CN103402558A - 含有间充质干细胞的根管充填材料及使用该材料的牙组织再生方法 - Google Patents

含有间充质干细胞的根管充填材料及使用该材料的牙组织再生方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103402558A
CN103402558A CN2012800108068A CN201280010806A CN103402558A CN 103402558 A CN103402558 A CN 103402558A CN 2012800108068 A CN2012800108068 A CN 2012800108068A CN 201280010806 A CN201280010806 A CN 201280010806A CN 103402558 A CN103402558 A CN 103402558A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
root
root canal
filling material
canal filling
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2012800108068A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103402558B (zh
Inventor
中岛美砂子
庵原耕一郎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Air Water Inc
Original Assignee
National Center for Geriatrics and Gerontology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Center for Geriatrics and Gerontology filed Critical National Center for Geriatrics and Gerontology
Publication of CN103402558A publication Critical patent/CN103402558A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103402558B publication Critical patent/CN103402558B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61C—DENTISTRY; APPARATUS OR METHODS FOR ORAL OR DENTAL HYGIENE
    • A61C5/00—Filling or capping teeth
    • A61C5/40—Implements for surgical treatment of the roots or nerves of the teeth; Nerve needles; Methods or instruments for medication of the roots
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61C—DENTISTRY; APPARATUS OR METHODS FOR ORAL OR DENTAL HYGIENE
    • A61C5/00—Filling or capping teeth
    • A61C5/50—Implements for filling root canals; Methods or instruments for medication of tooth nerve channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K6/00—Preparations for dentistry
    • A61K6/50—Preparations specially adapted for dental root treatment
    • A61K6/52—Cleaning; Disinfecting
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K6/00—Preparations for dentistry
    • A61K6/50—Preparations specially adapted for dental root treatment
    • A61K6/56—Apical treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3633—Extracellular matrix [ECM]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/12—Materials or treatment for tissue regeneration for dental implants or prostheses

Abstract

本发明的目的为提供一种在拔牙法或非拔牙法中使用的根管充填材料、以及使用该根管充填材料的牙组织再生方法，所述根管充填材料易于获得，可进行临床应用，并能有效地促进牙组织再生。本发明提供了根管充填材料（200），该根管充填材料（200）包含牙髓干细胞以外的间充质干细胞（220）和细胞外基质（210），所述根管充填材料被插入摘除牙髓后或对感染根管进行根管扩大和清洁后的根管的根尖侧。本发明还提供了通过拔牙法或非拔牙法进行的牙组织再生方法，所述方法包括如下步骤：在摘除牙髓后或对感染根管进行根管扩大和清洁后，将根管充填材料注入未拔出的牙齿的根管的根尖侧。

Description

含有间充质干细胞的根管充填材料及使用该材料的牙组织再生方法
技术领域
本发明涉及含有间充质干细胞（mesenchymal stem cells）的根管充填材料及使用该材料的牙组织再生方法。
背景技术
目前，龋齿（caries）（包括牙破折（tooth fractures））构成了牙齿缺失（tooth loss）的约半数原因，并且已知牙髓去除显著增加了牙齿缺失的风险。据称，目前牙齿的平均寿命为57年。为了使人在一生中都使用自身的牙齿咀嚼，牙齿的寿命需延长20年以上。尽管存在“8020”运动（促进在80岁时仍保有至少20颗其自身的牙齿的运动），然而目前80岁的人仅有21%达到了这一目标。为了达到由日本牙科协会设定的目标50%，需要对龋齿治疗进行重大改进。
牙髓去除，即牙髓摘除，引起修复性牙本质（reparative dentin）形成能力和感染防御机制缺失以及疼痛报警信号缺失，导致龋齿扩大的风险增加。此外，并无完美的牙髓摘除治疗方法，在牙髓摘除和根管填充后，充填剂从牙冠侧渗出可导致根尖周病变（periapical lesion）；或可能出现垂直性破折（vertical fracture）、美观性丧失、或术后疼痛。
因此，在超老龄社会中，引入牙再生医疗技术，通过牙本质和牙髓的再生开发龋齿和牙髓炎（pulpitis）的新型治疗方法，来避免不必要的牙髓摘除，并延长牙齿的寿命，是非常重要的。
同时，关于牙髓再生，迄今已知的是牙根发育不完全牙的牙髓可通过拔出牙齿、摘除牙髓、进行根管治疗、然后将所述牙齿再植入而再生。此外，据报道，即使是在根尖部（apex portion）具有病变的牙根发育不完全牙中，牙髓样组织（dental pulp-like tissue）通过如下步骤再生：拔出牙齿、充分扩大并清洁根管、以血凝块填充牙骨质-牙本质界（cementum-dentin junction）、然后以矿物三氧化物聚集体（MTA：mineraltrioxide aggregate）完全封闭窝洞（cavity）。
已知通过如下步骤来使牙根发育完全的犬健康牙齿的牙髓样组织再生：拔出牙齿、摘除牙髓、切除根尖部或将根尖部扩大至少1.1mm、将牙齿再植入并以血凝块填充根尖部（非专利文献1）。
上述描述的关于根管牙髓再生的报道多数集中于牙根发育不完全牙，并且未曾证明根管中再生的组织为具有血管和神经的牙髓固有组织（dental pulp intrinsic tissue）。另外，在所有情况中，一旦将牙齿拔出，在体外进行根管扩大并清洁、然后在再植入后以血凝块填充根管。
通过如下步骤进行的牙组织再生方法也是已知的：将待治疗的牙齿拔出、摘除牙髓、并将根管充填材料注入根管的根尖侧，其中，所述根管充填材料包含细胞和细胞外基质，所述细胞包括牙髓干细胞，所述包括牙髓干细胞的细胞附着至所述细胞外基质（专利文献1）。
牙髓干细胞可由乳牙或智齿中提取，不对患者造成过多负担，因此是有利的。然而，从老年患者中分离出足够量的牙髓干细胞很困难，认为实际临床应用是困难的。因此，在超老龄社会中，优选使用更易利用的细胞来源来实现牙组织再生。
现有技术文献
专利文献1
国际公开号WO2009/113733
非专利文献1
Laureys等，Am J Orthod Dentofacial Orthop.2001年4月；119（4）：335
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种用于拔出的牙齿或非拔出的牙齿的根管充填材料，所述材料克服了上述传统方法的不利之处，由于其易得性而可用于临床治疗，并可有效促进牙组织再生；本发明的目的还在于提供使用该充填材料使牙组织再生的方法。
解决技术问题的技术方案
本发明人为了实现上述目的，进行了深入研究，结果发现也可通过向拔出的牙齿或非拔出的牙齿的根管中移植牙髓干细胞以外的任何间充质干细胞（例如，骨髓干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞或脐带血细胞）而使牙髓再生，由此完成了本发明。
本发明的一个实施方式涉及在摘除牙髓后或对感染根管进行根管扩大和清洁后，在拔出的牙齿或未拔出的牙齿的根管的根尖侧插入的根管充填材料，所述根管充填材料包含牙髓干细胞以外的间充质干细胞以及细胞外基质。所述牙髓干细胞以外的间充质干细胞优选为骨髓干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞或脐带血细胞中的一种。
所述牙髓干细胞以外的间充质干细胞可优选包括下列细胞中的至少一种：SP细胞、CD31阴性SP细胞、CD24阳性细胞、CD29阳性细胞、CD44阳性细胞、CD73阳性细胞、CD90阳性细胞、CD105阳性细胞、CD31阴性细胞、CD45阴性细胞、MHC II类阴性细胞、CD150阳性细胞、CXCR4阳性细胞、CD271阳性细胞、CD133阳性细胞、FLK-1阳性细胞、CD166阳性细胞以及VEGFR2阳性细胞。
所述根管充填材料优选进一步包含趋化因子（chemotactic factor），所述趋化因子包括细胞迁移因子（cell migration factors）、细胞生长因子以及神经营养因子中的至少一种。特别是，在所述根管充填材料中，优选将所述牙髓干细胞以外的间充质干细胞移植入或注入根管的根尖侧，并将趋化因子附着至根管的牙冠侧，所述趋化因子包括细胞迁移因子、细胞生长因子以及神经营养因子中的至少一种。
所述细胞迁移因子可优选为下列物质中的至少一种：SDF1、VEGF、GCSF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF以及血清。
所述细胞生长因子可优选为下列物质中的至少一种：IGF、bFGF、PDGF以及血清。
所述神经营养因子可优选为下列物质中的至少一种：GDNF、BDNF、NGF、神经肽Y（neuropeptide Y）、神经营养蛋白3（neurotrophin3）以及血清。
所述细胞外基质可优选由生物相容性材料构成，所述生物相容性材料包括下列物质中的至少一种：胶原、人造蛋白多糖、明胶、水凝胶、纤维蛋白（fibrin）、磷蛋白（phosphophoryn）、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白（laminin）、纤连蛋白（fibronectin）、海藻酸（alginic acid）、透明质酸、壳多糖（chitin）、PLA、PLGA、PEG、PGA、PDLLA、PCL、羟磷灰石（hydroxyapatite）、β-TCP、碳酸钙、钛以及金。
在所述细胞外基质中，所述牙髓干细胞以外的间充质干细胞的含量优选等于或高于1×103细胞/μl、并等于或低于1×106细胞/μl。
本发明的另一方面涉及通过拔牙法或非拔牙法使牙组织再生的方法。所述方法可包括如下步骤：在摘除牙髓后或对感染根管进行根管扩大和清洁后，将上述任一种根管充填材料注入根管的根尖侧。
在将所述根管充填材料注入所述根管的根尖侧的步骤前，所述方法可优选进一步包括如下步骤：扩大所述根管，以将根尖部的根管直径增大至预定大小。
本发明的另一方面涉及牙组织异位（ectopically）再生的方法。所述方法可包括如下步骤：摘除第一个体的牙齿的牙髓、将所述牙齿的牙根部切出预定长度、将牙髓摘除后的根管的一端封闭、将含有间充质干细胞和细胞外基质的根管充填材料注入所述根管、并将注入有充填材料的牙根移植入第二个体；并优选包括将其中的牙髓已再生的牙根再植入牙槽骨（alveolar bone）内的步骤。
技术效果
本发明的根管充填材料和使用所述充填材料使牙组织再生的方法可通过拔牙法或非拔牙法促进牙组织再生。在通过根管充填材料和使用所述充填材料使牙组织再生的方法进行的牙组织再生中，在再生的组织中未观测到内部吸收（internal resorption）和外部吸收（external resorption），并且也未观测到破牙质细胞（odontoclasts），且可提供其中的成牙本质细胞（odontoblasts）在牙本质壁（dentin wall）上平整排列的再生组织。另外，本发明的牙组织异位再生方法例如在如下方面有用：牙组织可在异种个体，如携带有人类基因的猪（人源化的猪（humanized pig））（考虑到免疫排斥）中再生。它们在超老龄化社会的牙科治疗中极具前景。
附图说明
图1为第1实施方式的根管充填材料的说明图。
图2包括对第1实施方式的根管充填材料的制造工序进行说明的说明图。
图3A为患有牙髓炎的牙齿的说明图。
图3B为对摘除牙髓后的根管的扩大处理进行说明的示意图。
图3C为对以根管充填材料填充进行说明的示意图。
图3D为对注入Spongel（明胶）和树脂进行说明的示意图。
图3E为对牙髓再生和血管生成（vasculogenesis/angiogenesis）进行说明的示意图。
图3F为对注入形态发生因子（morphogenetic factor）和树脂进行说明的示意图。
图3G为对牙本质再生进行说明的示意图。
图3H为显示根尖牙周炎的示意图，其中，细菌到达根管壁的牙本质并更进一步到达根尖周组织。
图3I为对以根管充填材料填充根管进行说明的示意图，其中，对拔出的牙齿进行牙髓摘除和消毒，并切断根尖部以形成开口。
图4包括对第2实施方式的根管充填材料进行说明的说明图，其中，图（a）显示用于使趋化因子附着至根管的牙冠侧的构造；以及图（b）显示用于在牙冠部侧留下细胞外基质的构造。
图5为对第2实施方式的根管充填材料的制造工序进行说明的说明图。
图6包括对牙组织异位再生法进行说明的示意图，所述牙组织异位再生法通过将注入充填材料的牙根移植至免疫缺陷小鼠中而进行。
图7A显示犬牙髓组织来源的CD31-SP细胞的分离，其中，图7A（a）显示流式细胞仪分析的结果；图7A（b）显示使用抗CD31抗体从牙髓组织中进一步分离不同部分（fraction）；图7A（c）显示犬牙髓组织来源的原代（primary）CD31-SP细胞在第3天时的相差显微图像；以及图7A（d）显示上述细胞在第10天时的相差显微图像。将实验分别重复12次，并显示典型的实验结果。
图7B显示犬骨髓组织来源的CD31-SP细胞的分离，其中，图7B（e）显示流式细胞仪分析的结果；图7B（f）显示使用抗CD31抗体从骨髓组织中进一步分离不同部分；图7B（g）显示犬骨髓组织来源的原代CD31-SP细胞在第3天时的相差显微图像；以及图7B（h）显示上述细胞在第10天时的相差显微图像。
图7C显示犬脂肪组织来源的CD31-SP细胞的分离，其中，图7C（i）显示流式细胞仪分析的结果；图7C（j）显示使用抗CD31抗体从脂肪组织中进一步分离不同部分；图7C（k）显示犬脂肪组织来源的原代CD31-SP细胞在第3天时的相差显微图像；以及图7C（l）显示上述细胞在第10天时的相差显微图像。
图8包括示出了犬牙髓组织来源的CD31-SP细胞的多谱系分化潜能的相差显微图像（a）、（d）和（g）；犬骨髓组织来源的CD31-SP细胞的多谱系分化潜能的相差显微图像（b）、（e）和（h）；以及犬脂肪组织来源的CD31-SP细胞的多谱系分化潜能的相差显微图像（c）、（f）和（i），其中，（a）、（b）和（c）显示在基质胶（matrigel）分析中，接种（seeding）后12小时时的内皮分化潜能；（d）、（e）和（f）显示在对第4代细胞群进行诱导后第14天时的神经球形成；（g）、（h）和（i）显示在通过解离神经球进行神经诱导后第14天时的结果；以及（j）显示神经丝和神经调制蛋白的mRNA表达。实验重复三次，并显示一个代表性实验。
图9显示了基质细胞衍生因子1对犬牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP的迁移和生长作用。数据以4次测量的平均值±标准差表示。实验重复3次，并显示一个代表性实验。图（a）显示在使用SDF-1（10ng/ml）培养后0、3、6、9、12、15、18、21和24小时的迁移活性。*：P<0.001，牙髓vs.骨髓；#：P<0.05，牙髓vs.脂肪；**：P<0.001，骨髓vs.脂肪。图（b）显示使用SDF-1（10ng/ml）培养后2、18、26和44小时的生长活性。
图10A显示在向牙髓摘除后的犬根管中自体移植本发明的充填材料中，牙髓组织完全再生，其中，（a）、（d）和（g）为移植犬牙髓CD31-SP时的显微图像；（b）、（e）和（h）为移植犬骨髓CD31-SP时的显微图像；（c）、（f）和（i）为移植犬脂肪CD31-SP时的显微图像，其中，（a）-（f）为在移植后第14天时拍摄的图像；以及（g）-（i）为在移植后第28天时拍摄的图像。图中，基质形成由箭头指出，钙化组织由m标出。图（j）显示在第14天时，新再生组织的面积占根管面积的比例。数据以平均值±标准差表示。
图10B显示在向牙髓摘除后的犬根管中自体移植本发明的充填材料中，牙髓组织完全再生，其中，（k）、（n）和（q）为移植犬牙髓CD31-SP时的显微图像；（l）、（o）和（r）为移植犬骨髓CD31-SP时的显微图像；（m）、（p）和（s）为移植犬脂肪CD31-SP时的显微图像，其中，（k）、（l）和（m）为示出BS-1凝集素免疫染色（显示新形成的毛细血管）结果的共聚焦显微图像；（n）、（o）和（p）示出了PGP9.5免疫染色的结果；以及（q）、（r）和（s）示出了Masson三色染色（Masson’s trichromestaining）（显示基质形成）的结果。
图11A显示猪牙髓组织来源的CD31-SP细胞的分离，其中，（a）显示流式细胞仪分析的结果；（b）显示使用抗CD31抗体从牙髓组织中进一步分离不同部分；（c）显示猪牙髓组织来源的原代CD31-SP细胞在第3天时的相差显微图像；以及（d）显示上述细胞在第7天时的相差显微图像。实验分别重复了12次，并示出了一个代表性实验。
图11B显示猪骨髓组织来源的CD31-SP细胞的分离，其中，（e）显示流式细胞仪分析的结果；（f）显示使用抗CD31抗体从骨髓组织中进一步分离不同部分；（g）显示猪骨髓组织来源的原代CD31-SP细胞在第3天时的相差显微图像；以及（h）显示上述细胞在第7天时的相差显微图像。
图11C显示猪脂肪组织来源的CD31-SP细胞的分离，其中，（i）显示流式细胞仪分析的结果；（j）显示使用抗CD31抗体从脂肪组织中进一步分离不同部分；（k）显示猪脂肪组织来源的原代CD31-SP细胞在第3天时的相差显微图像；以及（l）显示上述细胞在第7天时的相差显微图像。
图12包括示出了猪牙髓组织来源的CD31-SP细胞的多谱系分化潜能的相差显微图像（a）和（d）；猪骨髓组织来源的CD31-SP细胞的多谱系分化潜能的相差显微图像（b）和（e）；以及猪脂肪组织来源的CD31-SP细胞的多谱系分化潜能的相差显微图像（c）和（f），其中，（a）、（b）和（c）显示在基质胶分析中，接种后12小时时的内皮分化潜能；（d）、（e）和（f）显示在对第4代细胞群进行诱导后第14天时的神经球。实验重复三次，显示一个代表性实验。
图13显示对于基质细胞衍生因子1（SDF-1），牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞的效果。数据各自以4组样品的平均值±标准差表示。实验重复三次，显示典型实验结果。通过非配对学生t检验（non-pairedStudent's t test）进行统计分析。（a）：在补充有SDF-1（10ng/ml）的情况下，0、3、6、9、12、15、18、21和24小时时的迁移活性。*：P<0.001，牙髓vs.骨髓；#：P<0.05，牙髓vs.脂肪；**：P<0.001，骨髓vs.脂肪。（b）：显示在补充有SDF-1（10ng/ml）的情况下，2、18、26和44小时时的生长活性。
图14显示体内皮下移植入免疫缺陷小鼠（SCID小鼠）后的牙髓再生，并包括移植猪牙髓CD31-SP细胞后第14天时的光学显微图像（a）、（b）和（c）；移植猪骨髓CD31-SP细胞后第14天时的光学显微图像（d）、（e）和（f）；以及移植猪脂肪CD31-SP细胞后第14天时的光学显微图像（g）、（h）和（i）。
图15显示使用犬自体或异体PBMC（外周血单核细胞）的犬牙髓、骨髓和脂肪的培养上清液（条件培养基）的免疫抑制活性的研究，*：P<0.001，牙髓vs.骨髓；#：P<0.001，牙髓vs.脂肪；
Figure BDA0000373418930000081
：P<0.001，骨髓vs.脂肪。
具体实施方式
以下将参照附图对本发明进行详细说明。本发明并不受以下说明的限制。
第1实施方式
根据第1实施方式，本发明涉及根管充填材料，所述根管充填材料含有细胞外基质和牙髓干细胞以外的间充质干细胞。图1为第1实施方式的根管充填材料200的说明图。根管充填材料200通过牙髓干细胞以外的间充质干细胞220附着至细胞外基质210而形成。本文中，术语“通过附着而形成”是指，当细胞外基质为例如液体或流体时，牙髓干细胞以外的间充质干细胞（优选均匀地）与细胞外基质混合；而当细胞外基质处于具有特定形状（如下述的海绵状三维结构）的形式时，牙髓干细胞以外的间充质干细胞被引入并（优选均匀地）保持在由细胞外基质构成的结构表面及内部。牙髓干细胞以外的间充质干细胞220附着至根管充填材料200的根管的根尖侧。本文中，短语“附着至根管充填材料200的根管的根尖侧”是指根管充填材料以如下方式形成：牙髓干细胞以外的间充质干细胞被注入根管的根尖侧并移植至此。
牙髓干细胞以外的间充质干细胞可以来源于牙髓以外的任何组织。例如，可以使用骨髓干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、或脐带血干细胞。另外，这些间充质干细胞可以是由待进行牙组织再生治疗的受试者个体自身的组织中提取的自体细胞，也可以是由待进行牙组织再生治疗的受试者个体以外的个体的组织中提取的同种（homogeneous）细胞。待进行牙组织再生治疗的受试者可以是哺乳动物、特别是人类。
骨髓干细胞（牙髓干细胞以外的间充质干细胞的实例）为来源于骨髓的干细胞，并可通过已知方法由骨髓组织中提取和分离。类似地，脂肪干细胞、羊膜干细胞和脐带血干细胞也分别为来自于脂肪组织、羊膜组织和脐带血组织的干细胞，并且可通过已知方法由各组织中提取和分离。
作为牙髓干细胞以外的间充质干细胞，可使用SP细胞和/或分离的表达特异性细胞标记物的细胞部分。具体而言，所述牙髓干细胞以外的间充质干细胞可包括下列细胞中的至少一种：CD29阳性细胞、CD44阳性细胞、CD73阳性细胞、CD90阳性细胞、CD105阳性细胞、CXCR4阳性细胞、CD31阴性细胞、CD45阴性细胞、MHC II类阴性细胞、CD150阳性细胞、CXCR4阳性细胞、CD271阳性细胞、CD133阳性细胞、FLK-1阳性细胞、CD166阳性细胞以及VEGFR2阳性细胞。在本申请文件中，阳性可称为“+”、阴性可称为“-”。
特别而言，间充质干细胞优选包括CD31阴性侧群（side population，SP）细胞。在本申请文件中，CD31阴性侧群细胞也称为CD31-SP细胞。移植入小鼠下肢缺血病变处的CD31-SP细胞促进血流恢复和血管生成；移植入大鼠脑梗塞缺血病变处的CD31-SP细胞促进向神经细胞分化并使得从运动麻痹中恢复。另外，将CD31-SP细胞移植入犬活牙髓（vital dentalpulp）的切断面，在活牙髓的切断面上的窝洞内观察到血管生成、神经再生和牙髓再生。相信作为间充质干细胞，CD31-SP细胞的牙髓再生潜能很高。
可利用流式细胞仪进行细胞分选，通过本领域技术人员已知的通常方法分离SP细胞。表达特异性细胞标记物的细胞部分可使用抗体通过流式细胞术或磁珠法进行分离。优选进一步培养所分离的部分，并将培养至第3代～第5代的间充质干细胞用作本实施方式的根管充填材料。
根管充填材料200中，间充质干细胞的含量优选为1×103细胞/μl以上、1×106细胞/μl以下。间充质干细胞含量低于1×103细胞/μl可导致根管中牙组织再生不足；而间充质干细胞含量高于1×106细胞/μl可导致在目标牙齿中产生不可预料的副作用。
细胞外基质（支架（scaffold））210优选由生物相容性材料构成，所述生物相容性材料包括下列物质中的至少一种：胶原、人造蛋白多糖、明胶、水凝胶、纤维蛋白、磷蛋白、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、壳多糖、PLA（聚乳酸）、PLGA（聚(乳酸-乙醇酸)共聚物）、PEG（聚乙二醇）、PGA（聚乙醇酸）、PDLLA（聚-DL-乳酸）、PCL（聚己内酯）、羟磷灰石、β-TCP、碳酸钙、钛以及金。蛋白多糖为其中的蛋白质与糖链（糖胺多糖（glycosaminoglycan））相互共价结合的复合糖（glycoconjugate）中的一种。另外，作为细胞外基质，也可使用由纳米纤维构成的海绵状三维结构，所述纳米纤维由如热塑性聚合物等的聚合物制成，具有1nm-1000nm的数均直径。此类三维结构优选具有80%-99.99%的孔隙率。
用作细胞外基质的胶原优选为I型/III型胶原混合物（I型胶原和III型胶原的混合物）。I型胶原为基本类型的胶原，是纤维型胶原。与胶原纤维不同，III型胶原可形成称作网状纤维的细网格状结构，从而形成例如细胞的支架。
在使用上述胶原混合物的情况下，III型胶原的比例优选为10wt%以上、50wt%以下。在III型胶原的比例高于50wt%的情况下，胶原混合物可能不能固化。相反，III型胶原的比例低于10wt%使得I型胶原的比例升高，可能导致牙本质再生、而非如下所述的血管生成。
以下，将根据图2对本实施方式的根管充填材料200的制造方法进行说明。
根管充填材料200通过牙髓干细胞以外的间充质干细胞220附着至细胞外基质210的根尖侧而形成。间充质干细胞220优选附着至根管充填材料200的根尖部的1/4～2/3、更优选根尖部的1/3。在使用处于流体状态的细胞外基质的情况下，根管充填材料可通过如下方式形成：制备含有细胞外基质和间充质干细胞的第一组合物与含有细胞外基质的第二组合物，以使得所述第一组合物和第二组合物分别位于根尖部和牙冠部。在制造方法的具体实例中，可用例如移液器枪头（Pipetman tip）等吸取10μl～13μl的I型/III型胶原混合物、然后吸取7μl～10μl的含有牙髓干细胞以外的间充质干细胞的I型/III型胶原混合物（例如，Collagen XYZ（Nitta Gelatin Inc.）），使总量为20μl。优选用移液器枪头等缓慢进行吸取，以免产生气泡。当根管充填材料内产生气泡时，所述气泡可能妨碍细胞迁移，从而抑制牙组织再生的诱发。优选具有较小内直径的移液器枪头，例如，可使用枪头底部内直径为0.5-0.7mm的枪头。例如，可使用QSP的H-010-96RS微毛细管枪头。根管充填材料的形状并不受具体限制，可以是，例如圆锥体、圆锥台（truncated cone）或圆柱体等。或者，在使用海绵状三维结构的细胞外基质的情况下，可通过在含有细胞外基质的结构的根尖部吸附牙髓干细胞以外的间充质干细胞制备所述根管充填材料（以适合于牙根的大小而形成）。本实施方式的说明中使用的所述细胞外基质的体积仅为例子，充填材料并不限于特定体积，并且可以根据牙髓再生的牙齿的根管体积适当确定。
现在将参考图3A-图3F，将使用根管充填材料200通过非拔牙法进行的牙组织再生方法作为牙组织再生法的实例进行说明。
如图3A所示，本实施方式的牙髓组织再生方法，例如在作为患有牙髓炎的目标的牙齿100中，在不拔出牙齿的状态下使牙组织再生。作为目标的牙齿是指例如由于龋齿或牙髓炎等而使细菌感染波及牙冠牙髓或牙根牙髓的牙齿。
如图3B所示，作为目标的牙齿100经受牙髓摘除或感染根管的根管扩大和清洁。术语“牙髓摘除”是指移除牙齿内部存在的牙髓。牙髓摘除可通过本领域技术人员已知的通常方法进行，例如，通过以手动或电动的扩孔器（reamer）/锉刀（file）或旋转电机（rotary engine）进行机械扩大，然后以次氯酸钠和双氧水交替洗涤的方法。术语“感染的根管”是指其中的细菌到达牙髓、然后到达根管壁的牙本质的根管。术语“根管扩大和清洁后”是指将感染根管中的细菌除去之后。细菌可通过例如交替洗涤后在根管内涂敷药物而除去。
在摘除牙髓后，扩大目标牙齿的根管，并优选将根尖部的根管扩大至预定的直径。根管扩大使得接受了牙髓摘除或接受了感染根管治疗的根管易于以根管充填材料200进行填充。另外，所述扩大促进血管和神经由根尖牙周组织进入。本文中，术语“根尖”是指目标牙齿与牙槽骨结合的端部（牙根的末端部分）。牙齿的根管扩大可通过手动或电动扩孔器/锉刀或旋转电机的机械方法进行。
例如，在图3B中，根尖部处的根管的直径d有利地为0.6mm以上、1.5mm以下。若根管的直径d小于0.6mm，血管和神经由根尖牙周组织进入可能几乎不会发生，并且用根管充填材料200进行的填充也会变得困难。相反，若根管的直径大于1.5mm，将向目标牙齿强加过度负担，这可能容易导致牙齿开裂。
然后，如图3C中所示，例如使用镊子等将根管充填材料200填充入根管的根尖侧。根管充填材料200含有生物材料，因此可为生物根管充填材料。根管充填材料200有利地填入对应于根管中牙髓所处部分的空间。若细胞外基质210为胶体状，则根管充填材料200不能以镊子等夹取，但可以例如用移液器或通过注射等注入。
在将根管充填材料200注入根管的根尖侧后，如图3D所示，将明胶610注入至根管充填材料200的上部，随后以树脂620覆盖。所述明胶和树脂并不受特别限制，可为牙科治疗中普遍使用的材料。
结果，根管中的牙组织得以再生。如图3E所示，待再生的牙组织的实例包括根管内的牙髓固有组织、血管400、神经等。另外，在使用BMP等形态发生因子的情况下，待再生的牙组织的实例包括牙本质。而且，在将根管充填材料200填充入感染的根管的情况下，待再生的牙组织的实例包括牙周组织，如牙周膜（periodontal ligament）（在牙槽骨中植入牙齿的牙周组织）和牙骨质。
随后，将树脂620暂时移除，并且如图3F所示，将BMP等形态发生因子630或牙本质形成因子涂敷于牙冠部的牙髓，并以树脂620覆盖。如图3G所示，将形态发生因子630或牙本质形成因子涂敷于牙冠部的牙髓还可使得牙本质500再生。
并且，在使用本实施方式的根管充填材料200进行的牙组织再生中，在再生的组织中未发现内部吸收和外部吸收，也未发现破牙质细胞，成牙本质细胞在牙本质壁上平整排列。另外，虽然认为由于出血而产生的大量血凝块的存在妨碍了牙髓组织再生，非拔牙法可以抑制血凝块产生，从而具有有效诱导牙组织再生的优点。另外，对根管的药物涂敷使得能够将根管的填充延至根管扩大后的出血和症状消失，该过程具有接近实际临床治疗的优点。
如上所述，目标牙齿100可以是由龋齿或牙髓炎等导致细菌感染波及至牙冠牙髓或牙根牙髓的牙齿，但并不限于此。即，目标牙齿100的实例还包括神经功能降低而使咬合感削弱的牙齿。在此类情况下，咬合感可通过牙髓再生得以加强，所述牙髓再生通过在牙髓摘除后以根管充填材料200填充根管来进行。另外，如图3H所示，目标牙齿100的实例包括细菌感染波及根尖牙周组织的牙齿（细菌到达牙髓并进一步到达根管壁的牙本质和根尖牙周组织的牙齿）。这些牙齿中多数患有根尖牙周炎（apical periodontitis）110。优选在对感染根管进行根管扩大和清洁后进行根管充填材料200的注入。
本实施方式的根管充填材料不仅可用于非拔出的牙齿，也可用于拔出的牙齿。在用于拔出的牙齿的情况下，首先，对想要进行牙组织再生的受试者进行拔牙。在拔牙以及感染根管的根管扩大和清洁后，进行牙髓摘除和消毒。牙髓摘除和消毒可以依照上述非拔牙法中所述的方法进行。随后，切断根尖部以形成开口，向其中植入根管充填材料。根尖部的切断位置优选为距下末端处1mm-2mm。可通过通常的牙科方法进行根尖部的切断，例如，使用空气涡轮（air turbine）或电机。可以依照上述非拔牙法中所述的方法进行根管充填材料的注入。图3I显示在拔牙的情况下，用根管充填材料200填充牙齿的根管根尖侧。在注入根管充填材料后，将明胶注入至根管充填材料上部，随后以树脂覆盖。随后，将拔出的牙齿再植入窝洞（socket）（拔牙窝洞（odontectomized cavity））。拔牙的情况具有如下优点：特别是，可以在直接观测下对患病牙进行治疗，并且对根尖部牙周组织的损伤较小。
第2实施方式
第2实施方式的根管充填材料含有牙髓干细胞以外的间充质干细胞和趋化因子。趋化因子包括细胞迁移因子、细胞生长因子以及神经营养因子中的至少一种。
图4（a）和图4（b）为本发明第2实施方式的根管充填材料200的说明图。在图4（a）中所示的根管充填材料200中，牙髓干细胞以外的间充质干细胞220附着至根管的根尖侧；而趋化因子230附着至根管的牙冠侧（例如，根管上端1/2至2/3处），所述趋化因子包括细胞迁移因子、细胞生长因子以及神经营养因子中的至少一种。
即使间充质干细胞220附着至根管的牙冠侧，细胞也不能获得由组织供给的营养，这可导致细胞坏死。因此，将间充质干细胞220附着至根管的根尖侧，而将趋化因子230附着至根管的牙冠侧。另外，附着至根管根尖侧的间充质干细胞220被附着至根管牙冠侧的趋化因子所吸引，从而易于促进牙组织再生。此外，如图4（b）所示，还可能在根管充填材料200的根管牙冠侧保留细胞外基质210。
趋化因子可包括细胞迁移因子、细胞生长因子和神经营养因子中的一种或其中两种以上的组合。
细胞迁移因子为通过结合至受体而使涉及细胞迁移的信号系统活化的分子。细胞生长因子为通过结合至受体而使涉及细胞生长的信号系统活化的分子。神经营养因子为通过结合至受体而使涉及细胞存活的信号系统活化的分子。
细胞迁移因子可优选为下列物质中的至少一种：SDF1、VEGF、GCSF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF以及血清。特别地，MMP3显出高趋化性（chemotaxis），因此可被优选使用。
细胞生长因子可优选为下列物质中的至少一种：IGF、bFGF、PDGF以及血清。
神经营养因子可优选为下列物质中的至少一种：GDNF、BDNF、NGF、神经肽Y、神经营养蛋白3以及血清。血清优选为自体血清（autoserum）。自体血清为待接受牙组织再生的个体的血清，可通过将新鲜血液放置30分钟然后通过离心收集上清液而制得。
附着有趋化因子的细胞外基质中趋化因子的含量优选为0.1ng/μl以上、500ng/μl以下。趋化因子含量低于0.1ng/μl时，可能导致迁移程度较低；而趋化因子含量高于500ng/μl时，可能导致对目标牙齿100产生不可预料的副作用。
以下，将根据图5对本实施方式的根管充填材料200的制造方法进行说明。图5为对通过将趋化因子230附着至根管的牙冠侧进行的制造根管充填材料200的方法进行说明的说明图。
在第2实施方式的根管充填材料200中，在使用流体状态的细胞外基质的情况下，制备含有细胞外基质和牙髓干细胞以外的间充质干细胞的第一组合物与含有细胞外基质和趋化因子的第二组合物，并且可将这些组合物注入、植入，以使得所述第一组合物和第二组合物分别位于根尖部和牙冠部。在制备方法的具体实例中，可用例如移液器枪头等吸取10μl～13μl的含有趋化因子的I型/III型胶原混合物（I型胶原与III型胶原的混合比为1:1）、然后吸取7μl～10μl的含有间充质干细胞的I型/III型胶原混合物，使总量为20μl。同样，在第2实施方式中，用移液器枪头等进行的吸取优选缓慢进行，以免导致气泡产生。优选具有较小内直径的移液器枪头。从而，制得图4（a）所示的根管充填材料200。
第2实施方式的根管充填材料200可以依照第1实施方式中的方式进行使用，即，可在摘除牙髓后或对感染根管进行根管扩大和清洁后的根管的非拔出的牙齿的根管的根尖侧填充所述根管充填材料；或者在拔牙后切断根尖部而形成开口，在根管的根尖侧填充所述根管充填材料。
由于本实施方式的根管充填材料200含有趋化因子，因此可进一步有效实现牙组织再生，并且再生组织中未出现内部吸收，也未发现破牙质细胞，并且成牙本质细胞在牙本质壁上平整排列。
第3实施方式
在上述第1实施方式中，通过牙髓干细胞以外的间充质干细胞220附着至根管充填材料200的根管的根尖侧而构成根管充填材料200。然而，所述充填材料不限于此类实施方式，间充质干细胞220也可均匀混合于根管充填材料200整体中。此类根管充填材料200也可在拔出状态的牙齿或非拔出状态的牙齿这两种情况下使用，且使用此类根管充填材料允许在具有发育完全的牙根的牙齿中进行牙组织再生，其中，不发生内部吸收，未观测到破牙质细胞，且成牙本质细胞平整排列于牙本质壁上。此类根管充填材料200例如可通过在避免产生气泡的情况下，将间充质干细胞220与作为细胞外基质实例的I型/III型胶原混合物相混合而制得。
在上述第2实施方式中，通过附着至根管根尖侧的牙髓干细胞以外的间充质干细胞220与附着至根管牙冠侧的趋化因子230构成了根管充填材料200。然而，所述充填材料并不限于此类实施方式，间充质干细胞220和趋化因子230均可均匀混合于根管充填材料200整体中。此类根管充填材料200也可在拔出状态的牙齿或非拔出状态的牙齿这两种情况下使用。使用此类根管充填材料允许在具有发育完全的牙根的牙齿中进行牙组织再生，其中，不发生内部吸收，未观测到破牙质细胞，且成牙本质细胞平整排列于牙本质壁上。这一根管充填材料200例如可通过在避免产生气泡的情况下，将间充质干细胞、趋化因子以及作为细胞外基质实例的I型/III型胶原混合物相混合而制得。
第4实施方式
本发明的第4实施方式涉及使用上述第1实施方式～第3实施方式中所述的根管充填材料进行牙组织异位再生的方法。牙组织异位再生的方法包括下列步骤：将第一个体的牙齿的牙髓摘除、将所述牙齿的牙根部切出预定长度、将根管充填材料注入所述根管、并将注入有充填材料的牙根移植入第二个体。
根管充填材料可为上述第1实施方式～第3实施方式中所述的充填材料。并且，也可使用牙髓干细胞替代构成上述第1实施方式～第3实施方式中的根管充填材料的间充质干细胞。在此类情况下，牙髓干细胞优选包括下列细胞中的至少一种：牙髓CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-1阳性细胞、CD105阳性细胞、牙髓SP细胞、CD31阴性和CD146阴性细胞、CD24阳性细胞、CD150阳性细胞、CD73阳性细胞，以及CD271阳性细胞和CD166阳性细胞；并且，所述牙髓SP细胞优选包括下列细胞中的至少一种：CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-1阳性细胞、CD31阴性和CD146阴性细胞、CD24阳性细胞、CD105阳性细胞、CD150阳性细胞、CD73阳性细胞、或CD271阳性细胞和CD166阳性细胞。
上述第一个体为期望进行牙齿再生的个体，优选为哺乳动物、典型地为人。上述第二个体不同于第一个体，并且为人类以外的哺乳动物。例如，第二个体可以是小鼠或猪，并且可使用免疫缺陷小鼠或猪。
将根据图6对第4实施方式的方法进行说明。图6（a）显示第一个体的牙齿100。本实施方式使用的第一个体的牙齿可以通过由第一个体拔出牙齿而获得。在对第一个体的牙齿的牙髓进行摘除的步骤中，按照第1实施方式中所述，进行牙髓摘除。图6（b）显示牙髓被去除的拔出的牙齿100。在切出预定长度的牙齿牙根部的步骤中，根据待再生的组织的尺寸来切出牙齿的牙根部。例如，所述长度可以为1mm-30mm，但并不限于此。图6（c）示意性地示出了待切出的牙根部120。在对接受牙髓摘除的根管的一端进行封闭的步骤中，用例如粘固剂（cement）等将切出的牙根部120的根管一端封闭。在将根管充填材料注入根管的步骤中，注入根据第1实施方式～第3实施方式中所述的方法制备的充填材料。图6（d）显示牙根部120的根管中已注入根管充填材料200的状态。根管充填材料200的间充质干细胞220附着至根管的根尖侧。图6（e）显示注入有根管充填材料的牙根部700。如图6（f）所示，在将注入有根管充填材料200的牙根移植入第二个体的步骤中，优选将注入有根管充填材料200的牙根部700移植入第二个体的皮下。
随后，将第二个体饲养预定的一段时间，然后取出上述填充有根管充填材料的牙根部700，从而获得再生的牙组织。可进一步将所述再生的牙组织再移植入第一个体的牙槽骨中。第4实施方式的方法在如下方面可非常有利：一个个体的牙组织可在另一个体中再生。
下面将通过实施例更具体地描述本发明，然而本发明完全不限于以下实施例。
实施例
实施例1
通过犬来源的干细胞进行的牙髓再生
细胞分离
根据在Iohara.等，2006（STEM CELLS，第24卷，第11期，2493-2503页，2006年11月）中描述的方法，从提取自犬上颚齿的犬牙髓组织中分离犬牙髓干细胞。原代脂肪细胞和原代骨髓细胞分别从同一犬的腹部皮下脂肪和肋骨骨髓中分离。如Iohara.等，2006中所述，使用Hoechst33342（Sigma，St.Louis，MO，http://www.sigmaaldrich.com）对这些细胞进行标记。随后，用小鼠BD Fc Block（BD Biosciences，San Jose，CA，http://www.bdbioscience.com）将所述细胞在4℃下预孵育30分钟，以除去非特异性结合。在含有小鼠IgG1阴性对照（MCA928）（AbD SerotecLtd，Oxford，UK，http://www.serotec.com）、小鼠IgG1阴性对照（藻红蛋白（Phycoerythrin），PE）（MCA928PE）（AbD Serotec）以及20%胎牛血清的PBS中，将所述细胞进一步用小鼠抗猪CD31（PE）（LCI-4）（AbDSerotec）（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，http://www.invitrogen.com）在4℃下孵育60分钟。随后，将这些细胞重悬于含有2μg/ml碘化丙啶（PI）（Sigma）的HEPES缓冲液中。使用流式细胞仪（FACS-ARIA II，BDbiosciences）对所述细胞进行分析与分选。
在涂覆有I型胶原的35mm板（Asahi Technoglass Corp.，Funabashi，Japan，http://www.atgc.co.jp）中，将来源于犬牙髓、骨髓和脂肪细胞的CD31-SP细胞分别接种于含有10%胎牛血清（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA）的Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）（Sigma）中，并对细胞进行培养。每4天或5天将培养基替换为新鲜培养基。将达到50%-60%汇合度的细胞在37℃下用0.02%EDTA孵育10分钟以进行分离、稀释至1:4、并进行继代培养。
细胞表面标记物的表达
使用第三代的细胞对来源于犬牙髓、骨髓和脂肪组织的CD31-SP细胞的表现型进行评价。用下列物质对细胞进行免疫标记：小鼠IgG1阴性对照（AbD Serotec Ltd.）、小鼠IgG1阴性对照（异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate），FITC）（MCA928F）（AbD Serotec）、小鼠IgG1阴性对照（藻红蛋白-Cy5、PE-Cy5）（MCA928C）（AbD Serotec）、小鼠IgG1阴性对照（Alexa647）（MRC OX-34）（AbD Serotec）；以及针对下列物质的抗体：CD24（Alexa Fluor647）（ML5）（BioLegend）、CD29（PE-Cy5）（MEM-101A）（eBioscience）、CD31（FITC）（Qbend10）（Dako）、CD33（FITC）（HIM3-4）（BD Bioscience）、CD34（别藻蓝蛋白（Allophycocyanin）、APC）（1H6）（R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，USA）、CD44（藻红蛋白-Cy7、PE-Cy7）（IM7）（eBioscience）、CD73（APC）（AD2）（BioLegend）、CD90（FITC）（YKIX337.217）（AbDSerotec）、CD146（FITC）（sc-18837）（Santa Cruz，Biotechnology，SantaCruz，CA，USA）、CD150（FITC）（A12）（AbD Serotec）、MHC I类（R-PE）（3F10）（Ancell Corporation，Bayport，MN，USA）、MHC II类（APC）（TDR31.1）（Ancell）以及CXCR4（FITC）（12G5）（R&D）。
实时RT-PCR分析
为了进一步评价细胞群的表现型，使用Trizol（Invitrogen）从第三代的牙髓和脂肪CD105+细胞和总牙髓细胞中提取总RNA。在各实验中，将细胞数量归一化至5×104。使用ReverTra Ace-α（Toyobo，Tokyo，Japan），通过逆转录由总RNA合成第一链cDNA。实时RT-PCR扩增以如下方式进行：使用干细胞标记物（犬CXCR4、Sox2、Stat3、Bmi1、Tert以及Oct4）；以LightCycler Fast Start DNA master SYBR Green I（RocheDiagnostics，Pleasanton，CA）进行标记；使用LightCycler（RocheDiagnostics）在95℃下10秒、62℃下15秒、以及72℃下8秒。使用的引物如下所示。
表1
表2
Figure BDA0000373418930000211
为了对血管生成因子和神经营养因子mRNA的表达进行研究，还对下列物质进行了实时RT-PCR扩增：犬基质金属蛋白酶-3（matrixmetalloprotease-3，MMP-3）、VEGF-A、粒细胞/单核细胞集落刺激因子（colony-stimulating factor）（GM-CSF）、SDF-1、NGF、BDNF、神经肽Y以及神经营养蛋白3（Iohara等，已提交）。用β-肌动蛋白对骨髓和脂肪CD31-SP细胞的表达进行归一化，然后将其与牙髓CD31-SP细胞的表达进行比较。
分化的诱导
将第3代-第5代犬骨髓和脂肪CD31-SP细胞向血管生成细胞和神经细胞的分化与Iohara等，2006中描述的牙髓CD31-SP细胞的分化进行比较。关于神经分化，对神经丝、神经调制蛋白和Iα型电压门控钠通道（Scn1α）的表达进行了研究。
生长和迁移分析
为了测定对基质细胞衍生因子1（SDF1）（Acris，Herford，Germany）进行应答的细胞生长，在含有0.2%胎牛血清（Sigma）和SDF-1（50ng/ml）的Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）中，以96孔板每孔103细胞的条件，将第4代的犬骨髓和脂肪CD31-SP细胞与牙髓CD31-SP细胞进行比较。将10μl的Tetra-color one（注册商标）（Seikagaku Kogyo，Co.，Tokyo，JAPAN）添加至96孔板的各个孔中，然后用分光光度计在开始培养后的2小时、12小时、24小时和36小时对波长450nm下的吸光度进行测量，以测定细胞数量。将不含所述细胞的孔用作阴性对照。
为了研究骨髓和脂肪CD31-SP细胞的迁移活性与牙髓CD31-SP细胞的迁移活性的比较，进行了SDF-1水平趋化性分析（horizontalchemotaxis assay）。用TAXI Scan-FL（Effector Cell Institute，Tokyo，JAPAN）对细胞的实时水平趋化性进行检测。TAXI Scan-FL由刻蚀的硅基底和平玻璃板组成，两者形成两个具有6μm深微通道的隔室。向与装配有不锈钢支持器（holder）的装置相连接的一个孔中注入各细胞部分（105细胞/ml：1μl），并向相对一侧的孔中注入1μl的10ng/μl SDF-1。拍摄了6个小时的细胞迁移视频图像。
体内移植
用具有完全发育的牙根和封闭根管的犬恒牙（Narc，Chiba，Japan）建立牙髓去除和细胞群移植的实验模型。对于双侧的上颚第二门牙和下颚第三门牙，静脉注入戊巴比妥钠（Schering-Plough，Germany）后，将全部牙髓去除，然后用#70K-锉刀（MANI，INC，Tochigi，Japan）将各牙齿根尖部的根管的直径扩大至0.7mm以上。制备了由第一组合物和第二组合物构成的根管充填材料，所述第一组合物包含10μl胶原TE（NittaGelatin Inc.）和5×105的用Dil标记的第三代至第四代犬牙髓、骨髓或脂肪CD31-SP细胞；所述第二组合物包含10μl胶原TE和终浓度为15ng/μl的SDF-1。以下述方式将充填材料填充入根管：将第一组合物自体移植入下部根管，并将第二组合物置于上部根管。填充后，上部的孔以磷酸锌粘固剂（Elite Cement，GC，Tokyo，Japan）和复合树脂（Clearfil MegaBond，Kuraray）封闭，然后用粘合剂（Clearfil Mega Bond，Kuraray）处理。使用了来自15只犬的60颗牙齿。将牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞与SDF-1一起分别移植入10颗牙齿中，并在14天和28天后拔出所述牙齿。
为了进行形态学分析，将所述牙齿在4℃下用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）（Nacarai Tesque，Kyoto，Japan）固定过夜，以10%甲酸脱盐，并包埋进石蜡（Sigma）中。将各石蜡切片（厚5μm）用苏木精/伊红（HE）染色，并进行形态学分析。在对血管进行的染色中，将厚5μm的石蜡切片脱蜡，并用荧光素-Griffonia（Bandeiraea）Simplicifolia凝集素1/荧光素-雪花莲（galanthus nivalis，snowdrop）凝集素（20μg/ml，Vector laboratories，Inc.，Youngstown，Ohio）染色15分钟，以监测涉及新生血管的移植细胞的存在和定位。在监测中，使用了荧光显微镜BIOREVO，BZ-9000（KEYENCE，Osaka，Japan）。
随后，在神经染色中，将厚5μm的石蜡切片脱蜡，并将其与0.3%Triton X-100（Sigma Chemical；St Louis，MO）一起孵育15分钟。在用2.0%正常山羊血清孵育以阻断非特异性结合之后，在4℃下将所述切片与山羊抗人PGP9.5（Ultra Clone Ltd.）（1:10000）一起孵育过夜。在以PBS洗涤三次后，在室温下将结合的抗体与生物素酰化的山羊抗兔IgG二级抗体（Vector）（1:200）反应1小时。还使用DAB色原和ABC试剂（Vector Laboratories，Burlingame，CA）将所述切片显色（developed）10分钟。
通过由立体显微镜（Leica，M205FA）获得的全齿图像确定移植后第14天时各样品中再生牙髓的相对量。分别对移植了犬牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞和SDF-1的5颗牙齿中间隔150μm的三份切片进行研究。跟踪新再生牙髓组织和牙本质在荧幕上的影像的轮廓，并使用Leica应用套件软件（Leica Application Suite software）确定由根管的轮廓所限定的表面积。计算各牙齿的三份切片的再生面积与根管面积的比值，并确定其平均值。由非配对学生t检验进行统计分析。数据各自以5次测量的平均值±标准差显示。
为了对移植了三种不同细胞中的再生组织进行比较，对于牙周膜，也使用上述标记物（犬axin2、骨膜蛋白（periostin）、无孢蛋白（asporin）/牙周膜相关蛋白1（PLAP-1）、多配体聚糖3（syndecan3）、生腱蛋白C（tenascin C）、TRH-DE、波形蛋白（vimentin）以及碱性磷酸酶）进行实时RT-PCR扩增。
统计分析
使用非配对学生t检验对以平均值±标准差示出的数据进行计算。将各实验重复三次，并在图表中示出一个代表性实验的结果。
结果
对犬牙髓、骨髓和脂肪组织来源的CD31-SP细胞的分离和评价
流式细胞仪分析结果表明，来自同一个体的犬牙髓、骨髓和脂肪组织来源的SP细胞分别以相对于细胞总量为1.5%、0.3%和0.1%的量存在（图7（a）、（e）和（i））。另外，结果显示，犬牙髓、骨髓和脂肪组织来源的CD31-SP细胞分别以相对于细胞总量为0.9%、0.3%和0.1%的量存在（图7（b）、（f）和（j））。这三种CD31-SP细胞群显示出相似的细胞表现型，即，它们均包含具有多个长突起的星形细胞和梭形细胞。星形细胞具有被颗粒围绕的大细胞核。梭形细胞为具有细长突起和少量细胞质的神经元样细胞。这些在图7（c）、（d）、（g）、（h）、（k）和（l）中示出。接种于35mm板的单个犬牙髓CD31-SP细胞和单个脂肪CD31-SP细胞在10天内各自形成集落（colony），而单个犬骨髓CD31-SP细胞在14天内形成集落。结果表明，这些细胞具备集落形成活性。估计犬牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞的贴附和生长效率分别为8%、6%和7%。对第三代培养物进行的有限稀释分析（Limiting dilution analysis）显示，估计犬牙髓CD31-SP细胞、犬骨髓CD31-SP细胞和犬脂肪CD31-SP细胞的牙髓CFU频率分别为80%、75%和80%。
通过对细胞表面抗体标记物进行流式细胞仪分析，将犬牙髓CD31-SP细胞的“干细胞特质（干细胞性（Stemness））”与犬骨髓CD31-SP细胞和犬脂肪CD31-SP细胞的“干细胞特质”进行比较。这三种CD31-SP细胞群呈CD29、CD44和CD90阳性。犬牙髓CD31-SP细胞中CD34+细胞的比例为4.4%，这一比例低于犬骨髓CD31-SP细胞中的9.8%和犬脂肪CD31-SP细胞中的7.1%。犬牙髓CD31-SP细胞和犬骨髓CD31-SP细胞中CD105+细胞的比例分别为60.2%和64.9%，上述比例低于犬脂肪CD31-SP细胞中的85.5%。这些细胞群的第四代基本上呈CD146阴性。CXCR4在犬牙髓和脂肪CD31-SP细胞中的表达水平比在犬骨髓CD31-SP细胞中的高。结果示于表3中。
表3
Figure BDA0000373418930000251
干细胞标记物Stat3、Bmi1、Sox2、Tert和CXCR4在犬牙髓CD31-SP细胞中的表达水平与在犬骨髓和脂肪CD31-SP细胞中相当。结果显示，这三种细胞群均具有相似的干细胞特性。血管生成因子和/或神经营养因子NGF、VEGF-A和MMP-3在犬牙髓CD31-SP细胞中的表达水平比在犬骨髓和脂肪CD31-SP细胞中的高。BDNF在犬骨髓CD31-SP细胞中的表达水平比在犬牙髓和脂肪CD31-SP细胞中的高。GDNF在全部三种细胞群中的表达相近。结果在表4中示出。
表4
BM/牙髓 脂肪/牙髓
Sox2 5.9 0.9
Tert 1.2 1.0
Bmi1 0.9 1.2
CXCR4 0.9 1.7
Stat3 1.1 0.6
GM-CSF 0.6 0.2
MMP3 0.2 0.2
VEGF 0.4 0.5
BDNF 5.1 2.1
GDNF3 1.2 1.0
NGF 0.7 0.8
在犬牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞这三种细胞群中，对CD31-SP细胞分化为血管内皮细胞的分化潜能（图8（a）、（b）和（c））、分化为神经球的分化潜能（图8（d）、（e）和（f））、以及分化成神经细胞的分化潜能（图8（g）、（h）和（i））进行比较。对于所有细胞群，均早在培养12小时时便在基质胶上观测到线状及管状结构的大范围网络（图8（a）、（b）和（c））。在诱导后14天时，检测到细胞簇（clusters）和增殖性神经球。这三种细胞群在神经球的发生率和数量上几乎显不出差异。另外，成功进行了由这些神经球进行的神经诱导。这三种细胞群中的大多数细胞对于神经调制蛋白显出免疫反应性。在全部三种细胞群中均有神经标记物、神经丝、神经调制蛋白和Scn1α mRNA表达（图8（j））。
迁移和生长
在犬牙髓CD31-SP细胞和脂肪CD31-SP细胞中，SDF-1存在下的迁移活性（由TAXI Scan-FL指示）相对较高，而在犬骨髓CD31-SP细胞中的迁移活性相对于其它两种细胞而言较低（图9（a））。在犬牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞中，具有SDF-1时的增殖活性相同（图9（b））。
移植入根管中之后的牙髓再生
随后，对犬牙髓、骨髓或脂肪CD31-SP细胞与SDF-1向犬恒牙的牙髓摘除后的根管的体内自体移植进行评价，所述犬恒牙具有发育完全的牙根以及闭合的根管（图10）。在牙髓和脂肪CD31-SP细胞与SDF-1的移植中，在移植后第14天检出牙髓样组织的形成（图10（a）和（c））。然而，在骨髓CD31-SP细胞与SDF-1的移植中，再生牙髓的量比移植牙髓和脂肪CD31-SP细胞与SDF-1时的量小（图10（b））。统计分析的结果表明，相比于移植骨髓CD31-SP细胞与SDF-1，在移植牙髓CD31-SP细胞和脂肪CD31-SP细胞与SDF-1时，再生区域较大（分别增高为2.0倍和1.5倍），具有统计学显著性（图10（j））。在全部三种细胞的移植中，再生组织中的细胞为星形或梭形（图10（d）、（e）和（f））。然而，在骨髓和脂肪CD31-SP细胞的移植中，部分观测到纤维基质的形成（图10（e）和（f））。并且，在移植脂肪CD31-SP细胞与SDF-1后第90天时，在牙髓中观测到强钙化（图10（i））；在移植牙髓CD31-SP细胞与SDF-1时几乎观测不到钙化；在移植骨髓CD31-SP细胞与SDF-1时则观测到轻度钙化。对用BS-1凝集素染色的冷冻切片进行的激光共聚焦显微分析揭示出，在再生组织中发生了血管生成（图10（k）、（l）和（m））。用抗体染色的轴突（neurites）延伸入由根尖孔处新再生的牙髓（图10（n）、（o）和（p））。Masson染色的结果显示出在移植脂肪CD31-SP细胞与SDF-1后第90天时的强基质形成。
相对于正常牙周膜组织中的骨膜蛋白mRNA的表达水平，在经由移植犬牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞而再生的组织中的骨膜蛋白mRNA的表达水平相当低。结果显示，与在正常牙髓组织中一样，已知在牙髓中高表达的多配体聚糖3、生腱蛋白C和波形蛋白在全部再生组织中均有表达。脂肪、骨、牙本质、aP2、Osterix和Dspp的分化标记物在全部再生组织中均未表达。结果在表5中示出。
表5
Figure BDA0000373418930000271
实施例2
通过猪来源的干细胞进行的牙髓再生
细胞分离
从猪牙胚（tooth germ）中分离原代牙髓细胞。从同一猪的下颚中分离猪原代脂肪细胞和原代骨髓细胞。根据Iohara等，2006中描述的方法，用Hoechst33342（Sigma，St.Louis，MO，http://www.sigmaaldrich.com）对这些细胞进行标记。随后，在4℃下用小鼠BD Fc Block（BDBiosciences，San Jose，CA，http://www.bdbioscience.com）预孵育所述细胞30分钟，以除去非特异性结合。在含有小鼠IgG1阴性对照（MCA928）（AbD Serotec Ltd，Oxford，UK，http://www.serotec.com）、小鼠IgG1阴性对照（藻红蛋白，PE）（MCA928PE）（AbD Serotec）以及20%胎牛血清的PBS中，将所述细胞进一步用小鼠抗猪CD31（PE）（LCI-4）（AbDSerotec）（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，http://www.invitrogen.com）在4℃下孵育60分钟。随后，将这些细胞重悬于含有2μg/ml碘化丙啶（PI）（Sigma）的HEPES缓冲液中。使用流式细胞仪（FACS-ARIA II，BDbiosciences）对所述细胞进行分析与分选。
在涂覆有I型胶原的35mm板（Asahi Technoglass Corp.，Funabashi，Japan，http://www.atgc.co.jp）中，将来源于猪牙髓、骨髓和脂肪细胞的CD31-SP细胞分别接种于含有10%胎牛血清（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA）和5ng/ml EGF（Cambrex Bio Science）的EBM2中，并对所述细胞进行培养。每4天或5天将培养基替换为新鲜培养基。将达到50%-60%汇合度的细胞在37℃下用0.02%EDTA孵育10分钟以进行分离、稀释至1:4、并进行继代培养。
细胞表面标记物的表达
使用第三代的细胞对来自猪牙髓、骨髓和脂肪组织的CD31-SP细胞的表现型进行评价。通过流式细胞仪分析用下列抗体免疫标记的细胞：小鼠IgG1阴性对照（AbD Serotec Ltd.）、小鼠IgG1阴性对照（异硫氰酸荧光素，FITC）（MCA928F）（AbD Serotec）、小鼠IgG1阴性对照（藻红蛋白-Cy5、PE-Cy5）（MCA928C）（AbD Serotec）、小鼠IgG1阴性对照（Alexa647）（MRC OX-34）（AbD Serotec）；以及针对下列物质的抗体：CD14（Alexa Fluor647）（Tuk4）（AbD Serotec）、CD29（PE-Cy5）（MEM-101A）（eBioscience）、CD31（PE）（LCI-4）（AbD Serotec）、CD34（PE）（581）（Beckman Coulter）、CD44（PE-Cy5）（IM7）（eBioscience）、CD73（Alexa Flour647）（AD2）（eBioscience）、CD90（Alexa Flour647）（F15-42-1）（AbD Serotec）、CD105（FITC）（MEM-229）（Abcam）、CD117/c-kit（别藻蓝蛋白，APC）（A3C6E2）（Miltenyi Biotec，BergischGladbach，Germany，http://www.miltenyibiotec.com）、CD133（Alexa Flour647）（293C3）（Miltenyi Biotec）、CD146（FITC）（OJ79c）（AbD Serotec）、CD150（FITC）（A12）（AbD Serotec）、CD271（APC）（ME20.4-1H4）（Miltenyi Biotec.）以及CXCR4（FITC）（12G5）（R&D）。
干细胞标记物、血管生成因子和神经营养因子的实时RT-PCR分析
为了研究来源于猪牙髓、骨髓和脂肪组织的CD31-SP细胞群的干细胞特性、血管生成潜能和神经生成（neurogenic）潜能，使用Trizol（Invitrogen）从各CD31-SP细胞中提取总RNA。在各实验中，将细胞数量归一化至5×104。使用ReverTra Ace-α（Toyobo，Tokyo，Japan），通过逆转录由总RNA合成第一链cDNA。实时RT-PCR扩增以如下方式进行：使用干细胞标记物（猪C Sox2、Tert、Bmi1、CXCR4以及Stat3），以及血管生成因子、神经营养因子、粒细胞/单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、血管内皮生长因子A（VEGF-A）、脑源神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神经胶质细胞系源神经营养因子（glial cell line-derivedneurotrophic factor，GDNF）、神经生长因子（NGF）、神经肽Y（Iohara等，2008（STEM CELLS，第26卷，第9期，2408-2418页，2008年9月）；Sugiyama等，2011（Tissue Engineering Part A.2011年1月））；以LightCycler Fast Start DNA master SYBR Green I（Roche Diagnostics，Pleasanton，CA）进行标记；使用LightCycler（Roche Diagnostics）在95℃下10秒、62℃下15秒、以及72℃下8秒。用β-肌动蛋白对骨髓和脂肪CD31-SP细胞的表达进行归一化，然后将其与牙髓CD31-SP细胞的表达进行比较。使用的引物如下所示。
表6
移植入牙根模型
为了对异位牙髓再生进行检测，进行了猪牙根模型的皮下移植。将猪的第三切牙拔出，并将其牙根各自切成长度为6mm。将根管扩大至1mm宽，然后用MTA粘固剂封闭一端。制备了根管充填材料，所述充填材料由1×106的第三代至第四代猪牙髓、骨髓或脂肪CD31-SP细胞群和10μl胶原TE（Nitta Gelatin Inc.，Osaka，Japan）组成。将所述充填材料分别注入一端已被封闭的牙根。将上述牙根经皮下移植入5周龄SCID小鼠（CB17，CLEA，Tokyo，JAPAN，http://www.clea-japan.com）。将来源于四只不同猪个体的牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞分别移植入两牙根中。为了进行组织学研究，在14天后将全部24只牙根取出。
为了进行形态学分析，将所述牙根在4℃下用4%多聚甲醛PFA（Nacarai Tesque，Kyoto，Japan）固定过夜，以10%甲酸脱盐，并包埋进石蜡（Sigma）中。将各石蜡切片（厚5μm）用苏木精/伊红（HE）染色，随后进行形态学分析。为了对血管进行染色，将厚5μm的石蜡切片脱蜡，并以荧光素-Griffonia（Bandeiraea）Simplicifolia凝集素1/荧光素-雪花莲（雪花莲）凝集素（20μg/ml，Vector laboratories，Inc.，Youngstown，Ohio）染色15分钟，以监测涉及新生血管的移植细胞的存在和定位。在监测中，使用了荧光显微镜BIOREVO，BZ-9000（KEYENCE，Osaka，Japan）。
对猪牙髓、骨髓和脂肪组织来源的CD31-SP细胞的分离和评价
流式细胞仪分析结果表明，来源于同一个体的牙髓、骨髓和脂肪组织的SP细胞分别以细胞总量的1.6%、0.3%和0.1%的量存在（图11A（a）、11B（e）和11C（i））。另外，结果显示，牙髓、骨髓和脂肪组织来源的CD31-SP细胞分别以细胞总量的0.9%、0.3%和0.1%的量存在（图11A（b）、11B（f）和11C（j））。这三种CD31-SP细胞群显示出相似的细胞表现型，即，它们均包含具有多个长突起的星形细胞和梭形细胞。星形细胞具有被颗粒围绕的大细胞核。梭形细胞为具有细长突触和少量细胞质的神经元样细胞。这些在图11A（c）、A（d）、B（g）、B（h）、C（k）和C（l）中示出。含有IGF1、EGF和10%胎牛血清的EBM2维持了CD31-SP细胞的表现型。这显示出在第12代中至少99.8%的细胞为CD31-和ABCG2/BCRP1+。接种于35mm板（涂覆有I型胶原）的单个牙髓CD31-SP细胞和单个脂肪CD31-SP细胞各自在10天内形成集落，而单个骨髓CD31-SP细胞在14天内形成集落。结果表明，这些细胞具备集落形成活性。估计猪牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞的贴附和生长效率分别为8%、6%和7%。对第三代培养物进行的有限稀释分析显示，猪牙髓CD31-SP细胞、猪骨髓CD31-SP细胞和猪脂肪CD31-SP细胞的牙髓CFU频率分别为80%、75%和80%。
通过对细胞表面抗体标记物进行流式细胞仪分析，将猪牙髓CD31-SP细胞的“干细胞特质（干细胞性）”与猪骨髓CD31-SP细胞和脂肪CD31-SP细胞的“干细胞特质（干细胞性）”进行比较。第三代的这三种CD31-SP细胞群呈CD29、CD44、CD90和CD105阳性，但对于CD31和CD146呈阴性。猪牙髓CD31-SP细胞中CD34的表达水平显著高于其在猪骨髓CD31-SP细胞和猪脂肪CD31-SP细胞中的表达水平。CXCR4在猪牙髓和脂肪CD31-SP细胞中的表达水平比在猪骨髓CD31-SP细胞中的高。结果示于表7中。
表7
Figure BDA0000373418930000321
干细胞标记物Sox2、Tert、Bmi1、CXCR4和Stat3mRNA在牙髓CD31-SP细胞中的表达水平与在骨髓和脂肪CD31-SP细胞中的表达水平相当。结果显示，这三种细胞群彼此具有相似的干细胞特性。血管生成因子和/或神经营养因子GM-CSF、MMP-3、VEGF-A、BDNF、GDNF、NGF以及神经肽Y在所有三种细胞群中均具有类似的表达。结果示于表8中。
表8
BM/牙髓 脂肪/牙髓
Sox2 2.5 0
Tert 1.0 0.2
Bmi1 0.8 1.7
CXCR4 0.7 0.7
Stat3 1.1 1.9
GM-CSF 0.5 0.2
MMP3 0.8 1.2
VEGF 0.9 0.9
BDNF 2.3 2.5
GDNF 0.9 0.3
NGF 0.5 2.2
在三种CD31-SP细胞群中，对CD31-SP细胞分化为血管内皮细胞的分化潜能（图12（a）、（b）和（c））和分化为神经球的分化潜能（图12（d）、（e）和（f））进行比较。在培养12小时内，全部细胞群均在基质胶上观测到线状及管状结构的大范围网络（图12（a）、（b）和（c））。在培养开始后第14天时，检测到细胞簇和增殖性神经球。这三种细胞群在神经球的发生率和数量上未显出较大差异。另外，成功进行了由这些神经球进行的神经诱导。这些结果表明，三种细胞群均具有相同的血管诱导（血管生成）潜能和神经诱导（神经生成）潜能。
猪牙髓CD31-SP细胞以及猪骨髓和脂肪CD31-SP细胞在具有SDF-1时的生长活性相同（图13（a））。在有SDF-1的情况下，牙髓CD31-SP细胞以及骨髓和脂肪CD31-SP细胞的迁移活性（由TAXI Scan-FL指示）也相同（图13（b））。
皮下移植入填充有CD31-SP细胞的牙根后的牙髓再生
随后，对填充有CD31-SP细胞的牙根向重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠的体内皮下移植进行评价。在移植猪牙髓CD31-SP细胞后第14天时，根管中填充了具有足够组织化（organized）的血管系统的牙髓样组织（图14（a）、（b）和（c））。移植猪骨髓CD31-SP细胞还诱导出具有毛细血管的牙髓样组织（图14（d）、（e）和（f））。在移植猪脂肪CD31-SP细胞时，观测到了钙化（图14（g）、（h）和（i））。
实施例3
牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞的免疫原性
采血后，即刻将犬血液转移入Venoject真空采血管（TERUMO）中，并向其中添加相同量的生理盐水（Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.）。在颠倒混合后，使用Lymphoprep管（Axis-Shield）通过比重离心法（比重：1.007）分离外周血单核细胞（PBMC）。在37℃下，用10mg/ml丝裂霉素C（Nacarai Tesque）对半数PBMC进行处理3小时，以抑制生长，同时保持其抗原性，然后将其用作刺激物。
为了对犬牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞的免疫调节潜能进行比较，将这些细胞分别在含10%FBS的DMEM中培养3天。随后分别收集培养上清液，并用Centrifugal Filter Units（MILLI PORE）将其浓缩10倍来使用。在96孔板中，将分别调整为1×105细胞的PBMC和刺激物PBMC在含有10%FBS的RPMI1640中共培养48小时。另外，向其中加入牙髓、骨髓或脂肪CD31-SP细胞的培养上清液（条件培养基）。使用TetraColor ONE（Seikagaku Biobusiness Corporation）（MTT法）测定随时间的生长活性，并对由添加培养上清液而导致的PBMC生长抑制效果进行比较。
通过实时RT-PCR对涉及猪牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞的免疫原性的信使RNA进行研究。其结果表明，在三种细胞中均未观测到MHC（主要组织相容复合体）II类DRB、CD80、CD40的表达。另外，与未分离的猪总牙髓细胞相比，牙髓、骨髓和脂肪中MHC IA类的表达水平非常低，分别为0.07、0.25和0.08。流式细胞仪的结果证实CD40、CD80、CD86和MHC II类在三种细胞中均呈阴性，而MHC I类在牙髓中为36.0%、骨髓中为73.8%、脂肪中为80.0%。因此，暗示了三种细胞的免疫原性较低。
牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞的免疫调节潜能
利用混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction（MLR））法，通过三种培养上清液对经由添加异体外周血单核细胞所引起的自体犬外周血单核细胞（无自身增殖潜能）增加的抑制作用，来对犬牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞的免疫调节潜能进行了研究。结果证实牙髓、骨髓和脂肪CD31-SP细胞均显著抑制了自体外周血单核细胞的增加，三种细胞间无任何显著差异（图15）。因此，暗示了三种类型的细胞具有类似的免疫调节潜能。
附图标记列表
100  目标牙齿
110  根尖牙周炎
120  牙根（根尖）部
200  根管充填材料
210  细胞外基质
220  间充质干细胞
230  趋化因子
400  血管
500  牙本质
610  明胶
620  树脂
630  形态发生因子
640  粘固剂
700  填充有根管充填材料的牙根（根尖）部
Figure IDA0000373419000000011
Figure IDA0000373419000000021
Figure IDA0000373419000000031
Figure IDA0000373419000000041
Figure IDA0000373419000000051
Figure IDA0000373419000000061
Figure IDA0000373419000000071
Figure IDA0000373419000000081
Figure IDA0000373419000000101

Claims (13)

1.一种根管充填材料，所述根管充填材料包含：
牙髓干细胞以外的间充质干细胞；以及
细胞外基质，
其中，在牙髓摘除后或对感染根管进行根管扩大和清洁后，将所述根管充填材料插入根管的根尖侧。
2.如权利要求1所述的根管充填材料，其中，所述间充质干细胞为骨髓干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞或脐带血细胞。
3.如权利要求1所述的根管充填材料，其中，所述骨髓干细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞或脐带血细胞包括下列细胞中的至少一种：
SP细胞、CD31阴性SP细胞、CD24阳性细胞、CD29阳性细胞、CD44阳性细胞、CD73阳性细胞、CD90阳性细胞、CD105阳性细胞、CD31阴性细胞、CD45阴性细胞、MHC II类阴性细胞、CD150阳性细胞、CXCR4阳性细胞、CD271阳性细胞、CD133阳性细胞、FLK-1阳性细胞、CD166阳性细胞以及VEGFR2阳性细胞。
4.如权利要求1-3中任一项所述的根管充填材料，所述根管充填材料进一步包含趋化因子，所述趋化因子包括细胞迁移因子、细胞生长因子以及神经营养因子中的至少一种。
5.如权利要求4所述的根管充填材料，其中，所述牙髓干细胞以外的间充质干细胞位于所述根管的根尖侧；所述趋化因子位于所述根管的牙冠侧。
6.如权利要求4或5所述的根管充填材料，其中，所述细胞迁移因子为下列物质中的至少一种：
SDF-1、VEGF、GCSF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF以及血清。
7.如权利要求4或5所述的根管充填材料，其中，所述细胞生长因子为下列物质中的至少一种：
IGF、bFGF、PDGF以及血清。
8.如权利要求4或5所述的根管充填材料，其中，所述神经营养因子为下列物质中的至少一种：
GDNF、BDNF、NGF、神经肽Y、神经营养蛋白3以及血清。
9.如权利要求1-8中任一项所述的根管充填材料，其中，所述细胞外基质由生物相容性材料构成，所述生物相容性材料包括下列物质中的至少一种：
胶原、人造蛋白多糖、明胶、水凝胶、纤维蛋白、磷蛋白、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、壳多糖、PLA、PLGA、PEG、PGA、PDLLA、PCL、羟磷灰石、β-TCP、碳酸钙、钛以及金。
10.如权利要求1-9中任一项所述的根管充填材料，其中，所述细胞外基质中的所述牙髓干细胞以外的间充质干细胞的含量等于或大于1×103细胞/μl、且等于或小于1×106细胞/μl。
11.一种用于牙组织再生的方法，所述方法包括下列步骤：
将权利要求1-10中任一项所述的根管充填材料注入根管的根尖侧，所述根管是牙髓摘除后或对感染根管进行根管扩大和清洁后的根管。
12.如权利要求11所述的用于牙组织再生的方法，所述方法进一步包括在将所述根管充填材料注入所述根管的根尖侧的步骤之前，扩大所述根管以将根尖部的根管直径增大至预定大小的步骤。
13.一种牙组织异位再生的方法，所述方法包括下列步骤：
将第一个体的牙齿的牙髓摘除；
将所述牙齿的牙根部切出预定长度；
将牙髓摘除后的所述根管的一端封闭；
向所述根管中注入根管充填材料，所述根管充填材料含有间充质干细胞和细胞外基质；以及
将注入所述充填材料的牙根移植入第二个体。
CN201280010806.8A 2011-02-28 2012-01-31 含有间充质干细胞的根管充填材料及使用该材料的牙组织再生方法 Active CN103402558B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011042862A JP5939559B2 (ja) 2011-02-28 2011-02-28 間葉系幹細胞を含んでなる根管充填材、及びこれを用いた歯組織再生方法
JP2011-042862 2011-02-28
PCT/JP2012/052155 WO2012117793A1 (ja) 2011-02-28 2012-01-31 間葉系幹細胞を含んでなる根管充填材、及びこれを用いた歯組織再生方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103402558A true CN103402558A (zh) 2013-11-20
CN103402558B CN103402558B (zh) 2015-10-14

Family

ID=46757734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280010806.8A Active CN103402558B (zh) 2011-02-28 2012-01-31 含有间充质干细胞的根管充填材料及使用该材料的牙组织再生方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9962237B2 (zh)
EP (1) EP2682136B1 (zh)
JP (1) JP5939559B2 (zh)
CN (1) CN103402558B (zh)
WO (1) WO2012117793A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016011039A1 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Biomimetic scaffold for regenerative dentistry
CN109731145A (zh) * 2019-01-09 2019-05-10 上海市第五人民医院 一种便于临床操作的根管消毒芯及其制备方法
CN112220966A (zh) * 2020-11-23 2021-01-15 北京大学口腔医学院 一种注射剂、注射剂的制备方法及其在牙髓再生中的应用
CN112245662A (zh) * 2020-10-10 2021-01-22 中山大学附属第五医院 一种Hep-HA复合多孔材料的制备方法及其在构建根管内置支架中的应用
WO2021012718A1 (zh) * 2019-07-25 2021-01-28 四川大学 用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs及其分离培养方法和应用
CN112754689A (zh) * 2021-01-13 2021-05-07 深圳和光医用橡胶材料科技有限公司 牙胶尖
CN113827486A (zh) * 2016-03-31 2021-12-24 国立研究开发法人国立长寿医疗研究中心 根管填充材料及牙组织再生试剂盒

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2019641A4 (en) * 2006-05-23 2014-12-24 Sonendo Inc MATERIALS AND METHODS FOR CAPTURING A RADICULAR CHANNEL
WO2012005593A2 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Stichting Glass For Health Apatite compositions
JP6338214B2 (ja) * 2014-03-28 2018-06-06 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター インプラント体
WO2017205601A1 (en) * 2016-05-26 2017-11-30 Ormco Corporation Root canal debridement effectiveness device and method
JP2019063191A (ja) 2017-09-29 2019-04-25 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター 非細胞性根管充填材及び非細胞性歯組織再生促進キット
WO2020196867A1 (ja) 2019-03-28 2020-10-01 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター 非細胞性根管充填材および非細胞性歯組織再生促進キット
JP7057006B1 (ja) * 2021-04-12 2022-04-19 医療法人社団サカイクリニック６２ 歯周組織用製剤及びそれを含むキット
US11890154B2 (en) * 2021-06-30 2024-02-06 Khalid AL HEZAIMI Pulp capping methods
KR102550828B1 (ko) 2021-07-07 2023-07-04 주식회사 에스티원 치수 및 상아질 재생용 하이브리드 스캐폴드 구조
WO2023105465A1 (de) 2021-12-08 2023-06-15 Hofmann Heidrun Dentales wachstumsstimulanz und behandlungsset

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101144069A (zh) * 2007-08-22 2008-03-19 黄显成 从口腔组织中培养间质干细胞的方法
CN101316926A (zh) * 2005-09-30 2008-12-03 复制基因股份公司 用于分化干细胞的方法及其在牙病治疗中的用途
WO2009078971A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-25 Nova Southeastern University Method and kit for delivering regenerative endodontic treatment
CN101970022A (zh) * 2008-03-12 2011-02-09 财团法人日本健康科学振兴财团 根管填充材料以及牙组织再生方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2211752A4 (en) * 2007-10-25 2013-10-02 Univ Columbia BIOPULPA
US20120164604A1 (en) * 2009-09-11 2012-06-28 National Center For Geriatrics And Gerontology Unextracted tooth root canal filler and dental tissue regeneration method for unextracted tooth

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101316926A (zh) * 2005-09-30 2008-12-03 复制基因股份公司 用于分化干细胞的方法及其在牙病治疗中的用途
CN101144069A (zh) * 2007-08-22 2008-03-19 黄显成 从口腔组织中培养间质干细胞的方法
WO2009078971A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-25 Nova Southeastern University Method and kit for delivering regenerative endodontic treatment
CN101970022A (zh) * 2008-03-12 2011-02-09 财团法人日本健康科学振兴财团 根管填充材料以及牙组织再生方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
董金山，等: "骨髓间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的体外实验研究", 《牙体牙髓牙周病学杂志》 *
陈小红，等: "脂肪来源干细胞诱导分化为成牙本质样细胞的体外培养研究", 《实用口腔医学杂志》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016011039A1 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Biomimetic scaffold for regenerative dentistry
CN113827486A (zh) * 2016-03-31 2021-12-24 国立研究开发法人国立长寿医疗研究中心 根管填充材料及牙组织再生试剂盒
CN109731145A (zh) * 2019-01-09 2019-05-10 上海市第五人民医院 一种便于临床操作的根管消毒芯及其制备方法
CN109731145B (zh) * 2019-01-09 2021-06-22 上海市第五人民医院 一种便于临床操作的根管消毒芯及其制备方法
WO2021012718A1 (zh) * 2019-07-25 2021-01-28 四川大学 用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs及其分离培养方法和应用
CN112245662A (zh) * 2020-10-10 2021-01-22 中山大学附属第五医院 一种Hep-HA复合多孔材料的制备方法及其在构建根管内置支架中的应用
CN112220966A (zh) * 2020-11-23 2021-01-15 北京大学口腔医学院 一种注射剂、注射剂的制备方法及其在牙髓再生中的应用
CN112754689A (zh) * 2021-01-13 2021-05-07 深圳和光医用橡胶材料科技有限公司 牙胶尖

Also Published As

Publication number Publication date
EP2682136A1 (en) 2014-01-08
EP2682136B1 (en) 2021-06-30
CN103402558B (zh) 2015-10-14
EP2682136A4 (en) 2016-10-26
JP5939559B2 (ja) 2016-06-22
WO2012117793A1 (ja) 2012-09-07
US9962237B2 (en) 2018-05-08
JP2012179123A (ja) 2012-09-20
US20140322672A1 (en) 2014-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103402558B (zh) 含有间充质干细胞的根管充填材料及使用该材料的牙组织再生方法
JP6031658B2 (ja) 根管充填材
JP5408578B2 (ja) 歯髄幹細胞を用いた自家又は同種移植用組成物及びその用途
JP5748194B2 (ja) 非抜歯根管充填材
Zhang et al. Hard tissue formation in a porous HA/TCP ceramic scaffold loaded with stromal cells derived from dental pulp and bone marrow
Naddeo et al. Surface biocompatibility of differently textured titanium implants with mesenchymal stem cells
JP6687757B2 (ja) ３ｄ軟骨オルガノイドブロックを調製するための方法
US11058721B2 (en) Composition comprising a substantially pure population of multipotent stromal cells encapsulated in platelet-poor plasma (PPP)
US20090298173A1 (en) Method of preparing cell for bone tissue formation and application of cell for bone tissue formation
JP2021072925A (ja) 根管充填材
Wei et al. Evaluation of silk fibroin-RGD-stem cell factor scaffold effect on adhesion, migration, and proliferation of stem cells of apical papilla
Khojasteh et al. Mesenchymal stem cell therapy for treatment of craniofacial bone defects: 10 years of experience
JP2022116298A (ja) 非細胞性根管充填材及び非細胞性歯組織再生促進キット
RU2530622C2 (ru) Биотрансплантат для восстановления объема костной ткани при дегенеративных заболеваниях и травматических пвореждениях костей и способ его получения
Karpyuk et al. Innovation-based approach in reconstruction of reduced jaw alveolar ridge bone using cell regeneration technologies
US20110117521A1 (en) Biological regenerate
US9168139B2 (en) Vertical bone augmentation using endothelial progenitor cells
TW202120685A (zh) 象牙質再生用細胞培養物
Tran Yi Lin1, 2, Mayumi Umebayashi2, Mohamed-Nur Abdallah3, Guoying Dong 4, Michael G. Roskies2, 5, Yaoyao Fiona Zhao4, Monzur Murshed6, 7, 8, Zhiguang Zhang1 &
KLEIN-NULEND et al. Bone Regeneration Using the Freshly Isolated Autologous Stromal Vascular Fraction of Adipose Tissue in Combination With Calcium Phosphate Ceramics
Sandor et al. SURGICAL ONCOLOGY AND RECONSTRUCTION
Wang et al. Bioengineering of Roots and Periodontal Tissues
WO2003075972A1 (fr) Composition formant un tissu
KR20160025705A (ko) 줄기세포의 기질부착 향상용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20211210

Address after: Aichi Prefecture, Japan

Patentee after: Nakashima Misako

Address before: Aichi Prefecture, Japan

Patentee before: National Center for Geriatrics and Gerontology

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230428

Address after: Osaka, Japan

Patentee after: AIR WATER Inc.

Address before: Aichi Prefecture, Japan

Patentee before: Nakashima Misako