CN101144069A

CN101144069A - 从口腔组织中培养间质干细胞的方法

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Publication number: CN101144069A
Application number: CNA2007100094051A
Authority: CN
Inventors: 黄显成
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-08-22
Filing date: 2007-08-22
Publication date: 2008-03-19

Abstract

本发明公开一种从口腔组织中培养间质干细胞的方法，先准备牙髓或牙龈粘膜样本，再由牙齿的牙髓组织中分离出牙髓间质干细胞或由牙龈粘膜组织中分离出牙龈粘膜间质干细胞，然后，进行细胞培养，细胞即呈现牙髓间质干细胞型态或牙龈粘膜间质干细胞型态，并进行后续培养与保存。由本发明的方法所分离出的牙髓间质干细胞与牙龈粘膜间质干细胞都具有群集能力、分化为骨质能力、分化为脂肪能力及分化为神经能力。本发明的方法降低了污染机会，且使间质干细胞易于培养与保存。

Description

从口腔组织中培养间质干细胞的方法

技术领域

本发明提供一种从口腔组织中培养间质干细胞的方法，是由牙齿的牙髓组织中分离出牙髓间质干细胞或由牙龈粘膜组织中分离出间质干细胞并进行培养。

背景技术

间质干细胞与胚胎干细胞为两大主流干细胞种类，常被运用在细胞或疾病治疗研究方面，间质干细胞可从多种不同的组织中被分离出来，包括骨髓、肝脏、血管及神经组织。其中常被研究的组织，莫过于来自骨髓的间质干细胞，这种来自骨髓的间质干细胞具有自我更新再生能力，也能分化成多种不同的细胞来源，近年来文献指出，来自骨髓的间质干细胞可在老鼠中改善脑部的神经生长(PNAS2005；102(50)，18171-18176)，或是增加胰岛素的产量(PNAS 2006；103，17438-17443)，这都是间质干细胞在治疗上的研究方向。

近年来，在哺乳类动物口腔组织间质干细胞研究中，发现哺乳类动物牙髓间质干细胞及牙龈粘膜间质干细胞绝大部分特征表现与骨髓的间质干细胞相近，例如：拥有自我更新再生能力，也具有可以分化为脂肪与骨质的能力(PNAS 2000；97(25)，13625-13630)(JDent Res 2002；81(8)，531-535)。然而，这些研究仅局限于第三大臼齿及乳门牙，且前述研究方式需要把牙齿由牙骨质与珐琅质接合处作整颗牙齿横切断开，十分耗时，同时牙髓组织容易被污染。

由于人们在不同口腔牙周疾病或治疗情况下，或是人为与非人为因素而脱落或替换牙齿，都有可能导致需要拔掉牙齿或切除牙龈粘膜组织，因此本发明提供一种从口腔组织中培养间质干细胞的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从口腔组织中培养间质干细胞的方法，以降低污染机会，且使间质干细胞易于培养与保存，分离出的间质干细胞具有群集能力、分化为骨质能力、分化为脂肪能力及分化为神经能力。

本发明的解决方案一包括下列步骤：

A、准备牙髓样本：将牙齿样本浸泡在缓冲溶液，或将牙齿样本冷藏保存，其保存时间小于或等于48小时，其后在牙齿表面预研磨出整圈的沟痕，其中沟痕的深度为0.5～1.0毫米，利用上述沟痕以外力剥开牙齿，暴露出牙髓组织，之后将牙髓样本抽出；

B、分离出牙髓间质干细胞：将牙髓样本浸泡在酵素混合液消化其它组织，之后加入培养基，并离心，离心后移除上清液，步骤B重复3至5次后，即得含牙髓间质干细胞的溶液；

C、细胞培养：将离心后之含牙髓间质干细胞之溶液悬浮于培养基，其中，该培养基含有3～5ml之5～20％胎牛血清，放入培养箱培养2至10天后，细胞即呈现牙髓间质干细胞型态。

上述步骤A，该抽取牙髓样本的手术工具为根管锉、刮匙、镊子及探针之其中任一种。

上述步骤A，该缓冲溶液为含抗生素杜比克氏磷酸缓冲溶液(DPBS，Dulbecco’s phosphate buffersaline)，其所含的抗生素为青霉素及链霉素。

上述步骤A，暴露出牙髓组织的方式是以齿科工具在沟痕位置加以切割、搥击、施压或研磨之其中任一种方式进行。

上述步骤B，该酵素混合液系包括第一型胶原蛋白酶(Collagenase Typel)与分解酶(Dispase)，且该酵素混合液须在37℃水浴进行消化作用。

上述A～C步骤所分离及培养出的牙髓间质干细胞进行后续保存及解冻培养：

牙髓间质干细胞培养至70％生长浓度(confluence)后，加以收集，其中牙髓间质干细胞收集方法为胰蛋白酶-乙二胺四乙酸盐(Trypsin-EDTA)，将收集之牙髓间质干细胞加入培养基混合后离心，离心移除上清液后，加入冷冻保护剂，其中该冷冻保护剂组成系包括：培养基、胎牛血清、5-15％二甲基亚砜(DMSO，Dimethylsulfoxide)，之后将牙髓间质干细胞及冷冻保护剂之混合物暂时储存于梯度降温冷冻盒，冷冻5～24小时后，其中该梯度降温冷冻盒须每分钟降1℃，降至特定温度，再转放至液态氮储存。

解冻培养时，将牙髓间质干细胞从液态氮中取出，置于37℃温度的水浴中，使其快速解冻，离心后移除上清液后，将培养基加入解冻的牙髓间质干细胞，在培养箱培养2至5天，其中，将培养基加入时，需一滴一滴的依序加入至所需份量。

上述细胞保存及解冻培养所使用之培养基含5～20％的胎牛血清。

本发明的解决方案二包括下列步骤：

A、准备牙龈粘膜样本：将牙龈粘膜组织浸泡于缓冲溶液后，将牙龈粘膜组织冷藏保存，其保存时间小于或等于48小时，再利用切割或打孔方式采集牙龈粘膜样本。

B、分离出牙龈粘膜间质干细胞：将牙龈粘膜样本浸泡于酵素混合液消化其它组织，之后加入培养基，并离心，离心后移除上清液，步骤B重复3至5次后，即得含牙龈粘膜间质干细胞之溶液。

C、细胞培养：将离心后之含牙龈粘膜间质干细胞之溶液悬浮于培养基，其中，该培养基含有3～5ml的5～20％胎牛血清，放入培养箱培养2至10天后，细胞即呈现牙龈粘膜间质干细胞型态。

上述步骤A，该切割方式为手术刀切割或电刀切割。

上述步骤B，该酵素混合液包括第一型胶原蛋白酶与分解酶，且该酵素混合液须在37℃水浴进行消化作用。

上述步骤A～C所分离及培养出之牙龈粘膜间质干细胞系进行后续保存及解冻培养：

牙龈粘膜间质干细胞培养至70％生长浓度后，加以收集，其中牙龈粘膜间质干细胞收集方法为胰蛋白酶-乙二胺四乙酸盐，将收集之牙龈粘膜间质干细胞加入培养基混合后离心，离心移除上清液后，加入冷冻保护剂，其中该冷冻保护剂组成系包括：培养基、胎牛血清、5-15％二甲基亚砜，之后将牙龈粘膜间质干细胞及冷冻保护剂之混合物暂时储存于梯度降温冷冻盒，冷冻5～24小时后，其中该梯度降温冷冻盒须每分钟降1℃，降至特定温度，再转放至液态氮储存。

解冻培养时，将牙龈粘膜间质干细胞从液态氮中取出，置于37℃温度的水浴中，使其快速解冻，离心后移除上清液后，将培养基加入解冻的牙龈粘膜间质干细胞，于培养箱培养2至5天。其中，将培养基加入时，需一滴一滴的依序加入至所需份量。

上述之细胞保存及解冻培养所使用的培养基含5～20％的胎牛血清。

本发明的优点如下：

一、本发明能在口腔内所有牙齿，用简单快捷的方式，以分离间质干细胞，易于培养与保存。

二、本发明利用任何角度的切割、搥击、施压、钻研和研磨方式暴露牙髓间质组织，再以根管锉、刮匙、镊子及探针等工具抽取出牙髓组织，无需把牙齿由牙骨质与珐琅质接合处作整颗牙齿横切断开，降低牙髓组织遭受污染的机会。

三、经由本发明的牙髓间质干细胞及牙龈粘膜间质干细胞之保存及解冻培养方法，可将牙髓间质干细胞及牙龈粘膜间质干细胞继代培养至10次以上，可节省材料使用。

四、这是由个人自己的组织所分离及培养出来，再使用在自体上，所以在治疗上不会产生严重的免疫排斥问题。相对于复制培养治疗，就更加不用担心伦理的问题。

五、牙髓间质干细胞及牙龈粘膜间质干细胞的来源采集非常简单，乃是日常口腔检查及治疗时可连带保留所拔除及切除下来的牙齿和牙龈组织，再作培养就能获得，不像骨髓样本需要采用额外的侵入性手术来采集样本。

六、由本发明的方法所分离出的牙髓间质干细胞与牙龈粘膜间质干细胞都具有群集能力、分化为骨质能力、分化为脂肪能力及分化为神经能力。

附图说明

图1是本发明第一实施例的分离及培养流程图；

图2是本发明第一实施例的牙髓间质干细胞型态；

图3是本发明第一实施例的牙髓间质干细胞培养情形；

图4是本发明第一实施例的牙髓间质干细胞脂肪分化能力培养结果；

图5是本发明第一实施例的牙髓间质干细胞骨质分化能力培养结果；

图6是本发明第二实施例的分离及培养流程图；

图7是本发明第二实施例的牙龈粘膜间质干细胞型态；

图8是本发明第二实施例的牙龈粘膜间质干细胞培养情形；

图9是本发明第二实施例牙龈粘膜间质干细胞脂肪分化能力培养结果；

图10是本发明第二实施例的牙龈粘膜间质干细胞骨质分化能力培养结果；

图11a是本发明第一实施例的牙髓间质干细胞针对干细胞标记及神经分化标记的反转录聚合酶链锁反应；

图11b是本发明第二实施例的牙龈粘膜间质干细胞针对干细胞标记及神经分化标记的反转录聚合酶链锁反应；

图12是在牙齿表面上作出0.5～1.0mm刻痕的照片；

图13是在牙齿刻痕上以无菌凿子，准备把牙齿凿开的照片；

图14是牙齿被凿开，并且牙髓暴露出来的照片；

图15是根管锉插入牙齿根管内，准备抽取牙髓组织的照片；

图16是根管锉抽取出牙髓组织图；

图17是牙龈粘膜组织放置于器皿中的照片。

具体实施方式

本发明以下列实验结果作进一步说明，该实验仅为本发明的示例而非局限之意。

本发明的第一实施例，为一种从口腔组织中培养间质干细胞的方法，请参见图1，包括有：

A、准备牙髓样本：将牙齿样本浸泡于缓冲溶液中，本实施例，是将浸泡于10ml含抗生素的杜比克氏磷酸缓冲溶液中，其中杜比克氏磷酸缓冲溶液中所含的抗生素为青霉素及链霉素，或将牙齿样本放入4℃冰箱冷藏保存，其保存时间小于或等于48小时；其后以高/慢速磨牙手机，在牙齿表面预研磨出整圈的沟痕，其中沟痕的深度系为0.5～1.0毫米，利用上述沟痕以外力剥开牙齿，暴露出牙髓组织后将之抽取出。该暴露出牙髓组织的方式系以齿科工具，本实施例是以凿子在沟痕位置加以切割、搥击、施压或研磨其中任一种方式暴露牙髓，然后以无菌的手术工具，如根管锉、刮匙、镊子及探针，本实施例是采用根管锉，抽取牙髓样本，抽取牙髓样本的手术过程，请参见图12至图16的抽取牙髓组织手术照片。

B、分离出牙髓间质干细胞：先以10ml含抗生素的杜比克氏磷酸缓冲溶液清洗已抽取出的牙髓样本，再将牙髓样本浸泡在1ml酵素混合液消化其它组织，该酵素混合液包括3mg/ml第一型胶原蛋白酶与4mg/ml分解酶，且该酵素混合液须在37℃水浴进行消化作用，再以40微米细胞筛来过滤消化后溶液；之后加入10ml含5～20％胎牛血清培养基，并以每分钟1000转的离心速度，将溶液离心10分钟，离心后移除上清液，步骤B重复3至5次后，即得含牙髓间质干细胞的溶液。

C、细胞培养：将离心后的含牙髓间质干细胞的溶液悬浮于培养基，再移入25平方公分的组织培养瓶中，其中，该培养基系含有3～5ml的5～20％胎牛血清，放入培养箱培养2至10天后，细胞即呈现如图2所示的牙髓间质干细胞型态，该培养箱的环境条件为37℃及5％二氧化碳，培养基每隔3天更换，牙髓间质干细胞培养的情形如图3所示。

上述A～C步骤所分离及培养出的牙髓间质干细胞系进行后续保存及解冻培养：

牙髓间质干细胞培养至70％生长浓度后，加以收集，其中牙髓间质干细胞收集方法为胰蛋白酶-乙二胺四乙酸盐，将收集的牙髓间质干细胞加入10ml含5～20％胎牛血清培养基混合后，以每分钟1000转的离心速度，将溶液离心10分钟，离心移除上清液后，加入冷冻保护剂，本实施例中，该冷冻保护剂组成包括：60％培养基、30％胎牛血清、10％二甲基亚砜，之后将牙髓间质干细胞及冷冻保护剂的混合物暂时储存于梯度降温冷冻盒，冷冻5～24小时后，其中该梯度降温冷冻盒须每分钟降1℃，降至特定温度，本实施例中为-80℃，再转放至液态氮储存。

解冻培养时，将牙髓间质干细胞从液态氮中取出，置于37℃温度的水浴中，使其快速解冻，离心后移除上清液后，将含5～20％胎牛血清的培养基加入解冻的牙髓间质干细胞，在环境条件为37℃及5％二氧化碳的培养箱培养2至5天，其中，将培养基加入时，需一滴一滴的依序加入至所需份量。

其后将解冻培养的牙髓间质干细胞脂肪分化能力培养，如图4所示，在油溶红(Oil-Red-O)染色下，可看见颗粒状红色油脂，显示本发明的牙髓间质干细胞具备脂肪分化能力。

将解冻培养的牙髓间质干细胞做骨质分化能力的培养，如图5，在茜素红(Alizarin red)下，可看见颗粒状红色钙质积聚物，显示本发明的牙髓间质干细胞具备骨质分化能力。

本发明的第二实施例，请参见图6，包括有：

A、采集牙龈粘膜样本：将牙龈粘膜组织浸泡于缓冲溶液，本实施例，将浸泡于10ml含抗生素的杜比克氏磷酸缓冲溶液中，其中杜比克氏磷酸缓冲溶液中所含的抗生素系为青霉素及链霉素，或将牙龈黏膜组织放入4℃冰箱冷冻保存，其保存时间小于或等于48小时；其后利用切割或打孔方式采集牙龈粘膜样本，其中，切割方式为手术刀切割或电刀切割，抽取出的牙龈黏膜样本型态请参见图6。

B、分离出牙龈粘膜间质干细胞：先以10ml含抗生素的杜比克氏磷酸缓冲溶液清洗取出的牙龈粘膜样本，再将牙龈粘膜样本浸泡于1ml酵素混合液消化其它组织，该酵素混合液包括3mg/ml第一型胶原蛋白酶与4mg/ml分解酶，且该酵素混合液须在37℃水浴进行消化作用，再以40微米细胞筛来过滤消化后溶液；之后加入10ml含5～20％胎牛血清培养基，并以每分钟1000转的离心速度，将溶液离心10分钟，离心后移除上清液，步骤B重复3至5次后，即得含牙龈粘膜间质干细胞的溶液。

C、细胞培养：将离心后的牙龈粘膜间质干细胞的溶液悬浮于培养基，再移入25平方公分的组织培养瓶中，其中，该培养基含有3～5ml的5～20％胎牛血清，放入培养箱培养2至10天后，细胞即呈现如图7所示的牙龈粘膜间质干细胞型态，该培养箱的环境条件为37℃及5％二氧化碳，培养基每隔3天更换，牙髓间质干细胞培养的情形如图8所示。

上述A～C步骤所分离及培养出的牙龈粘膜间质干细胞系进行后续保存及解冻培养：

牙龈粘膜间质干细胞培养至70％生长浓度后，加以收集，其中牙龈粘膜间质干细胞收集方法为胰蛋白酶-乙二胺四乙酸盐，将收集的牙龈粘膜间质干细胞加入10ml含5～20％胎牛血清培养基混合后，以每分钟1000转的离心速度，将溶液离心 10分钟，离心移除上清液后，加入冷冻保护剂，本实施例中，该冷冻保护剂组成包括：60％培养基、30％胎牛血清、10％二甲基亚砜，之后将牙龈粘膜间质干细胞及冷冻保护剂的混合物暂时储存于梯度降温冷冻盒，冷冻5～24小时后，其中该梯度降温冷冻盒须每分钟降1℃，降至特定温度，本实施例中为-80℃，再转放至液态氮储存。

解冻培养时，将牙龈粘膜间质干细胞从液态氮中取出，置于37℃温度的水浴中，使其快速解冻，离心后移除上清液后，将含5～20％胎牛血清的培养基加入解冻的牙龈粘膜间质干细胞，在环境条件为37℃及5％二氧化碳的培养箱培养2至5天，其中，将培养基加入时，需一滴一滴的依序加入至所需份量。

其后将解冻培养的牙龈粘膜间质干细胞脂肪分化能力培养，如图9所示，在油溶红(Oil-Red-O)染色下，可看见颗粒状红色油脂，显示本发明的牙龈粘膜间质干细胞具备脂肪分化能力。

将解冻培养的牙龈粘膜间质干细胞做骨质分化能力的培养，如图10，在茜素红(Alizarin red)下，可看见颗粒状红色钙质积聚物，显示本发明的牙髓间质干细胞及牙龈粘膜间质干细胞具备骨质分化能力。

牙龈粘膜组织放置于器皿中的形态如图17。

由图11a、图11b针对干细胞标记及神经分化标记的反转录聚合酶链锁反应(RT-PCR)，结果证明培养出的间质干细胞具有神经分化能力，故在临床上，系可应用于治疗神经细胞缺损疾病。

Claims

1.一种从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特生征在于包括下列步骤：

C、细胞培养：将离心后的含牙髓间质干细胞的溶液悬浮于培养基，其中，该培养基含有3～5ml的5～20％胎牛血清，放入培养箱培养2至10天后，细胞即呈现牙髓间质干细胞型态。

2.如权利要求1所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于步骤A，该抽取牙髓样本的手术工具为根管锉、刮匙、镊子及探针之其中任一种。

3.如权利要求1所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于步骤A，该缓冲溶液为含抗生素杜比克氏磷酸缓冲溶液，所含的抗生素系为青霉素及链霉素。

4.如权利要求1所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于步骤A，利用外力剥开牙齿，暴露出牙髓组织的方式是以齿科工具，在沟痕位置加以切割、槌击、施压或研磨之其中任一种方式。

5.如权利要求1所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于步骤B，该酵素混合液包括第一型胶原蛋白酶与分解酶，且该酵素混合液须在37℃水浴进行消化作用。

6.如权利要求1所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于上述细胞培养后进行后续保存：

牙髓间质干细胞培养至70％生长浓度后，加以收集，其中牙髓间质干细胞收集方法为胰蛋白酶-乙二胺四乙酸盐，将收集的牙髓间质干细胞加入培养基混合后离心，离心移除上清液后，加入冷冻保护剂，其中该冷冻保护剂组成系包括：培养基、胎牛血清、5-15％二甲基亚砜，之后将牙髓间质干细胞及冷冻保护剂的混合物暂时储存于梯度降温冷冻盒，冷冻5～24小时后，其中该梯度降温冷冻盒须每分钟降1℃，降至特定温度，再转放至液态氮储存。

7.如权利要求6所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于上述后续保存后进行解冻培养：

将牙髓间质干细胞从液态氮中取出，置于水浴中解冻，其后离心移除上清液后，将培养基加入解冻的牙髓间质干细胞，在培养箱培养2至5天，其中，将培养基加入时，需一滴一滴的依序加入至所需份量。

8.如权利要求6或7所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于：所使用的培养基含5～20％的胎牛血清。

9.一种从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于包括下列步骤：

A、准备牙龈粘膜样本：将牙龈粘膜组织浸泡在缓冲溶液后，或将牙龈粘膜组织冷藏保存，其保存时间小于或等于48小时，再利用切割或打孔方式采集牙龈粘膜样本；

B、分离出牙龈粘膜间质干细胞：将牙龈粘膜样本浸泡于酵素混合液消化其它组织，之后加入培养基，并离心，离心后移除上清液，步骤B重复3至5次后，即得含牙龈粘膜间质干细胞的溶液；

C、细胞培养：将离心后的含牙龈粘膜间质干细胞的溶液悬浮于培养基，其中，该培养基含有3～5ml的5～20％胎牛血清，放入培养箱培养2至10天后，细胞即呈现牙龈粘膜间质干细胞型态。

10.如权利要求9所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于步骤A，该切割方式为手术刀切割或电刀切割。

11.如权利要求9所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于步骤A，该缓冲溶液为含抗生素杜比克氏磷酸缓冲溶液，该所含的抗生素系为青霉素及链霉素。

12.如权利要求9所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于步骤B，该酵素混合液包括第一型胶原蛋白酶与分解酶，且该酵素混合液须在水浴下进行消化作用。

13.如权利要求9所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于：该水浴的温度为37℃。

14.如权利要求9所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于上述细胞培养后进行后续保存：

牙龈粘膜间质干细胞培养至70％生长浓度后，加以收集，其中牙龈粘膜间质干细胞收集方法为胰蛋白酶-乙二胺四乙酸盐，将收集的牙龈粘膜间质干细胞加入培养基混合后离心，离心移除上清液后，加入冷冻保护剂，其中该冷冻保护剂组成包括：培养基、胎牛血清、5-15％二甲基亚砜，之后将牙龈粘膜间质干细胞及冷冻保护剂的混合物暂时储存于梯度降温冷冻盒，冷冻5～24小时后，其中该梯度降温冷冻盒须每分钟降1℃，降至特定温度，再转放至液态氮储存。

15.如权利要求14所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于上述后续保存后进行解冻培养：

将牙龈粘膜间质干细胞从液态氮中取出，置于37℃温度的水浴中，使其快速解冻，离心后移除上清液后，将培养基加入解冻的牙龈粘膜间质干细胞，在培养箱培养2至5天，其中，将培养基加入时，需一滴一滴的依序加入至所需份量。

16.如权利要求14或15所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于：所使用的培养基含5～20％的胎牛血清。