CN101970022A - 根管填充材料以及牙组织再生方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种在拔髓或感染根管的根管扩大清扫后，实现牙组织再生的新颖且独创的牙组织再生方法。对于对象牙齿(100)，在拔髓后或感染根管的根管扩大清扫后，在根管的根尖侧，注入具有含有牙髓干细胞的细胞(220)和使含有牙髓干细胞的细胞附着的细胞外基质(210)的根管填充材料(200)。含有牙髓干细胞的细胞含有牙髓SP(Side Population)细胞、CD31阴性且CD146阴性的细胞、CD24阳性细胞、CD105阳性细胞、或CD150阳性细胞中的至少任一种。牙髓SP细胞可以是例如CD31阴性且CD146阴性的细胞等。即使在深度龋齿导致了牙髓炎的状况下，也可能适当地进行牙髓再生以及恢复牙髓功能。

Description

根管填充材料以及牙组织再生方法

技术领域

本发明涉及根管填充材料以及使用该根管填充材料的牙组织再生方法。

背景技术

龋食深入到牙髓时，一般通过拔髓对龋齿进行治疗。但是，牙髓具有通过形成修复象牙质而隔绝外来刺激、根据感觉信息抑制龋食的发展，产生咬合感觉以防止咀嚼坚硬物体时导致牙齿断裂的作用。另外，牙髓通过代谢维持象牙质蛋白质以及水分，进而保持象牙质的机械强度以及性质。众所周知，牙髓还具有提供免疫功能的感染防御构造。

在牙内治疗中，由于根管形态的复杂性，NiTi合金制旋转锉得到普及。但是完整的拔髓、根管扩大以及根管填充几乎是不可能的。因此，拔髓之后导致根尖性牙周炎，结果失去整个牙齿的潜在可能性很高。

为了提高牙齿的寿命，需要开发一种尽可能保存牙髓的方法。因此，要对新的龋齿治疗方法进行技术开发，该方法驱动被认为是牙齿再生的3要素，即：1)形态形成因子(BMPs(骨形成因子)等)，2)牙髓组织干细胞，3)微小环境(支持物、细胞外基质等)，从而使象牙质以及牙髓再生。

首先，如非专利文献1中所记载的，有一种根据生物体外细胞导入法或遗传基因导入法，在生物体外将BMP蛋白质投放到牙髓干细胞内或将BMP遗传基因导入到牙髓干细胞内，并将在三维培养下分化的象牙芽细胞移植到牙髓暴露面上，快速且大量再生象牙质的方法。

另外，如非专利文献2中所记载的，为了实际临床应用上述方法，进行一种不引起免疫排斥反应而大量生成人类牙髓干细胞的技术开发，分取含有大量干细胞的SP(side population)细胞，对其干细胞的分子生物学特征的进行分析。

若牙髓组织处于偶发性露髓或可逆性牙髓炎的程度，则认为所述象牙质的再生方法有效。但是对于不可逆性牙髓炎并伴有疼痛的情况，就不得不拔髓。

到目前为止，众所周知对于人类牙根发育未完全的自体移植，其移植后牙髓的治愈率很高。并且，这种方法在伴有由钙化组织引起的牙髓腔的关闭、牙根的生长以及根尖孔的封闭时，可以防止牙根断裂。即使牙髓发生坏死，只要没有被感染，残留的细胞外基质则可能作为血管以及细胞侵入的支架(scaffold)而发挥作用。

另外，移植时，根尖部附近的细胞具有生命活性，移植后可能向牙冠部方向移动、增殖。

另一方面，在狗的牙根发育不全的牙齿中，在拔髓后进行移植，牙髓也同样可以再生。有报告介绍，即使在根尖部伴有病变的牙根发育不全的牙齿中，通过进行彻底的根管清洗和消毒，且进行3种抗菌剂贴药后，牙骨质象牙质交界(CDJ，cemento-dentinal junction)处充满血块，使用无机三氧化复合物(MTA，Mineral trioxide aggregate)以及Cavit完全封锁窝洞，从而使牙髓再生。

然而，如非专利文献3所记载的，即使在狗的健全牙根发育完全的牙齿中，在拔牙后拔髓且切断根尖部后进行移植的情况下，也能看到牙髓通过血块得以再生。

然而，根管内牙髓再生的报告大多是关于根发育不全的牙齿的报告。针对深度龋食发生牙髓炎的情况，或根尖性牙周炎的牙根发育完全的牙齿的情况，其牙组织再生方法以及用于牙组织再生的根管填充材料的开发尚未成功。

专利文献1及专利文献2中记载了人工填充物制成的根管填充材料。但是，这些根管填充材料在根管填充后，填充材料可能发生剥离、断裂。进而，使用了这些根管填充材料，在数年后也可能发生根尖性牙周炎。

专利文献1：日本特开2006-001910号公报

专利文献2：日本特开2002-029911号公报

非专利文献1：Nakashima and Reddi、2003；Nakashima and Akamine、2006(PMID 12949568 doi 10.1038/nbt864；PMID：16186748)

非专利文献2：Iohara et al.，2006(PMID：16873765 doi：10.1634/stemcells，2006-0161)

非专利文献3：Laureys et al.，200l(PMID：11298308 doi：10.1067/mod.2001.113259)

发明内容

发明所要解决的问题

本发明是鉴于这种问题而完成的，其目的在于：提供在对牙根发育完全的牙齿拔髓后的根管内，填充支架(scaffold)从而实现牙组织再生的新颖、独创的适当根管填充材料以及使用这种填充材料的牙组织再生方法。

解决问题的手段

为达成上述目的，根据该发明的第1观点提供一种牙组织再生方法，其特征在于：在拔髓后或感染根管的根管扩大清扫后，通过在根管的根尖侧注入具有含有牙髓干细胞的细胞和使所述含有牙髓干细胞的细胞附着的细胞外基质的根管填充材料，从而使根管内的牙组织再生。

另外，所述含有牙髓干细胞的细胞可含有牙髓SP细胞、CD31阴性且CD146阴性的细胞、CD24阳性细胞、CD105阳性细胞以及CD150阳性细胞中的至少任一种。

另外，所述牙髓SP细胞可以是CD31阴性且CD146阴性、CD24阳性、CD105阳性、或CD150阳性的任一种。

另外，较佳地，所述根管填充材料在使含有牙髓干细胞的细胞附着在根管的根尖侧的同时，使含有细胞移动因子、细胞增殖因子以及神经营养因子中的至少任一种的移动因子附着在根管的牙冠侧。

所述细胞移动因子可以是SDF1、VEGF、GCSF、MMP3、Slit以及GMCSF中的至少任一种。

所述细胞增殖因子可以是bFGF以及PDGF中的至少任一种。

所述神经营养因子可以是GDNF、BDNF、NGF中的至少任一种。

另外，所述细胞外基质可以由含有胶原蛋白、人造蛋白聚糖、明胶、水凝胶、纤维素、磷酸胆碱(phosphocholine)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、几丁质、PLA、PLGA、PEG、PGA、PDLLA、PCL、羟磷灰石(hydroxyapatite)、β-TCP、碳酸钙、肌联蛋白(titin)以及金中的至少任一种的生物体亲和性材料构成。

另外，也可以在将所述根管填充材料注入到所述根管的根尖侧之前，通过所述根管扩大将根尖部的根管的粗细作为既定尺寸。

另外，使所述含有牙髓干细胞的细胞附着的细胞外基质中，所述牙髓干细胞的含量可在1×10³个/μl以上1×10⁶个/μl以下。

为了达成上述目的，根据该发明的第2观点提供一种根管填充材料，其特征在于：具有含有牙髓干细胞的细胞和使所述含有牙髓干细胞的细胞附着的细胞外基质。

另外，所述含有牙髓干细胞的细胞可含有牙髓SP细胞、CD31阴性且CD146阴性的细胞、CD24阳性细胞、CD105阳性细胞以及CD150阳性细胞中的至少任一种。

另外，所述牙髓SP细胞可以是CD31阴性且CD146阴性、CD24阳性、CD105阳性或CD150阳性的任一种。

另外，所述细胞外基质可由含有胶原蛋白、人造蛋白聚糖、明胶、水凝胶、纤维素、磷酸胆碱(phosphocholine)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、几丁质、PLA、PLGA、PEG、PGA、PDLLA、PCL、羟磷灰石(hydroxyapatite)、β-TCP、碳酸钙、肌联蛋白(titin)以及金中的至少任一种的生物体亲和性材料构成。

另外，使所述含有牙髓干细胞的细胞附着的细胞外基质中，所述牙髓干细胞的含量在1×10³个/μl以上1×10⁶个/μl以下。

发明的效果

本发明涉及的根管填充材料，即使在深度龋食导致牙髓炎时或牙根发育完全的牙齿发生根尖性牙周炎时，也可以通过在拔髓后或感染根管的根管扩大清扫后，在根管内填充该根管填充材料从而实现牙组织再生。本发明涉及的根管填充材料促进血管以及神经的再生，刺激牙髓细胞的增殖从而促进牙髓再生以及牙髓功能的恢复。进而，在牙冠部牙髓上涂敷BMPs等形态形成因子或象牙质形成因子，可促进牙髓细胞向象牙质细胞的分化，从而利用象牙质封闭牙冠。进而，通过添加牙骨质釉质封闭根尖孔。

附图说明

图1A为细胞外基质的模式图；

图1B为说明细胞外基质使含有牙髓干细胞的细胞附着而形成的根管填充材料的模式图；

图1C为作为对象的牙髓炎的说明图。

图1D为说明拔髓后进行根管扩大处理部位的模式图。

图1E为说明注入了填充材料的部位的模式图。

图1F为说明注入了止血用明胶海绵(明胶)以及合成树脂的部位的模式图。

图1G为说明再移植到拔牙洞内再移植部位的模式图。

图1H为表示牙髓再生以及血管再生的模式图。

图1I为说明注入了形态形成因子以及合成树脂的部位的模式图。

图1J为表示象牙质再生的模式图。

图1K为细菌侵入根管壁的象牙质以及根尖牙周组织的根尖性牙周炎的模式图。

图2A为说明在使含有牙髓干细胞的细胞附着在根管的根尖侧的同时，使移动因子附着在根管的牙冠侧的根管填充材料的模式图。

图2B为说明注入根管填充材料注入部位的模式图。

图2C为说明再移植到拔牙洞内再移植部位的模式图。

图3为说明SP细胞的流式细胞仪分析结果的图。

图4为在利用CD31以及CD146抗体进行标记，分选SP细胞的图。

图5A为说明在0.2％BSA的对照物中，CD31^-CD146^-SP细胞的增殖活性的图。

图5B为说明在50ng/ml VEGF中，CD31^-CD146^-SP细胞的增殖活性的图。

图5C为说明在50ng/ml bFGF中，CD31^-CD146^-SP细胞的增殖活性的图。

图5D为说明在50ng/ml EGF中，CD31^-CD146^-SP细胞的增殖活性的图。

图5E为说明在50ng/ml SDF1中，CD31^-CD146^-SP细胞的增殖活性的图。

图5F为说明在50ng/ml IGF1中，CD31^-CD146^-SP细胞的增殖活性的图。

图6为在VEGF浓度变化时表示CD31^-CD146^-SP细胞移动能力的图。

图7为在移动因子变化时表示CD31^-CD146^-SP细胞移动能力的图。

图8为说明HUVEC(血管内皮细胞)作用下，牙髓CD31^-CD146^-SP细胞的培养上清液的增殖活性的图。

图9为说明使用了由100nM星形孢菌素(staurosporine)诱导凋亡(apoptosis)的HUVEC(血管内皮细胞)，以流式细胞仪测定坏死细胞以及凋亡细胞的比例的图。

图10为说明将自体牙髓CD31^-CD146^-SP细胞移植至狗日常牙髓断面上14日后的图。

图11为将自体牙髓CD31⁺CD146^-SP细胞移植至狗日常牙髓断面上14日后的图。

图12为说明将不含有细胞的、I型胶原蛋白和III型胶原蛋白混合的混合胶原蛋白移植至狗日常牙髓断面上14日后的图。

图13为说明移植CD31^-CD146^-SP细胞14日后的放大图。

图14为说明移植CD31⁺CD146^-SP细胞14日后的放大图。

图15为说明在再生牙髓底部能看到CD31^-CD146^-SP细胞的部位的图。

图16为说明CD31⁺CD146^-SP细胞在整个窝洞分散存在部位的图。

图17为说明血管内皮细胞被CD146抗体染色，进行DiI标记的CD31^-CD146^-SP细胞与新生血管邻接存在的图。

图18为说明在与牙冠上部的磷酸牙骨质釉质链接的部分中可以看到象牙芽细胞的分化以及细管象牙质形成的部位的图。

图19为说明用神经丝(neurofilament)抗体染色、显示出在再生的牙髓中，神经轴突从被切断的牙根部牙髓神经延伸出去的图。

图20为说明在表示在残留的牙髓中，显示出被切断并修复的牙根部牙髓神经的图。

图21为说明利用I型以及III型胶原蛋白使SDF1以及自体CD31^-CD146^-SP细胞吸附，注入至拔髓后的根管内14日后的图，根管内几乎全部都是再生的牙髓组织。

图22为说明利用I型和III型胶原蛋白使SDF1吸附，注入至拔髓后的根管内14日后的图，根管内的根尖侧的仅仅一部分牙髓组织再生。

图23为利用I型以及III型胶原蛋白使CD31^-CD146^-SP细胞吸附，然后注入至拔髓后的根管内14日后的图，只有极少的牙髓组织再生。

图24为说明只将I型以及III型胶原蛋白注入14日后的图，牙髓组织几乎不再生。

图25为说明利用I型以及III型胶原蛋白将SDF1及CD31^-CD146^-SP细胞注入14日后根尖侧的毛细血管的高倍像的图。

图26为说明利用I型以及III型胶原蛋白将SDF1及CD31^-CD146^-SP细胞注入14日后牙冠侧的毛细血管的高倍像的图。

图27为说明使用BS-1血凝素(lectin)进行血管内皮细胞染色的图。

图28为说明神经丝免疫染色的神经轴突的图。

图29为说明利用I型以及III型胶原蛋白将SDF1及CD105⁺细胞注入14日后的图，根管内的几乎全部都是再生的牙髓组织。

图30为说明第三代人牙髓CD31^-CD146^-SP细胞的流式细胞仪分析图。

图31为说明第三代人牙髓CD31^-CD146^-SP细胞的血管诱导图。

图32为说明第三代人牙髓CD105⁺细胞的血管诱导图。

图33为说明第三代人牙髓CD150⁺细胞的血管诱导图。

图34为说明第三代人牙髓全牙髓细胞情况的图，血管几乎没有被诱导。

图35为说明人牙髓CD24⁺细胞的神经诱导图。

图36为说明第三代人牙髓CD31^-CD146^-SP细胞移植的激光多普勒分析的图，可以看到血流的恢复。

图37为说明第三代人牙髓CD105⁺细胞移植时的激光多普勒分析图，可以看到血流的恢复。

图38为说明PBS注入对照物时的激光多普勒分析图，看不到血流的恢复。

图39为说明人牙髓全牙髓细胞移植的激光多普勒分析图，几乎未看到血流恢复。

图40为说明人牙髓CD31^-CD146^-SP细胞、人牙髓CD105细胞、人牙髓全牙髓细胞移植的激光多普勒测定结果的统计学分析图。

图41为说明人牙髓CD31^-CD146^-SP细胞移植14日后使用BS-1血凝素染色血管内皮细胞的结果的图。

图42为说明PBS注入对照物14日后使用BS-1血凝素染色血管内皮细胞的结果的图。

附图标记说明

100：作为治疗对象的牙齿

110：根尖性牙周炎

200：根管填充材料

210：细胞外基质

220：含有牙髓干细胞的细胞

230；移动因子

300：拔牙洞

400：血管

500：象牙质

610：止血用明胶海绵(明胶)

620：合成树脂

630；形态形成因子

具体实施方式

以下，参照附图对本发明的实施方式进行具体说明。

(实施方式1)

本实施方式涉及的发明，是使根管内的牙组织再生的的牙组织再生方法，其特征在于，该方法包括：在拔髓后或感染根管的根管扩大清扫后，在根管的根尖侧注入具有含有牙髓干细胞的细胞和使含有牙髓干细胞的细胞附着的细胞外基质的根管填充材料。再生的牙组织为例如根管内的血管、神经、牙髓、象牙质等。本实施方式涉及的发明，是在拔牙后或感染根管的根管扩大清扫后，拔髓以及消毒，在根尖部切断并开口，从而移植根管填充材料。本实施方式涉及的发明，并不是向灭菌后具有空洞的牙根管内移植人工填充材料或血块，而是使含有牙髓干细胞的细胞附着到模仿牙髓组织制成的、生物体亲和性高、无害并且无免疫原性的支架(scaffold)上，从而充填到牙根管中。根管填充材料较佳地填充至根尖部的1/4～2/5，最佳地填充至根尖部的1/3。

以下，参照图1A～图1K说明实施方式1涉及的牙组织再生方法。如图1A所示，备好细胞外基质210。细胞外基质210是指所谓的支架(scaffold)，即固定细胞的支持物。为了便于填充至根管内，细胞外基质210的形状较佳地是圆柱形或大致为圆锥形。另外，细胞外基质210呈胶状时，其形状不是固定的。

细胞外基质210最好由含有胶原蛋白、人造蛋白聚糖、明胶、水凝胶、纤维素、磷酸胆碱(phosphocholine)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、几丁质、PLA(聚乳酸)、PLGA(端羧基聚乳酸)、PEG(聚乙二醇)、PGA(聚羟基乙酸)、PDLLA(聚L-乳酸)、PCL(聚己内酯)、羟磷灰石(hydroxyapatite)、β-TCP、碳酸钙、肌联蛋白(titin)以及金中的至少任一种的生物体亲和性材料构成。另外，蛋白聚糖是蛋白质与糖基(糖胺聚糖)共价结合的一种复合糖。另外，细胞外基质210也可以使用热可塑性高分子等高分子体制成的平均直径为1nm～1000nm的纳米纤维构成的海绵状的三维构造体。较佳地，这种三维构造体的空隙率为80％～99.99％。

细胞外基质210使用的胶原蛋白最好是I型胶原蛋白和III型胶原蛋白混合的混合胶原蛋白。所谓I型胶原蛋白是基本的胶原蛋白、纤维性胶原蛋白。III型胶原蛋白与胶原纤维不同，形成被称为细网纤维的细网格状的构造，成为细胞等的支持物。

所述混合胶原蛋白中，III型胶原蛋白的比例最好设为30％以上50％以下(重量比)。当III型胶原蛋白的比例大于50％(重量比)时，混合胶原蛋白可能无法凝固。另一方面，当III型胶原蛋白的比例低于30％(重量比)时，I型胶原蛋白的比例增多，则可能不发生后述的血管新生，而发生象牙质的再生。I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的混合比例为1∶1时为最佳。

如图1B所示，细胞基质210使含有牙髓干细胞的细胞220附着而形成根管填充材料200。含有牙髓干细胞的细胞220被附着在根管填充材料200的根管的根尖侧。作为根管填充材料200的制作方法的一个具体例子，首先，用微量移液器的吸头等吸入30μl～40μl的混合胶原蛋白(I型和III型胶原蛋白的混合比例为1∶1)，接着吸入混有含有牙髓干细胞的细胞的混合胶原蛋白20μl～30μl，总量为60μl。用微量移液器的吸头等吸取时，最好放慢吸取速度以避免产生气泡。因为当根管填充材料200内部产生气泡时，产生的气泡会妨碍细胞的移动，降低其对牙组织再生的促进作用。微量移液器的吸头的内径较细为好，例如可以使用下内径为0.5mm～0.7mm的吸头，例如QSP公司的H-010-96RS微型毛细管吸头。

在本实施方式涉及的牙组织再生方法中，如图1C所例示，对发生牙髓炎的作为对象的牙齿100，进行拔牙。接下来，如图1D所示，对作为对象的牙齿100进行拔髓。并且，所谓作为对象的牙齿100是指发生了龋食、牙髓炎等，细菌感染波及到冠部牙髓或根部牙髓的牙齿。所谓拔髓是取出存在于牙齿内部的牙髓的操作。

拔髓后，对对象牙齿100进行根管扩大时，最好将根尖部的根管的尺寸作为既定粗细。因为，如后面所述的，在向拔髓后的根管填充根管填充材料时，预先扩大根管使根管填充材料易于填充，而且血管以及神经易于从根尖牙周组织容易进入。

例如，如图1D所示，较佳地，在根管的直径范围内，根尖部的根管的尺寸d为0.7mm以上1.5mm以下。当根管尺寸d小于0.7mm时，血管以及神经难以从根尖牙周组织进入，而且根管填充材料恐怕难以填充，另一方面，当根管的尺寸d大于1.5mm时，对象牙齿100可能要承受不必要的负担而容易断裂。

对对象牙齿进行100拔髓后，如图1E所示，使用镊子等在根管的根尖侧注入填充材料200。由于根管填充材料200含有例如牙髓SP细胞等的生物学材质，所以属于生物学根管填充材料。另外，细胞外基质210为胶状时，由于使用镊子等无法夹住，因此可通过微量移液器、注射等方法注入。

含有牙髓干细胞的细胞，也可以是从接受牙组织再生处理的对象动物本身抽取的自体细胞，另外，也可以是从接受牙组织再生处理的对象动物以外的动物中抽取的同类细胞。

牙髓干细胞，是指来自恒牙或乳牙的牙髓干细胞。特别地，来自人乳牙的牙髓细胞中含有高达约50％的CD105⁺细胞(来自人恒牙的CD31^-SP细胞中，CD105⁺细胞约占20％)，来自乳牙的牙髓细胞显示出试管内血管诱导、下肢缺血部位的血流恢复和对血管新生的促进效果，与恒牙CD105⁺细胞或SP细胞几乎相同。另外，乳牙牙髓细胞中含有0.2％的CD105⁺，比恒牙CD31^-SP的含量0.1％多。而且，乳牙牙髓细胞无需分取，可在拔髓后直接用于促进新生血管新生以及牙髓再生。由此，在例如下肢缺血部位中的血管新生中，来自人乳牙的牙髓细胞与来自人恒牙的牙髓细胞相比，具有2.2倍的血管新生能力。

含有牙髓干细胞的细胞，较佳地含有牙髓SP细胞、CD31阴性且CD146阴性的细胞、CD24阳性细胞、CD105阳性细胞以及CD150阳性细胞中的至少任一种。例如，人牙髓SP细胞，具有较高的血管新生能力等组织再生能力。具体而言，在下肢缺血部位中的血管新生中，人牙髓SP细胞与人乳牙牙髓细胞相比，具有1.2倍的血管新生能力。另外，人牙髓SP细胞与人恒牙牙髓细胞相比具有2.6倍的血管新生能力。进而，与PBS对照物相比，具有5.7倍的血管新生能力。

在此，所谓牙尖是指与对象牙齿100的牙槽骨结合的端部(牙根的顶端部分)。

另外，所谓SP细胞是由Goodel(J.Exp.Med.vol.183，1996)等人发现的一种未分化细胞，在流式细胞仪中的分析中，向细胞中加入一种称为Hoechst33342的荧光色素，UV激发时，SP细胞在405nm以及600nm处产生荧光，在点阵图上出现的位置也与普通细胞(未分化细胞以外的细胞)不同(“Hoechst Blue弱阳性且Hoechst Red弱阳性”)，这种细胞集团即为SP细胞。

牙髓SP细胞，较佳地，为CD31阴性且CD146阴性、CD24阳性、CD105阳性、或CD150阳性的任一种。

根管填充材料中，较佳地，牙髓干细胞的含量为1×10³个/μl以上1×10⁶个/μl以下。因为当牙髓干细胞的含量低于1×10³个/μl时，根管内牙组织的再生可能不充分。另一方面，牙髓干细胞的含量高于1×10⁶个/μl时，可能对对象牙齿产生预想不到的副作用。

在根管的根尖侧注入根管填充材料后，如图1F所示，在根管填充材料200曲上部注入明胶610，并用合成树脂620将其盖住。然后，如图1G所示，将拔掉的牙齿再移植到拔牙洞300内。

由此，根管内的牙组织得以再生。再生的牙组织，如图1H所示，可以是例如根管内的血管400以及牙髓组织。然后，消除一次合成树脂620，并在牙冠部牙髓上涂敷BMPs等形态形成因子630或象牙质形成因子，如图1I所示，用合成树脂620将其盖住。通过在牙冠部牙髓上涂敷形态形成因子630或象牙质形成因子，如图1J所示，再生象牙质500也得以再生。但并不限定于此，还能促进神经再生。

另外，在上述实施方式1中，作为对象的牙齿100为发生了龋食、牙髓炎等，细菌感染波及到冠部牙髓或根部牙髓的牙齿，但并不限定于此，作为对象的牙齿100中也包含神经功能下降、咬合感觉变弱的牙齿。此时，在拔髓后，通过注入根管填充材料，使牙髓再生从而可以提高咬合感觉。另外，如图1K所示，在作为对象的牙齿100中，也包含细菌感染波及到根尖牙周组织的牙齿(细菌到达牙髓后，侵入到根管壁的象牙质以及根尖牙周围组织的牙齿)。这种牙齿大多数伴有根尖性牙周炎110。对感染根管进行根管扩大清扫后，注入根管填充材料200。在此所谓感染根管是指细菌到达牙髓后波及根管壁的象牙质时的根管，所谓根管扩大清扫后是指消除感染根管中的细菌后。

(实施方式2)

以下，参照图2A～图2C，说明实施方式2涉及的牙组织再生方法。作为实施方式2涉及的根管填充材料200的制造方法的一个具体例子是，首先，用微量移液器的吸头吸入混有移动因子的混合胶原蛋白(I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的混合比例为1∶1)30μl～40μl，接着吸入混有含有牙髓干细胞的细胞的混合胶原蛋白20μl～30μl，总量为60μl。在实施方式2中，用微量移液器的吸头吸取时，最好放慢吸取速度，以避免产生气泡。另外，微量移液器的吸头的内径较细为好。由此，可制成图2A所示的根管填充材料200。这样，根管填充材料200在使含有牙髓干细胞的细胞220附着在根管的根尖侧的同时，也使含有细胞移动因子、细胞增殖因子以及神经营养因子中的至少任一种的移动因子230附着在根管的牙冠侧(例如，根管的上部1/2～2/3处)。使含有牙髓干细胞的细胞220附着在根管的根尖侧，使移动因子230附着在根冠的牙冠侧的理由是，即使使含有牙髓干细胞的细胞220附着到根管的牙冠侧，也无法供给来自组织的营养而可能导致坏死，另外，附着在根管的根尖侧的含有牙髓干细胞的细胞，被附着在根管的牙冠侧的移动因子牵引，从而易于促进牙组织再生。另外，如图2A所示，也能在根管填充材料200的根管的牙管侧预先保存细胞外基质210。

并且，在实施方式1中如图1D所示，对作为对象的牙齿100进行拔髓以及拔髓后的根管扩大处理。然后，如图2B所示，向根管的根尖侧注入根管填充材料200。

所谓细胞移动因子，是指通过与其受体结合，从而激活与细胞迁移有关的信号传递系统的分子。另外，所谓细胞增殖因子，是指通过与其受体结合，从而激活与细胞增殖有关的信号传递系统的分子。并且，所谓神经营养因子，是指通过与其受体结合，从而激活与细胞生存有关的信号传递系统的分子。

较佳地，细胞移动因子使用SDF1、VEGF、GCSF、MMP3、Slit、GMCS中的至少任一种。特别地，MMP3的细胞移动能力较强，可以适当使用。

较佳地，细胞增殖因子使用bFGF以及PDGF中的至少任一种。

较佳地，神经营养因子使用GDNF、BDNF以及NGF中的至少任一种。

使移动因子附着的细胞外基质中，较佳地，移动因子的含量在0.1ng/μl以上500ng/μl以下。当移动因子的含量低于0.1ng/μl时，细胞移动程度可能降低。另一方面，当移动因子的含量高于500ng/μl时，对对象牙齿100可能产生预想不到的副作用。

与实施方式1一样，细胞外基质最好由含有胶原蛋白、人造蛋白聚糖、明胶、水凝胶、纤维素、磷酸胆碱(phosphocholine)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、几丁质、PLA(聚乳酸)、PLGA(端羧基聚乳酸)、PEG(聚乙二醇)、PGA(聚羟基乙酸)、PDLLA(聚L-乳酸)、PCL(聚己内酯)、羟磷灰石(hydroxyapatite)、β-TCP、碳酸钙、肌联蛋白(titin)以及金中的至少任一种的生物体亲和性材料构成。

胶原蛋白最好是I型胶原蛋白和III型胶原蛋白混合的混合胶原蛋白。进一步地，混合胶原蛋白中的III型胶原蛋白的比例最好在30％以上50％以下(重量比)。

然后，与实施方式1中的图1F一样，注入明胶610后使用合成树脂620盖住，如图2C所示，将拔掉的牙齿再移植到拔牙洞内。然后，如图1H所示，根管内的血管400以及牙组织得以再生，且比实施方式1的再生率更高。接着，如图1I所示将BMPs等形态形成因子630或象牙质形成因子涂敷于牙冠部牙髓处，如图1J所示进行象牙质再生，且比实施方式1再生率更高。

另外，在上述实施方式2中，也可以对作为对象的牙齿100在感染根管的根管扩大清扫后注入根管填充材料200。

实施例1

(细胞分取与表征)

在摘取出猪牙胚后，在37℃下使用胶原酶(collagenase)酶解1个半小时分离出牙髓细胞后，在含有2％血清的DMEM中将细胞稀释至1×10⁶个/ml，使用5μg/ml Hoechst33342进行标记。然后，使用CD31及CD146的抗体在4℃下标记30分钟后，进行流式细胞仪分析。图3示出了SP细胞的流式细胞仪的分析结果。来自猪牙髓的SP细胞占细胞总量的0.2％。

如图4所示，得到了来自牙髓的SP细胞的3个片段：CD31^-CD146^-SP细胞、CD31⁺CD146^-SP细胞、CD 31⁺CD146⁺SP细胞。若使用CD31以及CD146抗体进一步分选SP细胞，CD31^-CD146^-SP细胞、CD31⁺CD146^-SP细胞、CD31⁺CD146⁺SP细胞分别占50％、48％、2％。所得细胞在添加有EGF、IGF-I的含有10％牛胎血清的EBM2培养基中培养。

如表1所示，根据流式细胞仪分析，CD31^-CD146^-SP细胞中，CD34⁺、VEGFR2/FLK1⁺占70％～90％左右，CD11b、CD14为0％。在进行实时(Real-time)RT-PCR时，CD11b、CD14、CD45mRNA出现，明显与造血系统的干细胞不同。

[表1]

标记	CD31-CD146-SP	CD31+SP
			CD31	0.0％	100.0％
CD146	0.0％	7.0％
			CD11b	0.0％	0.0％
CD14	0.0％	0.0％
			CD34+	69.0％	93.0％
VEGFR2/FLK1+	87.0％	98.0％
			CD90	0.2％	0.2％
CD117/c-试剂盒	0.0％	0.0％
			CD150	0.0％	0.0％
CD271/LNGFR	94.0％	70.0％

另外，如表2所示，在来自骨髓的内皮干细胞(angioblast)中出现的CD133mRNA在来自牙髓的CD31^-CD146^-SP细胞中完全观察不到。

[表2]

	CD31-SP/牙髓组织	CD31+SP/牙髓组织
			CD11b	0.0	0.0
CD14	0.0	0.0

CD45	0.0	0.0
			CD133	0.0	0.0
sox2	12.0	5.0
			Bcrp1	34.0	8.0
CXCR4	12.0	1.5
			Stat3	730.0	560.0
Bmi1	450.0	300.0
			Tert	30.0	0.8

利用微阵列(Microarray)以及实时RTR-PCR对来自牙髓的CD31^-CD146^-SP细胞和来自牙髓的CD31⁺CD146^-SP细胞针对出现的RNA进行比较，如表3所示，前血管诱导因子(VEGF-A)、细胞因子(G-CSF、GM-CSF、MCP1/CCL2、MDCF I)、细胞外基质分解酶(MMP1、MMP3、I型精氨酸酶(Arginase I))、其他(GP38K、CRSP)等出现频率很高。

[表3]

(多分化能力)

当在基质胶(Matrigel)上进行血管诱导时，CD31^-CD146^-SP细胞在24小时后呈现出网格状的管腔构造。CD31⁺SP细胞未形成明显的管腔构造。进而10日后CD31^-CD146^-SP细胞在基质胶(Matrigel)内部形成血管状构造，血管状构造物周围的细胞出现了CEACAM1、CD146以及咬合蛋白(occludin)mRNA的内皮细胞的分化标记。另外，当在VEGF、bFGF存在下培养第10日时，出现CD31、vWF、血管内皮钙粘附蛋白(VE-cadherin)的内皮细胞的分化标记。进而，CD31^-CD146^-SP细胞显示出作为内皮细胞的功能性性质的，利用组胺(histamine)释放vWF和吸收ac-LDL的能力。另外，CD31^-CD146^-SP细胞具有多分化能力，在试管内可被诱导分化为软骨、脂肪、神经、象牙芽细胞。

(移动能力、增殖能力)

在试管内，CD31^-CD146^-SP细胞与另外2个片段相比显示出在bFGF以及EGF刺激下更高的增殖能力。另外，CD31^-CD146^-SP与另外2个片段相比显示出在VEGF以及SDF1诱导下的高达2倍的移动能力。

图5A是0.2％的BSA的对照物，图5B、图5C、图5D、图5E、图5F分别是50ng/ml的VEGF、bFGF、EGF、SDF1、IGF1。添加Tetra-color one(注册商标)，在0、12、24、36、48、72小时后，在450nm处测定细胞数。CD31^-CD146^-SP细胞与其他片段相比，在72小时内在bFGF或EGF作用下出现更高的增殖活性。数据采用4个样品的平均值加减SD来表示(*P＜0.01)。实验重复3次并示出了典型例子。

如图6所示，在24孔板(24well)培养基中添加0、5、10、100ng/ml的VEGF-A，并在PET膜(PET-membrane)插入物中接种5×10⁴个细胞，24小时后对通过膜的细胞进行计数。CD31^-CD146^-SP细胞，移动能力高，其浓度依赖性增加了其移动能力。采用4个样品的平均值加减SD来表示(*P＜0.01)。实验重复3次并示出了典型例子。

如图7所示，考察了添加VEGF-A、SDF-1以及GCSF引起的移动能力的变化。明确了SDF-1以及VEGF-A可促进CD31^-CD146^-SP细胞的移动。数据采用4个样品的平均值加减SD来表示(*P＜0.01、**P＜0.001)。实验重复3次并示出了典型例子。

这样，可以观察到，对于血管内皮细胞(HUVEC)，CD31^-CD146^-SP细胞的上清液在试管内作用48小时后，具有与以50ng/ml的MMP3或VEGF作用时大致一样的增殖活性。

另外，可以观察出对于血管内皮细胞，CD31^-CD146^-SP细胞的上清片段具有大致相当于MMP3或GM-CSF的凋亡抑制效果。

图8为表示HUVEC的牙髓CD31^-CD146^-SP细胞的培养上清液的增殖活性的图。示出了2、12、24、36、48小时后的MMP3、VEGF-A、G-CSF、GM-CSF以及CD31⁺CD146^-SP细胞上清液的比较结果。36以及48小时时，在CD31^-CD146^-SP细胞上清液中具有与其他细胞因子一样的增殖活性，与CD31⁺CD146^-SP细胞的上清液相比可以观察到明显更高的活性(#P＜0.01**P＜0.01、*P＜0.05vs control)。

图9中，使用以100nM星形孢菌素(staurosporine)诱导凋亡(apoptosis)的HUVEC(血管内皮细胞)，通过流式细胞仪测定坏死细胞以及凋亡细胞的比例。附图帮助理解牙髓CD31^-CD146^-SP细胞的培养上清与MMP3、VEGF-A、G-CSF、GM-CSF一样具有较高的抗凋亡效果，了解与CD31⁺CD146^-SP细胞上清液相比，其具有明显的抗凋亡效果(#P＜0.01)。根据这些结果明确了CD31^-CD146^-SP细胞是适于促进血管新生的细胞。

(鼠下肢缺血模型中的血管新生)

制作重症联合免疫缺陷(SCID，Severe Combined ImmunoDeficiency)鼠的下肢缺血模型，将CD31^-CD146^-SP细胞移植至下肢缺血部位，一周后，血流得以恢复，与CD31⁺CD146^-SP细胞移植群相比，新生血管形成被促进约13倍。

(狗日常牙髓切断模型中的血管新生、神经再生、牙髓再生)

从猪的一样，从狗牙髓组织中与分取CD31^-CD146^-SP细胞，SP细胞占约10％。向来自该牙髓的1×10⁶个CD31^-CD146^-SP细胞添加I型以及III型胶原蛋白，并进行三维培养。24小时后自体移植到狗的日常牙髓断面上，上部使用海绵以及磷酸牙骨质填充，进而用聚合树脂封闭。作为对照物只使用了CD31⁺SP细胞或I型以及III型胶原蛋白。14日后，在CD31^-CD146^-SP细胞群中在日常牙髓断面上牙髓得以再生，新生血管得以连接，如图10以及图13所示，在再生牙髓中可以看到。图10以及图13为在I型以及III型胶原蛋白中三维培养1日，自体移植后第14日，移植CD31^-CD146^-SP细胞后的图。染色使用了H-E染色(苏木素-伊红染色)。图中箭头指示牙髓断面。如图10以及图13所示，帮助理解牙髓断面上的窝洞内充满了再生的牙髓组织，毛细血管一直延伸至填充磷酸牙骨质的部位。

进而，如图15以及图17所示，移植细胞在新生血管周围移动并被固定。图15中，帮助理解在再生牙髓的底部可以看到CD31^-CD146^-SP细胞。图17帮助理解血管内皮细胞被CD146染色，被DiI标记的CD31^-CD146^-SP细胞存在于再生牙髓组织的新生血管的周围。另外，图17中箭头指示CD31^-CD146^-SP细胞的位置，符号v表示新生血管。图中虚线表示新生组织的边界部位。

另一方面，图11、图14、图16为移植了CD31⁺CD146^-SP细胞的图。如图11、图14以及图16所示，在CD31⁺CD146^-SP群中虽然可以看到移植细胞的固定，但是看不到新生血管的形成，也看不到细胞的移动。如图11以及图14中所示，可以看到移植组织固定在窝洞内，但几乎看不到毛细血管。图16中，示出了CD31⁺CD146^-SP细胞分散并存在于整个窝洞内。箭头为牙髓断面。白线表示象牙质壁。虚线表示新生组织的边界部位。

其次，图12为只移植了I型胶原蛋白以及III型胶原蛋白的标本。如图12所示，在日常牙髓断面上完全看不到组织。

如图18所示，28日后，在与牙冠部上部的磷酸牙骨质连接的部位可看到象牙芽细胞的分化以及细管象牙质的形成。在图18中，箭头指示分化了的象牙芽细胞的突起。

如图19所示，可以看到从被切断的牙根部牙髓的神经处延伸出的神经轴突。如图20所示，示出了在残存的牙根部牙髓中的存在，被切断又被修复的神经。另外，图19以及图20为神经丝(neurofilament)免疫染色后的图。

实施例2

在实施例2中，示出了使用CD31^-CD146^-SP细胞以及细胞移动因子SDF1的狗拔髓后的牙髓再生。

从猪的一样，从狗牙髓组织中分取CD31^-CD146^-SP细胞。另外，分取CD105⁺细胞。在拔去狗的上颚前齿后，去除骨髓，在培养基中扩大至#80，并将根尖部的根管的粗细扩至0.8mm以上。拔掉牙齿后30分钟内将1×10⁶个CD31^-CD146^-SP细胞混合于10μl的I型胶原蛋白以及III型胶原蛋白中，并注入根管的根尖1/3处。进而，在根管牙冠的2/3处填充添加了SDF1(200ng)的I型胶原蛋以及III型胶原蛋白20μl。30分钟内再移植到狗的拔牙洞300内，上部使用磷酸牙骨质以及聚合树脂封闭。14日后，拔牙、制作石蜡标本。

图21、图25、图26、图27、图28为注入了I型以及III型胶原蛋白的图。在将CD31^-CD146^-SP细胞以及SDF1(200ng)两者作为根管填充材料来使用时，如图21所示，14日后根管内全部是新生牙髓组织。图21为H-E染色后的图。在其新生牙髓组织中，在如图25所示的根尖侧以及如图26所示的牙冠侧可以看到新生毛细血管，如图28所示可以看到再生的神经。在图25以及图26中，符号v表示毛细血管。图27为BS-1血凝素(lectin)将血管内皮细胞染色的图。图28为神经丝(neurofilament)免疫染色后的图。

另一方面，在SFD1或CD31^-CD146^-SP细胞二者中的任一种细胞中，只能在根管内的根尖部1/5～1/4处看到新生牙髓组织。图22为借助I型以及III型胶原蛋白注入SDF 1(200ng)的图。图23为借助I型以及III型胶原蛋白注入CD31^-CD146^-SP细胞的图。进而，如图24所示的情况那样，在只有I型以及III型胶原蛋白时，几乎无法看到新生牙髓组织。

将CD105⁺细胞以及SDF 1两者作为根管填充材料来使用时，如图29所示，14日后根管内全部是新生牙髓组织。

实施例3

在实施例3中，主要示出了使用了人恒牙牙髓CD31^-CD146^-SP细胞以及人恒牙牙髓CD105⁺细胞进行的血管新生。

在拔除人牙牙髓后，在37℃下使用胶原酶(collagenase)酶解1小时分离出牙髓细胞后，在含有2％血清的DMEM中将细胞稀释至1×10⁶个/ml，使用5μg/ml的Hoechst33342进行标记，进而使用CD31抗体进行流式细胞仪分析，分取出CD31^-CD146^-SP细胞。另一方面，在分离出牙髓细胞后，使用CD105抗体进行标记并进行流式细胞仪分析，分取出CD105⁺细胞。将这些细胞在添加了EGF以及IGF-I的含有10％牛胎血清的EBM2培养基中培养，则细胞以与来自猪牙髓的细胞同等(约10％)的频率在培养皿(dish)中附着并增殖。将该第三代CD31^-CD146^-SP细胞以及牙髓CD105⁺细胞用于细胞表面标记，进行流式细胞仪分析探究细胞的特征，其结果，干细胞的标记CD44都为大致阳性，CD90标志分别为大致阳性以及30％阳性。图30示出了人CD31^-CD146^-SP细胞的流式细胞仪分析结果。表4为示出了人牙髓CD31^-CD146^-SP细胞与人牙髓CD105⁺细胞、人全牙髓细胞、人全乳牙细胞以及猪牙髓CD31^-CD146^-SP细胞的比较结果。血管内皮细胞或血管平滑肌细胞的标记CD146中，人CD31^-SP细胞为阴性，人CD105⁺细胞为大致阴性。在来自骨髓的内皮干细胞(angioblast)及末梢血中的血管内皮前体细胞中，被认为是阳性的CD133为阴性，虽然这与在来自猪牙髓的CD31^-CD146^-SP细胞一样，但CD134却与猪不同，为阴性。

[表4]

然后，当在基质胶(Matrigel)上以1×10⁴个/96孔板(well)接种，并进行血管诱导时，如图31所示，人牙髓CD31^-CD146^-SP细胞在接种20小时后形成网格状的管腔构造。

另外，同样在人牙髓CD105⁺细胞中也进行实验的结果，如图32所示在人牙髓CD105⁺细胞中也形成了管腔构造。

另外，同样在人牙髓CD105⁺细胞中也进行实验的结果，如图33所示在人牙髓CD105⁺细胞中也形成了管腔构造。

同样在没有分取的第三代人全牙髓细胞中也进行实验的结果，如图34所示，在没有分取的第三代人全牙髓细胞中没有形成明显的管腔构造。

另一方面，在人牙髓CD24⁺细胞中进行实验的结果，如图35所示，人牙髓CD24⁺细胞在试管内容易分化为神经。

图36为在下肢缺血部位移植第三代人牙髓的CD31^-CD146^-SP细胞后的图。图37为在下肢缺血部位移植第三代人牙髓CD105⁺细胞后的图。图38为在下肢缺血部位注入PBS对照物后的结果。图39为在下肢缺血部位移植第三代人牙髓全牙髓细胞后的的结果。图36、图37、图38、图39为激光多普勒的分析的结果，图40为表示激光多普勒分析的统计学显著性差异的图。如图36、图37、图38所示，当在下肢缺血部位移植人牙髓CD31^-CD146^-SP细胞或人牙髓CD105⁺细胞时，与注入了PBS的对照物相比，可以看到剧烈的血流恢复。如图39所示，移植第三代人全牙髓细胞，可以看到血流稍有恢复。

制作下肢缺血部位的连续冷冻切片，使用BS-1血凝素(lectin)对血管内皮细胞进行染色，测定新生血管的密度。图41为人牙髓CD31^-CD146^-SP移植中的使用BS-1血凝素对血管内皮细胞进行染色的结果。图42为PBS注入对照物时的使用BS-1血凝素对血管内皮细胞进行染色的结果。如图41、图42所示，人牙髓CD31^-CD146^-SP细胞，与注入了PBS的对照物相比，明显大幅促进血管新生。

根据以上结果，来自人牙髓的CD31^-CD146^-SP细胞以及CD105⁺细胞，与狗和猪的一样，在血管再生以及牙髓再生中是有效的。

产业上的利用可能性

由于可以在拔髓后的根管内填充根管填充材料从而实现牙组织再生，因此即使深度龋食发生牙髓炎时，也可以适当地应用于牙髓再生以及牙髓功能的恢复的用途。

Claims (15)

1.一种牙组织再生方法，其特征在于：

在拔髓或感染根管的根管扩大清扫后，通过在根管的根尖侧，注入具有含有牙髓干细胞的细胞和使所述含有牙髓干细胞的细胞附着的细胞外基质的根管填充材料，从而使根管内的牙组织再生。

2.根据权利要求1所述的牙组织再生方法，其特征在于：

所述含有牙髓干细胞的细胞含有牙髓SP细胞、CD31阴性且CD146阴性的细胞、CD24阳性细胞、CD105阳性细胞以及CD150阳性细胞中的至少任一种。

3.根据权利要求2所述的牙组织再生方法，其特征在于：

所述牙髓SP细胞为CD31阴性且CD146阴性、CD24阳性、CD105阳性、或CD150阳性中的任一种。

4.根据权利要求1所述的牙组织再生方法，其特征在于：

所述根管填充材料使含有牙髓干细胞的细胞附着在根管的根尖侧的同时，使含有细胞移动因子、细胞增殖因子以及神经营养因子中的至少任一种的移动因子附着在根管的牙冠侧。

5.根据权利要求4所述的牙组织再生方法，其特征在于：

所述细胞移动因子为SDF1、VEGF、GCSF、MMP3、Slit以及GMCSF中的至少任一种。

6.根据权利要求4所述的牙组织再生方法，其特征在于：

所述细胞增殖因子为bFGF以及PDGF中的至少任一种。

7.根据权利要求4所述的牙组织再生方法，其特征在于：

所述神经营养因子为GDNF、BDNF以及NGF中的至少任一种。

8.根据权利要求1所述的牙组织再生方法，其特征在于：

所述细胞外基质由含有在胶原蛋白、人造蛋白聚糖、明胶、水凝胶、纤维素、磷酸胆碱、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、几丁质、PLA、PLGA、PEG、PGA、PDLLA、PCL、羟磷灰石、β-TCP、碳酸钙、肌联蛋白以及金中的至少任一种的生物体亲和性材料构成。

9.根据权利要求1所述的牙组织再生方法，其特征在于：

在将所述根管填充材料注入所述根管的根尖侧之前，通过所述扩大根管，将根尖部的根管的粗细作为既定尺寸。

10.根据权利要求1所述的牙组织再生方法，其特征在于：

使所述含有牙髓干细胞的细胞附着的细胞外基质中，所述牙髓干细胞的含量在1×10³个/μl以上1×10⁶个/μl以下。

11.一种根管填充材料，其特征在于，包括：

含有牙髓干细胞的细胞和使所述含有牙髓干细胞的细胞附着的细胞外基质。

12.根据权利要求11所述的根管填充材料，其特征在于：

所述含有牙髓干细胞的细胞含有牙髓SP细胞、CD31阴性且CD146阴性的细胞、CD24阳性细胞、CD105阳性细胞以及CD150阳性细胞中的至少任一种。

13.根据权利要求12所述的根管填充材料，其特征在于：

所述牙髓SP细胞为CD31阴性且CD146阴性、CD24阳性、CD105阳性、或CD150阳性的任一种。

14.根据权利要求11所述的根管填充材料，其特征在于：

所述细胞外基质由含有胶原蛋白、人造蛋白聚糖、明胶、水凝胶、纤维素、磷酸胆碱、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、几丁质、PLA、PLGA、PEG、PGA、PDLLA、PCL、羟磷灰石、β-TCP、碳酸钙、肌联蛋白以及金中的至少任一种的生物体亲和性材料构成。

15.根据权利要求11所述的根管填充材料，其特征在于：

使所述含有牙髓干细胞的细胞附着的细胞外基质中，所述牙髓干细胞的含量在1×10³个/μl以上1×10⁶个/μl以下。

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