び細管象牙質形成が見られるところを説明する図である。
図 1 9は、 neurofilament抗体で染色したものであり、 再生された歯髄中 に、 切断された歯根部歯髄の神経から伸びる.神経軸索が示されているとこ ろを説明する図である。
図 20は、 残存した歯髄中に、 切断され修復された歯根部歯髄の神経が 示されているところを説明する図である。 図 2 1は、 I型及ぴ I I I型コラーゲンに SDF 1及ぴ自家 C D 3 1 一 ； CD 1 46— S P細胞を吸着させて、 抜髄後の根管内に注入した 14 日後を説明する図であり、根管内のほぼ全部が歯髄組織で再生されている。 図 22は、 I型及ぴ I I I型コラーゲンに SDF 1を吸着させて、 抜髄 後の根管内に注入した 14日後を説明する図であり、 根管内の根尖側のご く一部のみ歯髄組織で再生されている。
図 23は、 I型及ぴ I I I型コラーゲンに CD 3 1— ； CD 146— S P細胞のみを吸着させて抜髄後の根管内に注入した 14日後を説明する図 であり、 ごくわずかしか歯髄組織は再生されていない。
図 24は、 I型及び I I I型コラーゲンのみを注入した 1 4日後を説明 する図であり、 ほとんど歯髄組織は再生されていない。
図 25は、 I型及び I I I型コラーゲンに SDF 1及ぴ CD 3 1— ； C D 146 - S P細胞を注入した 1 4日後の根尖側の毛細血管の高倍像を説 明する図である。
図 26は、 I型及び I I I型コラーゲンに SDF 1及び CD 3 1— ； C D 1 46— S P細胞を注入した 1 4日後の歯冠側の毛細血管の高倍像を説 明する図である。
図 2 7は、 B S— 1 1 e c t i nによる血管内皮細胞染色を説明する図 である。
図 28は、 neurofilament免疫染色よる神経軸索を説明する図である。 図 29は、 I型及び I I I型コラーゲンに SDF 1及び CD 1 05 +細 胞を注入した 14日後を説明する図であり、 根管内のほぼ全部が歯髄組織 で再生されている。
図 30は、 3代目ヒト歯髄 CD 3 1— ； CD 146~ S P細胞のフローサ ィトメ トリーを説明する図である。
図 3 1は、 3代目ヒト歯髄 CD 3 1— ； CD 146— S P細胞の血管誘導 を説明する図である。
図 3 2は、 3代目ヒ ト歯髄 CD 1 0 5+細胞の血管誘導を説明する図で ある。
図 3 3は、 3代目ヒ ト歯髄 CD 1 50+細胞の血管誘導を説明する図で ある。
図 34は、 3代目 ヒ ト total歯髄細胞の場合を説明する図であり、 血管 はほとんど誘導されない。
図 3 5は、 ヒ ト歯髄 CD 24+細胞の神経誘導を説明する図である。 図 3 6は、 3代目ヒ ト歯髄 C D 3 1— ； CD 146— S P細胞移植のレ 一ザ一ドップラー解析を説明する図であり、 血流の回復がみられる。
図 3 7は、 3代目ヒ ト歯髄 CD 1 0 5+細胞移植の場合のレーザードッ ブラー解析を説明する図であり、 血流の回復がみられる。
図 38は、 P B S注入コントロールの場合のレーザードップラー角军析を 説明する図であり、 血流の回復がみられない。
図 3 9は、 ヒ ト歯髄 total歯髄細胞移植のレーザードップラー解析を説 明する図であり、 血流の回復はあまりみられない。
図 40は、 ヒ ト歯髄 CD 3 1— ； CD 1 46— S P細胞、 ヒ ト歯髄 CD 1 05細胞、 ヒ ト歯髄 total歯髄細胞移植のレーザードップラー測定結果 の統計学的解析を説明する図である。
図 41は、ヒ ト歯髄 CD 3 1— ； CD 146— S P細胞移植 1 4日後の、 B S- 1 1 e c t i nにて血管内皮細胞を染色した結果を説明する図で ある。
図 42は、 P B S注入コントロール 14日後の、 B S— 1 1 e c t i nにて血管内皮細胞を染色した結果を説明する図である。
符号の説明
1 00 :治療対象となる歯 W 200
11
1 1 0 ：根尖性歯周炎
2 0 0 ：根管充填材
2 1 0 ：細胞外基質
2 2 0 ：歯髄幹細胞を含む細胞
2 3 0 ：遊走因子
3 0 0 ：抜歯窩
4 0 0 ：血管
5 0 0 ：象牙質
6 1 0 ：スポンゼル （ゼラチン)
6 2 0 ： レジン
6 3 0 ：形態形成因子 発明を実施するための最良の形態
以下、 添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明す る。
(実施形態 1 )
本実施形態に係る発明は、 根管内の歯組織を再生する歯組織再生方法に おいて、 抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、 根管の根尖側に、 歯髄幹 細胞を含む細胞と、 歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質とを有 する根管充填材を注入することを特徴とする。 再生する歯組織は、 例えば 根管内の血管、 神経、 歯髄、 象牙質等である。 本実施形態に係る発明は、 抜歯後又は感染根管の根管拡大清掃後、 抜髄及ぴ消毒し、 根尖部を切断し て開口して根管充填材を移植する。 本実施形態に係る発明では、 無菌化さ れ空洞となった根管内に、 人工の充填材又は血餅を移植するのではなく、 歯髄組織を模倣した、 生体親和性に優れ、 為害性及び免疫原性のない scaffoldに歯髄幹細胞を含有する細胞を付着させて充填する。根管充填材 は、 根尖部の 1Z4〜 2/ 5に充填するのが望ましく、 より望ましくは根 尖部の 1ダ3に充填する。
以下、 図 1 A〜図 1 Kを参照しながら、 実施形態 1に係る歯組織再生方 法を説明する。 図 1 Aに示すように、 細胞外基質 21 0を用意する。 細胞 外基質 2 1 0とは、 いわゆる（scaffold)スキヤフォールドであり、 細胞を 定着させる足場である。 細胞外基質 2 1 0の形状は、 根管に充填されやす いように、 円柱形状又は略円錐形状が望ましい。 なお細胞外基質 2 1 0が ゲル状の場合は形状は不定形である。
細胞外基質 2 1 0は、 コラーゲン、 人工プロテオダリカン、 ゼラチン、 ハイ ドロゲル、 フィプリン、 フォスフォホリン、へパラン硫酸、へパリン、 ラミニン、 フイブロネクチン、 アルギン酸、 ヒアルロン酸、 キチン、 P L A (ポリ乳酸）、 P LGA (乳酸グリコール酸共重合体）、 PEG (ポリエ チレングリコール）、 PGA (ポリグリコール酸）、 PDLLA (ポリ一 D L一乳酸）、 PCL (ポリ力プロラタトン）、 ハイ ドロキシアパタイ ト、 β -TCP, 炭酸カルシウム、 チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを 含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。 なお、 プロテオ ダリカンは、 タンパク質と糖鎖 （グリコサミノダリカン） が共有結合した 複合糖質の一種である。 また、 細胞外基質 2 1 0は、 熱可塑性高分子等の 高分子体で作製された数平均直径が 1 nm〜 1 000 nmのナノファイバ 一からなるスポンジ状の三次元構造体も使用できる。 そのような三次元構 造体の空隙率は 80%〜9 9. 9 9%とすることが好ましい。
細胞外基質 21 0として使用されるコラーゲンは、 I型コラーゲンと I I I型コラーゲンとの混合である混合コラーゲンを用いることが好ましい。 I型コラーゲンとは、基本的コラーゲンであり、線維性コラーゲンである。 I I I型コラーゲンは、 コラーゲン線維とは別の、 細網線維と呼ばれる細 い網目状の構造を形成し、 細胞等の足場を作る。 上述の混合コラーゲンにおける、 I I I型コラーゲンの割合は 3 0重 量0 /0以上 5 0重量％以下とすることが好ましい。 I I I型コラーゲンの割 合が 5 0重量％よりも多くなると、 混合コラーゲンが固化できないおそれ があるからである。 一方、 I I I型コラーゲンの割合が 3 0重量％よりも 少なくなると、 I型コラーゲンの割合が多くなり、 後述するような血管新 生が起こるのではなく、 象牙質が再生される可能性があるからである。 特 に好ましくは I型コラーゲンと I I I型コラーゲンとの混合割合は 1 ： 1 である。
図 1 Bに示すように、 根管充填材 2 0 0は、 細胞外基質 2 1 0に歯髄幹 細胞を含む細胞 2 2 0を付着させて形成される。 歯髄幹細胞を含む細胞 2 2 0は、 根管充填材 2 0 0の根管の根尖側に、 付着される。 根管充填材 2 0 0の製造方法の一具体例としては、 まず、 トータルで 6 0 μリットルと し、 ピぺッ トマンのチップ等に 3 0 リ ツ トル〜 4 0 μ リ ツ トルの混合コ ラーゲン （ I型コラーゲンと I I I型コラーゲンとの混合割合は 1 ： 1 ) を吸い込み、 次に歯髄幹細胞を含む細胞を混合させた混合コラーゲンを 2 0 μ リ ツ トル〜 3 0 μ リ ツ トル吸い込む。 ピぺッ トマンのチップ等に吸い 込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好まし レ、。 根管充填材 2 0 0内部に気泡が発生すると、 発生した気泡が細胞の遊 走を妨げて歯組織再生の促進が損なわれるからである。 ピぺットマンのチ ップの内径は細いものが好ましく、 例えばチップの下内径が 0 . 5〜0 . 7 mmのものが使用でき、 例えば Q S P社の H— 0 1 0 - 9 6 R Sマイク 口キヤビラリ一チップを使用できる。
本実施形態に係る歯組織再生方法では、 図 1 Cに示すように例えば歯髄 炎が発生している対象となる歯 1 0 0について、 抜歯を行う。 そして、 図 1 Dに示されるように、 対象となる歯 1 0 0に対して抜髄を行う。 対象と なる歯 1 0 0とは、 う蝕、 歯髄炎等により、 細菌感染が冠部歯髄又は根部 歯髄まで波及している歯をいう。 抜髄とは、 歯牙の内部に存在する歯髄を 取り去る行為である。
抜髄後は、 対象となる歯 1 0 0の根管を拡大することで、 根尖部の根管 の大きさを所定の太さにすることが望ましい。 なぜならば、 後述するよう に、 抜髄した根管に根管充填材を充填する際に、 根管を拡大しておくほう が根管充填材を充填しゃすいからであり、 また根尖歯周組織から血管及ぴ 神経が進入しやすいからである。
例えば、 図 1 Dに示されるように、 根尖部の根管の太さ dは、 根管の直 径において 0 . 7 mm以上 1 . 5 mm以下とすることが望ましい。 根管の 太さ dが 0 . 7 mmよりも小さいと、 血管及び神経が根尖歯周組織から進 入しにくく、 また根管充填材の充填が難しいおそれがあるからであり、 一 ' 方、 根管の太さ d力 S 1 . 5 mmよりも大きいと、 対象となる歯 1 0 0に対 して必要以上の負担を与えて割れやすくなるおそれがあるからである。 対象となる歯 1 0 0を抜髄した後は、 図 1 Eに示されるように、 根管の 根尖側にピンセット等により根管充填材 2 0 0を注入する。 根管充填材 2 0 0は、 例えば歯髄 S P細胞のように生物学的材質を含有するので、 生物 学的根管充填材とすることもできる。 なお、 細胞外基質 2 1 0がゲル状の 場合はピンセット等でつまむことができないので、 ピペットマン、 注射等 により注入することになる。
歯髄幹細胞を含む細胞は、 歯組織再生の処置を受ける対象動物自身から 抽出した自家細胞でもよいし、 また、 歯組織再生の処置を受ける対象動物 以外の動物から抽出した同種細胞でもよい。
歯髄幹細胞は、 永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞である。 特に、 ヒ ト乳 歯由来の歯髄細胞には、 C D 1 0 5 +が約 5 0 %と多く含まれ、 （ヒ ト永久 歯由来 C D 3 1 - S P細胞では C D 1 0 5 +は約 2 0 %)、永久歯 C D 1 0 5 +細胞又は S P細胞とほぼ同様に、 乳歯由来の歯髄細胞は試験管内血管 誘導、 下肢虚血部位での血流回復、 血管新生促進効果を示す。 また、 CD 1 50+は乳歯歯髄細胞に 0. 2%含まれ、 永久歯 CD 3 1— S P細胞の 含有量 0. 1%より多い。 さらには、 乳歯歯髄細胞は分取せずとも、 その まま抜髄後血管新生及び歯髄再生に使うことも可能である。 そして、 例え ば、 下肤虚血部位における血管新生では、 ヒ ト乳歯由来の歯髄細胞は、 ヒ ト永久歯由来の歯髄細胞と比較して、 2. 2倍の血管新生能を有する。 歯髄幹細胞を含む細胞は、 歯髄 S P細胞、 CD 3 1陰性かつ CD 146 陰性細胞、 C D 24陽性細胞、 C D 1 05陽性細胞、 及び、. C D 1 50陽 性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことが好ましい。 例えばヒ ト歯 髄 S P細胞は、 血管新生能等の組織再生能力が高い。 具体的には、 下肢虚 血部位における血管新生では、 ヒ ト歯髄 S P細胞はヒ ト乳歯歯髄細胞と比 較して 1. 2倍の血管新生能を有する。 また、 ヒ ト歯髄 S P細胞はヒ ト永 久歯歯髄細胞と比較して 2. 6倍の血管新生能を有する。 さらに、 PB S コントロールと比較して 5. 7倍の血管新生能を有する。
ここで、 根尖とは、 対象となる歯 1 00の歯槽骨に結合される端部 （歯 根の先端部分） をいう。
また、 S P細胞とは、 Goodelら（J. Exp. Med. vol.183， 1996年）によって発 見された未分化細胞であり 、 フローサイ トメ ト リーでの解析で Hoechst33342 という蛍光色素を細胞に取り込ませて UVで励起すると 4 05 nm及ぴ 600 nmに蛍光を発する通常の細胞 （未分化細胞以外の細 胞）からサイトグラム上は異なった位置（"Hoechst Blue弱陽性かつ Hoechst Red弱陽性"）に出現する細胞集団のことである。
歯髄 S P細胞は、 C D 3 1陰性かつ C D 146陰性、 C D 24陽性、 C D 1 05陽性、 又は、 CD 1 50陽性の何れかとすることが好ましい。 根管充填材における歯髄幹細胞の含有率は、 1 X 1 03 セル 1以上 1 X 1 06 セルノ^ 1以下とすることが好ましい。歯髄幹細胞の含有率が、 1 X 1 0 3 セル/ μ 1よりも少ないと、 根管内の歯組織の再生が不十分な ものとなる可能性があるからである。 一方、 歯髄幹細胞の含有率が、 I X
1 0 6 セル 1よりも多いと、 対象の歯に対して予期せぬ副作用が生じ る可能性があるからである。
根管の根尖側に根管充填材を注入した後は、 図 1 Fに示されるように、 根管充填材 2 0 0の上部にゼラチン 6 1 0を注入し、 レジン 6 2 0により蓋 をする。 その後は図 1 Gに示されるように、 抜歯をした歯を抜歯窩 3 0 0 に再移植する。
これにより、 根管内の歯組織が再生される。 再生される歯組織は、 図 1 Ηに示されるように、 例えば根管内の血管 4 0 0及び歯髄組織である。 そ の後は、 レジン 6 2 0を一度除去して、 B M P s等の形態形成因子 6 3 0 又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布し、 図 I Iに示すように、 レジン 6 2 0により蓋をする。 形態形成因子 6 3 0又は象牙質形成因子を歯冠部 歯髄に塗布したことにより、 図 1 Jに示されるように象牙質 5 0 0も再生 される。 もっともこれに限定されず神経再生も促進される。
なお、 上述の実施形態 1では、 対象となる歯 1 0 0は、 う蝕、 歯髄炎等 により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯であつたが、 これに限定されず、 対象となる歯 1 0 0には神経機能が低下して咬合感覚 が弱くなつている歯も含まれる。 係る場合は、 抜髄後に、 根管充填材を注 入することにより、 歯髄を再生させることで咬合感覚を向上させることが できる。 また、 図 1 Kに示すように、 対象となる歯 1 0 0には、 細菌感染 が根尖歯周組織まで波及している歯 （細菌が歯髄に到達後、 根管壁の象牙 質及び根尖歯周組織に及んでいる歯） も含まれる。 このような歯は根尖性 歯周炎 1 1 0を伴うことが多い。 感染根管の根管拡大清掃後に根管充填材 2 0 0を注入する。 ここで感染根管とは、 細菌が歯髄に到達後、 根管壁の 象牙質に及んでいる場合の根管をいい、 根管拡大清掃後とは、 感染根管に おける細菌を除去した後をいう。
(実施形態 2 )
以下、 図 2 Α〜図 2 Cを参照しながら、 実施形態 2に係る歯組 ΙΪ再生方 法を説明する。 実施形態 2に係る根管充填材 2 0 0の製造方法の一具体例 としては、 まず、 トータルで 6 0 リットルとし、 ピペットマンのチップ 等に遊走因子を混合させた混合コラーゲン （I型コラーゲンと I I I型コ ラーゲンとの混合割合は 1 ： 1 ) を 3 0 リツトル〜 4 0 リツトルを吸 い込み、 次に歯髄幹細胞を含む細胞を混合させた混合コラーゲンを 2 0 μ リットル〜 3 0 ju リットル吸い込む。 実施形態 2においても、 ピぺットマ ンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やか にすることが好ましい。 また、 ピペットマンのチップの内径は細いものが 好ましレ、。このようにして、図' 2 Αに示す根管充填材 2 0 0が製造される。 このように、 根管充填材 2 0 0は、 歯髄幹細胞を含む細胞 2 2 0を根管の 根尖側に付着させるとともに、 根管の歯冠側 （例えば根管の上部 1 Z 2〜 2 / 3 ) に細胞遊走因子、 細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくと も何れか一つを含む遊走因子 2 3 0を付着させている。 歯髄幹細胞を含む 細胞 2 2 0を根管の根尖側に付着させ、 根管の歯冠側に遊走因子 2 3 0を 付着させる理由は、 歯髄幹細胞を含む細胞 2 2 0を根管の歯冠側にまで付 着させても組織からの栄養が供給されずに壊死する可能性があるからであ り、 また、 根管の根尖側に付着している歯髄幹細胞を含む細胞が根管の歯 冠側.に付着している遊走因子に引つぱられて歯組織再生が促進されやすい からである。 なお、 図 2 Aに示すように、 根管充填材 2 0 0の根管の歯冠 側に細胞外基質 2 1 0を残しておくことも可能である。
そして、 実施形態 1において図 1 Dに示したように、 対象となる歯 1 0 0に対して抜髄及ぴ抜髄後の根管拡大処置を行う。 その後は、 図 2 Bに示 すように、 根管の根尖側に根管充填材 2 0 0を注入する。 細胞遊走因子とは、 それが受容体に結合することによつて細胞の遊走に 関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。また、細胞増殖因子とは、 それが受容体に結合することによって細胞の増殖に関わる信号伝達系が活 性化する分子を意味する。 そして、 神経栄養因子とは、 それが受容体に結 合することによって細胞の生存に関わる信号伝達系が活性化する分子を意 味する。
細胞遊走因子は、 S D F 1、 VEGF、 GC S F、 MMP 3、 S l i t 及ぴ GMC S Fのうち少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。 特 に、 MMP 3は、 細胞遊走能が高く好適に使用することができる。
細胞増殖因子は、 b FGF及ぴ PDGFの少なくとも何れか一つを用い ることが好ましい。 ，
神経栄養因子は、 GDNF、 BDNF及び NG Fのうち少なくとも何れ か一つを用いることが好ましい。
遊走因子を付着させた細胞外基質における、 遊走因子の含有率は、 0. I n g/ 1以上 5 0 0 η g/ μ 1以下とすることが好ましい。 遊走因子 の含有率が 0. l n gZ 1よりも少ないと、 遊走の程度が少なくなる可 能性がありうるからである。 一方、 遊走因子の含有率が 5 0 0 n g/μ 1 よりも多いと、 対象となる歯 1 00に対して予期せぬ副作用が生じる可能 性があり得るからである。
実施形態 1と同様に、 細胞外基質は、 コラーゲン、 人工プロテオグリカ ン、 ゼラチン、 ハイ ド口ゲル、 ブイプリン、 フォスフォホリン、 へパラン 硫酸、 へパリン、 ラミニン、 フイブロネクチン、 ァノレギン酸、 ヒアルロン 酸、 キチン、 P LA、 P LGA、 PEG, PGA、 PDL LA、 P C L、 ハイドロキシアパタイ ト、 /3— TC P 炭酸カ^^シゥム、 チタン及ぴ金の うち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていること が好ましい。 コラーゲンは、 I型コラーゲンと I I I型コラーゲンとの混合である混 合コラーゲンである.ことが好ましい。 さらに、 混合コラーゲンにおける I I I型コラーゲンの割合は 3 0重量％以上 5 0重量％以下とすることが好 ましい。
その後は、 実施形態 1における図 1 Fと同様にゼラチン 6 1 0を注入し てレジン 6 2◦にて畫をして、 図 2 Cに示すように、 抜歯をした歯を抜歯 窩 3 0 0に再移植する。 その後は、 図.1 Hに示したように根管内の血管 4 0 0及び歯髄組織が再生するが、実施形態 1よりも再生率が向上している。 そして、 図 1 Iに示したように BMP s等の形態形成因子 6 3 0又は象牙 質形成因子を歯冠部歯髄に塗布し、 図 1 Jに示したように象牙質再生を行 う力 実施形態 1よりも再生率が向上している。
なお、 上述の実施形態 2においても、 対象となる歯 1 0 0に対して感染 根管の根管拡大清掃後に根管充填材 2 0 0を注入することもできる。 実施例 1
〈細胞分取と特徴化〉
プタ歯胚を摘出後、 3 7°Cで 1時間半、 コラーゲナーゼで酵素消化して 歯髄細胞を分離した後、 2%血清を含む DMEM中 1 X 1 06 c e 1 1 s / 1で細胞を分散させ、 5 μ g/m 1 Hoechst33342 でラベルした。 ついで、 CD 3 1及ぴ CD 1 4 6の抗体を用いて 4 °Cで 3 0分ラベル後、 フローサイトメ トリーを行った。 図 3に、 S P細胞のフローサイ トメ トリ 一の分析結果を示す。ブタ歯髄由来の S P細胞は全体の 0. 2%を占めた。 図 4に示されるように、 歯髄由来 CD 3 1— ； CD 1 4 6 - , CD 3 1 + ； CD 1 46 及ぴ CD 3 1 + ； CD 1 4 6+ S P細胞の 3分画を得た。 CD 3 1及ぴ CD 1 4 6抗体でラベルして S P細胞をさらに分画すると、 CD 3 1 - ； CD 1 4 6 - S P細胞， CD 3 1 + ； CD 1 4 6— S P細胞， CD 3 1 + ； CD 1 46 + S P細胞は、 それぞれ、 50%、 48%、 2% を占めた。 £0 及び1 GF— Iが添加された 10%ゥシ胎児血清を含む EBM2培地中で培養した。
表 1に示すように、 フローサイ トメ トリーにて、 CD 3 1— ； CD 14 6一 S P細胞は CD 34+ 、 VEGFR 2ZF LK 1 +が 70〜90%ぐ らいをしめており、 CD l l b、 CD 1 4は 0 %であった。 Realtime RT - PCRでは、 CD l l b、 CD 1 4、 CD45 mRN Aは発現しておらず、 造血系の幹細胞とは異なることが明らかとなった。 .
[表 1]
Figure imgf000022_0001
また、表 2に示すように、骨髄由来の angioblastに発現する CD 1 33 mRNAは歯髄由来 CD 3 1— ； CD 1 46— S P細胞には全くみられな かった。
[表 2]
Figure imgf000023_0001
マイクロアレイならびに Rea卜 time RT-PCR にて、 歯髄由来 CD 3 1 一 ； CD 146— S P細胞と歯髄由来 CD 3 1+ ； CD 1 46— S P細胞 とを RNA発現について比較すると、 表 3に示すように、 前血管誘導因子 (VEGF— A)、 サイト力イン （G— CSF、 GM— CSF、 MCP 1ノ CCL 2、 MDCF 1)、 細胞外基質分解酵素 （MMP 1、 MMP 3、 Arginase 1)、 その他 （GP 38K、 CRS P) 等が高発現していた。
[表 3]
Figure imgf000024_0001
〈多分化能〉
Matrigel上で血管誘導を行うと CD 3 1— ； CD 1 46— S P細胞は 2 4時間後には網目状の管腔構造を呈した。 CD 3 1+ S P細胞は明らかな 管腔構造を形成しなかった。 さらに 1 0日後に CD 3 1— ； CD 146一 S P細胞は Matrigel内部に血管様構造を形成し、血管様構造物周囲の細胞 は CE AC AMI、 CD 146及ぴ occludin mRNAの内皮細胞の分化マー カーを発現していた。 また VEGF、 b FGF存在下で培養すると 1 0日 目には CD 3 1、 vWF、 VE- c a d h e r i nの内皮細胞の分化マー カーを発現するようになった。 さらに CD 3 1— ； CD 1 46- S P細胞 は、 内皮細胞の機能的な性質であるヒスタミンによる vWFの放出や a c 一 LDLの取り込み能を示した。 また、 CD 3 1— ； CD 146— S P細 胞は、 多分化能を有し、 試験管内で軟骨、 脂肪、 神経、 象牙芽細胞に分化 誘導された。
〈遊走能、 増殖能〉
試験管内で、 CD 3 1— ； CD 146— S P細胞は他の 2画分と比較し て FGF及び EGF刺激により高い増殖能を示した。また、 CD 3 1一 ； CD 146— S P細胞は他の 2画分と比較して VEGF及ぴ SDF 1によ り誘導され 2倍高い遊走能を示した。
図 5 Aは 0. 2 % B S Aのコント口ールであり、 図 5 Bは S O n gZm l VEGFであり、 図 5 Cは 50 n g/m 1 b F G Fであり、 図 5 Dは 5 O n g/m l EGFであり、図 5 Eは 50 n gZm 1 SDF 1であり、 図 5 Fは 50 n g /m 1 I G F 1である。 Tetra- color one (登録商標） を添加して、 0、 12、 24、 36、 48、 72時間後、 細胞数を 450 nm で測定した。 CD 3 1— ； CD 1 46— S P細胞は他の画分と比較して、 72時間では b FGFあるいは EGFで高い増殖活性があった。 データは 4サンプルの平均値プラスマイナス S Dで示す （*Pく 0. 01)。 実験は 3回繰り返し、 典型例を示した。
図 6に示すように、 24 we 1 1の培地に VEGF— A、 0、 5、 10、 1 00 n g /m 1を添加し、 5 X 104個の細胞を PET- membraneィンサートに 播種し、 膜を通過した細胞を 24時間後に力ゥントした。 C D 3 1— ； CD 146— S P細胞は遊走能が高く、 濃度依存性に遊走能が増加した。 4サ ンプルの平均値プラスマイナス SDで示す （*P<0. 01)。 実験は 3回 繰り返し、 典型例を示した。
図 7に示すように、 VEGF— A、 SDF 1及ぴ GC S F添加による遊走 能の変化を観察した。 S D F 1及び VEGF— Aは CD 3 1 _ ； CD 1 4 6一 S P細胞の遊走を促進させることが判明した。 データは 4サンプルの 平均値プラスマイナス S Dで示す （* P< 0. 01、 **P<0. 001)。 実験は 3回繰り返し、 典型例を示した。
このように、 血管内皮細胞 （HUVE C) に対して、 CD 3 1— ； CD 146— S P細胞の上清画分を試験管内で 48時間作用させると MMP 3 あるいは VEGFを 50 n g Zm 1で作用させた場合とほぼ同様の増殖活 性がみられた。
また、 CD 3 1— ； CD 1 46 - S P細胞の上清画分は血管内皮細胞に 対して MMP 3あるいは GM— C S Fに相当するぐらいのアポトーシス抑 制効果がみられた。
図 8は、 HUVE Cに対する歯髄 CD 3 1— ； CD 1 46— S P細胞の 培養上清の増殖活性を示すものである。 2、 12、 24、 36、 48時間後に おける、 MMP 3、 VEGF— A、 G— CSF、 GM— CSF及び CD 3 1 + ； CD 146— S P細胞上清との比較が示される。' 36及ぴ 48時間では CD 3 1- ； CD 1 46" S P細胞上清では他のサイトカインと同様に増殖 活性があり、 CD 3 1 + ； CD 146— S P細胞の上清に比べて有意に高い 活' I·生が見られた （#Pく 0. 01) **Pく 0. 01、 *Pく 0. 05 V s c o n t r o l。
図 9は、 100 nM staurosporineによりアポトーシスを生じさせた HU VECを用いたフローサイトメ トリーによる壊死細胞及ぴアポトーシス細胞 の割合の測定したものである。 歯髄 CD 3 1— ； CD 146— S P細胞の培 養上清は、 MMP 3、 VEGF— A、 G— CSF、 GM— CSFと同様に高 ぃ抗アポトーシス効果を有することが理解され、 CD 3 1+ ； CD 146 一 S P細胞上清と比較して有意に高い抗アポトーシス効果を有することが わかった （#Pく 0. 01)。 これらの結果より、 CD 3 1— ； CD 146 ― S P細胞は血管新生を促進するのに適した細胞であることが明らかとな つた。 〈マウス下肢虚血モデルでの血管新生〉
S C I D (Sevefe Combined ImmunoDef iciency) マウスの下肢虚血モデ ルを作製し、 CD 3 1— ； CD 146— S P細胞を下肢虚血部位に移植す ると、 1週間後には血流が回復し、 CD 3 1+ ； CD 146— S P細胞移 植群と比較して、 新生血管形成が約 1 3倍に促進された。
〈ィヌ生活歯髄切断モデルでの血管新生、 神経再生、 歯髄再生〉 ィヌ歯髄組織より CD 3 1— ； CD 146" S P細胞をブタと同様に分 取すると、 S P細胞の約 1 0%を占めていた。 この歯髄由来 CD 3 1一 ； CD 146— S P細胞 1 X 1 06個を I型コラーゲン及ぴ I I I型コラー ゲンを添加して三次元培養を行った。 24時間後にィヌの生活歯髄切断面 上に自家移植し、 上部はスポンゼル及ぴ燐酸セメントで充填し、 さらに化 学重合レジンで封鎖した。 コントロールとして CD 3 1 + S P細胞あるい は I型コラーゲン及び I I I型コラーゲンのみを用いた。 1 4日後、 CD 3 1— ； CD 146~ S P細胞移植群では生活歯髄切断面上に歯髄が再生 され、 新生血管が連続して、 図 1 0及び図 1 3に示すように、 再生歯髄中 にみられた。 図 1 0及び図 1 3は、 I型及ぴ I I I型コラーゲン中に 1日三 次元培養して自家移植後 14日目のもので、 CD 3 1— ; CD 1 46— S P 細胞を移植したものである。 染色は H— E染色を使用した。 図中において矢 印は歯髄切断面を示す。図 10及び図 1 3に示すように、歯髄切断面上の窩洞 内は再生歯髄組織に満たされており、リン酸セメントを充填した部位近くまで 毛細血管が伸張していることが理角早される。
さらに、 図 1 5及び図 1 7に示されるように、 移植細胞は新生血管周囲 に遊走、 定着していた。 図 1 5では、 CD 3 1— ； CD 1 46 ~ S P細胞 は再生歯髄の底部に見られることが理解される。 また、 図 1 7は、 血管内皮細 胞を CD 146で染色したものであり、 D i Iラベルされた CD 3 1— ； C D 1 46— S P細胞は再生歯髄組織の新生血管周囲に存在することが理解さ れる。 なお、 図 17において矢印は CD 3 1— ； CD 1 46— S P細胞の位 置を示し、 記号 Vは、 新生血管を示す。 図中において点線は新生組織境界部 を示す。
—方、 図 1 1、 図 14、 図 1 6は、 CD 3 1+ ； CD 1 46— S P細胞 を移植したものである。 図 1 1、 図 14及ぴ図 1 6に示されるように、 C D 31 + ； CD 1 46 - S P細胞移植群では移植細胞の定着は見られた力 新生血管形成がみられず、 細胞の遊走もみられなかった。 図 1 1及び図 1 4では、 窩洞内に移植組織の定着は見られるが、 毛細血管はほとんど見られ ないことが示される。 図 16では、 CD 3 1+ ； CD 1 46— S P細胞は窩 洞全体に分散して存在することが示されている。矢印は歯髄切断面である。 白 線は象牙質壁を示す。 点線は新生組織境界部を示す。
次に、 図 1 2は、 I型コラーゲン及び I I I型コラーゲンのみを移植し た標本である。 図 1 2に示されるように、 生活歯髄切断面上に全く組織は みられなかった。
図 1 8に示すように、 28日後では、 歯冠部上部のリン酸セメントに接 する部分で、 象牙芽細胞の分化及び細管象牙質形成がみられた。 図 1 8に おいて、 矢印は分化した象牙芽細胞の突起を示す。
図 1 9に示されるように、 切断された歯根部歯髄の神経から伸びる神経 軸索がみられた。 図 20に示されるように、 残存した歯根部歯髄中に存在 する、 切断され修復された神経が示された。 なお、 図 1 9及び図 2 0は neurofilament免疫染色したものである。
実施例 2
実施例 2では、 CD 3 1— ； CD 146— S P細胞及び細胞遊走因子 S DF 1を用いたィヌ抜髄後の歯髄再生を示す。
ィヌ歯髄組織より CD 3 1— ； CD 146— S P細胞をブタと同様に分 取した。 また、 CD 10 5+細胞を分取した。 ィヌ上顎前歯を抜去後、 歯 髄を除去して、 培地中で # 80まで拡大し、 根尖部の根管の太さを 0. 8 mm以上にした。 抜去後 30分以内に 1 X 1 06個の CD 3 1 ； CD 1 46— S P細胞を I型コラーゲン及び I I I型コラーゲン 1 0 μ 1に混合 し、 根管の根尖側 1/3に注入した。 さらに、 根管の歯冠部 2Ζ3に SD F 1 (200 n g) を添加した I型コラーゲン及ぴ I I I型コラーゲンを 20 1充填した。 30分以内にィヌの抜歯窩 300に再移植し、 上部は 燐酸セメントならびに化学重合レジンで封鎖した。 14日後、 抜歯し、 パ ラフィン標本を作製した。
図 21、 図 25、 図 26、 図 27、 図 28は、 I型及ぴ I I I型コラーゲ ンに SDF 1 ( 200 n g ) 及、び C D 3 1— ； CD 146— S P細胞を注 入したものである。 CD 3 1— ； CD 1 46— S P細胞及ぴ S D F 1両方 を根管充填材として用いた場合、 図 2 1に示されるように、 14日後に根 管内すべてが新生歯髄組織で満たされていた。 図 2 1は H— E染色したも のである。その新生歯髄組織には、図 25に示されるように根尖側、及ぴ、 図 26に示されるように歯冠側とも新生毛細血管がみられ、 図 28に示さ れるように再生された神経が見られた。 図 25及ぴ図 26において、 記号 Vは毛細血管を示す。 図 2 7は BS-1 lectinによる血管内皮細胞染色を示す ものである。 図 28は neurofilament免疫染色したものである。
—方、 SDF 1あるいは CD 3 1— ； CD 1 46— S P細胞のどちらか 一方では、 根管内は根尖部 1/5〜1Z4しか新生歯髄組織はみられなか つた。 図 22は、 I型及び I I I型コラーゲンに S D F 1 (200 n g) を注入したものである。図 23は、 I型及び I I I型コラーゲンに CD 3 1 一 ； CD 146— S P細胞を注入したものである。 さらに、 図 24に示す 場合のように、 I型コラーゲン及ぴ I I I型コラーゲンのみでは、 ほとん ど新生歯髄組織はみられなかった。
CD 1 05+細胞及ぴ SDF 1両方を根管充填材として用いた場合、 図 29に示されるように、 14日後に根管内が新生歯髄組織で満たされてい た。
実施例 3
実施例 3では、 主に、 ヒ ト永久歯歯髄 C D 3 1陰性 C D 146陰性 S Ρ 細胞及びヒ ト'永久歯歯髄 CD 1 05陽性細胞を用いた血管新生を示す。
ヒ ト歯髄を摘出後、 3 7°Cで 1時間コラーゲナーゼで酵素消化して歯髄 細胞を分離後、 2%血清を含む DMEM中に 1 X 1 06 c e l l s /m 1 で細胞を分散させ、 5 w g/m l Hoechst33342でラベルしてさらに CD 3 1抗体を用いてフローサイ トメ トリーを行い、 歯髄 CD 3 1— ； CD 1 46— S P細胞を分取した。 一方、 歯髄細胞を分離後、 CD 1 05抗体を 用いてフローサイ トメ トリーを行い、 歯髄 CD 1 0 5+細胞を分取した。 これらの細胞を EG F及ぴ I GF— Iが添加された 1 0%ゥシ胎児血清を 含む EBM 2培地中で培養するとブタ歯髄由来のものと同等 （約 1 0%) の頻度で細胞は dishに付着し増幅した。 この 3代目の CD 3 1— ； CD 1 46— S P細胞及び歯髄 CD 105+細胞をさらに細胞表面マーカーを用 いてフローサイ トメ トリーを行い細胞の特徴を調べたところ、 幹細胞のマ 一力一 C D 44はどちらもほぼ陽性であり、 C D 90はそれぞれほぼ陽性 及び 30 %陽性であった。 図 30に、 ヒ ト CD 3 1— ； CD 146— S P 細胞のフローサイトメトリーを示す。 表 4は、 ヒト歯髄 CD 3 1— ； CD 1 46 - S P細胞とヒ ト歯髄 CD 1 05 + S P細胞、 ヒ ト total歯髄細胞、 ヒ ト total乳歯細胞及びブタ歯髄 C D 3 1— ； CD 146— S P細胞の比較を 示すものである。 血管内皮細胞あるいは血管平滑筋細胞のマーカー CD 1 46はヒ ト CD 3 1— S P細胞は陰性、 ヒ ト CD 1 05 +細胞はほぼ陰性 であった。骨髄由来の angioblast及び末梢血中の血管内皮前駆細胞で陽性 といわれる CD 1 3 3は陰性であり、 ブタ歯髄由来の CD 3 1— ； CD 1 46— S P細胞と同様であつたが、 CD 134はプタと異なり陰性であった。 [表 4]
Figure imgf000031_0001
ついで、 Matrigel上に 1 X 104個 / 96we 1 1播種し血管誘導を行 うと、 図 3 1に示すように、 ヒ ト歯髄 CD 3 1— ； CD 1 46- S P細胞 は播種 20時間後には網目状の管腔構造を形成した。
また、 同様にヒ ト歯髄 CD 105+細胞でも実験を行った結果、 図 3 2 に示すようにヒト歯髄 CD 105 +細胞でも管腔構造を形成した。
また、 同様にヒ ト歯髄 CD 1 50+細胞でも実験を行った結果、 図 3 3 に示すようにヒ ト歯髄 CD 1 50 +細胞でも管腔構造を形成した。
同様に分取していない 3代目のヒ ト total歯髄細胞でも実験を行った結 果、 図 34に示すように、 分取していない 3代目のヒ ト total歯髄細胞で は明らかな管腔構造を形成しなかった。
一方、 ヒ ト歯髄 CD 24+細胞で実験を行った結果、 図 3 5に示すよう に、 ヒ ト歯髄 CD 24+細胞は試験管内で容易に神経に分化した。
図 36は、 下肢虚血部位に 3代目ヒ ト歯髄 CD 3 1— ； CD 1 6" S P細胞を移植したものである。 図 3 7は、 下肢虚血部位に 3代目ヒ ト歯髄 CD 105+細胞を移植したものである。 図 38は、 下肢虚血部位に PB Sコントロールを注入したものである。 図 39は、 下肢虚血部位に 3代目 のヒ ト歯髄 total歯髄細胞を移植したものである。 図 36、 図 3 7、 図 3 8、 図 3 9はレーザードップラー解析の結果であり、 図 40はレーザード ップラ一解析の統計学的有意差を示すものである。 図 36、 図 37、 図 3 8に示すように、 下肢虚血部位にヒ ト歯髄 CD 3 1— ； CD 1 46— S P 細胞若しくはヒ ト歯髄 CD 1 05+細胞を移植すると、 P B Sを注入した コントロールと比べ、 劇的な血流回復がみられた。 図 3 9に示すように、 3代目のヒ ト total歯髄細胞ではやや血流回復がみられた。
下肢虚血部位の連続凍結切片を作製し、 BS- 1 lectin にて血管内皮細胞 を染色し、 新生血管密度を測定した。 図 4 1は、 ヒ ト歯髄 CD 3 1— ； C D 146— S P細胞移植の場合の BS- 1 lectin にて血管内皮細胞を染色し た結果である。 図 42は、 PB S注入コントロールの場合の BS-1 lectin にて血管内皮細胞を染色した結果である。図 4 1及ぴ図 42に示すように、 ヒ ト歯髄 CD 3 1- ； CD 146 - S P細胞では、 P B S注入コントロー ルに比べて大幅に血管新生を促進していることが明らかとなった。
以上の結果より、 ヒ ト歯髄由来の CD 3 1— ； CD 1 46 - S P細胞及 び CD 1 05 +細胞は、 ィヌ及ぴブタと同様に、 血管再生及び歯髄再生に 有効である。
産業上の利用可能性
抜髄後の根管内に根管充填材を充填して歯組織再生を図ることができる ので、 深いう蝕で歯髄炎を生じている場合でも、 適切に歯髄再生及び歯髄 機能の回復させる用途に適用できる。

Claims

DPT .iDonno / n 5554 jWO 2009/113733 31 PCT/JP2009/055541 請求の範囲
1. 抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、 根管の根尖側に、 歯髄幹細胞 を含む細胞と、 前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質とを有 する根管充填材を注入することで、 根管内の歯組織を再生する歯組織再生 方法。
2. 前記歯髄幹細胞を含む細胞は、 歯髄 S P細胞、 CD 3 1陰性かつ CD
146陰性細胞、 C D 24陽性細胞、 C D 1 0 5陽性細胞、 及び、 C D 1
50陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする請求項
1記載の歯組織再生方法。
3. 前記歯髄 S P細胞が、 C D 3 1陰性かつ C D 1 46陰性、 C D 24陽 性、 C D 1 05陽性、 又は、 C D 1 50陽性の何れかであることを特徴と する請求項 2記載の歯組織再生方法。
4. 前記根管充填材は、 歯髄幹細胞を含む細胞を根管の根尖側に付着させ るとともに、 根管の歯冠側に細胞遊走因子、 細胞増殖因子及ぴ神経栄養因 子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子を付着させていることを特 徴とする請求項 1記載の歯組織再生方法。
5. 前記細胞遊走因子が、 SDF 1、 VEGF、 GC S F、 MMP 3、 S
1 i t及び GMC S Fのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とす る請求項 4記載の歯組織再生方法。
6. 前記細胞増殖因子が、 b FGF及ぴ PDGFのうち少なくとも何れか 一つであることを特徴とする請求項 4記載の歯組織再生方法。
7. 前記神経栄養因子が、 GDNF、 BDNF及び NGFのうち少なくと も何れか一つであることを特徴とする請求項 4記載の歯組織再生方法。
8. 前記細胞外基質が、 コラーゲン、 人工プロテオダリカン、 ゼラチン、 ハイ ドロゲル、 フイブリン、 フォスフォホリン、へパラン硫酸、へパリン、 DOT / ] π n n n 7 41
WO 2009/113733 32 PCT/JP2009/055541
ラミニン、 フイブロネクチン、 ァノレギン酸、 ヒアノレロン酸、 キチン、 P L
A、 P LGA、 PEG、 PGA、 PDLLA、 PCL、 ハイ ドロキシァパ タイ ト、 j3— TCP、 炭酸カルシウム、 チタン及ぴ金のうち少なくとも何 れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることを特徴とする請求 項 1記載の歯組織再生方法。
9. 前記根管充填材を前記根管の根尖側に注入する前に、 前記根管を拡大 することで根尖部の根管の太さを所定の大きさにすることを特徴とする請 求項 1記載の歯組織再生方法。
1 0. 前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質における、 前記 歯髄幹細胞の含有率は、 1 X 103 セル/ i 1以上 1 X 1 06 セル 1 以下であることを特徴とする請求項 1記載の歯組織再生方法。
1 1. 歯髄幹細胞を含む細胞と、 前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた 細胞外基質とを有する根管充填材。
1 2. 前記歯髄幹細胞を含む細胞は、 歯髄 S P細胞、 CD 3 1陰性かつ C
D 146陰性細胞、 C D 24陽性細胞、 C D 1 05陽性細胞、 及ぴ、 C D
1 50陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする請求 項 1 1記載の根管充填材。
1 3. 前記歯髄 S P細胞が、 C D 3 1陰性かつ C D 1 46陰性、 C D 24 陽性、 C D 1 05陽性、 又は、 C D 1 5◦陽性の何れかであることを特徴 とする請求項 1 2記載の根管充填材。
14. 前記細胞外基質が、 コラーゲン、人工プロテオダリカン、ゼラチン、 ハイ ドロゲル、 フイブリン、 フォスフォホリン、へパラン硫酸、へパリン、 ラミニン、 フイブロネクチン、 アルギン酸、 ヒアルロン酸、 キチン、 P L
A、 P LGA、 PEG、 PGA、 PDLLA、 PCL、 ハイ ドロキシァパ タイ ト、 j3— TCP、 炭酸カルシウム、 チタン及ぴ金のうち少なくとも何
れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることを特徴とする請求 項 1 1記載の根管充填材。
1 5 . 前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質における、 前曾己 歯髄幹細胞の含有率は、 1 X 1 0 3 セル/ 1以上 1 X 1 0 6 セル/ μ 1 以下であることを特徴とする請求項 1 1記載の根管充填材。
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